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Neuroscience

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

Summary

Hier stellen wir ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll für die genetische Manipulation von primären Kleinhirn-Granulazellvorläufern (GCPs) vor, das kostengünstig, effizient und lebensfähig ist. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll auch eine einfache Methode für die molekulare Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Hedgehog-Signalwege in primären GCP-Zellen.

Abstract

Das primäre Cilium ist eine kritische Signalorganelle, die auf fast jeder Zelle vorkommt, die Hedgehog (Hh) -Signalreize von der Zelloberfläche überträgt. Im Granulatzellvorläufer (GCP) fungiert das primäre Cilium als zentrales Signalzentrum, das die Proliferation von Vorläuferzellen orchestriert, indem es den Hh-Signalweg moduliert. Die Untersuchung der primären Cilium-abhängigen Hh-Signalmaschinerie wird durch in vitro genetische Manipulation der Signalwegkomponenten erleichtert, um ihre dynamische Lokalisierung zum primären Cilium sichtbar zu machen. Die Transfektion von Transgenen in den Primärkulturen von GCPs unter Verwendung der derzeit bekannten Elektroporationsmethoden ist jedoch im Allgemeinen kostspielig und führt häufig zu einer geringen Zelllebensfähigkeit und unerwünschten Transfektionseffizienz. Dieses Papier stellt ein effizientes, kostengünstiges und einfaches Elektroporationsprotokoll vor, das eine hohe Transfektionseffizienz von ~ 80-90% und eine optimale Zelllebensfähigkeit aufweist. Dies ist eine einfache, reproduzierbare und effiziente genetische Modifikationsmethode, die auf die Untersuchung des primären Cilium-abhängigen Hedgehog-Signalwegs in primären GCP-Kulturen anwendbar ist.

Introduction

Kleinhirn-GCPs werden häufig verwendet, um die Maschinerie des Hh-Signalwegs in neuronalen Vorläuferzelltypen aufgrund ihrer hohen Häufigkeit und hohen Empfindlichkeit gegenüber dem Hh-Signalweg in vivo zu untersuchen1,2,3,4. In GCPs fungiert das primäre Cilium als pivotaler Hh-Signaltransduktionshub5, der die Proliferation der Vorläuferzellen orchestriert6,7,8. Die In-vitro-Visualisierung von Hh-Signalkomponenten auf dem primären Cilium ist aufgrund ihrer niedrigen endogenen Basalspiegel oft eine Herausforderung. Daher sind die transgene Modifikation der Proteinexpressionsniveaus und die Fluorophormarkierung des interessierenden Gens nützliche Ansätze, um den Signalweg bei molekularer Auflösung zu untersuchen. Die genetische Manipulation von GCP-Primärkulturen unter Verwendung von Liposomen-basierten Transfektionsansätzen führt jedoch häufig zu einer geringen Transfektionseffizienz, was weitere molekulare Untersuchungen behindert9. Die Elektroporation erhöht die Effizienz, erfordert jedoch in der Regel exorbitante herstellerspezifische und zelltypbeschränkte Elektroporationsreagenzien10.

In diesem Artikel wird eine hocheffiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Manipulation der Hh-Signalwegkomponenten in GCP-Primärkulturen vorgestellt. Mit diesem modifizierten Elektroporationsprotokoll wurde ein mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiertes smoothened transgene (pEGFP-Smo) effizient an GCPs abgegeben und erreichte hohe Zellüberlebens- und Transfektionsraten (80-90%). Darüber hinaus zeigten die transfizierten GCPs, wie durch die immunzytochemische Färbung belegt, eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der durch Geglätteten Agonisten induzierten Aktivierung des Hh-Signalwegs durch den Transport von EGFP-Smo zu den primären Zilien. Dieses Protokoll ist unmittelbar anwendbar und vorteilhaft für Experimente, die eine genetische In-vitro-Veränderung von schwer zu transfizierenden Zelltypen wie Primärzellkulturen für Menschen und Nagetiere sowie vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen beinhalten.

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Protocol

Alle tierbezogenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für den Umgang mit Tieren und dem vom Gesundheitsministerium in Hongkong genehmigten Protokoll durchgeführt. Tierversuchslizenzen gemäß der Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) wurden vom Gesundheitsministerium der Regierung von Hongkong erhalten. Die Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit der vom HKBU-Forschungsbüro und dem Laborsicherheitsausschuss genehmigten Tiersicherheitsethik durchgeführt. Ausführliche Informationen zu allen in diesem Protokoll verwendeten Materialien finden Sie in der Materialtabelle .

1. Vorbereitung vor dem Versuch

  1. Aufbereitung von Nährmedien und Puffern
    1. Serumfreies Medium (SFM)
      1. Um 50 ml SFM herzustellen, fügen Sie 500 μL 100x L-Glutaminersatz, 500 μL Penicillin-Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat und 12,5 μL 1 M KCl (letzte 250 μM) zu 49 mL neurobasalem Medium hinzu.
      2. Teilen Sie das SFM in 2 Aliquots von 10 mL und 40 mL in 50 mL konischen Rohren auf und lagern Sie sie bei 4 ° C für bis zu einem Monat.
    2. Aufschlussblockierendes Medium: 10% FBS in SFM
      1. Fügen Sie 1,1 ml hitzeinaktiviertes FBS zu einem 10 ml Aliquot SFM hinzu, um ein Verdauungsblockierungsmedium herzustellen.
    3. GCP-Kulturmedium: SFM mit B27
      1. Um GCP-Kulturmedium herzustellen, fügen Sie 800 μL serumfreies B-27-Präparat zu einem 40 ml Aliquot SFM hinzu.
        HINWEIS: B-27-ergänztes SFM kann bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden. Frisch aufbereitete Medien führen jedoch zu optimalen Ergebnissen.
    4. Dissektionspuffer: EBSS mit Glucose + HEPES
      1. Fügen Sie 6 g/L Glucose zu der calcium- und magnesiumfreien Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) hinzu, die 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure) enthält.
      2. Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Spritzenfilter und lagern Sie sie bei 4 °C zur Langzeitlagerung.
    5. Verdauungspuffer
      HINWEIS: Vor Gebrauch frisch zubereiten.
      1. Bereiten Sie 2 ml Verdauungspuffer für die Verdauung von 2-4 Kleinhirngeweben und 4 ml für 4-10 Gewebe vor. Zur Herstellung von 4 ml Aufschlusspuffer werden 1,5 mg L-Cystein (Endkonzentration 200-400 μg/ml) in 4 ml EBSS gelöst. Drehen Sie das Röhrchen wiederholt um, bis das Pulver vollständig gelöst ist.
      2. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,2 μm Spritzenfilter und einer 5 ml Spritze und geben Sie die Lösung in eine sterile 35 mm Zellkulturschale.
      3. Fügen Sie 4 μL Papain (1:1.000 Verdünnung aus einer Stammkonzentration von 20 Einheiten/mg) und 40 μL DNase I (1:100 Verdünnung aus einem 10 mg/ml Stamm für eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml) hinzu.
      4. Inkubieren Sie die Lösung bei 37 °C in einem CO2-Inkubator für mindestens 30 min oder bis zur Verwendung.
        HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um das Papain zu aktivieren. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten Sie vor der Anwendung 45 min bei 37 °C nicht überschreiten. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vor Gebrauch transparent wird und keine weißen Ausscheidungen auftreten.
  2. Deckgläser vorbeschichten
    1. Um die Deckgläser für die Zellanlagerung vorzubereiten, inkubieren Sie autoklavierte 12 mm Glasdeckgläser mit 100 μg/ml Poly-D-Lysin (PDL, 1 mg/ml in sterilem dH2O) für mindestens 1 h bei 37 °C. Bewahren Sie die Deckgläser bis zum Gebrauch in derselben PDL-Lösung bei 4 °C auf.
    2. Sammeln Sie am Tag der primären Zellkultur das PDL in einem sauberen konischen Röhrchen und spülen Sie die Deckgläser dreimal mit sterilem dH2O gründlich aus, um pdL-Reste zu entfernen.
      HINWEIS: Das PDL kann zur Wiederverwendung bei 4 °C gelagert werden.
    3. Übertragen Sie die PDL-beschichteten Glasdeckgläser auf eine 24-Well-Platte, indem Sie in jede Vertiefung einen Deckglas legen.
    4. Überschüssiges Wasser entfernen und 200-300 μL Matrigel (rekonstituiert gemäß den Anweisungen im Produktdatenblatt in serumfreiem DMEM-F12) hinzufügen, um die Deckgläser vollständig abzudecken.
    5. Die Deckgläser im Matrigel für 1 h bei 37 °C im CO2-Inkubator inkubieren.
      HINWEIS: Entfernen Sie das Matrigel vor dem Zellen-Seeding. Dieses Matrigel kann gesammelt und bei 4 ° C für mehrere Wiederverwendungen gelagert werden.
  3. Zubereitung von Vorkochkulturgerichten
    1. Beschichten Sie eine 60 mm Zellkulturschale mit 2 ml 100 μg/ml PDL (rekonstituieren Sie die 1 mg/ml PDL-Stammlösung in sterilem dH2O) durch Inkubation bei 37 °C für 1 h.
    2. Unmittelbar vor der Zellaussaat entfernen, sammeln Sie das verwendete PDL in einem sauberen konischen Röhrchen und lagern Sie es bei 4 ° C für mehrere Wiederverwendungen. Spülen und waschen Sie die PDL-beschichtete Schale dreimal mit sterilem dH2O. Trocknen Sie die Kulturschale vor der Zellaussaat an der Luft.
    3. Verwenden Sie eine 60-mm-Zellkulturschale, um Zellen zu säen, die aus maximal 2 ganzen Kleinhirngeweben gewonnen wurden.
    4. Bereiten Sie zusätzliche Kulturgerichte für zusätzliche Kleinhirne vor.
      HINWEIS: Siehe Schritte 2.1.18 und 2.1.19 für die Verwendung der Vorauflagekulturschale.

2. Experimentiertag 0

  1. Isolierung und Kultivierung von primären GCPs der Maus
    HINWEIS: Die GCP-Kulturmethode wurde von einem Standardprotokoll modifiziert, und das kurze Protokoll wurde in unserer vorherigen Arbeit kurz beschrieben6,11,12. Für einen optimalen GCP-Ertrag verwenden Sie postnatale (P) Tag 6 oder P7 Welpen für die Isolierung von GCP. Führen Sie die folgenden Sezierschritte 2.1.6-2.1.10 so schnell wie möglich aus, um eine optimale Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten.
    1. Vorwarm SFM, Verdauungsblockierungsmedium, Kulturmedium und Opti-MEM bei 37 °C während der Dissektion.
    2. Auf einer sauberen Bank alle Dissektionsapparaturen zur Desinfektion in 70% Ethanol vorsondern.
    3. Füllen Sie eine 60 mm Zellkulturschale mit 2-3 ml Dissektionspuffer und kühlen Sie sie auf Eis.
    4. Frischer Verdauungspuffer wie in Abschnitt 1.1.5 beschrieben vorbereiten und bei 37 °C warm halten.
    5. Verwenden Sie 70% Ethanol, um den Kopf des Welpen zur Desinfektion abzuwischen.
    6. Enthaupten Sie den Welpen ohne Betäubung. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Kopf zu halten, und eine sterilisierte chirurgische Schere, um von der Rückseite des Schädels zu schneiden, um den Welpen zu enthaupten. Entfernen Sie vorsichtig die Haut und den Schädel, um das Gehirn mit einer Pinzette aufzudecken.
    7. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Kleinhirn abzuklemmen, und tränken Sie es schnell in dem vorgekühlten Dissektionspuffer, der in Schritt 2.1.3 vorbereitet wurde.
    8. Entfernen Sie die Hirnhäute mit dem Kleinhirn, das unter einem Seziermikroskop in den Sezierpuffer eingetaucht ist. Blutgefäßangereicherte Hirnhäute sollten unter dem Seziermikroskop rosa erscheinen.
    9. Entfernen Sie alle Hirnhäute mit einer Pinzette.
      HINWEIS: Ein Kleinhirn ohne Hirnhäute sollte ein weißliches Aussehen haben.
    10. Entfernen Sie alle sichtbaren Mittelhirngewebe und den Plexus choroideus aus dem Kleinhirn.
    11. Das Kleinhirn wird in eine 35-mm-Kulturschale überführt, die mit einem in Schritt 2.1.4 vorbereiteten Warmvergärungspuffer vorgefüllt ist. Vermeiden Sie die Übertragung von überschüssigem Dissektionspuffer. Schneiden Sie das Kleinhirn mit einer Mikrofederschere so schnell wie möglich in feine Stücke.
    12. Das zerkleinerte Kleinhirn sofort bei 37 °C für 15 min in einem CO2-Inkubator inkubieren. Verlängern Sie die Inkubationszeit auf 20 min, wenn mehr als 4 Kleinhirne verarbeitet werden sollen.
      HINWEIS: Nach der Inkubation verklumpt das Gewebe.
    13. Übertragen Sie das verdaute Gewebe sofort auf den Boden eines neuen sterilen 15-ml-Zentrifugenröhrchens unter Verwendung einer P1000-Pipettenspitze mit Verdauungsblockermedium (vermeiden Sie die Übertragung von Verdauungspuffer).
    14. Fügen Sie ein geeignetes Volumen des Verdauungsblockierungsmediums (1 ml für 1 Kleinhirn) hinzu, um die Verdauung zu beenden, und pipettieren Sie vorsichtig 30 Mal mit einer P1000-Mikropipette, um das Gewebe weiter in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
    15. Führen Sie die Zellsuspension vorsichtig durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues steriles Zentrifugenröhrchen, um Zellklumpen zu entfernen.
    16. Geben Sie zusätzlich 1 ml frisches Verdauungsblockierungsmedium durch das Zellsieb, um Restzellen aus dem Zellsieb zu sammeln.
    17. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet mit 1 ml SFM. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
    18. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Endvolumen von 2 mL GCP-Kulturmedium und geben Sie die Zellsuspension in die PDL-beschichtete 60 mm Vorbeschichtungskulturschale, die in Schritt 1.3 vorbereitet wurde. 15 min bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubieren.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 20 Min.
    19. Klopfen Sie nach der Inkubation von der Seite auf die Kulturschale, um die lose anhaftenden GCP-Zellen zu entfernen. Sammeln Sie die adhärenten GCP-Zellen in Kulturmedium durch sanftes Pipettieren mit einer P1000-Pipette. Sammeln Sie diese GCP-Suspension in einem neuen 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie die 60-mm-Schüssel.
      HINWEIS: Stark haftende Astroglia- und Fibroblastenzellen bleiben auf dem 60 mm Schalenboden befestigt und werden in diesem Schritt getrennt. Das Weglassen dieses Schritts gefährdet die Reinheit der GCP-Kultur.
    20. Zählen Sie die Zellen und fahren Sie sofort mit der Elektroporation fort.
  2. Tag in vitro (DIV) 0: Elektroporation für Hh-Rezeptor-Transgen-Überexpression: pEGFP-Smo
    1. Für die Elektroporation mit einer 2 mm Spaltküvette ist für jede Elektroporationsreaktion die folgende Plasmid-Zell-Elektroporationsmischung herzustellen: 1,2 × 106 Zellen und 10 μg pEGFP-mSmo (einstellen der DNA-Stammkonzentration auf ~ 2-5 μg/μL in Tris-EDTA-Puffer oder sterilem dH2O) in 100 μL Opti-MEM.
      HINWEIS: Reduzieren Sie die Gesamtzahl der Zellen, wenn die Zellen nicht ausreichen (obwohl dies die Elektroporationseffizienz verringern kann). Passen Sie jedoch weder die Menge des Plasmids noch das Gesamtvolumen des pro Küvette verwendeten Opti-MEM an. Wenn die für das Experiment erforderliche Gesamtzellzahl 1,5 × 106 Zellen überschreitet, skalieren Sie die Elektroporationsmischung entsprechend und führen Sie mehrere Elektroporationsreaktionen separat durch. Die Küvette kann bis zu 5 Mal wiederverwendet werden.
    2. Bereiten Sie die Zellsaatplatte nach der Elektroporation vor, indem Sie 0,5 ml Kulturmedium in jede Vertiefung der 24-Well-Kulturplatte mit beschichteten Deckgläsern (ab Schritt 1.2) geben und bei 37 °C in einem CO2-Inkubator warm halten.
    3. Ab Schritt 2.1.20 wird die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert und bei 200 × g für 5 min bei RT gedreht. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit Opti-MEM, um sicherzustellen, dass kein Restkulturmedium in der Röhre vorhanden ist.
      HINWEIS: Für jede Vertiefung / jeden Deckglas einer 24-Well-Platte, Elektropulver und Samen 1,2-1,3 × 106 Zellen / Well, um ~ 70-75% Zellkonfluenz am nächsten Tag der Kultur zu erhalten.
    4. Stellen Sie die Parameter der Elektroporation wie in Tabelle 1 dargestellt ein.
    5. Die Elektroporationsreaktion vorsichtig pipettieren, um gut zu mischen, und verwenden Sie eine lange P200-Spitze, um ein exaktes Volumen von 100 μL der Mischung in die 2 mm Spaltküvette zu übertragen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
    6. Legen Sie die Küvette in die Küvettenkammer.
    7. Drücken Sie die Ω Taste des Elektroporators (siehe Materialtabelle) und notieren Sie sich den Impedanzwert, der ~ 30-35 betragen sollte. Um sicherzustellen, dass der elektrische Impedanzwert Ω im Bereich von 30-35 liegt, halten Sie sich an ein präzises Volumen von 100 μL.
    8. Drücken Sie die Starttaste , um den Impuls zu starten.
    9. Notieren Sie die Werte des gemessenen Stroms und der Joule, die auf dem Leserahmen angezeigt werden.
    10. Nehmen Sie die Küvette aus der Küvettenkammer.
    11. Sofort 100 μL vorgewärmtes Kulturmedium in die Küvette geben und durch sanftes Pipettieren 2-3 Mal resuspendieren. Die Zellsuspension wird sofort auf die in Schritt 2.2.2 vorbereitete 24-Well-Platte überführt.
      HINWEIS: Um den Zelltod zu minimieren, säen Sie die Zellen unmittelbar nach der Elektroporation aus.
    12. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem CO2-Inkubator. Lassen Sie die Zellen 3 h ungestört, um eine Zellablösung zu vermeiden.
    13. 3 h nach der Aussaat die Hälfte des überstehenden Mediums vorsichtig absaugen und verwerfen, um schwimmende abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen und durch die gleiche Menge vorgewärmtes Kulturmedium zu ersetzen.
    14. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C im CO2-Inkubator und füllen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums auf.
    15. Beobachten Sie die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop am nächsten Tag, d.h. DIV1 (Abbildung 1) für das GFP-Signal, um die Effizienz der Smo-Überexpression zu bestimmen.
    16. Zur Stimulation des Hh-Signalwegs auf DIV 1 nach dem Auffüllen der Hälfte des Mediums werden den Zellen 0,2 μM Glätteter Agonist (SAG) zugegeben, während der Kontrolle ein gleiches Volumen an DMSO hinzugefügt wird. Inkubieren Sie 24 Stunden vor der Zellfixierung.
      HINWEIS: Halten Sie das Hinzugefügte DMSO/SAG-Volumen so gering wie möglich. Hier wurden 0,5 μL DMSO oder 0,5 μL 0,2 mM SAG pro 500 μL Medium pro Vertiefung zugegeben, was einem Verdünnungsverhältnis von 1:1.000 entspricht.

3. DIV 2: Visualisierung primärer Zilien und Untersuchung des Hh-Signalwegs

  1. Zellfixierung
    1. Entfernen Sie 24 h nach der Behandlung das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen 2-3 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer Einweg-Pasteurpipette aus, während Sie das Entfernen der Zellen vermeiden.
    2. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von ~ 400 μL 4% Paraformaldehyd (hergestellt in PBS) und inkubieren Sie bei RT für 10 min.
    3. Spülen und waschen Sie 2-3 mal mit PBS mit einer Einweg-Pasteur-Pipette.
    4. In PBS bei 4 °C bis zu 2 Monate lagern oder mit der Immunfärbung fortfahren.
  2. Immunzytochemische Färbung von GCPs und primärem Ciliummarker
    1. In einer 24-Well-Platte waschen Sie die Zellen zweimal in PBS mit sanftem Schütteln für jeweils 5 Minuten.
    2. 0,5 ml 100 mM Ammoniumchlorid in die Zelle geben und bei RT für 10 min inkubieren, um das Fixiermittel zu löschen.
    3. Einmal abspülen und 2-3 mal mit PBS mit sanftem Schütteln für jeweils 10 min waschen.
    4. 30 μL Blockpuffer (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% hitzeinaktiviertes Pferdeserum in PBS) vorsichtig auf ein Stück Parafilm pipettieren, um einen Tröpfchen ohne Luftblasen zu bilden.
    5. Den Deckglas aus der Vertiefung vorsichtig auf den BB-Tröpfchen mit der zellengesäten Seite nach unten überführen. Inkubieren Sie die Zellen mit BB in einer Feuchtkammer für 1 h bei RT.
    6. Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung in BB vor, wie in der Materialtabelle gezeigt. Um die Zellen mit primären Antikörpern zu untersuchen, wiederholen Sie die Schritte 3.2.4 und 3.2.5 und ersetzen Sie BB durch die primäre Antikörpermischung. Inkubieren Sie die Zellen mit dem primären Antikörper für 2 h bei RT.
    7. Übertragen Sie die Deckgläser mit einer Pinzette mit der Zellenseite nach oben zurück auf die 24-Well-Platte. Spülen Sie die Zellen einmal und waschen Sie 3-4 mal in PBS mit sanftem Schütteln für jeweils 10 min.
    8. Bereiten Sie die sekundäre Antikörpermischung in BB vor, wie in der Materialtabelle gezeigt. Um die Zellen mit dem sekundären Antikörper zu inkubieren, wiederholen Sie die Schritte 3.2.4 und 3.2.5 und ersetzen BB durch die sekundäre Antikörpermischung. Inkubieren Sie im Dunkeln für 1 h bei RT.
    9. Wiederholen Sie Schritt 3.2.7 für die post-sekundäre Inkubationswäsche von Antikörpern.
    10. Montieren Sie den Deckglas mit einem Montagemedium auf einem sauberen mikroskopischen Glasobjektträger.
    11. Trocknen Sie den Objektträger über Nacht im Dunkeln an der Luft und fahren Sie mit der konfokalen Bildgebung fort13.

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Representative Results

Unter Verwendung des Opti-MEM (siehe Materialtabelle) als universelles Reagenz könnte diese vorgeschlagene Elektroporationsmethode eine konstant hohe Elektroporationseffizienz von ~ 80-90% erreichen (Abbildung 1). Die Elektroporationseffizienz des Smo-EGFP-Vektors wurde bei DIV 2 nach der Elektroporation durch Quantifizierung des Prozentsatzes grün fluoreszenzpositiver Zellen in allen gepaarten Box-Protein-6 (Pax6)-exprimierenden GCP-Zellen bestimmt. Die Elektroporationseffizienz von DMSO- und SAG-behandelten Gruppen schien vergleichbar zu sein (Abbildung 1 und Tabelle 2).

Darüber hinaus zeigt die Immunfärbung des primären Ciliummarkers Arl13b, dass die Flimmerrate von GCP bei DIV 2 der Kultur sowohl in der Vehikel- als auch in der SAG-behandelten Gruppe ~18% betrug (DMSO: 17,35% ± 0,59%; SAG: 18,24% ± 0,88%). Die Kiliarationsrate wird als Prozentsatz der Pax6-exprimierenden GCPs dargestellt, die ein primäres Cilium (Arl13b-positiv) auf der Zelloberfläche bei DIV 2 nach der Elektroporation tragen (Abbildung 2 und Tabelle 3).

Um den primären Cilium-abhängigen Hh-Signalweg zu entschlüsseln, wurde ein Agonist von Smo, SAG, verwendet, um den Hh-Signalweg zu aktivieren. Bei Aktivierung des Hh-Signalwegs wird der Smo-Rezeptor am Axonem des primären Ciliums angereichert14. Unsere Ergebnisse zeigen eine signifikant erhöhte Smo-EGFP-Lokalisation auf dem primären Ciliumaxonem von Pax6-exprimierenden GCP-Zellen 24 h nach der SAG-Behandlung (Abbildung 3, Quantifizierungsdaten aus früheren Arbeiten6), was auf eine tiefgreifende Aktivierung des primären Cilium-abhängigen Hh-Signalwegs hinweist.

Figure 1
Abbildung 1: Elektroporationsaufbau und Elektroporationseffizienz von GCPs. (A) Elektroporationsaufbau. Rechts, schwarze Pfeilspitze bezeichnet Elektroporationsküvette. (B, C) Repräsentative Bilder zeigen die Elektroporationseffizienz des Smo-EGFP-Vektors, bestimmt durch Quantifizierung des Prozentsatzes GFP-positiver Zellen in allen Pax6-exprimierenden GCP-Zellen (Tabelle 2). Repräsentative Bilder zeigen die grün fluoreszierenden Signale auf Pax6-exprimierenden (violetten) GCP-Zellen auf DIV 2 nach der Elektroporation nach 24-stündiger Behandlung mit (B) DMSO und (C) SAG. Kerne wurden mit DAPI (blau) beschriftet. Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: GCPs = Körnerzellvorstufen; GFP = grün fluoreszierendes Protein; Pax6 = gepaartes Boxprotein-6; DIV = Tag in vitro; DMSO = Dimethylsulfoxid; SAG = Geglätteter Agonist; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Prozentsatz der Ciliation auf DIV 2 der GCP-Primärkultur. (A, B) Repräsentative Bilder zeigen den Prozentsatz der Ciliation auf DIV 2 der GCP-Primärkultur. Repräsentative Bilder zeigen die primären Zilien (grün) auf Pax6-exprimierenden (roten) GCP-Zellen auf DIV 2 nach der Elektroporation nach 24 h Behandlung mit (A) DMSO und (B) SAG. Kerne wurden mit DAPI (blau) beschriftet. Das primäre Cilium (grün) wird durch weiße Pfeilspitzen gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 20 μm. (C) Grafik veranschaulicht Quantifizierungsdaten von 4 unabhängigen Experimenten. Statistische Analyse, t-Test des ungepaarten Schülers. Fehlerbalken zeigen ±SEM. Abkürzungen: GCP = Granulatzellvorläufer; Pax6 = gepaartes Boxprotein-6; DIV = Tag in vitro; DMSO = Dimethylsulfoxid; SAG = Geglätteter Agonist; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; n.s. = Nicht signifikant; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; Arl13b = ADP-Ribosylierungsfaktor-ähnliches Protein 13B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Erhöhte Smo-Lokalisation auf dem Primärcilium von Pax6-exprimierenden GCP-Zellen während der SAG-Behandlung. (A) Repräsentative Bilder zeigen die Smo-EGFP-Lokalisation (grün) auf dem primären Cilium (rot, weiße quadratische Box) auf Pax6-exprimierenden (violetten) GCP-Zellen bei DIV 2 nach der Elektroporation nach 24-stündiger Behandlung mit DMSO und SAG. Kerne wurden mit DAPI (blau) beschriftet. Skalenbalken = 5 μm. (B) Grafik veranschaulicht Quantifizierungsdaten von 4 unabhängigen Experimenten. Statistische Analyse, ungepaarten Student's t-Test. P ≤ 0,001. Fehlerbalken zeigen ± SEM. Summe n für DMSO-Gruppe = 97, Summe n für SAG-Gruppe = 130. Abbildung 3B wurde von 6 geändert. Abkürzungen: GCP = Körnerzellvorläufer; Smo = Geglättet; Pax6 = gepaartes Boxprotein-6; DIV = Tag in vitro; DMSO = Dimethylsulfoxid; SAG = Geglätteter Agonist; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; Arl13b = ADP-Ribosylierungsfaktor-ähnliches Protein 13B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Einstellung des Porenimpulses Einstellung des Übertragungsimpulses
Primäre GCPs der Maus Primäre Neuronen Primäre GCPs der Maus Primäre Neuronen
Spannung 275 V 275 V 20 V 20 V
Länge 1 ms 0,5 ms 50 ms 50 ms
Intervall 50 ms 50 ms 50 ms 50 ms
Nein. 2 2 5 5
D-Satz 10% 10% 40% 40%
Polarität + + ± ±

Tabelle 1: Die Elektroporationsparameter von primären GCPs und primären Neuronen der Maus unter Verwendung des Superelektroporators NEPA21 TYP II. Abkürzung: GCP = Granule cell precursor.

Effizienz der Elektroporation Exp. 1 (n = 486) Exp. 2 (n = 1314) Exp. 3 (n = 704) Exp. 4 (n = 476) Durchschnitt
DMSO-behandelte Gruppe 90,57% ± 10,12% 96,62% ± 3,09% 98,89% ± 0,97% 90,72% ± 11,31% 94,02% ± 1,36%
SAG-behandelte Gruppe 91,8% ± 8,69% 79,97% ± 2,77% 89,35% ± 5,67% 88,59% ± 13,54% 87,42% ± 1,71%
Durchschnittliche Elektroporationseffizienz 91,31% ± 7,99% 88,27% ± 10,81% 94,12% ± 6,36% 89,65% ± 11,21% 90,84% ± 0,84%

Tabelle 2: Elektroporationseffizienz des Smo-EGFP-Vektors bestimmt durch Quantifizierung des Prozentsatzes der GFP-positiven Zellen in allen Pax6-exprimierenden GCP-Zellen. Es werden Daten von vier unabhängigen Experimenten (Exp.) gezeigt. (Gesamt n = 2980). Abkürzungen: Smo = Geglättet; GFP = grün fluoreszierendes Protein; GCP = Vorläufer von Körnerzellen; Pax6 = gepaartes Boxprotein-6.

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Durchschnitt
Vermittlungsrate - DMSO 18,88% ± 3,61% 19,58% ± 7,42% 16,60% ± 1,48% 14,35% ± 7,99% 17,35% ± 0,59%
Vermittlungsrate - SAG 13,93% ± 3,39% 17,30% ± 2,15% 22,19% ± 10,35% 19,56% ± 1,15% 18,24% ± 0,88%

Tabelle 3: Der Prozentsatz der Verkabelung auf DIV 2 der GCP-Primärkultur. Es werden Daten von vier unabhängigen Experimenten (Exp.) gezeigt. (Gesamt n für DMSO-Gruppe = 1169, Summe n für SAG-Gruppe = 816). Abkürzungen: GCP = Körnerzellvorläufer; DIV = Tag in vitro; DMSO = Dimethylsulfoxid; SAG = Geglätteter Agonist.

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Discussion

Die Transfektion von Transgenen in primärer GCP-Kultur durch Elektroporationsmethode ist typischerweise mit einer geringen Zelllebensfähigkeit und einer schlechten Transfektionseffizienz assoziiert9,10. Dieses Papier stellt ein kostengünstiges und reproduzierbares Elektroporationsprotokoll vor, das eine hohe Effizienz und Lebensfähigkeit bewiesen hat. Darüber hinaus demonstrieren wir auch eine einfache Methode zur Untersuchung des primären Cilium-abhängigen Hh-Signalwegs in primären GCP-Zellen.

Andere gängige Elektroporationsmethoden erfordern oft kostspielige zelltypspezifische Elektroporationsreagenzien, die von bestimmten Herstellern bezogen werden müssen. Die hier beschriebene Methode wird als günstig erachtet, da sie ein gängiges und wirtschaftliches Elektroporationsreagenz für verschiedene Zelltypen verwendet. Darüber hinaus zeigten diese Daten, dass die Elektroporationseffizienz ~ 80-90% erreichte, was im Vergleich zu anderen Elektroporations- und Transfektionsmethoden sehr effizient ist9,10.

Um eine höhere Zelllebensfähigkeit zu erhalten, gibt es einige kritische Schritte, die man berücksichtigen sollte. Die Zerebelllumdissektions- und Dissoziationsverfahren sollten innerhalb eines möglichst kurzen Zeitfensters von 1-2 h abgeschlossen sein. Ein weiterer kritischer Schritt besteht darin, die Bildung von Blasen in der Plasmid-Zell-Elektroporationsmischung vor Impulsen während der Elektroporation zu vermeiden. Nach dem Puls sollte das vorgewärmte Kulturmedium sofort in die Küvetten gegeben und die Zellen so schnell wie möglich ausgesät werden. Die Zellen müssen in den ersten 3 Stunden nach dem Cell Seeding ungestört sein. Die oben genannten Vorsichtsmaßnahmen verbessern die Zelllebensfähigkeit am zweiten Tag der Kultur um bis zu etwa 70-80%.

Eine bemerkenswerte Einschränkung der Untersuchung des primären Ciliums in der primären Kulturplattform besteht darin, dass die Ziliarationsrate in kultivierten Zellen im Allgemeinen niedriger ist als in vivo beobachtet. Frühere Daten 6 zeigten, dass die In-vivo-Rate der Ziliaration unter GCP sowohl bei E15,5 als auch bei P15 etwa 60-80% betrug. Im Gegensatz dazu betrug die In-vitro-Rate der Ziliaration in der primären GCP-Kultur ~ 20%6. Nichtsdestotrotz ist dies ein allgemeines Phänomen, das bei den meisten (wenn nicht allen) Zelltypen erkennbar ist, wenn man die Ziliarate zwischen In-vitro- und In-vivo-Studien vergleicht.

Insbesondere ist diese Methode auch auf andere Primärkulturen wie neuronale Vorläuferzellen und kortikale und Hippocampus-Neuronenkultur anwendbar, was durch Modifikation des Elektroporationsparameters, d. H. Porenpulsspannung, Länge und Anzahl der Pulse, erreicht werden kann. Um die Anwendung dieses Protokolls auf ein breiteres Studiengebiet auszudehnen, sind die empfohlenen Elektroporationsparameter für primäre Neuronen in Tabelle 1 aufgeführt. Darüber hinaus hilft das in diesem Protokoll verwendete universelle Elektroporationsreagenz, d.h. Opti-MEM, zusätzlichen mühsamen Optimierungsaufwand im Vergleich zu anderen Elektroporationsprotokollen zu vermeiden, die eine Optimierung hinsichtlich der Reagenzienkompatibilität erfordern. Dieses optimierte, kostengünstige Elektroporationsprotokoll zur Untersuchung der primären Cilium- und Hh-Signalgebung in primären GCP-Kulturen könnte als Referenzverfahren für andere primäre Cilium-bezogene Studien unter Verwendung von Primärkulturen verwendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch den HKBU Seed Fund und den Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), den Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) an C.H.H. Hor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

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References

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Neuroscience Ausgabe 177 Primäre Zilien Kleinhirngranulatvorläufer In-vitro-Elektroporation Hedgehog-Signalweg primäre GCP-Kultur Geglättet
Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer
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Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

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