Summary
يصف هذا البروتوكول نموذجا فريدا ذا صلة سريرية لأمراض الشرايين الطرفية يجمع بين التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد مع إعطاء مثبط سينثاز أكسيد النيتريك للحث على الغرغرينا الخلفية في فئران FVB. ثم يتم استخدام التروية DiI داخل القلب للتصوير عالي الدقة ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية لوسادة القدم.
Abstract
يعد مرض الشرايين المحيطية (PAD) سببا مهما للمراضة الناتجة عن التعرض المزمن لعوامل الخطر لتصلب الشرايين. يواجه المرضى الذين يعانون من أشد أشكاله ، نقص التروية المزمن الذي يهدد الأطراف (CLTI) ، إعاقات كبيرة في الحياة اليومية ، بما في ذلك الألم المزمن ، ومسافة المشي المحدودة دون ألم ، والجروح غير الشافية. تم تطوير نماذج ما قبل السريرية في مختلفة لدراسة PAD ، لكن نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران لا يزال الأكثر استخداما. يمكن أن يكون هناك تباين كبير في الاستجابة للإهانة الإقفارية في هذه النماذج اعتمادا على سلالة الماوس المستخدمة وموقع ورقم ووسائل تعطيل الشرايين. يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة تجمع بين التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد مع إعطاء مثبط سينثاز أكسيد النيتريك (NOS) للحث بشكل موثوق على غرغرينا وسادة القدم في الفئران Friend Virus B (FVB) التي تشبه فقدان الأنسجة من CLTI. في حين أن الوسائل التقليدية لتقييم التروية مثل التصوير بالليزر دوبلر التروية (LDPI) لا تزال موصى بها ، فإن التروية داخل القلب للصبغة المحبة للدهون 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) تستخدم لتسمية الأوعية الدموية. يسمح الفحص المجهري اللاحق بالليزر متحد البؤرة كامل التركيب بإعادة بناء عالية الدقة ثلاثية الأبعاد (3D) لشبكات الأوعية الدموية في وسادة القدم التي تكمل الوسائل التقليدية لتقييم التروية في نماذج نقص تروية الأطراف الخلفية.
Introduction
يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD)، الذي يتميز بانخفاض تدفق الدم إلى الأطراف بسبب تصلب الشرايين، على 6.5 مليون شخص في الولايات المتحدة و200 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1. المرضى الذين يعانون من PAD يعانون من انخفاض وظائف الأطراف ونوعية الحياة ، وأولئك الذين يعانون من CLTI ، وهو أشد أشكال PAD ، معرضون لخطر متزايد للبتر والوفاة بمعدل وفيات لمدة 5 سنوات يقترب من 50٪ 2. في الممارسة السريرية ، يعتبر المرضى الذين يعانون من مؤشرات الكاحل العضدي (ABI) <0.9 لديهم PAD ، وأولئك الذين يعانون من ABI <0.4 المرتبطة إما بألم الراحة أو فقدان الأنسجة على أنهم مصابون ب CLTI3. تختلف الأعراض بين المرضى الذين يعانون من ABIs مماثلة اعتمادا على النشاط اليومي ، وتحمل العضلات لنقص التروية ، والاختلافات التشريحية ، والاختلافات في التطور الجانبي4. الغرغرينا الرقمية والأطراف هي أشد مظاهر جميع أمراض انسداد الأوعية الدموية التي تؤدي إلى CLTI. وهو شكل من أشكال النخر الجاف الذي يحنط الأنسجة الرخوة. بالإضافة إلى PAD تصلب الشرايين ، يمكن ملاحظته أيضا في المرضى الذين يعانون من مرض السكري ، والأوعية الدموية مثل مرض بورغر وظاهرة رينود ، أو التأق التكلسي في وضع مرض الكلى في المرحلة النهائية5,6.
تم تطوير العديد من النماذج قبل السريرية لدراسة التسبب في PAD / CLTI واختبار فعالية العلاجات المحتملة ، وأكثرها شيوعا لا يزال نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران. عادة ما يتم تحقيق نقص تروية الأطراف الخلفية في الفئران عن طريق عرقلة تدفق الدم من الشرايين الحرقفية أو الفخذية، إما عن طريق ربط الخياطة أو التخثر الكهربائي أو غيرها من الوسائل لتضييق الوعاء المطلوب7. هذه التقنيات تقلل بشكل كبير من التروية إلى الطرف الخلفي وتحفز الأوعية الدموية الجديدة في عضلات الفخذ والساق. ومع ذلك ، هناك اختلافات أساسية تعتمد على سلالة الفئران في الحساسية للإهانة الإقفارية جزئيا بسبب الاختلافات التشريحية في التوزيع الجانبي8,9. على سبيل المثال، الفئران C57BL/6 مقاومة نسبيا لنقص تروية الأطراف الخلفية، مما يدل على انخفاض وظيفة الأطراف ولكن عموما لا يوجد دليل على وجود الغرغرينا في وسادة القدم. من ناحية أخرى ، فإن الفئران BALB / c لديها قدرة ضعيفة بطبيعتها على التعافي من نقص التروية وعادة ما تتطور إلى البتر التلقائي للقدم أو أسفل الساق بعد ربط الشريان الفخذي وحده. هذه الاستجابة الشديدة لنقص التروية تضيق النافذة العلاجية ويمكن أن تمنع التقييم الطولي لتروية الأطراف ووظيفتها. ومن المثير للاهتمام أن الاختلافات الجينية في موضع سمة كمية واحدة تقع على كروموسوم الفئران الفئران 7 قد تورطت في هذه الحساسيات التفاضلية للفئران C57BL/6 و BALB / c لنخر الأنسجة وتروية الأطراف10.
بالمقارنة مع سلالات C57BL/6 و BALB / c ، تظهر فئران FVB استجابة وسيطة ولكنها غير متسقة لربط الشريان الفخذي وحده. تصاب بعض الحيوانات بغرغرينا وسادة القدم في شكل أظافر إقفارية سوداء أو أرقام محنطة ، ولكن البعض الآخر دون أي علامات علنية على نقص التروية11. الإدارة المصاحبة لهيدروكلوريد ميثيل استر Nω-Nitro-L-arginine (L-NAME) ، وهو مثبط لأكسيد النيتريك (NOS) 12 ، يمنع آليات توسيع الأوعية التعويضية ويزيد من الإجهاد التأكسدي في أنسجة الأطراف الخلفية. بالاقتران مع ربط الشريان الفخذي أو تخثره ، ينتج عن هذا النهج باستمرار فقدان أنسجة وسادة القدم في فئران FVB التي تشبه التغيرات الضمورية في CLTI ولكنها نادرا ما تتطور إلى البتر التلقائي للأطراف11. الإجهاد التأكسدي هو أحد السمات المميزة ل PAD / CLTI وينتشر عن طريق الخلل البطاني وانخفاض التوافر البيولوجي لأكسيد النيتريك (NO) 13,14. NO هو جزيء متعدد القدرات يمارس عادة تأثيرات مفيدة على تدفق الدم الشرياني والشعري ، والتصاق الصفائح الدموية وتجميعها ، وتجنيد الكريات البيض وتنشيطها 13. كما ثبت أن المستويات المنخفضة من NOS تنشط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين ، والذي يحفز الإجهاد التأكسدي ويسرع تطور تصلب الشرايين15.
بمجرد إنشاء نموذج لنقص تروية الأطراف الخلفية ، هناك حاجة أيضا إلى مراقبة إعادة تروية الأطراف اللاحقة والتأثير العلاجي لأي علاجات محتملة. في نموذج غرغرينا الفئران المقترح ، يمكن أولا تحديد درجة فقدان الأنسجة باستخدام درجة Faber لتقييم المظهر الإجمالي للقدم (0: طبيعي ، 1-5: فقدان الأظافر حيث تمثل النتيجة عدد الأظافر المتأثرة ، 6-10: ضمور الأرقام حيث تمثل النتيجة عدد الأرقام المتأثرة ، 11-12: ضمور القدم الجزئي والكامل ، على التوالي)9. ثم يتم إجراء القياسات الكمية لتروية الأطراف الخلفية عادة باستخدام LDPI ، والذي يعتمد على تفاعلات دوبلر بين ضوء الليزر وخلايا الدم الحمراء للإشارة إلى التروية على مستوى البكسل في منطقة ذات أهمية (ROI)16. في حين أن هذه التقنية كمية وغير غازية ومثالية للقياسات المتكررة، إلا أنها لا توفر تفاصيل تشريحية دقيقة للأوعية الدموية للأطراف الخلفية16. أما طرائق التصوير الأخرى، مثل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT)، وتصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي (MRA)، وتصوير الأوعية بالأشعة السينية، فتثبت أنها إما مكلفة، وتتطلب أجهزة متطورة، أو أنها تشكل تحديا تقنيا16. في عام 2008 ، وصف لي وآخرون تقنية لوضع العلامات على الأوعية الدموية داخل شبكية العين باستخدام صبغة الكربوسيانين المحبة للدهون DiI17. يدمج DiI في الخلايا البطانية ، وعن طريق الانتشار المباشر ، يصبغ هياكل الأغشية الوعائية مثل البراعم الوعائية والعمليات الزائفة17،18. نظرا لتوصيله المباشر إلى الخلايا البطانية والطبيعة الفلورية العالية للصبغة ، يوفر هذا الإجراء وضع علامات مكثفة وطويلة الأمد على الأوعية الدموية. في عام 2012 ، قام Boden et al. بتكييف تقنية تروية DiI مع نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية الفئران عبر تصوير كامل لعضلات الفخذ المقربة التي تم حصادها بعد ربط الشريان الفخذي 19.
توفر الطريقة الحالية طريقة غير مكلفة نسبيا وممكنة تقنيا لتقييم الأوعية الدموية الجديدة استجابة لنقص تروية الأطراف الخلفية والعلاجات القائمة على الجينات أو الخلايا. في مزيد من التكيف ، يصف هذا البروتوكول تطبيق تروية DiI لتصوير الأوعية الدموية وسادة القدم بدقة عالية و 3D في نموذج الفئران من الغرغرينا الخلفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في البروتوكول من قبل لجنة جامعة ميامي المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC). تم استخدام فئران FVB ، من الذكور والإناث ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ، للدراسة.
1. إعداد حل L-NAME
- في ظل ظروف معقمة في غطاء التدفق الرقائقي ، قم بإعداد محلول مخزون L-NAME عن طريق إذابة 1 جم من مسحوق L-NAME (انظر جدول المواد) مع 20 مل من الماء المعقم لصنع 50 مجم / مل من المحلول. قم بتخزين محلول المخزون في 300-500 ميكرولتر من الأليكوتات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- لصنع محلول L-NAME يعمل ، قم بإذابة أليكوت من محلول مخزون L-NAME وتخفيفه باستخدام PBS (1: 4) تحت ظروف معقمة للحصول على تركيز نهائي 10 mg / mL.
- لإعداد PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، قم بإذابة 8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.2 جم من KCl ، و 1.44 جم من Na2HPO4 ، و 0.23 جم من NaH2PO4 في 800 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl. أضف الماء إلى حجم إجمالي قدره 1000 مل وقم بالتصفية من خلال فلتر أعلى زجاجة 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: الحقن داخل الصفاق (IP) من 4 ميكرولتر / غرام من محلول العمل L-NAME يعادل الجرعة المطلوبة 40 ملغم / كغم من L-NAME. يجب أن يبقى حل العمل L-NAME على الجليد أثناء الاستخدام ، ويجب إجراء تخفيفات جديدة يوميا باستخدام أليكوتس مذاب طازج من محلول المخزون.
2. الحث الكيميائي والجراحي للغرغرينا الخلفية
- الحصول على الفئران FVB ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ، إما من مربي أو تربى في المنشأة (انظر جدول المواد). 2 ساعة قبل الجراحة ، قم بإعطاء جرعة IP 40 مجم / كجم من L-NAME.
- تخدير الفئران مع حقن IP من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ من زيلازين (انظر جدول المواد) المخفف في PBS. تأكد من التخدير الكافي من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم واستمر في مراقبة معدل التنفس أثناء الإجراء.
- إزالة الشعر من الأطراف الخلفية الثنائية والفخذين باستخدام المقصات و / أو كريم مزيل الشعر. وضع الحيوان تحت المجهر الجراحي supine ؛ تمديد وشريط الأطراف في مكانها. تعقيم المجال الجراحي عن طريق تطبيق محلول البوفيدون واليود محيطيا على الموقع الجراحي.
- تحت تكبير 10-20x ، استخدم مقص أو مشرط لإجراء شق 1 سم على طول تجعد الفخذ أقل شأنا من الرباط الأربي. استخدم ملقطا ناعما وقضيب طرف قطني معقم لتشريح وسادة الدهون الإربية بشكل صريح أفقيا من الرباط الإربي وفضح غمد الفخذ الأساسي بحيث يتم تحديد الشريان الفخذي والوريد والعصب بوضوح (الشكل 1).
- باستخدام ملقط ناعم ، اخترق غمد الفخذ. قم بتنظيف العصب الفخذي بعناية بعيدا عن الشريان الفخذي. تحديد إقلاع الفرع الجانبي المحيطي للشريان الفخذي (LCFA) في عمق العصب الفخذي (الشكل 1).
- المضي قدما في التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد القريب فقط من LCFA عن طريق تنشيط جهاز الكي (انظر جدول المواد) وملامسة الأوعية بلطف بحركة من جانب إلى آخر ، مما يضمن أن العصب الفخذي معزول جيدا ويظل محميا من الإصابة الحرارية. قسم جزء السفينة المتخثر بمقص.
- المضي قدما في التعرض للشريان الفخذي البعيد والوريد عن طريق تعبئة وسادة الدهون الإربية عن طريق الإنسي. تحديد الشريان الشرسوفي السطحي والتقاطع saphenopopliteal بشكل أكثر بعدا.
- اخترق غمد الفخذ بين هذين الموقعين وتشريح العصب الفخذي بعناية بعيدا عن الأوعية الفخذية. المضي قدما في تخثر وتحويل الشريان الفخذي والوريد كما هو موضح في الخطوة 2.4.1.
- قم بري المجال الجراحي باستخدام حقنة مملوءة ب PBS معقمة. احصل على الإرقاء عن طريق تطبيق ضغط لطيف باستخدام قضيب طرف القطن لمدة 3-5 دقائق على أي مناطق من النزيف.
- المضي قدما في إغلاق الشق باستخدام خياطة 5-0 قابلة للامتصاص بطريقة بسيطة مستمرة. إعطاء جرعة 1 مغ/كغ تحت الجلد من البوبرينورفين المستدام الإطلاق (انظر جدول المواد) لتخفيف الآلام بعد العملية الجراحية.
- تأكد من فقدان تروية وسادة القدم في الطرف الخلفي المربوط بواسطة LDPI (انظر جدول المواد). أثناء التخدير ، ضع الحيوان على وسادة رغوة داكنة في وضع عرضة أسفل آلة LDPI واستخدم حلقات من الشريط الكهربائي لتثبيت القدمين في مكانهما.
- المضي قدما مع LDPI من القدمين الثنائية. بمجرد اكتمال المسح الضوئي ، ارسم عائد استثمار حول كل لوحة قدم واحصل على قيم التدفق المتوسطة.
- احسب مؤشر التروية كنسبة متوسط قيم التدفق من وسادة القدم المربوطة إلى غير المربوطة. تأكد من أن مؤشر التروية أقل من 0.1.
- انقل الحيوان مرة أخرى إلى قفص نظيف باستخدام وسادة تدفئة أو مصباح علوي للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية. ضمان الشفاء التام من التخدير قبل نقل الفئران مرة أخرى إلى منشأة الحيوانات.
3. إدارة ما بعد الجراحة من L-NAME ومراقبة الغرغرينا الخلفية
- في أيام ما بعد الجراحة 1-3 ، قم بإعطاء جرعة IP إضافية من 40 مجم / كجم من L-NAME لكل. في الوقت نفسه ، قم بتقييم القدم بعناية من الطرف الإقفاري.
- حدد درجة نقص تروية الأطراف الخلفية والغرغرينا باستخدام درجة نقص تروية الطرف الخلفي من فابر9. الدرجات 1-5: عدد الأظافر الإقفارية. الدرجات 6-10: 1-5 أرقام نقص تروية ؛ الدرجات 11 و 12: ضمور القدم الجزئي والكامل. سجل درجات Faber في أيام ما بعد الجراحة 1-3 ثم أسبوعيا.
4. إعداد DiI وحلول العمل لتروية الحيوانات
- لإعداد محلول مخزون DiI ، قم بإذابة 100 ملغ من بلورات DiI (انظر جدول المواد) في 16.7 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. يغطى بورق الألمنيوم ويترك على منصة هزازة طوال الليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- لتحضير المخفف ، قم بإذابة 50 جم من الجلوكوز في 1000 مل من الماء المقطر لإنتاج محلول جلوكوز بنسبة 5٪. تصفية من خلال مرشح أعلى زجاجة 0.22 ميكرومتر. امزج محاليل PBS والجلوكوز بنسبة 5٪ بنسبة 1: 4 لإعداد محلول مخفف يعمل.
5. إعداد المعدات والتروية DiI
- اجعل حل DiI يعمل عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول مخزون DiI إلى 10 مل من محلول مخفف العمل (تم إعداده في الخطوة 4.2) مباشرة قبل الاستخدام. رجه باليد حتى يمتزج جيدا.
- قم بتوصيل اثنين أو ثلاثة من أجهزة التوقف في 3 اتجاهات وإبرة فراشة 25 G في سلسلة. قم بإعداد محاقن سعة 10 مل مع 4 مل من PBS و 10 مل من محلول DiI و 10 مل من الفورمالين المخزن مؤقتا المحايد بنسبة 10٪ (انظر جدول المواد).
- قم بتوصيل المحقنة بالفورمالين بمنفذ التدفق القريب وحقن المحلول لطرد الهواء من الخط ؛ أدر مفتاح التوقف لإغلاق المنفذ. كرر نفس الإجراء بالتتابع ، مع توصيل المحاقن ب DiI ثم PBS بمنافذ التدفق المتوسطة والبعيدة ، على التوالي ، مع الحرص على طرد جميع فقاعات الهواء من خلال مجموعة stopcock.
ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في أي جزء من مجموعة أو أنابيب السداد. يمكن لفقاعات الهواء أن تسد الشرايين الصغيرة أثناء التروية مما يؤدي إلى سوء توزيع DiI داخل الأوعية الدموية ونتائج التصوير المعرضة للخطر. - بمجرد اكتمال الإعداد ، قم بالقتل الرحيم للحيوان عن طريق جرعة زائدة من CO2 في غرفة الحث.
- ضع الحيوان ليتم ارتداؤه في وضع ضعيف على وسادة ماصة وقم بتأمين الإبطين والأطراف السفلية بالإبر.
- باستخدام المقص ، قم بعمل شق عرضي لفتح تجويف البطن. كشف ثم تقسيم الحجاب الحاجز الأيسر والأيمن للوصول إلى التجويف الصدري.
- قطع جدار الصدر على جانبي القص من الأضلاع السفلية إلى الضلعين الأول أو الثاني ، وتجنب الشرايين الصدرية الداخلية (الثديية) بشكل إنسي. استخدم مرقئ (انظر جدول المواد) للإمساك بالطرف السفلي من القص وعكسه نحو رأس الحيوان لفضح التجويف الصدري.
- حدد البطين الأيسر، الذي يبدو أفتح لونا من البطين الأيمن. أمسك القلب بلطف باستخدام ملقط حاد وأدخل إبرة الفراشة في البطين الأيسر.
- استخدم مقص أو إبرة 18 جم لثقب الأذين الأيمن ، مما يسمح لمحاليل الدم والتروية بالعودة إلى القلب لتصريفها. قم بتثبيت الإبرة بيد واحدة أو اثنتين ، مع الحرص على عدم ثقب البطين الأيمن عن غير قصد واختراق الدورة الدموية الرئوية بدلا من الدورة الدموية الجهازية.
- افتح المنفذ إلى المحقنة باستخدام PBS وقم بحقن 2-4 مل يدويا بمعدل 1-2 مل / دقيقة لمدة 1-2 دقيقة لطرد الدم من نظام الأوعية الدموية. ضمان التروية الناجحة من خلال مراقبة النزيف من الأذين الأيمن. بعد الحقن ، أغلق منفذ حقنة PBS.
- افتح المنفذ إلى المحقنة باستخدام DiI وحقن 5-10 مل بمعدل 1-2 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق. راقب الأذنين والأنف وراحة اليد التي يجب أن تتحول إلى اللون الوردي قليلا مع حقن محلول DiI. بعد الحقن ، أغلق منفذ حقنة DiI وانتظر لمدة 2 دقيقة للسماح بدمج الصبغة قبل حقن المثبت.
- افتح المنفذ إلى المحقنة بالفورمالين وحقن 5-10 مل بمعدل 1-2 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق. بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة من البطين الأيسر والمضي قدما في حصاد الأنسجة ذات الاهتمام.
- باستخدام مقص ثقيل ، قم بخلع الساق عند الكاحل ، وفصل القدمين اليسرى واليمنى تماما عن أسفل الساقين. ضع القدمين المحصودين في طبق من 6 أو 12 بئرا مع 1-2 مل من محلول الفورمالين بنسبة 10٪. لف الطبق بورق القصدير وخزنه على درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
6. إعداد أنسجة وسادة القدم للمجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري
- في اليوم التالي ، استبدل المحلول المثبت في لوحة 6 أو 12 بئرا ب 1-2 مل من PBS لكل بئر.
- لجلد القدم ، أولا ، قم بعمل شق طولي باستخدام مشرط على الجوانب الأخمصية والظهرية للقدم. ثم ، باستخدام ملقط مسنن ومرقئ صغير ، قم بإزالة جميع الجلد بعناية من القدم والأرقام ، دون إتلاف الأنسجة الرخوة الكامنة.
- المضي قدما في تركيب وتصوير الأنسجة ، ويفضل أن يكون ذلك في غضون 1-2 أيام من التروية والحصاد. بدلا من ذلك ، قم بإعادة منصات القدم إلى لوحات 6 أو 12 بئرا مع 1-2 مل من PBS ؛ تغطي مع احباط وتخزينها في 4 درجة مئوية للحفاظ على التألق لمدة تصل إلى 1 شهر.
- لتركيب الأنسجة، ضع القدمين بشكل فردي بين شريحتين من المجهر الزجاجي مع وسادة خزعة رغوية مطوية فوق نفسها (مرة أو مرتين اعتمادا على سمك الأنسجة) في كل طرف (انظر جدول المواد). استخدم مشبكين صغيرين لضغط الشرائح الزجاجية معا في كل طرف (السماكة النهائية حوالي 1 مم).
ملاحظة: تتطلب الأنسجة الأكثر سمكا أوقات مسح أطول. يمكن ضغط وسادة القدم الجلدية بين الشرائح الزجاجية قبل يوم واحد من التصوير لتقليل سمك الأنسجة.
7. المجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري
- الاستعداد لجلسة التصوير: قم بتشغيل نظام التصوير وابدأ برنامج الاقتناء (انظر جدول المواد). استخدم هدف تكبير منخفض/فتحة رقمية منخفضة (على سبيل المثال، x5/0.15) لالتقاط الصور لأن عدسات التكبير الأقل عادة ما يكون لها مسافات عمل أطول مطلوبة لهذه التجربة.
- انقر فوق نعم إلى مربع الحوار تنشيط المرحلة. قم بتنشيط ليزر 561 نانومتر في علامة التبويب تكوين. على الشاشة الرئيسية ، قم بتنشيط مسار شعاع مرئي بالنقر فوق الزر مرئي . قم بتعيين كاشف إلى نطاق 570-600 نانومتر بالنقر فوق خانة الاختيار نشط المقابلة.
- حدد أيقونة مسح البلاط ضوئيا في علامة التبويب اكتساب > وقم بتعيين الدقة المطلوبة (512 × 512 أو 1024 × 1024).
- ضع عينة الأنسجة المثبتة على الجاف (بدون ماء أو إضافة PBS) المضغوطة بين الشرائح الزجاجية على مرحلة المجهر وجلب الأنسجة إلى التركيز.
- لتعيين حدود المسح الضوئي، انتقل إلى الزاوية العلوية اليسرى أو اليمنى من العينة. في علامة التبويب اكتساب ، ضمن قائمة مسح البلاط ، انقر فوق الزر وضع علامة على الموضع . انتقل إلى الزاوية المقابلة (أسفل اليمين أو اليسار ، على التوالي) وانقر فوق الزر "وضع علامة على الموضع " مرة أخرى.
- لتعيين عمق مكدس Z ، انقر فوق الزر Live في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة وانتقل إلى وسط العينة. استخدم مقبض المحور z للتمرير إلى أسفل العينة.
- في علامة التبويب الاستحواذ ، ضمن قائمة Z-Stack ، انقر فوق الزر "ابدأ ". مرر إلى أعلى العينة وانقر على زر إنهاء . انقر فوق حجم الخطوة Z واضبطه على القيمة المطلوبة (على سبيل المثال ، 50 ميكرومتر).
- في الزاوية السفلية اليمنى من الشاشة ، انقر فوق ابدأ لبدء الحصول على الصور.
8. التحليل الكمي وإعادة بناء 3D للأوعية الدموية وسادة القدم
- قم بتنزيل وتثبيت أحدث إصدار من فيجي (ImageJ) بالإضافة إلى المكون الإضافي لتحليل السفن20. افتح ملفات صور المجهر في فيجي ، والتي ستجمع بين سلسلة Z الفردية في مكدسات Z التي يمكن عرضها في المحور z باستخدام شريط التمرير الموجود أسفل الصورة.
- حدد صورة مكدس Z المركب، ثم ضمن القائمة صورة، اختر مكدسات > Z Project لإنشاء إسقاط ثنائي الأبعاد. بعد ذلك، قم بتحويل الإسقاط Z إلى ثنائي ضمن عملية > ثنائي > جعل ثنائي.
- قم بتشغيل المكون الإضافي "كثافة الأوعية الدموية" ضمن المكونات الإضافية > كثافة الأوعية الدموية. عند المطالبة، استخدم المؤشر لتتبع عائد استثمار حول محيط لوحة القدم والأرقام. لاحظ كثافة الأوعية التي يتم الإبلاغ عنها ، والتي يتم التعبير عنها كنسبة مئوية من عائد الاستثمار (جزء منطقة الأوعية الدموية).
- لإنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد في فيجي ، حدد Stacks > 3D Project وقم بتعيين محور الدوران المطلوب والزاوية والسرعة ضمن القائمة Image. بدلا من ذلك، حدد عارض مستوى الصوت ضمن قائمة المكونات الإضافية لتصور الصور كشرائح أو معالجة إعادة البناء في المحاور المطلوبة.
- لمزيد من المشاركة في تقديم 3D ، استخدم برامج بديلة لتحليل الصور ومعالجتها (انظر جدول المواد). قم بتحويل الملفات إلى تنسيق البرنامج المطلوب وقم بخياطة عمليات مسح البلاط الفردية باستخدام وظيفة خياطة البلاط.
- بعد خياطة عمليات مسح البلاط الفردية معا ، افتح الملف المركب وتابع عرض سطح وحدة التخزين. انقر فوق إضافة سطح جديد لفتح معالج إنشاء Surface واستخدام الأسهم للتبديل بين القوائم ، ولا سيما تعيين عائد الاستثمار وكثافة العتبة. بمجرد الرضا عن عرض السطح ، استخدم وظيفة الرسوم المتحركة لإنشاء مقاطع فيديو للصورة المعالجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يفصل هذا البروتوكول وسيلة موثوقة للحث على نقص التروية وفقدان الأنسجة في وسادة القدم الفئرانية باستخدام مزيج من تخثر الشريان الفخذي والوريد مع إدارة L-NAME ، وهو مثبط سينثاز أكسيد النيتريك ، في الفئران FVB الحساسة. يفصل الشكل 1 تشريح الأوعية الدموية للطرف الخلفي الفئراني ويشير إلى مواقع تخثر الشريان الفخذي والوريد (X الأصفر) ، القريب فقط من الشريان الفخذي الجانبي المحيطي (LCFA) والقريب من التقاطع saphenopopliteal. يجب تحديد LCFA ، ويتم الحفاظ على مواقع التخثر الخاصة بهذا الهيكل متسقة في جميع الإجراءات الجراحية. كما هو موضح ، قبل 2 ساعة من العمليات الجراحية وفي أيام ما بعد الجراحة 1-3 ، تم إعطاء الفئران أيضا 40 ملغم / كغم IP من L-NAME للحفاظ على مستويات الأنسجة المرتفعة من الإجهاد التأكسدي. يوضح الشكل 2 التباين في فقدان الأنسجة الذي يمكن توقعه من هذا النموذج بعد أسبوع واحد من الجراحة ، مع تسجيل درجات Faber 9 في الزاوية اليمنى السفلى من كل صورة.
تم إجراء تروية DiI في الفئران FVB في 5 و 20 يوما بعد تخثر الشريان الفخذي والوريد لتقييم تروية الأطراف الخلفية بعد تحريض نقص التروية. يوضح الشكل 3A تشريح الفئران بعد التشريح لفضح التجويف الصدري. يتم إدخال إبرة فراشة في البطين الأيسر لبدء تروية القلب. لاحظ أن البطين الأيسر يبدو شاحبا قليلا في اللون من البطين الأيمن. يصور الشكل 3B المعدات التي تم إعدادها باستخدام أجهزة إيقاف متصلة في سلسلة وثلاث محاقن مملوءة ب PBS وحل DiI ومثبت. بعد تروية DiI ، تم حصاد القدمين وجلدهما وضغطهما بين شرائح المجهر كما هو موضح في الشكل 3C ، D قبل التصوير باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤرة تحت تكبير 5x. كشفت صور الفحص المجهري لإعادة البناء عن تشريح الأوعية الدموية الطبيعي في وسادة القدم الضابطة غير المربوطة (الشكل 4A) مقارنة بالتروية المتناقصة بشدة إلى وسادة القدم في الطرف الخلفي المربوط بعد 5 أيام من الجراحة (الشكل 4B). بعد عشرين يوما من الجراحة ، تحسنت التروية إلى وسادة القدم بشكل كبير (الشكل 4C و D والشكل 5B) ، على الرغم من أنها لم تصل إلى حد التحكم غير المربوط (الشكل 4A والشكل 5A). تم تحديد الأوعية الدموية كميا كما هو موضح أعلاه باستخدام المكون الإضافي لكثافة السفن في فيجي. كان الجزء الوعائي لوسادة القدم الضابطة 28٪. بعد خمسة أيام من الجراحة ، تم تخفيض الجزء الوعائي لوسادة القدم بشدة إلى 2٪ ولكنه تعافى تدريجيا إلى 15٪ و 18٪ في اثنين من الفئران المنفصلة بحلول 20 يوما بعد الجراحة. لتصور تشريح الأوعية الدموية في لوحة القدم في 3D ، قمنا باستيراد صورة مجهرية مخيطة إلى برنامج بديل لتحليل الصور ومعالجتها لإنشاء عرض سطحي كما هو موضح سابقا (الشكل التكميلي 1). ثم تم إنشاء فيديو لعرض السطح باستخدام وظيفة الرسوم المتحركة (فيديو 1).
الشكل 1: تشريح الأوعية الدموية للأطراف الخلفية الفئرانية ومواقع الشريان الفخذي وتخثر الوريد. يستمر الشريان الحرقفي الخارجي حيث أن الشريان الفخذي (FA) بعيد عن الرباط الأربي. تشمل الفروع الأولى للشريان الفخذي الالتفاف الجانبي (LCFA) والشرايين الفخذية العميقة (غير المصورة). وبشكل أكثر بعدا، يتفرع الفخذ الذيلي القريب (PCFA) والشرايين الشرسوفية الذيلية السطحية (SCEA) من FA القريب إلى تشعب الشرايين الصافنة (SA) والشرايين المأبضية (PA). يدور العصب الفخذي (FN) جنبا إلى جنب مع الأوعية الفخذية ويجب عزله بلطف قبل تخثر الأوعية الفخذية. يشار أيضا إلى مواقع تخثر FA والوريد الفخذي (FV) (X). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور تمثيلية للغرغرينا الخلفية في فئران FVB مع درجات Faber المقابلة. تختلف درجة التغيرات الإقفارية التي يسببها هذا النموذج من واحد أو أكثر من الأظافر الإقفارية (درجات فابر 1-5) إلى أرقام الغرغرينا (درجات فابر 6-10) وضمور القدم الجزئي أو الكامل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تشريح الحيوانات وإعداد المعدات لتروية DiI وتركيب قدم الفأر للتصوير . (أ) صورة تشريحية لتشريح الفئران أثناء تروية DiI. يتم فتح تجاويف البطن والصدر ، وينعكس القص ، ويتم قطع الأضلاع على جانبي القص. يتم إدخال إبرة فراشة 25 جم متصلة بمجموعة السدادة في البطين الأيسر. (ب) يتم توصيل ثلاثة أجهزة توقف في 3 اتجاهات في سلسلة. تمتلئ ثلاث محاقن سعة 10 مل بمثبتات و DiI و PBS وتتصل بتجميع stopcock. يتم توصيل إبرة فراشة 25 جم بمنفذ التدفق الخارجي للتوقف القريب. (ج) تركيب القدم الجلدية بين شريحتين مجهريتين باستخدام وسادة خزعة رغوية مطوية ومشبك موثق في كل طرف لضغط الشرائح معا. (د) منظر بديل للقدم الجلدية المضغوطة بين شرائح المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية 5x تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري بالليزر البؤري لوسادة قدم الماوس بعد تروية DiI مع كثافة الأوعية الكمية المعبر عنها كنسبة مئوية من عائد الاستثمار. (A) الأوعية الدموية العادية لوسادة القدم. (ب) يظهر توسع وسادة القدم بعد 5 أيام من تخثر الشريان الفخذي والوريد انخفاضا حادا في التروية مع الحد الأدنى من عتامة الأوعية. (ج) يوضح توسع وسادة القدم بعد 20 يوما من تخثر الشريان الفخذي والوريد بعض إعادة تكوين التدفق البعيد إلى مشط القدم والشرايين الرقمية. (د) صورة لوسادة قدم فأر إضافية تم الحصول عليها بعد 20 يوما من تخثر الشريان الفخذي والوريد تظهر الحد الأدنى من الأوعية الكبيرة مقارنة بعتامة الأوعية الدموية الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور مكبرة للأوعية الدموية في وسادة القدم. (أ) صور 5x و 20x للأوعية الدموية لوسادة القدم الضابطة التي تظهر تروية سليمة عبر مشط القدم والشرايين الرقمية. (ب) صور 5x و 20x لوسادة القدم من الطرف الخلفي المربوط بعد 20 يوما بعد العملية الجراحية تظهر انخفاض التروية عبر فروع شريانية مشط القدم الأكبر ولكن تطوير شبكة شعرية واسعة وفخمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: الرسوم المتحركة من تقديم سطح 3D من الأوعية الدموية وسادة القدم. فيديو يعرض عرضا سطحيا للأوعية الدموية لوسادة القدم يوضح دقة 3D التي يمكن تحقيقها باستخدام البروتوكول الموصوف. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الشكل التكميلي 1: خطوات في العرض السطحي لصور التروية DiI. (أ) صورة تروية DiI الأصلية المستوردة إلى برنامج تحليل الصور ومعالجتها. (ب) عرض السطح المتراكب على صورة التروية DiI أثناء إعداد شدة العتبة. (ج) العرض السطحي النهائي 3D لصورة المجهر التروية DiI. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن نقص تروية الأطراف الخلفية للفأر هو النموذج قبل السريري الأكثر استخداما على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية الجديدة في PAD و CLTI ، هناك تباين كبير في شدة نقص التروية والانتعاش اعتمادا على سلالة الفأر المحددة المستخدمة وموقع وعدد وطريقة تعطيل الشرايين. يمكن أن يؤدي الجمع بين ربط الشريان الفخذي وإدارة IP ل L-NAME إلى تحفيز الغرغرينا الخلفية بشكل موثوق به في فئران FVB 11. نفس العلاج يؤدي إلى نقص تروية الأطراف الخلفية دون فقدان الأنسجة في الفئران C57BL/6 ، بينما في الفئران BALB / c ، يمكن أن يحدث البتر التلقائي للقدم أو الساق عن طريق ربط الشريان الفخذي وحده. على هذا النحو ، فإن التقنية الموصوفة أعلاه لتخثر الشريان الفخذي مع إدارة L-NAME المتزامنة في فئران FVB ، والتي لديها استجابة وسيطة لإهانة نقص التروية ، توفر نموذجا فريدا وقابلا للتكرار من غرغرينا وسادة القدم على غرار ذلك الذي شوهد في أشد مظاهر الأمراض التي تؤدي إلى CLTI. يمكن أن تختلف درجة فقدان الأنسجة التي لوحظت مع هذا النموذج من عدد قليل من الأظافر الإقفارية إلى أرقام غرغرينية متعددة ولكن نادرا ما تتطور إلى البتر التلقائي للقدم أو الساق ، مما يسمح بإجراء تقييم طولي لتروية الأطراف ووظيفتها. على عكس الفئران BALB / c ، حيث يكون ظهور الغرغرينا سريعا مع البتر التلقائي للأطراف الذي يحدث عادة في أقل من أسبوع واحد ، هناك بداية متأخرة لفقدان الأنسجة في نموذج الغرغرينا الفأر FVB هذا. يحد تخثر الشريان الفخذي بشدة من تدفق الدم إلى الطرف الخلفي. ومع ذلك ، فإن تراكم الإجهاد التأكسدي بسبب إدارة L-NAME في أيام ما بعد الجراحة 0-3 أكثر تدرجا ، مع ملاحظة التغيرات الضمورية الذروة بين 7-14 يوما. لذلك ، يوفر هذا النموذج نافذة علاجية محسنة لتقييم آثار تدخل معين على المظهر الإجمالي للأنسجة وإنقاذ فقدان الأنسجة بالإضافة إلى تحديد كمية التروية وتقييم وظيفة الأطراف.
فيما يتعلق بالتقنية الجراحية ، يفضل تخثر أو ربط كل من الشريان الفخذي والوريد بسبب السهولة النسبية لهذه العملية مقارنة بعزل الشريان الفخذي. في حين أن هذه التقنية يمكن أن تؤدي إلى تجلط الدم الوريدي والقصور ، إلا أنها تضاعف الإهانة الإقفارية وتساعد على إحداث تغييرات غرغرينية بشكل أكثر موثوقية. بالإضافة إلى ذلك ، ينتشر القصور الوريدي المزمن (CVI) بشكل كبير بين عامة السكان ، مع 10٪ -30٪ من البالغين المتضررين. باستمرار ، ما يقرب من 20 ٪ من المرضى الذين يعانون من PAD ، وخاصة أولئك الذين يعانون من قصور شرياني حاد ، لديهم أيضا CVI21,22 المصاحبة . بغض النظر عما إذا كان المرء يقرر أن يتخثر أو يتخثر الوريد الفخذي ، فمن المهم للغاية الحفاظ على الموقع (المواقع) المحددة لاضطراب الشريان الفخذي ثابتة عبر المجموعات التجريبية. تؤدي المزيد من الروابط القريبة ، مثل الشريان الحرقفي ، إلى انسداد ضمانات إضافية في اتجاه المصب وتحد من إمكانية تكوين الشرايين8,16. ومع ذلك ، لا يزال ينبغي تحفيز تولد الأوعية الدموية في الجزء البعيد من الطرف ، وخاصة عضلة المعدة والأمعاء. في الفئران FVB ، يؤدي الربط المزدوج أو تخثر الشريان الفخذي القريب فقط من الشريان الفخذي الجانبي الجانبي والقريب من التشعب saphenopopliteal بشكل أكثر اتساقا إلى تحفيز الغرغرينا أكثر من موقع ربط أو تخثر واحد.
تجدر الإشارة إلى أنه في مرضى PAD و CLTI ، يحدث نقص تروية الأطراف بسبب انسداد تصلب الشرايين (عملية مزمنة). في المقابل ، في نماذج الفئران ، يتم تحفيز نقص تروية الأطراف جراحيا (عملية حادة). على الرغم من أن نموذج الغرغرينا الخلفي للفأر FVB لديه بداية أبطأ نسبيا من الغرغرينا مع تأخر ذروة شدة فقدان الأنسجة ، إلا أنه لا يمكن مقارنته مباشرة بخاصية تضيق الشرايين المزمن والتدريجي ل PAD و CLTI. طورت مجموعات أخرى تقنيات انسداد الشريان الفخذي تحت الحاد باستخدام انقباضات أميرويد تتكون من غلاف معدني خارجي وطبقة داخلية من المواد الممتصة للرطوبة التي تتوسع ذاتيا تدريجيا. وقد ثبت أن هذه التقنية تؤدي إلى انخفاض التعبير عن علامات الالتهاب ، وانخفاض تدفق الدم في 4-5 أسابيع ، وانخفاض نخر العضلات 23,24. بخلاف الاختلافات في حدة نقص التروية ، تفشل النماذج قبل السريرية التي تستخدم الحيوانات الشابة والسليمة أيضا في تكرار عوامل الخطر مثل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم والسمنة وفرط شحميات الدم والتدخين والعدوى التي تسهم في أحداث الأطراف الضارة الرئيسية وعبء أمراض الأوعية الدموية.
في معظم الدراسات حول نقص تروية الأطراف الخلفية الفئرانية ، عادة ما يتم تقييم استعادة تدفق الدم إلى الطرف الخلفي الإقفاري عبر LDPI24,25. هذه الطريقة غير جراحية وقابلة للتكرار ولكن يمكن أن تتأثر بدرجة حرارة الجسم الأساسية ، واستخدام التخدير ، ووجود الشعر ، وتحديد موضع الأطراف الخلفية26. يمكن أن يساعد توحيد هذه الإجراءات واستخدام الطرف الخلفي غير المربوط كعنصر تحكم داخلي في التخفيف من أي اختلافات. على النقيض من LDPI ، توفر micro-CT و MRA معلومات تشريحية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ولكنها تتطلب تقليديا حقن عامل التباين16. تصوير الأوعية الدقيقة بالأشعة السينية هو أيضا غازي وصعب تقنيا16,27. مثل DiI ، يسمح التروية مع عوامل صب السيليكون المشعة بإعادة بناء 3D بعد الوفاة للأوعية الدموية الطرفية28. كما تم وصف حقن الوريد داخل القلب أو الذيل من اللكتين الفلورسنت لوضع العلامات على الأوعية الدموية في الأنسجة29. بعد حصاد الأنسجة ذات الأهمية ، غالبا ما يستخدم التلطيخ الكيميائي المناعي باستخدام علامات خاصة بالبطانة (على سبيل المثال ، CD31 ، عامل فون ويلبراند) لتحديد كثافة الشعيرات الدموية30.
بالمقارنة مع التقنيات المذكورة أعلاه ، يوفر تروية DiI العديد من المزايا. أولا ، الكواشف والمواد المطلوبة غير مكلفة نسبيا ، شريطة أن يكون الوصول إلى مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري متاحا. تسمح هذه الطريقة بإعادة بناء الأوعية الدموية 3D ، والتي يمكن تحديدها كميا باستخدام برنامج تحليل الصور. في حين يركز هذا البروتوكول على الأوعية الدموية لوسادة القدم، فإن التصوير الكامل لأنسجة الأطراف الخلفية الفئرانية الأخرى، ولا سيما عضلات المعدة وعضلات المقرب، ممكن أيضا وذو صلة بتكوين الأوعية الدموية وتكوين الشرايين19 . يمكن تعديل هذه التقنية للنماذج الحيوانية الأكبر ، بما في ذلك الفئران والأرانب ، عن طريق زيادة حجم حلول التروية. ومع ذلك ، يتم وصف قيود التصوير المتعلقة بحجم الأنسجة أدناه.
الأجزاء الحرجة من تروية DiI هي كما يلي. قد تسد فقاعات الهواء في الجهاز الأوعية الصغيرة وتعيق توزيع DiI في جميع أنحاء الأوعية الدموية ، وبالتالي تؤثر على نتائج التصوير. على هذا النحو ، يجب توخي الحذر لإزالة أي فقاعات هواء في جهاز stopcock والأنابيب قبل التروية. يوصى أيضا بتصفية جميع الحلول باستثناء DiI من خلال مرشح أعلى زجاجة 0.22 ميكرومتر لإزالة أي جسيمات دقيقة. أثناء التروية داخل القلب ، راقب الرئتين بعناية. إذا أصبحت متضخمة وتحولت إلى اللون الوردي ، فهذه علامة على أن إبرة الفراشة قد اخترقت البطين الأيمن وتحتاج إلى التراجع قليلا.
أحد القيود المهمة على تروية DiI هو الطبيعة الطرفية للإجراء ، والتي لا تسمح بإجراء قياسات متكررة. نظرا لأن نتائج التروية الضعيفة قد تعكس القصور الشرياني الكامن أو الخطأ الفني ، يوصى بحصاد وتصوير الطرف الخلفي غير المربوط كعنصر تحكم داخلي. فيما يتعلق بالتصوير ، فإن سمك الأنسجة الأمثل لاختراق الليزر هو ~ 1 مم بعد الضغط. وبالتالي ، تتطلب الأنسجة الأكبر تقسيما إلى قطع أصغر ليتم تركيبها على الشرائح واستيعابها على مرحلة المجهر وأوقات التقاط الصور الأطول نسبيا.
باختصار ، يحدد هذا البروتوكول نموذجا فريدا قبل سريريا لدراسة PAD و CLTI. على وجه التحديد ، يؤدي تخثر الشريان الفخذي والوريد مع الإدارة المتزامنة ل L-NAME ، وهو مثبط NOS ، بشكل موثوق إلى فقدان الأنسجة في منصات أقدام فئران FVB. بعد الوفاة ، يتم استخدام تروية DiI داخل القلب لتسمية الأوعية الدموية بالفلورسنت. يسمح التصوير اللاحق الكامل للأقدام التي تم حصادها باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري بإعادة بناء عالية الدقة و 3D للأوعية الدموية وسادة القدم وتصور الشبكات الشريانية والشعرية التي تكمل الوسائل التقليدية لتقييم التروية في نماذج نقص تروية الأطراف الخلفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى Z-J L و OC V من المعاهد الوطنية للصحة [R01HL149452 و VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. كما نشكر مرفق الفحص المجهري والتصوير التابع لمشروع ميامي لعلاج الشلل في كلية الطب بجامعة ميامي على توفير إمكانية الوصول إلى برامج تحليل الصور ومعالجتها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
