Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל ייחודי ורלוונטי מבחינה קלינית של מחלת עורקים היקפית המשלב עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול מעכב סינתאז תחמוצת החנקן כדי לגרום לנמק אחורי בעכברים FVB. זלוף תוך-לבבי DiI משמש לאחר מכן להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל.
Abstract
מחלת עורקים היקפית (PAD) היא גורם משמעותי לתחלואה הנובעת מחשיפה כרונית לגורמי סיכון טרשת עורקים. חולים הסובלים מצורתה החמורה ביותר, איסכמיה כרונית מסכנת גפיים (CLTI), מתמודדים עם ליקויים משמעותיים בחיי היומיום, כולל כאב כרוני, מרחק הליכה מוגבל ללא כאב ופצעים שאינם מחממים. מודלים פרה-קליניים פותחו בבעלי חיים שונים כדי לחקור PAD, אבל איסכמיה אחורית עכבר נשאר הנפוץ ביותר בשימוש נרחב. יכולה להיות שונות משמעותית בתגובה לעלבון איסכמי במודלים אלה בהתאם לזן העכבר המשמש ואת האתר, המספר והאמצעים להפרעה עורקית. פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית המשלבת עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול של מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (NOS) כדי לגרום באופן אמין נמק משטח כף הרגל בעכברים וירוס חבר B (FVB) הדומה לאובדן הרקמה של CLTI. בעוד אמצעים מסורתיים להערכת reperfusion כגון הדמיית זלוף דופלר לייזר (LDPI) עדיין מומלץ, זלוף תוך לב של צבע ליפופילי 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) משמש לתיוג כלי הדם. מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית בהרכבה מלאה לאחר מכן מאפשרת שחזור ברזולוציה גבוהה ותלת-ממדית (3D) של רשתות כלי דם של משטחי רגליים המשלימים אמצעים מסורתיים להערכת רפרטפוזיה במודלים של איסכמיה אחורית.
Introduction
מחלת עורקים היקפית (PAD), המאופיינת בזרימת דם מופחתת לגפיים עקב טרשת עורקים, משפיעה על 6.5 מיליון אנשים בארצות הברית ועל 200 מיליון אנשים ברחבי העולם1. חולים עם PAD חווים ירידה בתפקוד הגפיים ובאיכות החיים, ואלה עם CLTI, הצורה החמורה ביותר של PAD, נמצאים בסיכון מוגבר לכריתה ולמוות עם שיעור תמותה של 5 שנים המתקרב ל -50%2. בפרקטיקה הקלינית, חולים עם מדדי ברכיאל קרסול (ABI) <0.9 נחשבים כבעלי PAD, ואלה עם ABI <0.4 הקשורים לכאב מנוחה או לאובדן רקמות כבעלי CLTI3. הסימפטומים משתנים בין חולים עם ABIs דומים בהתאם לפעילות היומיומית, עמידות שרירים לאיסכמיה, וריאציות אנטומיות, והבדלים בהתפתחות בטחונות4. נמק ספרות וגפיים הוא הביטוי החמור ביותר של כל מחלות אוטם כלי הדם הגורמות CLTI. זהו סוג של נמק יבש שחונט את הרקמות הרכות. בנוסף PAD טרשת עורקים, זה יכול להיות נצפה גם בחולים עם סוכרת, vasculitides כגון מחלת Buerger ואת התופעה של Raynaud, או calciphylaxis בהגדרה של מחלת כליות סופנית5,6.
מספר מודלים פרה קליניים פותחו כדי לחקור את הפתוגנזה של PAD / CLTI ולבדוק את היעילות של טיפולים פוטנציאליים, הנפוץ שבהם נשאר איסכמיה אחורית עכבר. גרימת איסכמיה אחורית בעכברים מושגת בדרך כלל על ידי חסימת זרימת הדם מעורקי הכף או הירך, בין אם על ידי קשירת תפר, אלקטרו-קרישה או אמצעים אחרים של כיווץ הכלי הרצוי7. טכניקות אלה מפחיתות באופן דרסטי זלוף לחלק האחורי וממריצות את הניאווסקולריזציה בשרירי הירך והשוק. עם זאת, ישנם הבדלים חיוניים תלויי זן מורין ברגישות לעלבון איסכמי חלקית בשל הבדלים אנטומיים בהתפלגות בטחונות8,9. לדוגמה, עכברי C57BL/6 עמידים יחסית לאיסכמיה אחורית, ומדגימים תפקוד גפיים מופחת אך בדרך כלל אין ראיות לנמק בפנקס הרגליים. מצד שני, לעכברי BALB/c יש יכולת ירודה מטבעה להתאושש מאיסכמיה ובדרך כלל לפתח קטיעה אוטומטית של כף הרגל או הרגל התחתונה בעקבות קשירת עורק הירך בלבד. תגובה חמורה זו לאיסכמיה מצמצמת את החלון הטיפולי ויכולה למנוע הערכה אורכית של רפרטפוז ותפקוד הגפיים. מעניין, הבדלים גנטיים לוקוס תכונה כמותית אחת הממוקם על כרומוזום מורין 7 היו מעורבים אלה רגישות דיפרנציאלית של C57BL / 6 ו BALB / c עכברים נמק רקמות ו reperfusion גפיים10.
בהשוואה לזני C57BL/6 ו- BALB/c, עכברי FVB מדגימים תגובה בינונית אך לא עקבית לקשירת עורק הירך בלבד. בעלי חיים מסוימים מפתחים נמק משטח כף הרגל בצורה של מסמרים איסכמיים שחורים או ספרות חנוטות, אך אחרים ללא כל סימנים גלויים של איסכמיה11. ניהול בו זמנית של Nω-Nitro-L-ארגנין מתיל אסתר הידרוכלוריד (L-NAME), מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (NOS)12, מונע מנגנוני vasodilatory מפצה ומגביר עוד יותר את הלחץ החמצוני ברקמה האחורית. בשילוב עם קשירת עורק הירך או קרישה, גישה זו מייצרת בעקביות אובדן רקמת משטח כף הרגל בעכברים FVB הדומה לשינויים הנטרופיים של CLTI אך לעתים רחוקות מתקדם לכריתת איברים אוטומטית11. עקה חמצונית היא אחד מסימני ההיכר של PAD / CLTI והוא מופץ על ידי תפקוד לקוי של אנדותל וזמינות ביולוגית מופחתת של תחמוצת החנקן (NO)13,14. NO היא מולקולה פלוריפוטנטית שבדרך כלל מפעילה השפעות מועילות על זרימת דם עורקית ונימית, הידבקות טסיות דם וצבירה, וגיוס לויקוציטים והפעלה13. רמות מופחתות של NOS הוכחו גם להפעיל את האנזים ממיר אנגיוטנסין, אשר גורם סטרס חמצוני ומאיץ את ההתקדמות של טרשת עורקים15.
ברגע שנוצר מודל של איסכמיה אחורית, ניטור ריפוזיון הגפיים הבאים ואת ההשפעה הטיפולית של כל טיפולים פוטנציאליים נדרשים גם. במודל נמק מורין המוצע, ניתן לכמת תחילה את מידת אובדן הרקמות באמצעות ציון פייבר כדי להעריך את המראה הגס של כף הרגל (0: נורמלי, 1-5: אובדן מסמרים שבהם הציון מייצג את מספר הציפורניים המושפעות, 6-10: ניוון של ספרות שבהן הציון מייצג את מספר הספרות המושפעות, 11-12: ניוון חלקי ומלא כף הרגל, בהתאמה)9. מדידות כמותיות של זלוף אחורי נעשות בדרך כלל באמצעות LDPI, המסתמך על אינטראקציות דופלר בין אור לייזר לתאי דם אדומים כדי לציין זלוף ברמת הפיקסל באזור מעניין (ROI)16. בעוד שטכניקה זו היא כמותית, לא פולשנית ואידיאלית למדידות חוזרות ונשנות, היא אינה מספקת פירוט אנטומי פרטני של כלי הדם האחוריים16. שיטות הדמיה אחרות, כגון טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT), אנגיוגרפיה של תהודה מגנטית (MRA) ומיקרואנגיוגרפיה של קרני רנטגן, מוכיחות יקרות, דורשות מכשור מתוחכם, או מאתגרות מבחינה אחרת מבחינה טכנית16. בשנת 2008, Li et al. תיאר טכניקה לתיוג כלי דם בתוך הרשתית עם צבע קרבוציאנין ליפופילי DiI17. DiI משתלב בתאי אנדותל, ועל ידי דיפוזיה ישירה, כתמים מבני קרום כלי דם כגון נבטים אנגיוגניים ותהליכים פסאודופודיים17,18. בשל המסירה הישירה שלה לתאי אנדותל ואופי פלואורסצנטי מאוד של הצבע, הליך זה מספק תיוג אינטנסיבי וארוך טווח של כלי הדם. בשנת 2012, בודן ואח ' התאים את הטכניקה של זלוף DiI למודל איסכמיה אחורית מורין באמצעות הדמיה הר שלם של שרירי תוספת הירך שנקטפו בעקבות קשירת עורק הירך19.
השיטה הנוכחית מספקת דרך זולה יחסית וישימה מבחינה טכנית להערכת ניאווסקולריזציה בתגובה לאיסכמיה אחורית וטיפולים מבוססי גנים או תאים. בהסתגלות נוספת, פרוטוקול זה מתאר את היישום של זלוף DiI כדי לדמות את כלי הדם של משטח כף הרגל ברזולוציה גבוהה ותלת-ממד במודל מורין של נמק אחורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת מיאמי (IACUC). עכברי FVB, גברים ונשים כאחד, בגילאי 8-12 שבועות, שימשו למחקר.
1. הכנת פתרון L-NAME
- בתנאים סטריליים במכסה המנוע של זרימה למינארית, הכינו פתרון מלאי L-NAME על ידי המסת 1 גרם אבקת L-NAME (ראו טבלת חומרים) עם 20 מ"ל של מים סטריליים ליצירת תמיסה של 50 מ"ג/מ"ל. לאחסן את פתרון המלאי ב 300-500 μL aliquots ב -20 °C (60 °F) עד 3 חודשים.
- כדי ליצור פתרון L-NAME עובד, להפשיר aliquot של פתרון מלאי L-NAME ולדלל עם PBS (1:4) בתנאים סטריליים כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל.
- כדי להכין PBS (pH 7.4), להמיס 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na2HPO4, ו 0.23 גרם של NaH2PO4 ב 800 מ"ל של מים מזוקקים. כווננו את רמת החומציות ל-7.4 עם HCl. הוסיפו מים לנפח כולל של 1,000 מ"ל וסיננו דרך מסנן עליון של בקבוק בגודל 0.22 מיקרומטר.
הערה: הזרקה תוך-אפריטונית (IP) של 4 μL/g של פתרון עבודה מסוג L-NAME שקולה למינון הרצוי של 40 מ"ג/ק"ג/ק"ג של L-NAME. פתרון עבודה L-NAME צריך להישמר על קרח במהלך השימוש, ודילולים חדשים צריכים להיעשות מדי יום באמצעות aliquots מופשר טרי של פתרון מלאי.
2. אינדוקציה כימית וניתוחית של נמק אחורי
- להשיג עכברי FVB, בגילאי 8-12 שבועות, או ממגדל או bred במתקן (ראה טבלת חומרים). 2 שעות לפני הניתוח, לנהל מינון IP 40 מ"ג/ק"ג של L-NAME.
- עכברים מרדימים עם הזרקת IP של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג של קסילאזין (ראו טבלת חומרים) מדוללים ב-PBS. אשר הרגעה נאותה על ידי היעדר רפלקס צביטת בוהן ולהמשיך ניטור קצב הנשימה במהלך ההליך.
- יש להסיר את השיער מהידיים האחוריים והמפשעות הדו-צדדיים באמצעות מזמרה ו/או קרם דפילטורי. מקם את החיה תחת מיקרוסקופ כירורגי supine; להרחיב ולהדביק את הגפיים במקום. לחטא את השדה הכירורגי על ידי החלת היקף פתרון povidone-יוד לאתר הניתוח.
- תחת הגדלה של פי 10-20, השתמש במספריים או באזמל כדי לבצע חתך של 1 ס"מ לאורך קמט המפשעה רק נחות מהרצועה המפשעתית. השתמשו במלקחיים עדינים ובמוליך קצה כותנה סטרילי כדי לנתח בבוטות את כרית השומן המפשעתית לרוחב מהרצועה המפשעתית ולחשוף את נדן הירך הבסיסי, כך שעורק הירך, הווריד והעצב מזוהים בבירור (איור 1).
- בעזרת מלקחיים עדינים, חודרים את נדן הירך. בזהירות לצחצח את עצב הירך הרחק מעורק הירך. זהה את ההמראה של ענף ההקפה לרוחב של עורק הירך (LCFA) עמוק לעצב הירך (איור 1).
- המשך עם electrocoagulation של עורק הירך הווריד רק קרוב LCFA על ידי הפעלת מכשיר הצריבה (ראה טבלת חומרים) ויצירת קשר בעדינות עם כלי הדם בתנועה מצד לצד, להבטיח כי עצב הירך מבודד היטב ונשאר מוגן מפני פגיעה תרמית. חלקו את מקטע כלי הדם הקרוש במספריים.
- המשך עם החשיפה של עורק הירך דיסטלי וריד על ידי גיוס כרית השומן מפשעתית באופן בינוני. זהה את העורק האפיגסטרי השטחי ואת צומת saphenopopliteal יותר distally.
- לנקב את נדן הירך בין שני מקומות אלה ולנתח בזהירות את עצב הירך הרחק מכלי הירך. המשך עם קרישה והעברה של עורק הירך וריד הירך כמתואר בשלב 2.4.1.
- להשקות את השדה כירורגי באמצעות מזרק מלא PBS סטרילי. להשיג hemostasis על ידי החלת לחץ עדין עם אפליקטור קצה כותנה במשך 3-5 דקות לכל אזורים של דימום.
- המשך עם סגירת החתך באמצעות תפר 5-0 נספג בצורה רציפה פשוטה. תן מנה תת עורית של 1 מ"ג/ק"ג של buprenorphine בשחרור מתמשך (ראה טבלת חומרים) להקלה על הכאב לאחר הניתוח.
- אשר אובדן זלוף משטח כף הרגל באחוריים הקשורים על ידי LDPI (ראה טבלת חומרים). בעוד עדיין מורדם, למקם את החיה על כרית קצף כהה במצב נוטה מתחת למכונת LDPI ולהשתמש לולאות של סרט חשמלי כדי לאבטח את הרגליים במקום.
- המשך עם LDPI של רגליים דו-צדדיות. לאחר השלמת הסריקה, צייר החזר השקעה סביב כל משטח כף רגל וקבל את ערכי השטף הממוצעים.
- חשב את מדד הזלוף כיחס בין ערכי השטף הממוצעים ממשטח הרגליים הקשור למשטח שאינו קשור. ודא שמדד הזלוף קטן מ- 0.1.
- העבר את החיה בחזרה לכלוב נקי עם כרית חימום או מנורה תקורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הליבה. ודאו החלמה מלאה מהרדמה לפני העברת עכברים בחזרה למתקן לבעלי החיים.
3. ניהול לאחר הניתוח של L-NAME וניטור של נמק אחורי
- בימים שלאחר הניתוח 1-3, לנהל תוספת של 40 מ"ג/ק"ג מינון IP של L-NAME לכל בעל חיים. יחד עם זאת, להעריך בזהירות את כף הרגל מן האיבר האיסכמי.
- לכמת את מידת האיסכמיה והנמק האחוריים באמצעות ציון איסכמיה הינדימב של פייבר9. ציונים 1-5: מספר מסמרים איסכמיים; ציונים 6-10: 1-5 ספרות איסכמיות; ציונים 11 ו -12: ניוון רגל חלקי ומלא. הקלט ציוני פייבר בימים שלאחר הניתוח 1-3 ולאחר מכן שבועי.
4. הכנת DII ופתרונות עבודה לתזוזת בעלי חיים
- להכנת פתרון מלאי DiI, יש להמיס 100 מ"ג גבישי DiI (ראו טבלת חומרים) ב-16.7 מ"ל של 100% אתנול. מכסים בנייר אלומיניום ומשאירים על משטח נדנדה למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר.
- כדי להכין את הדילול, להמיס 50 גרם של גלוקוז ב 1,000 מ"ל של מים מזוקקים כדי להניב פתרון גלוקוז 5%. סנן באמצעות מסנן עליון של בקבוק 0.22 מיקרומטר. ערבבו פתרונות PBS ו-5% גלוקוז ביחס של 1:4 כדי להכין פתרון דילול עבודה.
5. התקנת ציוד וזלוף DiI
- הפוך פתרון עבודה DiI על ידי הוספת 200 μL של פתרון מלאי DiI ל 10 מ"ל של פתרון דילול עובד (מוכן בשלב 4.2) מיד לפני השימוש. לחץ ביד כדי לערבב היטב.
- חבר שניים או שלושה עצירות תלת-כיווניות ומחט פרפר 25 גרם בסדרה. הכינו מזרקים של 10 מ"ל עם 4 מ"ל של PBS, 10 מ"ל של פתרון DiI ו-10 מ"ל של 10% פורמלין ניטרלי עם חוצץ (ראו טבלת חומרים).
- חבר את המזרק עם פורמלין ליציאת הזרימה הפרוקסימלית והזריק את הפתרון לשטיפת אוויר מהקו; סובב את העצירה כדי לסגור את הנמל. חזור על אותו הליך ברצף, חיבור המזרקים עם DiI ולאחר מכן PBS ליציאות הזרימה האמצעית והדיסטלית, בהתאמה, תוך הקפדה לשטוף את כל בועות האוויר דרך הרכבת stopcock.
הערה: ודא כי אין בועות אוויר בחלק כלשהו של הרכבת stopcock או צינורות. בועות אוויר יכולות לחסום עורקים קטנים במהלך זלוף וכתוצאה מכך הפצת DiI תוך וסקולרית לקויה ותוצאות הדמיה נפגעות. - לאחר השלמת ההתקנה, להרדים את החיה על ידי מנת יתר CO2 בתא אינדוקציה.
- מניחים את החיה להיות perfused במצב supine על כרית סופגת ו axillae מאובטח וגפיים תחתונות עם מחטים.
- באמצעות מספריים, לעשות חתך רוחבי כדי לפתוח את חלל הבטן. לחשוף ולאחר מכן לחלק את הסרעפת השמאלית והימנית כדי לגשת לחלל בית החזה.
- חותכים את דופן החזה משני צדי עצם החזה מהצלעות התחתונות לצלע הראשונה או השנייה, תוך הימנעות מעורקי בית החזה הפנימיים (החלביים) באופן בינוני. השתמש בהמוסטט (ראה טבלת חומרים) כדי לתפוס את הקצה התחתון של עצם החזה ולשקף אותו לכיוון ראשו של בעל החיים כדי לחשוף את חלל בית החזה.
- זהה את החדר השמאלי, שנראה בהיר יותר בצבעו מאשר החדר הימני. לאחוז בעדינות את הלב עם מלקחיים קהים ולהכניס את מחט הפרפר לחדר השמאלי.
- השתמש במספריים או מחט 18 גרם כדי לנקב את האטריום הנכון, ומאפשר פתרונות דם וזלוף לחזור ללב לנקז. לייצב את המחט עם יד אחת או שתיים, תוך הקפדה שלא לנקב בשוגג את החדר הימני ולפרוע את ריאתי ולא מחזור מערכתי.
- פתחו את היציאה למזרק עם PBS והזריקו ידנית 2-4 מ"ל בקצב של 1-2 מ"ל/דקה למשך 1-2 דקות כדי לשטוף דם ממערכת כלי הדם. להבטיח זלוף מוצלח על ידי התבוננות דימום מן האטריום הימני. לאחר ההזרקה, סגור את היציאה של מזרק PBS.
- פתחו את היציאה למזרק עם DiI והזריקו 5-10 מ"ל בקצב של 1-2 מ"ל/דקה למשך 5 דקות. נטר את האוזניים, האף וכפות הידיים שאמורים להפוך ורודים מעט עם הזרקת פתרון DiI. לאחר ההזרקה, סגור את היציאה של מזרק DiI ולחכות 2 דקות כדי לאפשר שילוב של הצבע לפני הזרקה של קבוע.
- פתחו את הנמל למזרק עם פורמלין והזריקו 5-10 מ"ל בקצב של 1-2 מ"ל/דקה למשך 5 דקות. לאחר ההזרקה, להסיר את המחט מהחדר השמאלי ולהמשיך לקצור את רקמות העניין.
- באמצעות מספריים כבדים, לפרוק את השוקה בקרסול, הפרדה מוחלטת את הרגליים השמאלית והימנית מן הרגליים התחתונות. מניחים רגליים שנקטפו בצלחת של 6 או 12 בארות עם 1-2 מ"ל של תמיסת פורמלין של 10%. עוטפים את הצלחת בנייר כסף ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות בלילה.
6. הכנת רקמת משטח כף הרגל למיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלי
- למחרת, החלף את הפתרון המקבע בצלחת של 6 או 12 בארות עם 1-2 מ"ל של PBS לבאר.
- כדי לפשוט את כף הרגל, ראשית, לעשות חתך אורך עם אזמל על ההיבטים plantar ו הגב של כף הרגל. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים שיניים hemostat קטן, להסיר בזהירות את כל העור מכף הרגל וספרות, לא לפגוע ברקמות הרכות הבסיסיות.
- המשך הרכבה והדמיה של רקמות, רצוי בתוך 1-2 ימים של זלוף וקציר. לחלופין, החזירו את משטחי הרגליים לצלחות של 6 או 12 בארות עם 1-2 מ"ל של PBS; לכסות בנייר כסף ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על פלואורסצנטיות עד חודש אחד.
- כדי להרכיב רקמות, למקם בנפרד את הרגליים בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם כרית ביופסיה קצף מקופל על עצמו (פעם או פעמיים בהתאם לעובי הרקמה) בכל קצה (ראה טבלת חומרים). השתמש בשני מהדקי קלסר קטנים כדי לדחוס את שקופיות הזכוכית יחד בכל קצה (עובי סופי כ 1 מ"מ).
הערה: רקמות עבות יותר ידרשו זמני סריקה ארוכים יותר. ניתן לדחוס את לוח הרגליים העור בין שקופיות זכוכית יום אחד לפני ההדמיה כדי להפחית את עובי הרקמה.
7. מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקל
- היכונו למפגש ההדמיה: הפעילו את מערכת ההדמיה והפעילו את תוכנת הרכישה (ראו טבלת חומרים). השתמש במטרה של הגדלה נמוכה/צמצם מספרי נמוך (לדוגמה, x5/0.15) כדי ללכוד תמונות מכיוון שלעדשות הגדלה נמוכות יותר יש בדרך כלל מרחקי עבודה ארוכים יותר הנדרשים לניסוי זה.
- לחץ על כן לתיבת הדו-שיח הפעלת שלב. הפעל את הלייזר 561 ננומטר בכרטיסיה תצורה. במסך הראשי, הפעל נתיב קרן גלוי על-ידי לחיצה על לחצן גלוי . הגדר גלאי לטווח של 570-600 ננומטר על-ידי לחיצה על תיבת הסימון הפעילה המתאימה.
- בחר בסמל סריקת אריחים בכרטיסיה רכישה > והגדר את הרזולוציה הרצויה (512 x 512 x 512 או 1024 x 1024 x 1024).
- מקם דגימת רקמה יבשה (ללא תוספת מים או PBS) דחוסה בין שקופיות זכוכית על במת המיקרוסקופ ומביאה את הרקמה לפוקוס.
- כדי להגדיר את גבולות הסריקה, נווט לפינה השמאלית העליונה או הימנית של המדגם. בכרטיסיה רכישה, תחת תפריט סריקת אריחים, לחץ על לחצן סמן מיקום . נווט לפינה הנגדית (ימינה או שמאלה, בהתאמה) ולחץ שוב על לחצן סמן מיקום .
- כדי להגדיר את עומק מחסנית Z, לחץ על לחצן Live בפינה הימנית התחתונה של המסך ונווט למרכז המדגם. השתמש בידית ציר z כדי לגלול לתחתית המדגם.
- בכרטיסיה רכישה, תחת תפריט Z-Stack, לחץ על לחצן התחל . גלול אל החלק העליון של המדגם ולחץ על לחצן סיום . לחץ על גודל שלב Z והגדר את הערך הרצוי (למשל, 50 מיקרומטר).
- בפינה השמאלית התחתונה של המסך, לחץ על התחל כדי להתחיל ברכישת תמונה.
8. ניתוח כמותי ושחזור תלת מימדי של כלי הדם של משטח כף הרגל
- הורד והתקן את הגרסה העדכנית ביותר של פיג'י (ImageJ) כמו גם את תוסף ניתוח כלי שיט20. פתחו קובצי תמונה מיקרוסקופיים בפיג'י, שישלבו סדרות Z בודדות לערימות Z שניתן להציג בציר z באמצעות המחוון בתחתית התמונה.
- בחרו בתמונת מחסנית Z המורכבת ולאחר מכן, תחת התפריט 'תמונה', בחרו 'ערימות' > Z Project ליצירת הקרנה דו-ממדית. לאחר מכן, המר את הקרנת Z לבינארית תחת תהליך > בינארי > הפוך בינארי.
- הפעל את תוסף צפיפות כלי הדם תחת תוספים > צפיפות כלי הדם. כאשר תתבקש, השתמש בסמן כדי לעקוב אחר החזר השקעה סביב היקף לוח הרגליים והספרות. שימו לב לצפיפות כלי הדם המדווחת, המתבטאת כאחוז מהחזר ההשקעה (שבר באזור כלי הדם).
- ליצירת שחזורים תלת-ממדיים בפיג'י, בחרו 'ערימות' >'פרוייקט תלת-ממדי' והגדירו את ציר הסיבוב, הזווית והמהירות הרצויים מתחת לתפריט 'תמונה'. לחלופין, בחרו ' מציג עוצמת הקול' מתפריט 'תוספים ' כדי להציג תמונות באופן חזותי כפרוסות או לטפל בשחזור בצירים הרצויים.
- לעיבוד תלת-ממדי מעורב יותר, השתמש בתוכנת ניתוח ועיבוד תמונה חלופית (ראה טבלת חומרים). המר קבצים לתבנית התוכנה הרצויה ותפר סריקות אריחים בודדות באמצעות פונקציונליות תפירת האריחים.
- לאחר תפירת סריקות אריחים בודדות יחד, פתח את הקובץ המורכב והמשיך בעיבוד משטח עוצמת הקול. לחץ על הוסף משטח חדש כדי לפתוח את אשף יצירת פני השטח ולהשתמש בחצים כדי לעבור בין תפריטים, ובמיוחד להגדיר את ההחזר על ההשקעה ואת עוצמת הסף. לאחר שמרוצה מעיבוד פני השטח, השתמש בפונקציונליות ההנפשה כדי ליצור סרטוני וידאו של התמונה המעובדת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מפרט אמצעי אמין של גרימת איסכמיה ואובדן רקמות בפנקס הרגליים murine באמצעות שילוב של עורק הירך וקרישת ורידים עם ניהול L-NAME, מעכב סינתאז תחמוצת החנקן, בעכברים FVB רגישים. איור 1 מפרט את האנטומיה של כלי הדם האחוריים של מורין ומציין את האתרים של עורק הירך וקרישת הוורידים (X צהוב), רק בסמיכות לעורק הירך המקיף לרוחב (LCFA) וקרוב לצומת saphenopopliteal. יש לזהות את ה- LCFA, ואתרי הקרישה המתאימים למבנה זה נשמרים עקביים לאורך כל ההליכים הכירורגיים. כפי שתואר, 2 שעות לפני הליכים כירורגיים ובימים שלאחר הניתוח 1-3, עכברים נוהלו גם 40 מ"ג / קילוגרם IP של L-NAME כדי לשמור על רמות רקמות גבוהות של עקה חמצונית. איור 2 מציג את השונות באובדן רקמות שניתן לצפות מהמודל הזה שבוע לאחר הניתוח, כאשר ציוני פייבר9 נרשמו בפינה הימנית התחתונה של כל תמונה.
זלוף DiI בוצע בעכברים FVB ב 5 ו 20 ימים לאחר עורק הירך וקרישת ורידים כדי להעריך reperfusion האחורית בעקבות אינדוקציה של איסכמיה. איור 3A ממחיש את האנטומיה של המורין לאחר הניתוח כדי לחשוף את חלל בית החזה. מחט פרפר מוכנסת לחדר השמאלי כדי להתחיל זלוף לב. שים לב שהחדר השמאלי נראה מעט חיוור יותר בצבעו מאשר החדר הימני. איור 3B מתאר את הציוד שהוקם עם פקקים המחוברים בסדרה ושלושה מזרקים מלאים ב-PBS, פתרון DiI ו-Fixative. לאחר זלוף DiI, כפות הרגליים נקצרו, פשטו את עורן ונדחסו בין שקופיות מיקרוסקופ כפי שמוצג באיור 3C,D לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי תחת הגדלה של פי 5. תמונות מיקרוסקופיות של שחזור חשפו אנטומיה תקינה של כלי הדם במשטח כף הרגל הלא-קשור (איור 4A) בהשוואה לזלוף מופחת קשות למשטח כף הרגל של אחוריים קשורים 5 ימים לאחר הניתוח (איור 4B). עשרים יום לאחר הניתוח, הזלוף למשטח כף הרגל השתפר משמעותית (איור 4C, D ואיור 5B), אם כי לא במידה של שליטה לא קשורה (איור 4A ואיור 5A). כלי הדם היה כימות כמתואר לעיל באמצעות תוסף צפיפות כלי בפיג'י. שבר כלי הדם למשטח הרגליים של הבקרה היה 28%. חמישה ימים לאחר הניתוח, שבר כלי הדם של משטח כף הרגל צומצם מאוד ל -2% אך התאושש בהדרגה ל -15% ו -18% בשני עכברים נפרדים על ידי 20 ימים לאחר הניתוח. כדי לדמיין את האנטומיה של כלי הדם בתלת-ממד, ייבאנו תמונת מיקרוסקופיה תפורה לתוכנת ניתוח ועיבוד תמונה חלופית כדי ליצור עיבוד פני שטח כפי שתואר קודם לכן (איור משלים 1). וידאו של עיבוד פני השטח נוצר לאחר מכן באמצעות פונקציונליות ההנפשה (וידאו 1).
איור 1: האנטומיה של כלי הדם האחוריים של מורין ואתרים של עורק הירך וקרישת הוורידים. עורק הכסל החיצוני ממשיך כעורק הירך (FA) דיסטלי לרצועה המפשעתית. הענפים הראשונים של עורק הירך כוללים את circumflex לרוחב (LCFA) ועורקים ירך עמוקים (לא בתמונה). באופן מזוקק יותר, עצם הירך הפרוקסימלית (PCFA) ועורקים אפיגסטריים שטחיים (SCEA) מסתעפים מה-FA בסמיכות לביפורציה של העורקים הספניים (SA) והפופליטים (PA). עצב הירך (FN) קורסים לצד כלי הירך ויש לבודד אותו בעדינות לפני קרישת כלי הירך. FA ואתרי קרישת וריד הירך (FV) מצוינים גם הם (X). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של נמק אחורי בעכברים FVB עם ציוני פייבר מקבילים. מידת השינויים האיסכמיים הנגרמים על ידי מודל זה משתנה מציפורן איסכמית אחת או יותר (פייבר מקבלת ציון 1-5) לספרות נמקיות (פייבר מקבלת ציונים 6-10) וניוון חלקי או מלא של כף הרגל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביתור בעלי חיים והגדרת ציוד עבור זלוף DiI והרכבת כף רגל העכבר לצורך הדמיה. (א) תצלום אנטומי של האנטומיה של מורין במהלך זלוף DiI. חללי הבטן ובית החזה נפתחים, עצם החזה משתקפת והצלעות נחתכות משני צדי עצם החזה. מחט פרפר במשקל 25 גרם המחוברת להרכבה של סטופקוק מוכנסת לחדר השמאלי. (ב) שלושה עצירות תלת-כיווניות מחוברות בסדרה. שלושה מזרקים של 10 מ"ל מלאים בקיבוע, DiI ו- PBS ומחוברים להרכבה של סטופקוק. מחט פרפר במשקל 25 גרם מחוברת ליציאת היציאה של העצירה הפרוקסימלית. (ג) הרכבה של כף רגל נטויה בין שתי שקופיות מיקרוסקופ עם כרית ביופסיה קצף מקופלת ומהדק קלסר בכל קצה כדי לדחוס את השקופיות יחד. (ד) מבט חלופי על כף הרגל הדחוסה בין שקופיות מיקרוסקופ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות 5x המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית של משטח כף הרגל של העכבר בעקבות זלוף DiI עם צפיפות כלי כימות המתבטאת כאחוז מהחזר ההשקעה. (A) כלי נגינה רגיל למשטח כף הרגל. (B) כלי דם Footpad 5 ימים לאחר עורק הירך וקרישת ורידים מראה זלוף מופחת קשות עם אטימות כלי מינימלית. (ג) כלי דם Footpad 20 ימים לאחר עורק הירך וקרישת ורידים מדגים כמה שחזור של זרימה דיסטלית לעורקים metatarsal ודיגיטלי. (D) תמונה של משטח רגל עכבר נוסף שהושג 20 ימים לאחר עורק הירך וקרישת ורידים מראה כלי גדול מינימלי לעומת אטימות מיקרווסקולרית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות מוגדלות של כלי הדם של משטח כף הרגל. (A) תמונות 5x ו-20x של כלי דם שליטה על משטח כף הרגל המדגימים זלוף שלם דרך העורקים המטטרסליים והדיגיטליים. (B) תמונות 5x ו -20x של משטח כף הרגל מהידיים קשירה 20 ימים לאחר הניתוח מראה זלוף מופחת באמצעות ענפים עורקיים metatarsal גדול יותר אבל פיתוח של רשת נימים נרחבת, קטיפה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: הנפשה של עיבוד משטח 3D של כלי הדם לוח כף הרגל. וידאו המציג עיבוד משטח של כלי הדם של לוח כף הרגל ממחיש את הרזולוציה התלת-ממדית הניתנת להשגה עם הפרוטוקול המתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
איור משלים 1: שלבים בעיבוד פני השטח של תמונות זלוף DiI. (A) תמונת זלוף DiI מקורית המיובאת לתוכנת ניתוח ועיבוד תמונה. (B) עיבוד פני השטח מכוסה בתמונת זלוף DiI במהלך הגדרת עוצמת הסף. (C) עיבוד משטח תלת-ממדי סופי של תמונת מיקרוסקופיה של DiI. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד איסכמיה אחורית עכבר הוא המודל הפרה קליני הנפוץ ביותר ללמוד neovascularization ב PAD ו- CLTI, יש שונות משמעותית חומרת איסכמיה והתאוששות בהתאם לזן העכבר הספציפי המשמש ואת האתר, מספר, ואת השיטה של הפרעה עורקית. השילוב של קשירת עורק הירך וניהול IP של L-NAME יכול באופן אמין לגרום נמק אחורי בעכברים FVB11. אותו טיפול גורם לאיסכמיה אחורית ללא אובדן רקמות בעכברים C57BL/6, ואילו בעכברים BALB /c, קטיעה אוטומטית של כף הרגל או הרגל יכולה להיגרם על ידי קשירת עורק הירך בלבד. ככזה, הטכניקה המתוארת לעיל של קרישת עורק הירך עם ניהול L-NAME בו זמנית בעכברים FVB, אשר יש תגובת ביניים עלבון איסכמיה, מספק מודל ייחודי לשחזור של נמק footpad דומה לזה שנראה בביטוי החמור ביותר של מחלות שמובילות CLTI. מידת אובדן הרקמות שנצפו במודל זה יכולה להשתנות מכמה מסמרים איסכמיים למספר ספרות נמקיות, אך לעתים רחוקות מתקדמת לכריתה אוטומטית של כף הרגל או הרגל, המאפשרת הערכה אורכית של רפרופוזיה ותפקוד של הגפיים. שלא כמו עכברי BALB / c, שבהם הופעת הנמק מהירה עם כריתה אוטומטית של גפיים המתרחשת בדרך כלל בתוך פחות משבוע אחד, יש עיכוב בהופעה של אובדן רקמות במודל נמק עכבר FVB זה. קרישת עורק הירך מגבילה באופן חריף את זרימת הדם לחלק האחורי. עדיין, הצטברות של עקה חמצונית עקב ניהול L-NAME בימים שלאחר הניתוח 0-3 הוא הדרגתי יותר, עם שינויים אטרופיים שיא שנצפו בין 7-14 ימים. לכן, מודל זה מציע חלון טיפולי משופר כדי להעריך את ההשפעות של התערבות מסוימת על מראה הרקמה ברוטו והצלה של אובדן רקמות בנוסף לכימות רפרטפוזיה והערכה של תפקוד הגפיים.
לגבי טכניקה כירורגית, קרישה או קשירה של עורק הירך והווריד הוא מועדף בשל הקלות היחסית של פעולה זו לעומת בידוד של עורק הירך. בעוד טכניקה זו יכולה להוביל פקקת ורידים ואי ספיקה, זה מגביר את העלבון האיסכמי ומסייע לגרום לשינויים נמקים באופן אמין יותר. בנוסף, אי ספיקה ורידית כרונית (CVI) שכיחה מאוד באוכלוסייה הכללית, עם 10%-30% מהמבוגרים שנפגעו. באופן עקבי, כ -20% מהחולים עם PAD, במיוחד אלה עם אי ספיקה עורקית חמורה, יש גם CVI תחלואה 21,22. לא משנה אם מחליטים לשבש או להקריש את וריד הירך, חשוב מאוד לשמור על האתרים הספציפיים של הפרעה בעורק הירך קבוע על פני קבוצות ניסיוניות. קשירות פרוקסימליות יותר, כגון זו של עורק הכזיאק, מובילות לחסימה של בטחונות נוספים במורד הזרם ומגבילים את האפשרות לעורקיים8,16. עם זאת, אנגיוגנזה בחלק הדיסטלי של הגפה, במיוחד שריר gastrocnemius, עדיין צריך להיות מופעל. בעכברים FVB, קשירה כפולה או קרישה של עורק הירך רק קרוב לעורק הירך circumflex לרוחב פרוקסימה פרוקסימלית bifurcation saphenopliteal באופן עקבי יותר גורם נמק מאשר אתר קשירה או קרישה יחיד.
יש לציין כי בחולי PAD ו- CLTI, איסכמיה גפיים נגרמת על ידי חסימה טרשת עורקים (תהליך כרוני). לעומת זאת, במודלים של עכברים, איסכמיה של גפיים מושרה בניתוח (תהליך חריף). למרות זה מודל נמק אחורי עכבר FVB יש התפרצות איטית יחסית של נמק עם חומרת שיא מאוחרת של אובדן רקמות, זה לא ניתן להשוות ישירות עם היצרות עורקים כרונית, מתקדמת האופיינית PAD ו- CLTI. קבוצות אחרות פיתחו טכניקות חסימת עורק הירך התת-קרקעי באמצעות נחשי בריח אמרואידיים המורכבים משרוול מתכת חיצוני ושכבה פנימית של חומר סופג לחות המתרחבת בהדרגה. טכניקה זו הוכח לגרום לירידה בביטוי של סמנים דלקתיים, התאוששות זרימת דם נמוכה ב 4-5 שבועות, ונמק שריר מופחת23,24. מלבד הבדלים בחדות האיסכמיה, מודלים פרה-קליניים המשתמשים בבעלי חיים צעירים ובריאים גם אינם מצליחים לשכפל גורמי סיכון כגון סוכרת, יתר לחץ דם, השמנת יתר, היפרליפידמיה, עישון וזיהום התורמים לאירועי גפיים שליליים גדולים ולנטל מחלות כלי הדם.
ברוב המחקרים של איסכמיה אחורית מורין, שיקום זרימת הדם אל האחורי האיסכמי מוערך בדרך כלל באמצעות LDPI24,25. שיטה זו אינה פולשנית וניתן לחזור עליה, אך יכולה להיות מושפעת מטמפרטורת הגוף המרכזית, שימוש בהרדמה, נוכחות שיער ומיצוב של האחוריים26. סטנדרטיזציה של הליכים אלה ושימוש באחוריים שאינם קשורים כבקרה פנימית יכולים לסייע בהפחתת כל וריאציות. בניגוד ל-LDPI, מיקרו-CT ו-MRA מספקים מידע אנטומי תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה, אך באופן מסורתי דורשים הזרקה של חומר ניגודיות16. מיקרו-אנגיוגרפיה של קרני רנטגן היא גם פולשנית ומאתגרת מבחינה טכנית 16,27. כמו DiI, זלוף עם סוכני יציקת סיליקון radiopaque מאפשר שחזור 3D שלאחר המוות של כלי הדם ההיקפי28. הזרקת תוך לב או וריד זנב של לציטין פלואורסצנטי תוארה גם עבור תיוג של כלי דם רקמות29. לאחר קציר של רקמות מעניינות, כתמים אימונוהיסטוכימיים עם סמנים ספציפיים לאנדותל (למשל, CD31, גורם פון וילברנד) משמש לעתים קרובות לכימות צפיפות נימית30.
בהשוואה לטכניקות שהוזכרו לעיל, זלוף DiI מספק מספר יתרונות. ראשית, הריאגנטים והחומרים הנדרשים הם זולים יחסית, בתנאי שיש גישה למיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. שיטה זו מאפשרת שחזור 3D של כלי הדם, אשר ניתן לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. בעוד פרוטוקול זה מתמקד vasculature משטח כף הרגל, הדמיה הר שלם של רקמות אחוריות מורין אחרות, במיוחד שרירי gastrocnemius ו adductor, הוא גם אפשרי ורלוונטי אנגיוגנזה ו arteriogenesis19 מחקרים. טכניקה זו יכולה להיות שונה עבור מודלים בעלי חיים גדולים יותר, כולל חולדות וארנבות, על ידי הגדלת נפח פתרונות זלוף. עם זאת, אילוצי הדמיה לגבי גודל הרקמה מתוארים להלן.
חלקים קריטיים של זלוף DiI הם כדלקמן. בועות אוויר במנגנון עלולות לחסום כלי שיט קטנים ולעכב את התפלגות DiI בכל כלי הדם, ובכך להשפיע על תוצאות ההדמיה. ככזה, יש לנקוט בזהירות כדי להסיר את כל בועות האוויר במנגנון stopcock צינורות לפני זלוף. מומלץ גם לסנן את כל הפתרונות למעט DiI באמצעות מסנן עליון של בקבוק 0.22 מיקרומטר. במהלך זלוף תוך לבבי, לפקח בקפידה על הריאות. אם הם הופכים מוגדלים והופכים ורודים בצבע, זהו סימן שמחט הפרפר חדרה דרך החדר הימני ויש לחזור בה מעט.
מגבלה חשובה של זלוף DiI היא האופי הסופי של ההליך, אשר אינו מאפשר מדידות חוזרות ונשנות. מכיוון שתוצאות זלוף גרועות עשויות לשקף אי ספיקה עורקית בסיסית או שגיאה טכנית, מומלץ לקצור ולהדמות את האחורי הלא קשור כבקרה פנימית. לגבי הדמיה, עובי רקמות אופטימלי לחדירת לייזר הוא ~ 1 מ"מ לאחר דחיסה. כתוצאה מכך, רקמות גדולות יותר דורשות חלוקה לחתיכות קטנות יותר כדי להיות מותקן על שקופיות ומאוכלס על במת המיקרוסקופ וזמני רכישת תמונה ארוכים יותר באופן יחסי.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר מודל פרה-קליני ייחודי ללימוד PAD ו- CLTI. באופן ספציפי, עורק הירך וקרישת ורידים עם ניהול בו זמנית של L-NAME, מעכב NOS, אמין גורם לאובדן רקמות בפנקסים של עכברי FVB. לאחר המוות, זלוף תוך לבבי DiI משמש לאחר מכן כדי לתייג את כלי הדם פלואורסצנטיים. הדמיה של הרכבה מלאה לאחר מכן של כפות הרגליים שנקטפו עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית מאפשרת שחזור ברזולוציה גבוהה, תלת-ממדית של כלי הדם של משטח כף הרגל והדמיה של רשתות עורקים ונימי המשלימים אמצעים מסורתיים להערכת רפרטפוזיה במודלים איסכמיה אחוריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל- Z-J L ו- OC V מהמכונים הלאומיים לבריאות [R01HL149452 ו- VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. אנו מודים גם למתקן המיקרוסקופיה והדמיה של פרויקט מיאמי לריפוי שיתוק בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מיאמי על מתן גישה לתוכנת ניתוח ועיבוד התמונות שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
