Summary
O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.
Abstract
A doença arterial periférica (PAD) é uma causa significativa de morbidade resultante da exposição crônica a fatores de risco ateroscleróticos. Pacientes que sofrem de sua forma mais grave, isquemia crônica ameaçadora de membros (CLTI), enfrentam prejuízos substanciais para a vida diária, incluindo dor crônica, distância de caminhada limitada sem dor e feridas não ogêsicas. Modelos pré-clínicos foram desenvolvidos em vários animais para estudar PAD, mas a isquemia de pândico do rato continua sendo a mais utilizada. Pode haver variação significativa na resposta ao insulto isquêmico nesses modelos, dependendo da cepa do mouse usada e do site, número e meios de interrupção arterial. Este protocolo descreve um método único que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de óxido nítrico (NOS) para induzir de forma confiável gangrena de footpad em camundongos Friend Virus B (FVB) que se assemelha à perda de tecido de CLTI. Enquanto os meios tradicionais de avaliação da reperfusão, como a imagem de perfusão de doppler laser (LDPI) ainda são recomendados, a perfusão intracardiac do corante lipofílico 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) é usada para rotular a vasculatura. A microscopia de varredura a laser confocal subsequente permite a reconstrução de redes vasculares de alto nível (3D) de alta resolução tridimensional (3D) que complementa os meios tradicionais de avaliar a reperfusão em modelos de isquemia hindlimb.
Introduction
A doença arterial periférica (PAD), caracterizada pela redução do fluxo sanguíneo para as extremidades devido à aterosclerose, afeta 6,5 milhões de pessoas nos Estados Unidos e 200 milhões de pessoas em todo o mundo1. Pacientes com PAD experimentam função reduzida dos membros e qualidade de vida, e aqueles com CLTI, a forma mais grave de PAD, estão em risco aumentado de amputação e morte com uma taxa de mortalidade de 5 anos próxima de 50%2. Na prática clínica, são considerados pacientes com índices de tornozelo-braquial (ABI) <0,9, sendo aqueles com ABI <0,4 associados à dor de repouso ou perda de tecido como tendo CLTI3. Os sintomas variam entre pacientes com IIS semelhantes dependendo da atividade diária, tolerância muscular à isquemia, variações anatômicas e diferenças no desenvolvimento colateral4. A gangrena de dígitos e membros é a manifestação mais grave de todas as doenças oclusivas vasculares que resultam em CLTI. É uma forma de necrose seca que mumifica os tecidos moles. Além do PAD aterosclerótico, também pode ser observado em pacientes com diabetes, vasculitídeos como a doença de Buerger e o fenômeno de Raynaud, ou calcifilaxia no cenário da doença renal em estágio terminal5,6.
Vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos para estudar a patogênese do PAD/CLTI e testar a eficácia de tratamentos potenciais, sendo o mais comum a isquemia de pêblico posterior do camundongo. Induzir isquemia de retrocessão em camundongos é tipicamente realizada pela obstrução do fluxo sanguíneo das artérias ilíacas ou femorais, seja por ligadura de sutura, eletrocoagulação ou outros meios de constrição do vaso desejado7. Essas técnicas reduzem drasticamente a perfusão ao retrocesso e estimulam a neovascularização nos músculos da coxa e da panturrilha. No entanto, existem diferenças essenciais de sensibilidade à sensibilidade isquêmica ao insulto isquêmico parcialmente devido a diferenças anatômicas na distribuição colateral8,9. Por exemplo, os camundongos C57BL/6 são relativamente resistentes à isquemia hindlimb, demonstrando função reduzida do membro, mas geralmente não há evidência de gangrena no footpad. Por outro lado, os camundongos BALB/c têm uma capacidade inerentemente ruim de se recuperar da isquemia e normalmente desenvolvem auto-amputação do pé ou perna inferior após a ligadura da artéria femoral sozinho. Esta resposta severa à isquemia estreita a janela terapêutica e pode impedir a avaliação longitudinal da reperfusão e função dos membros. Curiosamente, as diferenças genéticas em um único locus de traço quantitativo localizado no cromossomo murine 7 foram implicadas nessas suscetibilidades diferenciais de camundongos C57BL/6 e BALB/c à necrose tecidual e reperfusão de membros10.
Em comparação com as cepas C57BL/6 e BALB/c, os camundongos FVB demonstram uma resposta intermediária, mas inconsistente, apenas à ligadura da artéria femoral. Alguns animais desenvolvem gangrena de footpad na forma de unhas isquêmicas pretas ou dígitos mumificados, mas outros sem qualquer sinal de isquemia11. Administração concomitante de Cloridrato de Éster de Élíste de Metila Nω-Nitro-L-arginina (L-NAME), um inibidor de sintetizador de óxido nítrico (NOS)12, previne mecanismos vasodilatários compensatórios e aumenta ainda mais o estresse oxidativo no tecido hindlimb. Em combinação com ligação ou coagulação da artéria femoral, esta abordagem produz consistentemente perda de tecido de footpad em camundongos FVB que se assemelha às alterações atroficas de CLTI, mas raramente progride para auto-amputação de membros11. O estresse oxidativo é uma das marcas do PAD/CLTI e é propagado por disfunção endotelial e biodisponibilidade diminuída de óxido nítrico (NO)13,14. NO é uma molécula pluripotente que geralmente exerce efeitos benéficos sobre o fluxo sanguíneo arterial e capilar, a adesão e agregação de plaquetas, e recrutamento e ativação de leucócitos13. Níveis reduzidos de NOS também têm sido mostrados para ativar a enzima conversora de angiotensina, que induz o estresse oxidativo e acelera a progressão da aterosclerose15.
Uma vez estabelecido um modelo de isquemia de escalada posterior, também são necessários monitorar a reperfusão subsequente do membro e o efeito terapêutico de quaisquer tratamentos potenciais. No modelo de gangrena murina proposto, o grau de perda de tecido pode ser quantificado primeiro usando a pontuação de Faber para avaliar o aparecimento bruto do pé (0: normal, 1-5: perda de pregos onde a pontuação representa o número de pregos afetados, 6-10: atrofia de dígitos onde a pontuação representa o número de dígitos afetados, 11-12: atrofia parcial e completa do pé, respectivamente)9. As medições quantitativas da perfusão de limbo hind são então tipicamente feitas usando LDPI, que se baseia em interações do Doppler entre luz laser e glóbulos vermelhos para indicar perfusão em nível de pixel em uma região de interesse (ROI)16. Embora esta técnica seja quantitativa, não invasiva e ideal para medições repetidas, ela não fornece detalhes anatômicos granulares da vasculatura hindlimb16. Outras modalidades de imagem, como tomografia microcomputante (micro-TC), angiografia de ressonância magnética (MRA) e microangiografia de raios-X, se mostram dispendidas, exigindo instrumentação sofisticada ou tecnicamente desafiadora16. Em 2008, Li et al. descreveram uma técnica para rotular vasos sanguíneos dentro da retina com o corante lipofílico de carbocianina DiI17. O DII incorpora em células endoteliais e, por difusão direta, mancha estruturas de membrana vascular, como brotos angiogênicos e processos pseudopodais17,18. Devido à sua entrega direta em células endoteliais e à natureza altamente fluorescente do corante, este procedimento fornece rotulagem intensa e duradoura dos vasos sanguíneos. Em 2012, Boden et al. adaptaram a técnica de perfusão dii ao modelo de isquemia de hindlimb murina através de imagens de montagem integral dos músculos adutores da coxa colhidas após a ligadura da artéria femoral19.
O método atual fornece uma maneira relativamente barata e tecnicamente viável para avaliar a neovascularização em resposta à isquemia de liminar e terapêuticas baseadas em genes ou células. Em outra adaptação, este protocolo descreve a aplicação da perfusão diI à imagem da vasculatura do bloco de pés em alta resolução e 3D em um modelo murino de gangrena hindlimb.
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Protocol
Todos os experimentos em animais descritos no protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Miami (IACUC). Foram utilizados no estudo camundongos FVB, tanto do sexo masculino quanto do feminino, com idade entre 8 e 12 semanas.
1. Preparação da solução L-NAME
- Em condições estéreis em uma capa de fluxo laminar, prepare uma solução de estoque L-NAME dissolvendo 1g de pó L-NAME (ver Tabela de Materiais) com 20 mL de água estéril para fazer uma solução de 50 mg/mL. Armazene a solução de estoque em alíquotas de 300-500 μL a -20 °C por até 3 meses.
- Para fazer uma solução L-NAME em funcionamento, descongele uma alíquota da solução de estoque L-NAME e dilua-se com PBS (1:4) em condições estéreis para obter uma concentração final de 10 mg/mL.
- Para preparar PBS (pH 7.4), dissolva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,23 g de NaH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajuste o pH para 7,4 com HCl. Adicione água a um volume total de 1.000 mL e filtre através de um filtro superior de garrafa de 0,22 μm.
NOTA: A injeção intraperitoneal (IP) de 4 μL/g de solução de trabalho L-NAME equivale à dose desejada de 40 mg/kg de L-NAME. A solução de trabalho L-NAME deve ser mantida no gelo durante o uso, e novas diluições devem ser feitas diariamente usando alíquotas recém-descongeladas de solução de estoque.
2. Indução química e cirúrgica de gangrena de subida traseira
- Obtenha camundongos FVB, com idade entre 8 e 12 semanas, seja de um criador ou criados in-facility (ver Tabela de Materiais). 2 h antes da cirurgia, administre uma dose IP de 40 mg/kg de L-NAME.
- Camundongos anestesiados com injeção IP de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina (ver Tabela de Materiais) diluídos em PBS. Confirme a sedação adequada pela ausência de reflexo do dedo do dedo do dedo e continue monitorando a taxa respiratória durante o procedimento.
- Remova o cabelo de berços bilaterais e virilhas usando tesouras e/ou um creme depilatório. Posicione o animal sob uma supina de microscópio cirúrgico; estender e gravar as extremidades no lugar. Esterilize o campo cirúrgico aplicando circunferencialmente a solução povidone-iodo ao local cirúrgico.
- Sob ampliação de 10-20x, use uma tesoura ou um bisturi para fazer uma incisão de 1 cm ao longo da linha da virilha apenas inferior ao ligamento inguinal. Use fórceps finos e um aplicador de ponta de algodão estéril para dissecar sem rodeios a almofada de gordura inguinal lateralmente do ligamento inguinal e expor a bainha femoral subjacente para que a artéria femoral, veia e nervo sejam claramente identificados (Figura 1).
- Usando fórceps finos, fure a bainha femoral. Escove cuidadosamente o nervo femoral da artéria femoral. Identifique a decolagem do ramo circunflexo lateral da artéria femoral (LCFA) profundamente ao nervo femoral (Figura 1).
- Prossiga com a eletrocoagulação da artéria femoral e da veia apenas proximal à LCFA ativando o dispositivo cautery (ver Tabela de Materiais) e entrando em contato suavemente com os vasos com um movimento lateral-a-lado, garantindo que o nervo femoral esteja bem isolado e permaneça protegido contra lesões térmicas. Divida o segmento de vaso coagulado com uma tesoura.
- Prossiga com a exposição da artéria femoral distal e da veia, mobilizando a almofada de gordura inguinal mediadamente. Identifique a artéria epigástrica superficial e a junção saphenopopliteal de forma mais distral.
- Furar a baia femoral entre esses dois locais e dissecar cuidadosamente o nervo femoral longe dos vasos femorais. Proceder com coagulação e transeção da artéria femoral e veia conforme descrito na etapa 2.4.1.
- Irrigar o campo cirúrgico usando uma seringa cheia de PBS estérei. Obtenha hemostasia aplicando pressão suave com um aplicador de ponta de algodão por 3-5 min para quaisquer áreas de sangramento.
- Proceda com o fechamento da incisão usando sutura 5-0 absorvível de forma simples e contínua. Administre uma dose subcutânea de 1 mg/kg de buprenorfina de liberação sustentada (ver Tabela de Materiais) para alívio da dor pós-operatório.
- Confirme a perda da perfusão do footpad no bloco traseiro ligado pelo LDPI (ver Tabela de Materiais). Enquanto ainda anestesiado, coloque o animal em uma almofada de espuma escura em uma posição propensa sob a máquina LDPI e use laços de fita elétrica para fixar os pés no lugar.
- Prossiga com LDPI de pés bilaterais. Uma vez que a varredura esteja completa, desenhe um ROI em torno de cada footpad e obtenha os valores médios de fluxo.
- Calcule o índice de perfusão como a razão dos valores médios de fluxo do footpad ligado para o não ligado. Certifique-se de que o índice de perfusão seja inferior a 0,1.
- Transfira o animal de volta para uma gaiola limpa com uma almofada de aquecimento ou lâmpada aérea para manter a temperatura corporal do núcleo. Certifique-se de recuperação completa da anestesia antes de transferir os ratos de volta para a instalação animal.
3. Administração pós-operatória de L-NAME e monitoramento de gangrena hindlimb
- Nos dias pós-operatórios 1-3, administre uma dose IP adicional de 40 mg/kg de L-NAME para cada animal. Ao mesmo tempo, avalie cuidadosamente o pé do membro isquêmico.
- Quantifique o grau de isquemia de subida e gangrena usando o resultado de isquemia de subida de Faber9. Pontuações 1-5: número de pregos isquêmicos; pontuações 6-10: 1-5 dígitos isquêmicos; pontuações 11 e 12: atrofia parcial e completa do pé. Recorde faber pontuações nos dias pós-operatórios 1-3 e, em seguida, semanalmente.
4. Preparação de DI E soluções de trabalho para perfusão animal
- Para preparar a solução de estoque dii, dissolva 100 mg de cristais DiI (ver Tabela de Materiais) em 16,7 mL de 100% etanol. Cubra em papel alumínio e deixe em uma plataforma de balanço durante a noite no escuro à temperatura ambiente.
- Para preparar o diluente, dissolva 50 g de glicose em 1.000 mL de água destilada para produzir uma solução de glicose de 5%. Filtre através de um filtro superior de garrafa de 0,22 μm. Misture PBS e 5% de soluções de glicose em uma proporção de 1:4 para preparar uma solução diluída em funcionamento.
5. Configuração do equipamento e perfusão diI
- Faça a solução de trabalho DiI adicionando 200 μL de solução de estoque DiI a 10 mL da solução diluente de trabalho (preparada na etapa 4.2) imediatamente antes do uso. Aperte à mão para misturar bem.
- Conecte duas ou três torneiras de 3 vias e uma agulha borboleta de 25 G em série. Prepare 10 mL de seringas com 4 mL de PBS, 10 mL de solução DiI e 10 mL de formalina tamponada 10% neutra (ver Tabela de Materiais).
- Conecte a seringa com formalina à porta de entrada proximal e injete a solução para liberar o ar da linha; virar a torneira para fechar o porto. Repita o mesmo procedimento sequencialmente, conectando as seringas com DiI e, em seguida, PBS aos portos de entrada média e distal, respectivamente, tomando o cuidado de lavar todas as bolhas de ar através do conjunto de torneiras.
NOTA: Certifique-se de que não há bolhas de ar em qualquer parte do conjunto de torneiras ou tubos. Bolhas de ar podem ocluir pequenas artérias durante a perfusão, resultando em má distribuição intravascular do DII e resultados de imagem comprometidos. - Uma vez que a configuração esteja completa, eutanize o animal por overdose de CO2 em uma câmara de indução.
- Coloque o animal a ser perfumado em uma posição supina em uma almofada absorvente e fixar axilas e extremidades inferiores com agulhas.
- Usando uma tesoura, faça uma incisão transversal para abrir a cavidade abdominal. Exponha e divida o diafragma esquerdo e direito para acessar a cavidade torácica.
- Corte a parede torácica em ambos os lados do esterno das costelas inferiores para a primeira ou segunda costelas, evitando as artérias torácicas internas (mamárias) mediadamente. Use um hemosta (ver Tabela de Materiais) para agarrar a extremidade inferior do esterno e refleti-la em direção à cabeça do animal para expor a cavidade torácica.
- Identifique o ventrículo esquerdo, que aparece em cores mais claras que o ventrículo direito. Segure suavemente o coração com fórceps sem cortes e insira a agulha borboleta no ventrículo esquerdo.
- Use uma tesoura ou uma agulha de 18 G para perfurar o átrio direito, permitindo que soluções de sangue e perfusão retornem ao coração para drenar. Estabilize a agulha com uma ou duas mãos, tomando cuidado para não perfurar inadvertidamente o ventrículo direito e perfure o pulmão em vez de circulação sistêmica.
- Abra a porta para a seringa com PBS e injete manualmente 2-4 mL a uma taxa de 1-2 mL/min por 1-2 min para retirar o sangue do sistema vascular. Garanta a perfusão bem sucedida observando o sangramento do átrio direito. Após a injeção, feche a porta da seringa PBS.
- Abra a porta para a seringa com DiI e injete 5-10 mL a uma taxa de 1-2 mL/min por 5 min. Monitore as orelhas, nariz e palmas que devem ficar ligeiramente rosados com a injeção de solução DiI. Após a injeção, feche a porta da seringa DiI e espere por 2 minutos para permitir a incorporação do corante antes da injeção de fixação.
- Abra a porta para a seringa com formalina e injete 5-10 mL a uma taxa de 1-2 mL/min por 5 min. Após a injeção, remova a agulha do ventrículo esquerdo e proceda à colheita dos tecidos de interesse.
- Usando uma tesoura pesada, desloque a tíbia no tornozelo, separando completamente os pés esquerdo e direito das pernas inferiores. Coloque os pés colhidos em uma placa de 6 ou 12 poços com 1-2 mL de solução de 10% formalina. Enrole a placa com papel alumínio e guarde a 4 °C durante a noite.
6. Preparação de tecido de footpad para microscopia de varredura a laser confocal
- No dia seguinte, substitua a solução fixativa em placa de 6 ou 12 poços por 1-2 mL de PBS por poço.
- Para esfolar o pé, primeiro, faça uma incisão longitudinal com um bisturi nos aspectos plantar e dorsal do pé. Em seguida, usando fórceps dentudos e um pequeno hemostato, remova cuidadosamente toda a pele do pé e dos dígitos, não danificando os tecidos moles subjacentes.
- Proceda à montagem e imagem dos tecidos, preferencialmente dentro de 1-2 dias de perfusão e colheita. Alternativamente, retorne os footpads para placas de 6 ou 12 poços com 1-2 mL de PBS; cobrir com papel alumínio e armazenar a 4 °C para manter a fluorescência por até 1 mês.
- Para montar tecidos, coloque individualmente os pés entre dois slides de microscópio de vidro com uma almofada de biópsia de espuma dobrada sobre si mesma (uma ou duas vezes dependendo da espessura do tecido) em cada extremidade (ver Tabela de Materiais). Use dois pequenos clipes de aglutinante para comprimir os slides de vidro juntos em cada extremidade (espessura final aproximadamente 1 mm).
NOTA: Tecidos mais grossos exigirão tempos de varredura mais longos. O footpad esfolado pode ser comprimido entre lâminas de vidro um dia antes da imagem para reduzir a espessura do tecido.
7. Microscopia de varredura a laser confocal
- Prepare-se para a sessão de imagem: ligue o sistema de imagem e inicie o software de aquisição (ver Tabela de Materiais). Use um objetivo de baixa ampliação/baixa abertura numérica (por exemplo, x5/0,15) para capturar imagens, pois as lentes de ampliação mais baixas normalmente têm distâncias de trabalho mais longas necessárias para este experimento.
- Clique em Sim para a caixa de diálogo Ativar estágio. Ative o laser de 561 nm na guia Configuração. Na tela principal, ative um caminho visível do feixe clicando no botão Visível . Defina um detector para a faixa de 570-600 nm clicando na caixa de seleção ativa correspondente.
- Selecione o ícone de varredura de ladrilhos na guia Adquirir > Aquisição e defina a resolução desejada (512 x 512 ou 1024 x 1024).
- Posicione a amostra de tecido montado a seco (sem água ou pbs adicionado) compactada entre lâminas de vidro no estágio do microscópio e coloque o tecido em foco.
- Para definir os limites de digitalização, navegue até o canto superior esquerdo ou direito da amostra. Na guia Aquisição, no menu 'Digitalizar' clique no botão Marcar posição . Navegue até o canto oposto (inferior direito ou esquerdo, respectivamente) e clique no botão Marcar posição mais uma vez.
- Para definir a profundidade da pilha Z, clique no botão Viver no canto inferior esquerdo da tela e navegue até o centro da amostra. Use o botão do eixo z para rolar até a parte inferior da amostra.
- Na guia Aquisição, no menu Z-Stack, clique no botão Iniciar . Role até o topo da amostra e clique no botão Finalizar . Clique em Tamanho de passo Z e defina para o valor desejado (por exemplo, 50 μm).
- No canto inferior direito da tela, clique em Iniciar para iniciar a aquisição de imagens.
8. Análise quantitativa e reconstrução 3D da vascularização do footpad
- Baixe e instale a versão mais recente de Fiji (ImageJ) bem como o plugin Vessel Analysis20. Abra arquivos de imagem de microscopia em Fiji, que combinarão sérieS-Z individuais em pilhas Z que podem ser visualizadas no eixo z usando o controle deslizante na parte inferior da imagem.
- Selecione a imagem composta de pilha Z e, em seguida, sob o menu Imagem, escolha Stacks > Z Project para criar uma projeção bidimensional. Em seguida, converta a projeção Z em binário em processo > binário > Make Binary.
- Execute o plugin de densidade vascular sob plugins > densidade vascular. Quando solicitado, use o cursor para rastrear um ROI ao redor do perímetro do footpad e dígitos. Tome nota da densidade do vaso que é relatada, que é expressa em percentagem do ROI (fração da área vascular).
- Para criar reconstruções 3D em Fiji, selecione Stacks > Projeto 3D e defina o eixo de rotação, ângulo e velocidade desejados sob a imagem do menu. Alternativamente, selecione O Visualizador de Volumes no menu Plugins para visualizar imagens como fatias ou manipular a reconstrução nos eixos desejados.
- Para obter mais serviços 3D envolvidos, use software alternativo de análise de imagens e processamento (ver Tabela de Materiais). Converta arquivos para o formato do software desejado e costure as varreduras individuais de ladrilhos usando a funcionalidade de costura de ladrilhos.
- Depois de costurar as varreduras individuais de ladrilhos, abra o arquivo composto e prossiga com a renderização da superfície de volume. Clique em Adicionar nova superfície para abrir o Assistente de Criação de Superfície e use as setas para alternar através de menus, notadamente definindo o ROI e a intensidade do limiar. Uma vez satisfeito com a renderização da superfície, utilize a funcionalidade de animação para criar vídeos da imagem processada.
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Representative Results
Este protocolo detalha um meio confiável de induzir isquemia e perda de tecido no footpad murine usando uma combinação de artéria femoral e coagulação venosa com a administração L-NAME, um inibidor de sinthase de óxido nítrico, em camundongos FVB suscetíveis. A Figura 1 detalha a anatomia da vasculatura de limítrofe murina e indica os locais da artéria femoral e coagulação venosa (X amarelo), apenas proximal à artéria femoral circunflexo lateral (LCFA) e proximal à junção saphenopopliteal. A LCFA precisa ser identificada, e os locais de coagulação, respectivamente, para esta estrutura, são mantidos consistentes em todos os procedimentos cirúrgicos. Como descrito, 2 h antes dos procedimentos cirúrgicos e nos dias pós-operatórios 1-3, os camundongos também foram administrados 40 mg/kg IP de L-NAME para manter níveis elevados de estresse oxidativo. A Figura 2 mostra a variação da perda de tecido que pode ser esperada a partir deste modelo uma semana após a cirurgia, com os escores de Faber9 registrados no canto inferior direito de cada imagem.
A perfusão diI foi realizada em camundongos FVB aos 5 e 20 dias após a artéria femoral e coagulação venosa para avaliar a reperfusão de subida posterior após a indução da isquemia. A Figura 3A ilustra a anatomia murina após dissecção para expor a cavidade torácica. Uma agulha de borboleta é inserida no ventrículo esquerdo para iniciar a perfusão cardíaca. Note que o ventrículo esquerdo parece ligeiramente mais pálido em cores do que o ventrículo direito. A Figura 3B retrata os equipamentos configurados com torneiras conectadas em série e três seringas cheias de PBS, solução DiI e fixação. Após a perfusão diI, os pés foram colhidos, esfolados e comprimidos entre slides de microscópio, como mostrado na Figura 3C,D antes de imagens com um microscópio de varredura a laser confocal sob ampliação de 5x. As imagens de microscopia de reconstrução revelaram anatomia vascular normal no footpad de controle não ligado (Figura 4A) em comparação com a perfusão severamente diminuída ao footpad de plataforma traseira ligada 5 dias após a cirurgia (Figura 4B). Vinte dias após a cirurgia, a perfusão ao footpad melhorou significativamente (Figura 4C,D e Figura 5B), embora não na extensão do controle não ligado (Figura 4A e Figura 5A). A vascularidade foi quantificada como descrito acima usando o plugin de densidade de vasos em Fiji. A fração vascular para o bloco de controle foi de 28%. Cinco dias após a cirurgia, a fração vascular do footpad foi severamente reduzida para 2%, mas gradualmente recuperada para 15% e 18% em dois camundongos separados por 20 dias após o operatório. Para visualizar a anatomia vascular do footpad em 3D, importamos uma imagem de microscopia costurada em software alternativo de análise e processamento de imagens para criar uma renderização superficial como descrito anteriormente (Figura Suplementar 1). Um vídeo da renderização de superfície foi então criado usando a funcionalidade de animação (Vídeo 1).
Figura 1: Anatomia da vasculatura de hindlimb murina e locais da artéria femoral e coagulação venosa. A artéria ilíaca externa continua como a artéria femoral (FA) distal ao ligamento inguinal. Os primeiros ramos da artéria femoral incluem o circunflexo lateral (LCFA) e artérias femorais profundas (não retratados). Mais distally, o ramo femoral caudal proximal (PCFA) e artérias epigástricas caudais superficiais (SCEA) do proximal fa à bifurcação das artérias safenas (SA) e popliteal (PA). O nervo femoral (FN) gira ao lado dos vasos femorais e deve ser suavemente isolado antes da coagulação dos vasos femorais. Também são indicados locais de coagulação da veia fa e femoral (FV). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de gangrena de subida traseira em camundongos FVB com pontuações faber correspondentes. O grau de alterações isquêmicas induzidas por este modelo varia de uma ou mais unhas isquêmicas (Faber pontua 1-5) a dígitos gangrenosos (faber pontua 6-10) e atrofia parcial ou completa do pé. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dissecção animal e configuração de equipamentos para perfusão diI e montagem de pé de rato para imagem. (A) Fotografia anatômica da anatomia murina durante a perfusão diI. As cavidades abdominais e torácicas são abertas, o esterno é refletido, e as costelas são cortadas em ambos os lados do esterno. Uma agulha borboleta de 25 G conectada ao conjunto da torneira é inserida no ventrículo esquerdo. (B) Três torneiras de três vias estão conectadas em série. Três seringas de 10 mL estão cheias de fixação, DII e PBS e conectadas ao conjunto stopcock. Uma agulha borboleta de 25 G está conectada à porta de saída da torneira proximal. (C) Montagem do pé esfolado entre dois slides de microscópio com uma almofada de biópsia de espuma dobrada e clipe de aglutinante em cada extremidade para comprimir os slides juntos. (D) Uma visão alternativa do pé esfolado comprimido entre slides de microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens representativas 5x obtidas pela microscopia de varredura a laser confocal do bloco de pé do mouse após a perfusão de DI com densidade de vaso quantificada expressa como um por cento do ROI. (A) Vasculatura normal do footpad. (B) Vasculatura do footpad 5 dias após a artéria femoral e coagulação venosa mostra perfusão severamente reduzida com opacificação mínima do vaso. (C) Vasculatura do footpad 20 dias após a artéria femoral e coagulação venosa demonstra alguma reconstituição do fluxo distal para as artérias metatarsais e digitais. (D) Imagem de um bloco de pé de rato adicional obtida 20 dias após a artéria femoral e coagulação venosa mostrando vaso grande mínimo em comparação com a opacificação microvascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens ampliadas da vasculatura do bloco de pés. (A) Imagens de 5x e 20x de vasculatura de footpad de controle demonstrando perfusão intacta através das artérias metatarsais e digitais. (B) 5x e 20x imagens de footpad de hindlimb ligado 20 dias após o dia pós-operatório mostrando perfusão reduzida através de ramos arteriais metatarsais maiores, mas o desenvolvimento de uma extensa rede capilar de pelúcia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Animação da renderização de superfície 3D da vasculatura do footpad. O vídeo exibindo uma renderização superficial da vasculatura do bloco de rodas ilustra a resolução 3D alcançável com o protocolo descrito. Clique aqui para baixar este vídeo.
Figura suplementar 1: Passos na renderização superficial de imagens de perfusão dii. (A) Imagem original de perfusão dii importada em software de análise e processamento de imagens. (B) Renderização de superfície sobreposta à imagem de perfusão diI durante a definição da intensidade do limiar. (C) Renderização final da superfície 3D da imagem de microscopia de perfusão diI. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Embora a isquemia de cetameira do rato seja o modelo pré-clínico mais utilizado para estudar a neovascularização em PAD e CLTI, há uma variação significativa na gravidade e recuperação da isquemia, dependendo da cepa específica do rato utilizada e do local, número e método de ruptura arterial. A combinação de ligadura da artéria femoral e administração IP de L-NAME pode induzir de forma confiável gangrena hindlimb em camundongos FVB11. O mesmo tratamento resulta em isquemia hindlimb sem perda de tecido em camundongos C57BL/6, enquanto em camundongos BALB/c, a auto-amputação do pé ou da perna pode ser induzida apenas pela ligadura da artéria femoral. Como tal, a técnica acima descrita de coagulação da artéria femoral com administração simultânea de L-NAME em camundongos FVB, que têm uma resposta intermediária ao insulto da isquemia, fornece um modelo único e reprodutível de gangrena de footpad semelhante ao visto na manifestação mais grave de doenças que levam à CLTI. O grau de perda de tecido observado com este modelo pode variar de algumas unhas isquêmicas a vários dígitos gangrenosos, mas raramente progride para auto-amputação do pé ou perna, o que permite uma avaliação longitudinal da reperfusão e função dos membros. Ao contrário dos camundongos BALB/c, em que o início da gangrena é rápido com a auto-amputação de membros normalmente ocorrendo em menos de uma semana, há um início atrasado de perda de tecido neste modelo de gangrena de rato FVB. A coagulação da artéria femoral restringe o fluxo sanguíneo para o hindlimb. Ainda assim, o acúmulo de estresse oxidativo devido à administração L-NAME nos dias pós-operatórios 0-3 é mais gradual, com pico de alterações atroficas observadas entre 7 e 14 dias. Portanto, este modelo oferece uma janela terapêutica melhorada para avaliar os efeitos de uma determinada intervenção na aparência do tecido bruto e no resgate da perda de tecido, além de quantificar a reperfusão e avaliar a função do membro.
Quanto à técnica cirúrgica, a coagulação ou ligadura da artéria femoral e da veia é favorecida devido à relativa facilidade desta operação em comparação com o isolamento da artéria femoral. Embora essa técnica possa levar à trombose venosa e à insuficiência, ela compõe o insulto isquêmico e ajuda a induzir mudanças gangrenas de forma mais confiável. Além disso, a insuficiência venosa crônica (IC) é altamente prevalente na população geral, com 10%-30% dos adultos afetados. Consistentemente, aproximadamente 20% dos pacientes com PAD, especialmente aqueles com insuficiência arterial grave, também possuem comorbidade CVI21,22. Independentemente de se decidir ligar ou coagular a veia femoral, é extremamente importante manter o local específico de interrupção da artéria femoral constante entre grupos experimentais. Ligações mais proximais, como a da artéria ilíaca, levam à oclusão de garantias adicionais a jusante e limitam a possibilidade de arteriogênese8,16. No entanto, a angiogênese na parte distal do membro, especialmente o músculo gastrocnemius, ainda deve ser acionada. Em camundongos FVB, a dupla ligação ou coagulação da artéria femoral apenas proximal à artéria femoral circunflexo lateral e proximal à bifurcação saphenopopliteal mais consistentemente induz gangrena do que um único local de ligadura ou coagulação.
Deve-se notar que em pacientes PAD e CLTI, a isquemia de membros é causada por obstrução aterosclerótica (processo crônico). Em contraste, em modelos de camundongos, a isquemia de membros é induzida cirurgicamente (um processo agudo). Embora este modelo de gangrena de camundongos FVB tenha um início relativamente mais lento de gangrena com aumento de gravidade retardada da perda de tecido, ele não é diretamente comparável com a estenose arterial crônica e progressiva característica de PAD e CLTI. Outros grupos desenvolveram técnicas de oclusão da artéria femoral subacústas usando constritores ameróides compostos por uma manga metálica externa e uma camada interna de material absorvedor de umidade que gradualmente se auto-expande. Esta técnica tem sido demonstrada como resultado de diminuição da expressão de marcadores inflamatórios, menor recuperação do fluxo sanguíneo em 4-5 semanas e redução da necrose muscular23,24. Além das diferenças na acuidade da isquemia, modelos pré-clínicos utilizando animais jovens e saudáveis também não conseguem replicar fatores de risco como diabetes, hipertensão, obesidade, hiperlipidemia, tabagismo e infecção que contribuem para grandes eventos adversos dos membros e a carga de doenças vasculares.
Na maioria dos estudos de isquemia de hindlimb murina, a restauração do fluxo sanguíneo para o hindlimb isquêmico é tipicamente avaliada via LDPI24,25. Este método não é invasivo e repetível, mas pode ser influenciado pela temperatura corporal do núcleo, uso anestésico, presença capilar e posicionamento das limbs 26. A padronização desses procedimentos e o uso do retrocesso não ligado como controle interno podem ajudar a mitigar quaisquer variações. Em contraste com o LDPI, micro-CT e MRA fornecem informações anatômicas 3D de alta resolução, mas tradicionalmente requerem a injeção de agente de contraste16. A microangiografia de raios-X também é invasiva e tecnicamente desafiadora16,27. Assim como o DII, a perfusão com agentes de fundição de silicone radiopaque permite a reconstrução 3D pós-morte da vasculatura periférica28. A injeção intracardiac ou veia da cauda de lectina fluorescente também foi descrita para rotulagem de vasculatura tecidual29. Após a colheita de tecidos de interesse, a coloração imunohistoquímica com marcadores específicos do endotelial (por exemplo, CD31, fator von Willebrand) é frequentemente usada para quantificar a densidade capilar30.
Em comparação com as técnicas mencionadas acima, a perfusão dii fornece várias vantagens. Em primeiro lugar, os reagentes e materiais necessários são relativamente baratos, desde que o acesso a um microscópio de varredura a laser confocal esteja disponível. Este método permite a reconstrução 3D da vasculatura, que pode ser quantificada por meio de software de análise de imagem. Enquanto este protocolo se concentra na vasculatura do footpad, imagens de montagem total de outros tecidos de retrolimina murina, notadamente os músculos gastrocnemius e adutor, também é viável e relevante para estudos de angiogênese e arteriogênese19. Esta técnica pode ser modificada para modelos animais maiores, incluindo ratos e coelhos, aumentando o volume de soluções de perfusão. No entanto, as restrições de imagem em relação ao tamanho do tecido são descritas abaixo.
Porções críticas da perfusão dii são as seguintes. Bolhas de ar no aparelho podem ocluir pequenos vasos e dificultar a distribuição de DI em toda a vasculatura, influenciando assim os resultados de imagem. Como tal, deve-se tomar cuidado para remover quaisquer bolhas de ar no aparelho de torneira e tubo antes da perfusão. A filtragem de todas as soluções, exceto o DiI através de um filtro superior de garrafa de 0,22 μm, também é recomendado para remover quaisquer micropartículas. Durante a perfusão intracardiac, monitore cuidadosamente os pulmões. Se eles se tornarem ampliados e ficarem cor de rosa, este é um sinal de que a agulha da borboleta penetrou através do ventrículo direito e precisa ser retraída ligeiramente.
Uma limitação importante da perfusão dii é a natureza terminal do procedimento, que não permite medições repetidas. Como os resultados ruins da perfusão podem refletir a insuficiência arterial ou erro técnico subjacente, a colheita e a imagem do retrocesso não ligado como um controle interno é recomendado. No que diz respeito à imagem, a espessura ideal do tecido para penetração a laser é de ~1 mm após a compressão. Consequentemente, tecidos maiores requerem seção em pedaços menores para serem montados em slides e acomodados no estágio do microscópio e tempos de aquisição de imagens proporcionalmente mais longos.
Em resumo, este protocolo descreve um modelo pré-clínico único para estudar PAD e CLTI. Especificamente, a artéria femoral e a coagulação venosa com administração simultânea de L-NAME, um inibidor de NOS, induz de forma confiável a perda de tecido nos footpads dos camundongos FVB. Post-mortem, a perfusão dii intracardiac é então usada para rotular a vasculatura fluorescentemente. A posterior imagem de montagem total dos pés colhidos com microscopia de varredura a laser confocal permite a reconstrução 3D de alta resolução da vasculatura do bloco de pés e visualização de redes arteriais e capilares que complementam os meios tradicionais de avaliar a reperfusão em modelos de isquemia hindlimb.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios ao Z-J L e OC V dos Institutos Nacionais de Saúde [R01HL149452 e VITA (NHLBL-CSB-HV-2017-01-JS)]. Agradecemos também ao Centro de Microscopia e Imagem do Projeto Miami para Curar Paralisia na Faculdade de Medicina da Universidade de Miami por fornecer acesso ao software de análise e processamento de imagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
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