Summary
Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.
Abstract
La malattia arteriosa periferica (PAD) è una causa significativa di morbilità derivante dall'esposizione cronica a fattori di rischio aterosclerotici. I pazienti affetti dalla sua forma più grave, l'ischemia cronica che minaccia gli arti (CLTI), affrontano notevoli menomazioni nella vita quotidiana, tra cui dolore cronico, distanza a piedi limitata senza dolore e ferite non cicatrizzanti. Modelli preclinici sono stati sviluppati in vari animali per studiare la PAD, ma l'ischemia degli arti posteriori del topo rimane la più utilizzata. Ci possono essere variazioni significative nella risposta all'insulto ischemico in questi modelli a seconda del ceppo di topo utilizzato e del sito, del numero e dei mezzi di interruzione arteriosa. Questo protocollo descrive un metodo unico che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e della vena con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi (NOS) per indurre in modo affidabile la cancrena del footpad nei topi Friend Virus B (FVB) che assomiglia alla perdita di tessuto di CLTI. Mentre i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione come l'imaging laser doppler perfusione (LDPI) sono ancora raccomandati, la perfusione intracardiaca del colorante lipofilo 1,1'-diottadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI) viene utilizzata per etichettare la vascolarizzazione. La successiva microscopia a scansione laser confocale a montaggio intero consente la ricostruzione tridimensionale (3D) ad alta risoluzione delle reti vascolari footpad che integra i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione nei modelli di ischemia degli arti posteriori.
Introduction
La malattia arteriosa periferica (PAD), caratterizzata da un ridotto flusso sanguigno alle estremità a causa dell'aterosclerosi, colpisce 6,5 milioni di persone negli Stati Uniti e 200 milioni di persone in tutto il mondo1. I pazienti con PAD sperimentano una ridotta funzionalità degli arti e qualità della vita, e quelli con CLTI, la forma più grave di PAD, sono ad aumentato rischio di amputazione e morte con un tasso di mortalità a 5 anni vicino al 50%2. Nella pratica clinica, i pazienti con indici caviglia-brachiali (ABI) <0,9 sono considerati affetti da PAD e quelli con ABI < 0,4 associati a dolore a riposo o perdita di tessuto come affetti da CLTI3. I sintomi variano tra i pazienti con ABI simili a seconda dell'attività quotidiana, della tolleranza muscolare all'ischemia, delle variazioni anatomiche e delle differenze nello sviluppo collaterale4. La cancrena delle dita e degli arti è la manifestazione più grave di tutte le malattie occlusive vascolari che provocano CLTI. È una forma di necrosi secca che mummifica i tessuti molli. Oltre alla PAD aterosclerotica, può essere osservata anche in pazienti con diabete, vasculitidi come la malattia di Buerger e il fenomeno di Raynaud, o calcifilassi nel contesto della malattia renale allo stadio terminale5,6.
Sono stati sviluppati diversi modelli preclinici per studiare la patogenesi della PAD/CLTI e testare l'efficacia di potenziali trattamenti, il più comune dei quali rimane l'ischemia degli arti posteriori del topo. L'induzione dell'ischemia del tronco posteriore nei topi è tipicamente realizzata dall'ostruzione del flusso sanguigno dalle arterie iliache o femorali, sia mediante legatura di sutura, elettrocoagulazione o altri mezzi per restringere il vaso desiderato7. Queste tecniche riducono drasticamente la perfusione agli arti posteriori e stimolano la neovascolarizzazione nei muscoli della coscia e del polpaccio. Tuttavia, esistono differenze essenziali murine dipendenti dal ceppo nella sensibilità all'insulto ischemico, in parte dovute a differenze anatomiche nella distribuzione delle garanzie8,9. Ad esempio, i topi C57BL/6 sono relativamente resistenti all'ischemia degli arti posteriori, dimostrando una ridotta funzionalità degli arti ma generalmente nessuna evidenza di cancrena nella pedana. D'altra parte, i topi BALB / c hanno una capacità intrinsecamente scarsa di riprendersi dall'ischemia e in genere sviluppano l'autoamplificazione del piede o della parte inferiore della gamba dopo la sola legatura dell'arteria femorale. Questa grave risposta all'ischemia restringe la finestra terapeutica e può precludere la valutazione longitudinale della riperfusione e della funzione degli arti. È interessante notare che le differenze genetiche in un singolo locus del tratto quantitativo situato sul cromosoma murino 7 sono state implicate in queste suscettibilità differenziali dei topi C57BL/6 e BALB/c alla necrosi tissutale e alla riperfusione degli arti10.
Rispetto ai ceppi C57BL/6 e BALB/c, i topi FVB dimostrano una risposta intermedia ma incoerente alla sola legatura dell'arteria femorale. Alcuni animali sviluppano cancrena sotto forma di unghie ischemiche nere o dita mummificate, altri ancora senza segni evidenti di ischemia11. La somministrazione concomitante di Nω-Nitro-L-arginina estere metilico cloridrato (L-NAME), un inibitore dell'ossido nitrico sintasi (NOS)12, previene i meccanismi vasodilatatori compensatori e aumenta ulteriormente lo stress ossidativo nel tessuto posteriore. In combinazione con la legatura o la coagulazione dell'arteria femorale, questo approccio produce costantemente una perdita di tessuto del footpad nei topi FVB che assomiglia ai cambiamenti atrofici del CLTI, ma raramente progredisce verso l'auto-amputazione degli arti11. Lo stress ossidativo è uno dei tratti distintivi della PAD/CLTI ed è propagato dalla disfunzione endoteliale e dalla diminuita biodisponibilità dell'ossido nitrico (NO)13,14. L'NO è una molecola pluripotente che di solito esercita effetti benefici sul flusso sanguigno arterioso e capillare, sull'adesione e aggregazione piastrinica e sul reclutamento e l'attivazione dei leucociti13. Livelli ridotti di NOS hanno anche dimostrato di attivare l'enzima di conversione dell'angiotensina, che induce stress ossidativo e accelera la progressione dell'aterosclerosi15.
Una volta stabilito un modello di ischemia degli arti posteriori, è necessario monitorare la successiva riperfusione degli arti e l'effetto terapeutico di eventuali trattamenti potenziali. Nel modello di cancrena murina proposto, il grado di perdita di tessuto può essere prima quantificato utilizzando il punteggio Faber per valutare l'aspetto lordo del piede (0: normale, 1-5: perdita di unghie dove il punteggio rappresenta il numero di unghie colpite, 6-10: atrofia delle dita dove il punteggio rappresenta il numero di cifre colpite, 11-12: atrofia parziale e completa del piede, rispettivamente)9. Le misurazioni quantitative della perfusione degli arti posteriori vengono quindi in genere effettuate utilizzando LDPI, che si basa sulle interazioni Doppler tra luce laser e globuli rossi per indicare la perfusione a livello di pixel in una regione di interesse (ROI)16. Sebbene questa tecnica sia quantitativa, non invasiva e ideale per misurazioni ripetute, non fornisce dettagli anatomici granulari della vascolarizzazione degli arti posteriori16. Altre modalità di imaging, come la tomografia micro-computerizzata (micro-CT), l'angiografia a risonanza magnetica (MRA) e la microangiografia a raggi X, si rivelano costose, richiedono una strumentazione sofisticata o altrimenti tecnicamente impegnative16. Nel 2008, Li et al. hanno descritto una tecnica per etichettare i vasi sanguigni all'interno della retina con il colorante lipofilo di carbocianina DiI17. DiI incorpora nelle cellule endoteliali e, per diffusione diretta, colora le strutture della membrana vascolare come germogli angiogenici e processi pseudopodali17,18. Grazie alla sua consegna diretta nelle cellule endoteliali e alla natura altamente fluorescente del colorante, questa procedura fornisce un'etichettatura intensa e duratura dei vasi sanguigni. Nel 2012, Boden et al. hanno adattato la tecnica della perfusione DiI al modello di ischemia dell'arto posteriore murino tramite imaging a montaggio intero dei muscoli adduttori della coscia raccolti dopo la legatura dell'arteria femorale19.
Il metodo attuale fornisce un modo relativamente economico e tecnicamente fattibile per valutare la neovascolarizzazione in risposta all'ischemia degli arti posteriori e alle terapie basate su geni o cellule. In un ulteriore adattamento, questo protocollo descrive l'applicazione della perfusione DiI per visualizzare la vascolarizzazione del footpad in alta risoluzione e 3D in un modello murino di cancrena posteriore.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti nel protocollo sono stati approvati dall'Università di Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per lo studio sono stati utilizzati topi FVB, sia maschi che femmine, di età compresa tra 8 e 12 settimane.
1. Preparazione della soluzione L-NAME
- In condizioni sterili in una cappa a flusso laminare, preparare una soluzione madre L-NAME sciogliendo 1 g di polvere L-NAME (vedere Tabella dei materiali) con 20 ml di acqua sterile per ottenere 50 mg/mL di soluzione. Conservare la soluzione madre in aliquote da 300-500 μL a -20 °C per un massimo di 3 mesi.
- Per realizzare una soluzione L-NAME funzionante, scongelare un'aliquota della soluzione madre L-NAME e diluire con PBS (1:4) in condizioni sterili per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/mL.
- Per preparare PBS (pH 7,4), sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,23 g di NaH2PO4 in 800 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 7,4 con HCl. Aggiungere acqua a un volume totale di 1.000 ml e filtrare attraverso un filtro a bottiglia da 0,22 μm.
NOTA: L'iniezione intraperitoneale (IP) di 4 μL/g di soluzione di lavoro L-NAME equivale alla dose desiderata di 40 mg/kg di L-NAME. La soluzione di lavoro L-NAME deve essere mantenuta sul ghiaccio durante l'uso e nuove diluizioni devono essere effettuate ogni giorno utilizzando aliquote di soluzione madre appena scongelate.
2. Induzione chimica e chirurgica della cancrena degli arti posteriori
- Ottenere topi FVB, di età compresa tra 8 e 12 settimane, da un allevatore o allevati in-facility (vedi Tabella dei materiali). 2 ore prima dell'intervento chirurgico, somministrare una dose IP di 40 mg/kg di L-NAME.
- Anestetizzare topi con iniezione IP di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina (vedere Tabella dei materiali) diluita in PBS. Confermare un'adeguata sedazione dall'assenza di riflesso del pizzico della punta e continuare a monitorare la frequenza respiratoria durante la procedura.
- Rimuovere i peli dagli arti posteriori bilaterali e dall'inguine usando cesoie e/o una crema depilatoria. Posizionare l'animale sotto un microscopio chirurgico supino; estendere e fissare le estremità in posizione. Sterilizzare il campo chirurgico applicando circonferenzialmente la soluzione di povidone-iodio al sito chirurgico.
- Sotto ingrandimento 10-20x, utilizzare forbici o un bisturi per fare un'incisione di 1 cm lungo la piega inguinale appena inferiore al legamento inguinale. Utilizzare una pinza fine e un applicatore sterile a punta di cotone per sezionare senza mezzi termini il cuscinetto di grasso inguinale lateralmente dal legamento inguinale ed esporre la guaina femorale sottostante in modo che l'arteria, la vena e il nervo del femore siano chiaramente identificati (Figura 1).
- Usando una pinza fine, perforare la guaina femorale. Spazzolare con cura il nervo femorale lontano dall'arteria femorale. Identificare il decollo del ramo circonflesso laterale dell'arteria femorale (LCFA) in profondità al nervo femorale (Figura 1).
- Procedere con l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e della vena appena prossimale alla LCFA attivando il dispositivo cauteristico (vedi Tabella dei Materiali) e contattando delicatamente i vasi con un movimento da un lato all'altro, assicurando che il nervo femorale sia ben isolato e rimanga protetto dalle lesioni termiche. Dividere il segmento del vaso coagulato con le forbici.
- Procedere con l'esposizione dell'arteria femorale distale e della vena mobilitando medialmente il cuscinetto di grasso inguinale. Identificare l'arteria epigastrica superficiale e la giunzione safenopoplitea più distalmente.
- Perforare la guaina femorale tra queste due posizioni e sezionare attentamente il nervo femorale lontano dai vasi femorali. Procedere con la coagulazione e la trasezione dell'arteria femorale e della vena come descritto al punto 2.4.1.
- Irrigare il campo chirurgico utilizzando una siringa riempita con PBS sterile. Ottenere l'emostasi applicando una leggera pressione con un applicatore di punta di cotone per 3-5 minuti a qualsiasi area di sanguinamento.
- Procedere con la chiusura dell'incisione utilizzando la sutura assorbibile 5-0 in modo semplice e continuo. Somministrare una dose sottocutanea di 1 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (vedere Tabella dei materiali) per alleviare il dolore postoperatorio.
- Confermare la perdita di perfusione della pedana nell'arto posteriore legato da LDPI (vedere Tabella dei materiali). Mentre è ancora anestetizzato, posizionare l'animale su un cuscinetto di schiuma scura in posizione prona sotto la macchina LDPI e utilizzare anelli di nastro elettrico per fissare i piedi in posizione.
- Procedere con LDPI di piedi bilaterali. Una volta completata la scansione, disegnare un ROI attorno a ciascun footpad e ottenere i valori medi di flusso.
- Calcolare l'indice di perfusione come rapporto tra i valori medi di flusso dalla pedana legata a quella non legata. Assicurarsi che l'indice di perfusione sia inferiore a 0,1.
- Trasferire l'animale in una gabbia pulita con una piastra riscaldante o una lampada a soffitto per mantenere la temperatura corporea interna. Garantire il completo recupero dall'anestesia prima di trasferire i topi alla struttura per animali.
3. Somministrazione postoperatoria di L-NAME e monitoraggio della cancrena degli arti posteriori
- Nei giorni postoperatori 1-3, somministrare una dose IP aggiuntiva di 40 mg/kg di L-NAME a ciascun animale. Allo stesso tempo, valutare attentamente il piede dall'arto ischemico.
- Quantificare il grado di ischemia e cancrena posteriore utilizzando il punteggio di ischemia posteriore di Faber9. Punteggi 1-5: numero di unghie ischemiche; punteggi 6-10: 1-5 cifre ischemiche; punteggi 11 e 12: atrofia parziale e completa del piede. Registra i punteggi Faber nei giorni postoperatori 1-3 e poi settimanalmente.
4. Preparazione di DiI e soluzioni di lavoro per la perfusione animale
- Per preparare la soluzione madre DiI, sciogliere 100 mg di cristalli DiI (vedere Tabella dei materiali) in 16,7 ml di etanolo al 100%. Coprire in un foglio di alluminio e lasciare su una piattaforma a dondolo durante la notte al buio a temperatura ambiente.
- Per preparare il diluente, sciogliere 50 g di glucosio in 1.000 ml di acqua distillata per ottenere una soluzione di glucosio al 5%. Filtrare attraverso un filtro superiore del flacone da 0,22 μm. Mescolare PBS e soluzioni di glucosio al 5% in un rapporto 1:4 per preparare una soluzione di diluente funzionante.
5. Configurazione dell'apparecchiatura e perfusione DiI
- Realizzare la soluzione di lavoro DiI aggiungendo 200 μL di soluzione madre DiI a 10 mL della soluzione diluente di lavoro (preparata al punto 4.2) immediatamente prima dell'uso. Agitare la mano per mescolare bene.
- Collegare due o tre rubinetti a 3 vie e un ago a farfalla da 25 G in serie. Preparare siringhe da 10 mL con 4 mL di PBS, 10 mL di soluzione di DiI e 10 mL di formalina tamponata neutra al 10% (vedere Tabella dei materiali).
- Collegare la siringa con formalina alla porta di afflusso prossimale e iniettare la soluzione per lavare l'aria dalla linea; ruotare il rubinetto per chiudere la porta. Ripetere la stessa procedura in sequenza, collegando le siringhe con DiI e quindi PBS alle porte di afflusso centrale e distale, rispettivamente, avendo cura di lavare tutte le bolle d'aria attraverso il gruppo stopcock.
NOTA: assicurarsi che non vi siano bolle d'aria in nessuna parte del gruppo rubinetto o del tubo. Le bolle d'aria possono occludere piccole arterie durante la perfusione con conseguente scarsa distribuzione intravascolare della DiI e risultati di imaging compromessi. - Una volta completata la configurazione, eutanasizzare l'animale per overdose di CO2 in una camera di induzione.
- Posizionare l'animale da perfusare in posizione supina su un cuscinetto assorbente e fissare le ascelle e gli arti inferiori con gli aghi.
- Usando le forbici, fai un'incisione trasversale per aprire la cavità addominale. Esporre e quindi dividere il diaframma sinistro e destro per accedere alla cavità toracica.
- Tagliare la parete toracica su entrambi i lati dello sterno dalle costole inferiori alla prima o alla seconda costola, evitando medialmente le arterie toraciche interne (mammarie). Utilizzare un emostato (vedi Tabella dei materiali) per afferrare l'estremità inferiore dello sterno e rifletterlo verso la testa dell'animale per esporre la cavità toracica.
- Identificare il ventricolo sinistro, che appare di colore più chiaro rispetto al ventricolo destro. Afferrare delicatamente il cuore con una pinza smussata e inserire l'ago a farfalla nel ventricolo sinistro.
- Utilizzare forbici o un ago da 18 G per perforare l'atrio destro, consentendo al sangue e alle soluzioni di perfusione di tornare al cuore per drenare. Stabilizzare l'ago con una o due mani, facendo attenzione a non perforare inavvertitamente il ventricolo destro e perfondere la circolazione polmonare piuttosto che sistemica.
- Aprire la porta della siringa con PBS e iniettare manualmente 2-4 mL ad una velocità di 1-2 mL/min per 1-2 minuti per lavare il sangue dal sistema vascolare. Garantire una perfusione di successo osservando il sanguinamento dall'atrio destro. Dopo l'iniezione, chiudere la porta della siringa PBS.
- Aprire la porta della siringa con DiI e iniettare 5-10 mL ad una velocità di 1-2 mL/min per 5 min. Monitorare le orecchie, il naso e i palmi delle mani che dovrebbero diventare leggermente rosa con l'iniezione di soluzione di DiI. Dopo l'iniezione, chiudere la porta della siringa DiI e attendere 2 minuti per consentire l'incorporazione del colorante prima dell'iniezione del fissativo.
- Aprire la porta della siringa con formalina e iniettare 5-10 mL ad una velocità di 1-2 mL/min per 5 min. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago dal ventricolo sinistro e procedere alla raccolta dei tessuti di interesse.
- Usando forbici pesanti, dislocare la tibia alla caviglia, separando completamente i piedi sinistro e destro dalla parte inferiore delle gambe. Posizionare i piedi raccolti in una piastra a 6 o 12 pozzetti con 1-2 ml di soluzione di formalina al 10%. Avvolgere la piastra con un foglio e conservare a 4 °C durante la notte.
6. Preparazione del tessuto del footpad per la microscopia a scansione laser confocale
- Il giorno successivo, sostituire la soluzione fissativa in una piastra a 6 o 12 pozzetti con 1-2 ml di PBS per pozzetto.
- Per scuoiare il piede, in primo luogo, fare un'incisione longitudinale con un bisturi sugli aspetti plantari e dorsali del piede. Quindi, utilizzando una pinza dentata e un piccolo emostato, rimuovere con cura tutta la pelle dal piede e dalle dita, non danneggiando i tessuti molli sottostanti.
- Procedere al montaggio e all'imaging dei tessuti, preferibilmente entro 1-2 giorni dalla perfusione e dalla raccolta. In alternativa, riportare le pedane a piastre a 6 o 12 pozzetti con 1-2 ml di PBS; coprire con un foglio e conservare a 4 °C per mantenere la fluorescenza fino a 1 mese.
- Per montare i tessuti, posizionare individualmente i piedi tra due vetrini per microscopio di vetro con un tampone per biopsia in schiuma piegato su se stesso (una o due volte a seconda dello spessore del tessuto) a ciascuna estremità (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare due piccole clip leganti per comprimere insieme le diapositive di vetro a ciascuna estremità (spessore finale circa 1 mm).
NOTA: i tessuti più spessi richiedono tempi di scansione più lunghi. La pedana scuoiata può essere compressa tra vetrini un giorno prima dell'imaging per ridurre lo spessore del tessuto.
7. Microscopia a scansione laser confocale
- Prepararsi per la sessione di imaging: accendere il sistema di imaging e avviare il software di acquisizione (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento/bassa apertura numerica (ad esempio, x5/0,15) per acquisire immagini poiché gli obiettivi a basso ingrandimento hanno in genere distanze di lavoro più lunghe richieste per questo esperimento.
- Fare clic su Sì per visualizzare la finestra di dialogo Attiva fase. Attivare il laser a 561 nm nella scheda Configurazione. Nella schermata principale, attivare un percorso del fascio visibile facendo clic sul pulsante Visibile . Impostare un rilevatore sull'intervallo 570-600 nm facendo clic sulla casella di controllo Attivo corrispondente.
- Selezionare l'icona Scansione riquadri nella scheda Acquisizione > Acquisizione e impostare la risoluzione desiderata (512 x 512 o 1024 x 1024).
- Posizionare il campione di tessuto montato a secco (senza acqua o PBS aggiunto) compresso tra i vetrini sullo stadio del microscopio e mettere a fuoco il tessuto.
- Per impostare i limiti di scansione, passare all'angolo superiore sinistro o destro del campione. Nella scheda Acquisizione, sotto il menu Scansione riquadri, fare clic sul pulsante Segna posizione . Passare all'angolo opposto (rispettivamente in basso a destra o a sinistra) e fare nuovamente clic sul pulsante Segna posizione .
- Per impostare la profondità dello Z-stack, fare clic sul pulsante Live nell'angolo in basso a sinistra dello schermo e passare al centro dell'esempio. Utilizzare la manopola dell'asse z per scorrere fino alla parte inferiore del campione.
- Nella scheda Acquisizione, nel menu Z-Stack, fare clic sul pulsante Inizia . Scorri fino alla parte superiore dell'esempio e fai clic sul pulsante Fine . Fare clic su Z-step Size e impostare sul valore desiderato (ad esempio, 50 μm).
- Nell'angolo in basso a destra dello schermo, fai clic su Avvia per iniziare l'acquisizione delle immagini.
8. Analisi quantitativa e ricostruzione 3D della vascolarizzazione del footpad
- Scarica e installa l'ultima versione di Fiji (ImageJ) e il plugin Vessel Analysis20. Apri i file di immagini al microscopio nelle Figi, che combineranno le singole serie Z in pile Z che possono essere visualizzate nell'asse z utilizzando il cursore nella parte inferiore dell'immagine.
- Selezionare l'immagine Z-stack composita e quindi sotto il menu Immagine, scegliere Stack > Progetto Z per creare una proiezione bidimensionale. Quindi, converti la proiezione Z in binario in Processo > Binario > Crea binario.
- Esegui il plugin Vascular Density in Plugins > Vascular Density. Quando richiesto, utilizzare il cursore per tracciare un ROI attorno al perimetro del footpad e delle cifre. Prendi nota della densità del vaso che viene riportata, che è espressa come percentuale del ROI (frazione dell'area vascolare).
- Per creare ricostruzioni 3D nelle Figi, selezionare Stack > Progetto 3D e impostare l'asse di rotazione, l'angolo e la velocità desiderati nel menu Immagine. In alternativa, selezionare Volume Viewer nel menu Plugin per visualizzare le immagini come sezioni o manipolare la ricostruzione negli assi desiderati.
- Per un rendering 3D più coinvolto, utilizzare un software alternativo di analisi ed elaborazione delle immagini (vedere Tabella dei materiali). Converti i file nel formato del software desiderato e cuci le singole scansioni delle piastrelle utilizzando la funzionalità di cucitura delle piastrelle.
- Dopo aver cucito insieme le singole scansioni dei riquadri, aprire il file composito e procedere con il rendering della superficie del volume. Fare clic su Aggiungi nuova superficie per aprire la Creazione guidata superficie e utilizzare le frecce per passare da un menu all'altro, in particolare impostando il ROI e l'intensità della soglia. Una volta soddisfatto del rendering della superficie, utilizzare la funzionalità di animazione per creare video dell'immagine elaborata.
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Representative Results
Questo protocollo descrive un mezzo affidabile per indurre ischemia e perdita di tessuto nella pedana murina utilizzando una combinazione di arteria femorale e coagulazione venosa con la somministrazione di L-NAME, un inibitore dell'ossido nitrico sintasi, in topi FVB sensibili. La Figura 1 descrive in dettaglio l'anatomia della vascolarizzazione murina degli arti posteriori e indica i siti dell'arteria femorale e della coagulazione venosa (X gialla), appena prossimali all'arteria femorale circonflessa laterale (LCFA) e prossimali alla giunzione safenopoplitea. L'LCFA deve essere identificato e i siti di coagulazione relativi a questa struttura sono mantenuti coerenti in tutte le procedure chirurgiche. Come descritto, 2 ore prima delle procedure chirurgiche e nei giorni postoperatori 1-3, ai topi sono stati somministrati anche 40 mg / kg IP di L-NAME per mantenere elevati livelli tissutali di stress ossidativo. La Figura 2 mostra la variazione della perdita di tessuto che ci si può aspettare da questo modello una settimana dopo l'intervento chirurgico, con i punteggi Faber9 registrati nell'angolo in basso a destra di ogni immagine.
La perfusione diI è stata eseguita in topi FVB a 5 e 20 giorni dopo la coagulazione dell'arteria femorale e della vena per valutare la riperfusione degli arti posteriori dopo l'induzione dell'ischemia. La Figura 3A illustra l'anatomia murina dopo la dissezione per esporre la cavità toracica. Un ago a farfalla viene inserito nel ventricolo sinistro per iniziare la perfusione cardiaca. Si noti che il ventricolo sinistro appare leggermente più chiaro di colore rispetto al ventricolo destro. La Figura 3B illustra l'apparecchiatura allestita con rubinetti collegati in serie e tre siringhe riempite con PBS, soluzione DiI e fissativo. Dopo la perfusione DiI, i piedi sono stati raccolti, scuoiati e compressi tra i vetrini del microscopio, come mostrato nella Figura 3C, D prima dell'imaging con un microscopio a scansione laser confocale con ingrandimento 5x. Le immagini al microscopio di ricostruzione hanno rivelato una normale anatomia vascolare nella pedana di controllo non legata (Figura 4A) rispetto alla perfusione gravemente ridotta alla pedana dell'arto posteriore legato 5 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 4B). Venti giorni dopo l'intervento chirurgico, la perfusione alla pedana è migliorata significativamente (Figura 4C, D e Figura 5B), anche se non nella misura del controllo non legato (Figura 4A e Figura 5A). La vascolarizzazione è stata quantificata come descritto sopra utilizzando il plug-in Vessel Density nelle Figi. La frazione vascolare per il footpad di controllo era del 28%. Cinque giorni dopo l'intervento chirurgico, la frazione vascolare della pedana è stata gravemente ridotta al 2%, ma gradualmente recuperata al 15% e al 18% in due topi separati entro 20 giorni dopo l'intervento. Per visualizzare l'anatomia vascolare del footpad in 3D, abbiamo importato un'immagine al microscopio cucita in un software alternativo di analisi ed elaborazione delle immagini per creare un rendering della superficie come descritto in precedenza (Figura supplementare 1). È stato quindi creato un video del rendering della superficie utilizzando la funzionalità di animazione (Video 1).
Figura 1: Anatomia della vascolarizzazione dell'arto posteriore murino e siti dell'arteria femorale e della coagulazione venosa. L'arteria iliaca esterna continua come l'arteria femorale (FA) distale al legamento inguinale. I primi rami dell'arteria femorale includono il circonflesso laterale (LCFA) e le arterie femorali profonde (non nella foto). Più distalmente, le arterie femorali caudali prossimali (PCFA) e le arterie epigastriche caudali superficiali (SCEA) si diramano dalla FA prossimale alla biforcazione delle arterie safene (SA) e poplitea (PA). Il nervo femorale (FN) si accompagna ai vasi femorali e deve essere isolato delicatamente prima della coagulazione dei vasi femorali. Sono indicati anche i siti di coagulazione fa e vena femorale (FV) (X). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di cancrena posteriore in topi FVB con corrispondenti punteggi Faber. Il grado di cambiamenti ischemici indotti da questo modello varia da una o più unghie ischemiche (punteggi Faber 1-5) a cifre cancrenose (punteggi Faber 6-10) e atrofia parziale o completa del piede. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dissezione animale e configurazione dell'attrezzatura per la perfusione DiI e il montaggio del piede di topo per l'imaging. (A) Fotografia anatomica dell'anatomia murina durante la perfusione DiI. Le cavità addominali e toraciche sono aperte, lo sterno viene riflesso e le costole vengono tagliate su entrambi i lati dello sterno. Un ago a farfalla da 25 G collegato al gruppo stopcock viene inserito nel ventricolo sinistro. (B) Tre rubinetti a 3 vie sono collegati in serie. Tre siringhe da 10 mL sono riempite con fissativo, DiI e PBS e collegate al gruppo rubinetto. Un ago a farfalla da 25 G è collegato alla porta di deflusso del rubinetto prossimale. (C) Montare il piede scuoiato tra due vetrini per microscopio con un tampone per biopsia in schiuma piegata e una clip legante a ciascuna estremità per comprimere insieme i vetrini. (D) Una visione alternativa del piede scuoiato compresso tra i vetrini del microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative 5x ottenute mediante microscopia a scansione laser confocale della pedana del mouse dopo perfusione DiI con densità del vaso quantificata espressa come percentuale del ROI. (A) Vascolarizzazione normale della pedana. (B) La vascolarizzazione della pedana 5 giorni dopo l'arteria femorale e la coagulazione venosa mostrano una perfusione gravemente ridotta con un'opacizzazione minima dei vasi. (C) La vascolarizzazione della pedana 20 giorni dopo la coagulazione dell'arteria femorale e della vena dimostra una certa ricostituzione del flusso distale alle arterie metatarsali e digitali. (D) Immagine di un footpad di topo aggiuntivo ottenuto 20 giorni dopo l'arteria femorale e la coagulazione venosa che mostra un vaso di grandi dimensioni minimo rispetto all'opacizzazione microvascolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini ingrandite della vascolarizzazione del footpad. (A) immagini 5x e 20x della vascolarizzazione del footpad di controllo che dimostrano la perfusione intatta attraverso le arterie metatarsali e digitali. (B) Immagini 5x e 20x di footpad da arti posteriori legati 20 giorni dopo l'intervento che mostrano una perfusione ridotta attraverso rami arteriosi metatarsali più grandi, ma lo sviluppo di una rete capillare estesa e lussuosa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Animazione del rendering superficiale 3D della vascolarizzazione del footpad. Il video che mostra un rendering superficiale della vascolarizzazione del footpad illustra la risoluzione 3D raggiungibile con il protocollo descritto. Clicca qui per scaricare questo video.
Figura 1 supplementare: Passaggi nel rendering superficiale delle immagini di perfusione DiI. (A) Immagine di perfusione DiI originale importata nel software di analisi ed elaborazione delle immagini. (B) Rendering superficiale sovrapposto all'immagine di perfusione DiI durante l'impostazione dell'intensità di soglia. (C) Rendering finale della superficie 3D dell'immagine al microscopio a perfusione DiI. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Mentre l'ischemia del tronco posteriore del topo è il modello preclinico più utilizzato per studiare la neovascolarizzazione in PAD e CLTI, vi è una variazione significativa nella gravità e nel recupero dell'ischemia a seconda del ceppo murino specifico utilizzato e del sito, del numero e del metodo di interruzione arteriosa. La combinazione di legatura dell'arteria femorale e somministrazione IP di L-NAME può indurre in modo affidabile la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB11. Lo stesso trattamento provoca ischemia posteriore senza perdita di tessuto nei topi C57BL/6, mentre nei topi BALB/c l'autoamplificazione del piede o della gamba può essere indotta dalla sola legatura dell'arteria femorale. Come tale, la tecnica sopra descritta di coagulazione dell'arteria femorale con somministrazione concomitante di L-NAME nei topi FVB, che hanno una risposta intermedia all'insulto ischemia, fornisce un modello unico e riproducibile di cancrena footpad simile a quello osservato nella manifestazione più grave di malattie che portano a CLTI. Il grado di perdita di tessuto osservato con questo modello può variare da poche unghie ischemiche a più dita gangrenose, ma raramente progredisce verso l'autoamplutazione del piede o della gamba, che consente una valutazione longitudinale della riperfusione e della funzione degli arti. A differenza dei topi BALB/c, in cui l'insorgenza della cancrena è rapida con l'autoamplutazione degli arti che si verifica tipicamente in meno di una settimana, c'è un inizio ritardato della perdita di tessuto in questo modello di cancrena di topo FVB. La coagulazione dell'arteria femorale limita acutamente il flusso sanguigno all'arto posteriore. Tuttavia, l'accumulo di stress ossidativo dovuto alla somministrazione di L-NAME nei giorni postoperatori 0-3 è più graduale, con picchi di cambiamenti atrofici osservati tra 7-14 giorni. Pertanto, questo modello offre una finestra terapeutica migliorata per valutare gli effetti di un particolare intervento sull'aspetto grossolano del tessuto e sul salvataggio della perdita di tessuto, oltre a quantificare la riperfusione e valutare la funzione degli arti.
Per quanto riguarda la tecnica chirurgica, la coagulazione o la legatura sia dell'arteria femorale che della vena è favorita a causa della relativa facilità di questa operazione rispetto all'isolamento dell'arteria femorale. Mentre questa tecnica può portare a trombosi venosa e insufficienza, aggrava l'insulto ischemico e aiuta a indurre cambiamenti cancrenosi in modo più affidabile. Inoltre, l'insufficienza venosa cronica (CVI) è molto diffusa nella popolazione generale, con il 10% -30% degli adulti colpiti. Coerentemente, circa il 20% dei pazienti con PAD, in particolare quelli con grave insufficienza arteriosa, hanno anche comorbidità CVI21,22. Indipendentemente dal fatto che si decida di ligare o coagulare la vena femorale, è di fondamentale importanza mantenere costanti i siti specifici di interruzione dell'arteria femorale tra i gruppi sperimentali. Legazioni più prossimali, come quella dell'arteria iliaca, portano all'occlusione di ulteriori collaterali a valle e limitano la possibilità di arteriogenesi8,16. Tuttavia, l'angiogenesi nella parte distale dell'arto, in particolare il muscolo gastrocnemio, dovrebbe ancora essere innescata. Nei topi FVB, la doppia legatura o coagulazione dell'arteria femorale appena prossimale all'arteria femorale circonflessa laterale e prossimale alla biforcazione sasanopoplitea induce più costantemente la cancrena di una singola legatura o sito di coagulazione.
Va notato che nei pazienti con PAD e CLTI, l'ischemia degli arti è causata da ostruzione aterosclerotica (un processo cronico). Al contrario, nei modelli murini, l'ischemia degli arti è indotta chirurgicamente (un processo acuto). Sebbene questo modello di cancrena posteriore del topo FVB abbia un esordio relativamente più lento della cancrena con gravità di picco ritardata della perdita tissutale, non è direttamente paragonabile alla stenosi arteriosa cronica e progressiva caratteristica di PAD e CLTI. Altri gruppi hanno sviluppato tecniche di occlusione dell'arteria femorale subacuta utilizzando costrittori ameroidi composti da un manicotto metallico esterno e uno strato interno di materiale che assorbe l'umidità che gradualmente si auto-espande. È stato dimostrato che questa tecnica provoca una diminuzione dell'espressione dei marcatori infiammatori, un minore recupero del flusso sanguigno a 4-5 settimane e una riduzione della necrosi muscolare23,24. Oltre alle differenze nell'acuità dell'ischemia, i modelli preclinici che utilizzano animali giovani e sani non riescono a replicare fattori di rischio come diabete, ipertensione, obesità, iperlipidemia, fumo e infezione che contribuiscono ai principali eventi avversi degli arti e al carico di malattie vascolari.
Nella maggior parte degli studi sull'ischemia degli arti posteriori murini, il ripristino del flusso sanguigno all'arto posteriore ischemico è tipicamente valutato tramite LDPI24,25. Questo metodo non è invasivo e ripetibile, ma può essere influenzato dalla temperatura corporea interna, dall'uso di anestetici, dalla presenza di peli e dal posizionamento degli arti posteriori26. La standardizzazione di queste procedure e l'utilizzo dell'arto posteriore non legato come controllo interno possono aiutare a mitigare eventuali variazioni. A differenza di LDPI, micro-CT e MRA forniscono informazioni anatomiche 3D ad alta risoluzione, ma tradizionalmente richiedono l'iniezione di mezzo di contrasto16. Anche la microangiografia a raggi X è invasiva e tecnicamente impegnativa16,27. Come il DiI, la perfusione con agenti di colata in silicone radiopaco consente la ricostruzione 3D post-mortem della vascolarizzazione periferica28. L'iniezione intracardiaca o della vena della coda di lectina fluorescente è stata descritta anche per l'etichettatura della vascolarizzazione tissutale29. Dopo la raccolta dei tessuti di interesse, la colorazione immunoistochimica con marcatori endoteliali specifici (ad esempio, CD31, fattore di von Willebrand) viene spesso utilizzata per quantificare la densità capillare30.
Rispetto alle tecniche sopra menzionate, la perfusione DiI offre diversi vantaggi. In primo luogo, i reagenti e i materiali necessari sono relativamente economici, a condizione che sia disponibile l'accesso a un microscopio a scansione laser confocale. Questo metodo consente la ricostruzione 3D della vascolarizzazione, che può essere quantificata utilizzando un software di analisi delle immagini. Mentre questo protocollo si concentra sulla vascolarizzazione del footpad, l'imaging a montaggio intero di altri tessuti artiformi posteriori murini, in particolare i muscoli gastrocnemio e adduttore, è anche fattibile e rilevante per gli studi di angiogenesi e arteriogenesi19 . Questa tecnica può essere modificata per modelli animali più grandi, inclusi ratti e conigli, aumentando il volume delle soluzioni di perfusione. Tuttavia, i vincoli di imaging relativi alle dimensioni dei tessuti sono descritti di seguito.
Le porzioni critiche della perfusione DiI sono le seguenti. Le bolle d'aria nell'apparecchio possono occludere piccoli vasi e ostacolare la distribuzione del DiI in tutta la vascolarizzazione, influenzando così i risultati dell'imaging. Pertanto, è necessario prestare attenzione a rimuovere eventuali bolle d'aria nell'apparato del rubinetto e nei tubi prima della perfusione. Si consiglia inoltre di filtrare tutte le soluzioni tranne il DiI attraverso un filtro per bottiglie da 0,22 μm per rimuovere eventuali microparticelle. Durante la perfusione intracardiaca, monitorare attentamente i polmoni. Se si ingrandiscono e diventano di colore rosa, questo è un segno che l'ago della farfalla è penetrato attraverso il ventricolo destro e deve essere leggermente retratto.
Un'importante limitazione della perfusione DiI è la natura terminale della procedura, che non consente misurazioni ripetute. Poiché scarsi risultati di perfusione possono riflettere l'insufficienza arteriosa sottostante o un errore tecnico, si raccomanda la raccolta e l'imaging dell'arto posteriore non legato come controllo interno. Per quanto riguarda l'imaging, lo spessore ottimale del tessuto per la penetrazione laser è di ~ 1 mm dopo la compressione. Di conseguenza, i tessuti più grandi richiedono il sezionamento in pezzi più piccoli da montare su vetrini e alloggiati sullo stadio del microscopio e tempi di acquisizione delle immagini proporzionalmente più lunghi.
In sintesi, questo protocollo delinea un modello preclinico unico per lo studio di PAD e CLTI. In particolare, la coagulazione dell'arteria femorale e della vena con la somministrazione concomitante di L-NAME, un inibitore NOS, induce in modo affidabile la perdita di tessuto nelle pedane dei topi FVB. La perfusione di DiI intracardiaca post-mortem viene quindi utilizzata per etichettare la vascolarizzazione in modo fluorescente. La successiva imaging a montaggio intero dei piedi raccolti con microscopia a scansione laser confocale consente la ricostruzione 3D ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad e la visualizzazione di reti arteriose e capillari che integrano i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione nei modelli di ischemia degli arti posteriori.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a Z-J L e OC V dal National Institutes of Health [R01HL149452 e VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Ringraziamo anche la Microscopy and Imaging Facility del Miami Project to Cure Paralysis presso la University of Miami School of Medicine per aver fornito l'accesso al loro software di analisi ed elaborazione delle immagini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
