Summary
본 프로토콜은 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 유도하기 위해 대퇴골 동맥 및 정맥 전기응고와 산화질소 합성효소 억제제의 투여를 결합한 말초 동맥 질환의 독특하고 임상적으로 관련된 모델을 기술한다. 심장 내 DiI 관류는 풋패드 혈관 구조의 고해상도, 입체 영상화에 사용됩니다.
Abstract
말초 동맥 질환 (PAD)은 죽상 경화성 위험 인자에 대한 만성 노출로 인한 이환의 중요한 원인입니다. 가장 심한 형태, 만성 사지를 위협하는 허혈 (CLTI)으로 고통받는 환자는 만성 통증, 통증이없는 제한된 도보 거리 및 치유되지 않는 상처를 포함하여 일상 생활에 상당한 장애에 직면합니다. 전임상 모델은 PAD를 연구하기 위해 다양한 동물에서 개발되었지만 마우스 뒷다리 허혈은 여전히 가장 널리 사용되고 있습니다. 이들 모델에서 허혈성 모욕에 대한 반응에서 상당한 변동이 있을 수 있는데, 사용된 마우스 균주 및 동맥 파괴의 부위, 수 및 수단에 의존한다. 이 프로토콜은 CLTI의 조직 손실과 유사한 프렌드 바이러스 B (FVB) 마우스에서 발판 괴괴를 안정적으로 유도하기 위해 대퇴 동맥 및 정맥 전기 응고를 산화 질소 신타제 (NOS) 억제제의 투여와 결합하는 독특한 방법을 설명합니다. 레이저 도플러 관류 영상 (LDPI)과 같은 재관류를 평가하는 전통적인 수단이 여전히 권장되지만, 친유성 염료 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염 (DiI)의 심장 내 관류는 혈관 구조를 라벨링하는 데 사용됩니다. 후속 전체 마운트 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사는 뒷다리 허혈 모델에서 재관류를 평가하는 전통적인 수단을 보완하는 풋패드 혈관 네트워크의 고해상도, 3차원(3D) 재구성을 가능하게 합니다.
Introduction
죽상 동맥 경화증으로 인해 사지로의 혈류 감소를 특징으로하는 말초 동맥 질환 (PAD)은 미국에서 6.5 백만 명과 전 세계적으로 2 억 명에게 영향을 미칩니다1. PAD 환자는 사지 기능과 삶의 질이 저하 된 경험을하고, PAD의 가장 심각한 형태 인 CLTI를 가진 환자는 절단 및 사망 위험이 증가하며 5 년 사망률은 50 % 2에 가깝습니다. 임상 실습에서, 발목-상완 지수(ABI) <0.9를 갖는 환자는 PAD를 갖는 것으로 간주되고, ABI <0.4를 갖는 환자는 CLTI3을 갖는 것으로 휴식 통증 또는 조직 손실과 관련된다. 증상은 일상 활동, 허혈에 대한 근육 내성, 해부학 적 변화 및 부수적 인 발달의 차이에 따라 유사한 ABI를 가진 환자간에 다릅니다4. 디지트 및 사지 괴저(Digit and limb gangrene)는 CLTI를 초래하는 모든 혈관 폐쇄성 질환 중 가장 심각한 증상이다. 그것은 연조직을 미라화하는 건조한 괴사의 한 형태입니다. 죽상 경화성 PAD 외에도 당뇨병, Buerger 병 및 Raynaud 현상과 같은 혈관염 또는 말기 신장 질환의 설정에서 calciphylaxis 환자에서도 관찰 될 수 있습니다5,6.
PAD / CLTI의 발병 기전을 연구하고 잠재적 인 치료법의 효능을 테스트하기 위해 몇 가지 전임상 모델이 개발되었으며, 그 중 가장 흔한 것은 마우스 뒷다리 허혈로 남아 있습니다. 마우스에서 뒷다리 허혈을 유도하는 것은 전형적으로 봉합사 결찰, 전기 응고 또는 원하는 혈관을 수축시키는 다른 수단에 의해, 장골 또는 대퇴골 동맥으로부터의 혈류의 방해에 의해 달성된다7. 이 기술은 뒷다리에 대한 관류를 크게 줄이고 허벅지와 종아리 근육의 신생혈관화를 자극합니다. 그러나, 부수적 분포의 해부학적 차이로 인해 허혈성 모욕에 대한 민감도에 필수적인 뮤린 균주-의존적 차이가 부분적으로 존재한다8,9. 예를 들어, C57BL/6 마우스는 뒷다리 허혈에 상대적으로 내성이 있어 사지 기능이 감소하지만 일반적으로 발판에서 괴저에 대한 증거는 없다. 반면에, BALB/c 마우스는 허혈로부터 회복할 수 있는 능력이 본질적으로 열악하며, 전형적으로 대퇴골 동맥 결찰 단독 후 발 또는 하부 다리의 자동 절단을 일으킨다. 허혈에 대한이 심한 반응은 치료 창을 좁히고 사지 재관류 및 기능에 대한 종단 평가를 배제 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 뮤린 염색체 7에 위치한 단일 정량적 형질 유전자좌의 유전적 차이는 조직 괴사 및 사지 재관류에 대한 C57BL/6 및 BALB/c 마우스의 이러한 차별적 감수성에 연루되어 있다10.
C57BL/6 및 BALB/c 균주와 비교하여, FVB 마우스는 대퇴골 동맥 결찰 단독에 대해 중간이지만 일관성 없는 반응을 보인다. 일부 동물은 검은 허혈성 손톱이나 미라화 된 숫자의 형태로 발판 괴저가 발생하지만 허혈의 명백한 징후가없는 동물도 있습니다11. 산화질소 합성효소(NOS) 억제제12인 Nω-Nitro-L-아르기닌 메틸 에스테르 염산염(L-NAME)의 병용 투여는 보상 혈관 확장 기작을 예방하고 뒷다리 조직의 산화 스트레스를 더욱 증가시킨다. 대퇴골 동맥 결찰 또는 응고와 함께, 이 접근법은 CLTI의 위축성 변화와 유사한 FVB 마우스에서 지속적으로 풋패드 조직 손실을 발생시키지만, 사지 자동 절단으로 거의 진행되지 않는다11. 산화 스트레스는 PAD / CLTI의 특징 중 하나이며 내피 기능 장애와 산화 질소 (NO) 13,14의 생체 이용률 감소에 의해 전파됩니다. NO는 일반적으로 동맥 및 모세관 혈류, 혈소판 부착 및 응집, 백혈구 모집 및 활성화에 유익한 효과를 발휘하는 다능성 분자이다13. NOS의 감소된 수준은 또한 산화 스트레스를 유도하고 죽상동맥경화증의 진행을 가속화하는 안지오텐신 전환 효소를 활성화시키는 것으로 나타났다15.
일단 뒷다리 허혈의 모델이 확립되면, 후속 사지 재관류 및 잠재적 인 치료법의 치료 효과를 모니터링하는 것도 필요합니다. 제안 된 뮤린 괴저 모델에서, 조직 손실의 정도는 먼저 Faber 점수를 사용하여 발의 총 모양을 평가하기 위해 정량화 될 수 있습니다 (0 : 정상, 1-5 : 점수가 영향을받는 손톱의 수를 나타내는 손톱 손실, 6-10 : 점수가 영향을받는 숫자의 수를 나타내는 숫자의 위축, 11-12 : 부분적이고 완전한 발 위축, 각각)9. 그런 다음 뒷다리 관류의 정량적 측정은 일반적으로 LDPI를 사용하여 이루어지며, LDPI는 레이저 광과 적혈구 사이의 도플러 상호 작용에 의존하여 관심 영역 (ROI)16에서 픽셀 수준의 관류를 나타냅니다. 이 기술은 양적, 비침습적, 반복적 인 측정에 이상적이지만 뒷다리 혈관 구조의 세분화 된 해부학 적 세부 사항을 제공하지는 않습니다16. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (micro-CT), 자기 공명 혈관 조영술 (MRA) 및 X 선 미세 혈관 조영술과 같은 다른 이미징 양식은 비용이 많이 들고 정교한 계측이 필요하거나 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다16. 2008년에, Li et al.은 친유성 카르보시아닌 염료 DiI17로 망막 내 혈관을 표지하는 기술을 기술하였다. DiI는 내피 세포로 통합되고, 직접 확산에 의해, 혈관신생 새싹채소 및 유사 포드 과정과 같은 혈관막 구조를 염색한다17,18. 내피 세포로의 직접 전달과 염료의 형광성이 높기 때문에이 절차는 혈관의 강렬하고 오래 지속되는 라벨링을 제공합니다. 2012년에, Boden et al.은 대퇴골 동맥 결찰 후 수확된 허벅지 부가물 근육의 전체 탑재 영상화를 통해 뮤린 뒷다리 허혈 모델에 DiI 관류 기술을 적용하였다19.
현재의 방법은 뒷다리 허혈 및 유전자 또는 세포 기반 치료제에 반응하여 신생혈관화를 평가하기 위한 비교적 저렴하고 기술적으로 실현 가능한 방법을 제공한다. 추가의 적응에서, 이 프로토콜은 뒷다리 괴저의 뮤린 모델에서 발판 혈관구조를 고해상도로 그리고 3D로 이미지화하기 위한 DiI 관류의 적용을 기술한다.
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Protocol
프로토콜에 기재된 모든 동물 실험은 마이애미 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받았다. FVB 마우스, 8-12 주 나이의 남성과 여성 모두 연구에 사용되었다.
1. L-NAME 용액의 제조
- 층류 후드의 멸균 조건 하에서, L-NAME 분말 1g( 물자재 표 참조) 1g을 멸균수 20mL와 용해시켜 50mg/mL의 용액을 만들어 L-NAME 원액을 준비한다. 원액을 -20°C에서 300-500 μL 분취량으로 최대 3개월 동안 보관한다.
- 작동 L-NAME 용액을 만들기 위해, L-NAME 원액의 분취량을 해동하고 멸균 조건 하에서 PBS (1:4)로 희석하여 최종 10 mg/mL 농도를 얻었다.
- PBS (pH 7.4)를 제조하기 위해, 800 mL의 증류수에 8 g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g의 Na2HPO4, 및 0.23 g의 NaH2PO4를 용해시켰다. HCl로 pH를 7.4로 조정하십시오. 총 부피 1,000 mL에 물을 넣고 0.22 μm 병 탑 필터를 통해 여과하십시오.
참고 : L-NAME 작업 용액의 4 μL / g의 복강 내 (IP) 주사는 L-NAME의 원하는 40 mg / kg 용량과 동일합니다. L-NAME 작업 용액은 사용 중에 얼음 위에 보관해야하며 새로 해동 된 원액 분취량을 사용하여 매일 새로운 희석액을 만들어야합니다.
2. 뒷다리 괴저의 화학 및 외과 적 유도
- 브리더 스 또는 시설에서 자란 8-12 주 된 FVB 마우스를 얻으십시오 ( 자료 표 참조). 수술 2 시간 전에 L-NAME의 40 mg / kg IP 용량을 투여하십시오.
- PBS에 희석된 케타민 100mg/kg과 자일라진 10mg/kg( 자료표 참조)의 IP 주사로 마우스를 마취시킨다. 발가락 꼬집음 반사가 없어 적절한 진정을 확인하고 절차 중에 호흡률을 계속 모니터링하십시오.
- 가위 및 / 또는 탈모 크림을 사용하여 양측 뒷다리와 사타구니에서 머리카락을 제거하십시오. 동물을 수술 현미경 하에 위치시키는 수핀; 사지를 제자리에 뻗어 테이프로 붙입니다. 포비돈-요오드 용액을 수술 부위에 원주적으로 적용하여 수술 현장을 멸균한다.
- 10-20x 배율로 가위 또는 메스를 사용하여 사타구니 주름을 따라 1cm 절개를 만들어 사타구니 인대보다 열등합니다. 미세한 포셉과 멸균 면화 팁 어플리케이터를 사용하여 사타구니 지방 패드를 사타구니 인대에서 옆으로 둔감하게 해부하고 대퇴골 동맥, 정맥 및 신경이 명확하게 식별되도록 기본 대퇴골 외피를 노출시킵니다 (그림 1).
- 미세한 포셉을 사용하여 대퇴골 덮개를 관통하십시오. 조심스럽게 대퇴 동맥에서 대퇴 신경을 닦으십시오. 대퇴골 신경에 깊은 대퇴동맥(LCFA)의 측방주플렉스 분지의 이륙을 확인한다(그림 1).
- 소작 장치 ( 재료 표 참조)를 활성화하고 좌우 운동으로 혈관을 부드럽게 접촉시켜 대퇴골 동맥과 정맥의 전기 응고를 LCFA에 바로 앞당겨 대퇴골 신경이 잘 분리되어 있고 열 손상으로부터 보호되도록하십시오. 응고 된 용기 세그먼트를 가위로 나눕니다.
- 사타구니 지방 패드를 중앙으로 동원하여 원위 대퇴골 동맥과 정맥의 노출을 진행하십시오. 피상적 인 상복부 동맥과 saphenopopliteal 접합을보다 멀리 식별하십시오.
- 이 두 위치 사이의 대퇴골 외피를 관통하고 대퇴골 혈관에서 대퇴골 신경을 조심스럽게 해부하십시오. 단계 2.4.1에 기술된 바와 같이 대퇴골 동맥 및 정맥의 응고 및 횡단을 진행한다.
- 멸균 PBS로 채워진 주사기를 사용하여 수술 현장을 관개한다. 출혈의 모든 부위에 3-5 분 동안 면봉 팁 어플리케이터로 부드러운 압력을 가하여 지혈을 얻으십시오.
- 간단한 연속 방식으로 흡수 가능한 5-0 봉합사를 사용하여 절개 폐쇄를 진행하십시오. 수술 후 통증 완화를 위해 서방성 부프레노르핀의 1mg/kg 피하 용량( 자료 표 참조)을 투여하십시오.
- LDPI에 의한 결찰된 뒷다리에서의 풋패드 관류 손실을 확인 한다(물자의 표 참조). 여전히 마취 된 상태에서 LDPI 기계 아래의 경향이있는 어두운 거품 패드에 동물을 놓고 전기 테이프 루프를 사용하여 발을 제자리에 고정하십시오.
- 양측 발의 LDPI로 진행하십시오. 스캔이 완료되면 각 풋패드 주위에 ROI를 그리고 평균 플럭스 값을 구하십시오.
- 관류 지수를 라이게이션된 풋패드에서 비라이게이션된 풋패드로부터의 평균 플럭스 값의 비로 계산하십시오. 관류 지수가 0.1보다 작은지 확인하십시오.
- 핵심 체온을 유지하기 위해 가열 패드 또는 오버 헤드 램프가있는 깨끗한 케이지로 동물을 다시 옮깁니다. 생쥐를 동물 시설로 다시 옮기기 전에 마취에서 완전한 회복을 보장하십시오.
3. L-NAME의 수술 후 관리 및 뒷다리 괴저의 모니터링
- 수술 후 1-3 일에 각 동물에게 L-NAME의 추가 40 mg / kg IP 용량을 투여하십시오. 동시에, 허혈성 사지에서 발을 조심스럽게 평가하십시오.
- Faber 뒷다리 허혈 스코어를 사용하여 뒷다리 허혈 및 괴저의 정도를 정량화9. 스코어 1-5: 허혈성 손톱의 수; 스코어 6-10: 허혈성 숫자 1-5; 점수 11 및 12 : 부분적이고 완전한 발 위축. 수술 후 1-3 일에 Faber 점수를 기록 한 다음 매주 기록하십시오.
4. DiI의 제조 및 동물 관류를위한 작업 솔루션
- DiI 원액을 제조하기 위해, 100 mg의 DiI 결정( 물자 표 참조)을 100% 에탄올 16.7 mL에 용해시킨다. 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 어둠 속에서 밤새 흔들리는 플랫폼에 두십시오.
- 희석제를 제조하기 위해, 글루코스 50 g을 증류수 1,000 mL에 용해시켜 5% 글루코스 용액을 수득하였다. 0.22 μm 병 상부 필터를 통해 여과한다. PBS와 5% 글루코스 용액을 1:4 비율로 혼합하여 작동 희석제 용액을 제조하였다.
5. 장비 설정 및 DiI 관류
- 사용 직전에 작업 희석액 10 mL에 DiI 원액 200 μL를 첨가하여 DiI 작업 용액을 만든다(단계 4.2에서 제조). 잘 섞이기 위해 손으로 흔든다.
- 두 개 또는 세 개의 3 방향 스토콕과 25G 나비 바늘을 직렬로 연결하십시오. PBS 4 mL, DiI 용액 10 mL, 및 10 mL의 10% 중성 완충 포르말린으로 10 mL 주사기를 제조하였다( 표 참조).
- 포르말린으로 주사기를 근위 유입 포트에 연결하고 용액을 주입하여 라인에서 공기를 플러시하십시오. 스톱콕을 돌려 포트를 닫습니다. 동일한 절차를 순차적으로 반복하여 주사기를 DiI와 연결한 다음 PBS를 각각 중간 및 원위 유입 포트에 연결하여 스톱콕 어셈블리를 통해 모든 기포를 플러시하도록 주의하십시오.
주: 스톱콕 조립품 또는 튜브의 어느 부분에도 기포가 없는지 확인하십시오. 기포는 관류 중에 작은 동맥을 막아 혈관 내 DiI 분포가 좋지 않고 이미징 결과가 손상 될 수 있습니다. - 설치가 완료되면 유도 챔버에서 CO2 과다 복용으로 동물을 안락사시킵니다.
- 흡수 패드의 수핀 위치에 관류 할 동물을 놓고 바늘로 겨드랑이와 하지를 고정하십시오.
- 가위를 사용하여 복강을 열기 위해 횡단 절개를하십시오. 왼쪽과 오른쪽 횡격막을 노출시킨 다음 나누어 흉강에 접근하십시오.
- 흉골의 양쪽에있는 흉벽을 아래쪽 갈비뼈에서 첫 번째 또는 두 번째 갈비뼈로 자르고 내부 흉부 (유방) 동맥을 중앙으로 피하십시오. 지혈제 ( 재료 표 참조)를 사용하여 흉골의 하단을 잡고 동물의 머리 쪽으로 반사하여 흉강을 노출시킵니다.
- 우심실보다 색상이 가벼워 보이는 좌심실을 확인하십시오. 무딘 포셉으로 심장을 부드럽게 잡고 나비 바늘을 좌심실에 삽입하십시오.
- 가위 또는 18G 바늘을 사용하여 오른쪽 심방을 뚫어 혈액과 관류 용액이 심장으로 돌아가 배출되도록하십시오. 한 두 손으로 바늘을 안정시키고 실수로 우심실에 구멍을 뚫지 않도록주의하고 전신 순환보다는 폐를 관류시키지 않도록주의하십시오.
- PBS로 주사기에 포트를 열고 수동으로 2-4 mL를 1-2 mL / min의 속도로 1-2 분 동안 주사하여 혈관 시스템에서 혈액을 플러시하십시오. 오른쪽 심방에서 출혈을 관찰하여 성공적인 관류를 보장하십시오. 주사 후, PBS 주사기의 포트를 닫는다.
- DiI로 주사기의 포트를 열고 5 분 동안 1-2 mL / min의 속도로 5-10 mL를 주입하십시오. DiI 용액의 주입으로 약간 분홍색으로 변해야하는 귀, 코 및 손바닥을 모니터링하십시오. 주사 후, DiI 주사기의 포트를 닫고 고정제를 주입하기 전에 염료의 혼입을 허용하기 위해 2 분 동안 기다리십시오.
- 포르말린으로 주사기에 포트를 열고 5 분 동안 1-2 mL / 분의 속도로 5-10 mL를 주입하십시오. 주사 후, 좌심실에서 바늘을 제거하고 관심있는 조직을 수확하기 위해 진행하십시오.
- 무거운 가위를 사용하여 발목의 경골을 탈구하여 왼쪽 발과 오른쪽 발을 다리 아래에서 완전히 분리하십시오. 수확한 발을 10% 포르말린 용액 1-2mL와 함께 6웰 또는 12웰 플레이트에 넣습니다. 플레이트를 호일로 감싸고 하룻밤 사이에 4°C에서 보관한다.
6. 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 위한 풋패드 조직의 제조
- 다음날, 6- 또는 12-웰 플레이트 중의 고정 용액을 웰 당 PBS 1-2 mL로 교체한다.
- 발을 피부로 가꾸려면 먼저 발바닥과 등쪽 측면에 메스가있는 세로 절개를하십시오. 그런 다음 치아가있는 포셉과 작은 지혈제를 사용하여 발과 숫자에서 모든 피부를 조심스럽게 제거하고 기본 연조직을 손상시키지 마십시오.
- 조직의 장착 및 이미징, 바람직하게는 관류 및 수확 후 1-2 일 이내에 진행하십시오. 대안적으로, 풋패드를 1-2 mL의 PBS와 함께 6- 또는 12-웰 플레이트로 복귀시키고; 호일로 덮고 4°C에서 보관하여 최대 1개월 동안 형광을 유지한다.
- 조직을 장착하려면 두 개의 유리 현미경 슬라이드 사이에 발을 개별적으로 놓고 거품 생검 패드를 접은 후 (조직 두께에 따라 한두 번) 양쪽 끝에 놓습니다 ( 재료 표 참조). 두 개의 작은 바인더 클립을 사용하여 각 끝에서 유리 슬라이드를 함께 압축합니다(최종 두께 약 1mm).
참고: 조직이 두꺼워지면 더 긴 스캔 시간이 필요합니다. 스킨 풋패드는 이미징 하루 전에 유리 슬라이드 사이에서 압축되어 조직 두께를 줄일 수 있습니다.
7. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사
- 이미징 세션 준비: 이미징 시스템을 켜고 수집 소프트웨어를 시작합니다( 자료 표 참조). 낮은 배율/낮은 숫자 조리개 목표(예: x5/0.15)를 사용하여 낮은 배율 렌즈가 일반적으로 이 실험에 더 긴 작동 거리를 갖기 때문에 이미지를 캡처합니다.
- 스테이지 활성화 대화 상자에서 예를 클릭합니다. 구성 탭에서 561nm 레이저를 활성화합니다. 메인 화면에서 Visible 버튼을 클릭하여 보이는 빔 경로를 활성화하십시오. 해당 활성 확인란을 클릭하여 검출기를 570-600nm 범위로 설정합니다.
- > 획득 탭에서 타일 스캔 아이콘을 선택하고 원하는 해상도(512 x 512 또는 1024 x 1024)를 설정합니다.
- 유리 슬라이드 사이에 압축된 건식 장착형(물 또는 PBS 첨가 없음) 조직 샘플을 현미경 스테이지에 배치하고 조직에 초점을 맞춥니다.
- 스캔 경계를 설정하려면 샘플의 왼쪽 위 또는 오른쪽 모서리로 이동합니다. 획득 탭의 타일 스캔 메뉴에서 마크 위치 버튼을 클릭합니다. 반대쪽 모서리(각각 오른쪽 아래 또는 왼쪽)로 이동하고 위치 표시 단추를 다시 한 번 클릭합니다.
- Z 스택의 깊이를 설정하려면 화면의 왼쪽 아래 모서리에 있는 라이브 단추를 클릭하고 샘플의 가운데로 이동합니다. z축 노브를 사용하여 샘플 아래쪽으로 스크롤합니다.
- 획득 탭의 Z-스택 메뉴에서 시작 버튼을 클릭합니다 . 샘플 상단으로 스크롤하여 끝 단추를 클릭합니다. Z 스텝 사이즈를 클릭하고 원하는 값(예: 50μm)으로 설정합니다.
- 화면의 오른쪽 하단에서 시작 을 클릭하여 이미지 수집을 시작하십시오.
8. 발판 혈관의 정량적 분석 및 3D 재구성
- 피지 (ImageJ)의 최신 버전과 선박 분석 플러그인20을 다운로드하여 설치하십시오. 피지에서 현미경 이미지 파일을 열면 이미지 하단의 슬라이더를 사용하여 개별 Z 시리즈를 Z 축에서 볼 수있는 Z 스택으로 결합합니다.
- 합성 Z 스택 이미지를 선택한 다음 이미지 메뉴에서 Z 프로젝트> 스택 을 선택하여 이차원 투영을 만듭니다. 그런 다음 바이너리 만들기 > 프로세스>서 Z 프로젝션을 바이너리로 변환하십시오.
- 플러그인 > 혈관 밀도에서 혈관 밀도 플러그인을 실행하십시오. 메시지가 표시되면 커서를 사용하여 풋패드와 숫자의 둘레에서 ROI를 추적합니다. 보고되는 혈관 밀도를 기록하고, 이는 ROI(혈관 면적 분율)의 백분율로서 표현된다.
- 피지에서 3D 재구성을 만들려면 3D 프로젝트> 스택을 선택하고 이미지 메뉴에서 원하는 회전 축, 각도 및 속도를 설정합니다. 또는 플러그인 메뉴에서 볼륨 뷰어를 선택하여 이미지를 슬라이스로 시각화하거나 원하는 축에서 재구성을 조작합니다.
- 3D 렌더링에 대한 자세한 내용은 대체 이미지 분석 및 처리 소프트웨어를 사용하십시오( 자료 표 참조). 파일을 원하는 소프트웨어 형식으로 변환하고 타일 스티칭 기능을 사용하여 개별 타일 스캔을 스티치합니다.
- 개별 타일 스캔을 함께 바느질한 후 복합 파일을 열고 볼륨 표면 렌더링을 진행합니다. 새 서피스 추가를 클릭하여 서피스 생성 마법사를 열고 화살표를 사용하여 메뉴를 전환하고 특히 ROI 및 임계값 강도를 설정합니다. 표면 렌더링에 만족하면 애니메이션 기능을 사용하여 처리된 이미지의 비디오를 만듭니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 감수성이 있는 FVB 마우스에서 대퇴골 동맥 및 정맥 응고와 L-NAME 투여, 산화질소 신타제 억제제의 조합을 사용하여 뮤린 풋패드에서 허혈 및 조직 손실을 유도하는 신뢰할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 도 1 은 뮤린 뒷다리 혈관구조의 해부학을 상세히 기술하고 대퇴골 동맥 및 정맥 응고 부위(황색 X)를 나타내며, 측방둘레 대퇴골 동맥(LCFA)에 바로 근접하고 사페노포플라이트 접합부에 근위한다. LCFA를 식별해야 하며, 이 구조에 해당하는 응고 부위는 모든 수술 과정 전반에 걸쳐 일관되게 유지됩니다. 기술된 바와 같이, 수술 절차 2시간 전과 수술 후 1-3일에, 마우스는 또한 산화 스트레스의 상승된 조직 수준을 유지하기 위해 L-NAME의 40 mg/kg IP를 투여하였다. 도 2 는 수술 일주일 후 이 모델로부터 예상될 수 있는 조직 손실의 변화를 보여주며, Faber 스코어9 는 각 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 기록된다.
DiI 관류는 허혈의 유도에 따른 뒷다리 재관류를 평가하기 위해 대퇴동맥 및 정맥 응고 후 5 및 20일에 FVB 마우스에서 수행되었다. 도 3A는 흉강을 노출시키기 위한 해부 후 뮤린 해부학을 도시한다. 나비 바늘이 심장 관류를 시작하기 위해 좌심실에 삽입됩니다. 좌심실은 우심실보다 약간 더 창백하게 보입니다. 도 3B는 직렬로 연결된 스톱콕과 PBS, DiI 용액 및 고정제로 채워진 3개의 주사기로 설정된 장비를 묘사한다. DiI 관류 후, 발을 수확하고, 껍질을 벗기고, 현미경 슬라이드 사이에서 5x 배율로 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 이미징하기 전에 그림 3C, D와 같이 압축했습니다. 재건 현미경 검사 이미지는 수술 5일 후 결찰된 뒷다리의 풋패드에 대한 관류가 심각하게 감소한 것과 비교하여 비결찰 대조군 풋패드(그림 4A)에서 정상 혈관 해부학을 밝혀냈다(도 4B). 수술 이십 일 후, 풋패드로의 관류가 유의하게 개선되었지만(도 4C, D, 및 도 5B), 비록 비결찰 조절의 정도까지는 아니었다(도 4A 및 도 5A). 혈관성은 피지에서 혈관 밀도 플러그인을 사용하여 전술한 바와 같이 정량화되었다. 대조군 풋패드에 대한 혈관 분획은 28%였다. 수술 5일 후, 풋패드 혈관 분획은 2%로 심하게 감소하였으나 수술 후 20일까지 두 마리의 분리된 마우스에서 15%와 18%로 점진적으로 회복되었다. 풋패드 혈관 해부학을 3D로 시각화하기 위해 스티치된 현미경 이미지를 대체 이미지 분석 및 처리 소프트웨어로 가져와 앞에서 설명한 대로 표면 렌더링을 만들었습니다(보충 그림 1). 그런 다음 애니메이션 기능을 사용하여 표면 렌더링 비디오를 만들었습니다(비디오 1).
그림 1 : 뮤린 뒷다리 혈관 구조와 대퇴 동맥 및 정맥 응고 부위의 해부학. 외부 장골 동맥은 사타구니 인대에 대한 대퇴 동맥 (FA) 원위로서 계속됩니다. 대퇴 동맥의 첫 번째 지점에는 측면 둘레 (LCFA)와 깊은 대퇴 동맥 (그림이 아님)이 포함됩니다. 보다 원위적으로, 근위 인과 대퇴골 (PCFA) 및 표면 꼬리 상복부 동맥 (SCEA)은 FA 근위로부터 사페누스 (SA) 및 popliteal 동맥 (PA)의 분기로 분기한다. 대퇴골 신경 (FN)은 대퇴골 혈관과 함께 진행되며 대퇴골 혈관이 응고되기 전에 부드럽게 격리되어야합니다. FA 및 대퇴골 정맥 (FV) 응고 부위도 또한 표시된다 (X). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 상응하는 Faber 스코어를 갖는 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저의 대표적인 이미지. 이 모델에 의해 유도되는 허혈성 변화의 정도는 하나 이상의 허혈성 손톱 (Faber 점수 1-5)에서 괴저성 숫자 (Faber 점수 6-10) 및 부분적 또는 완전한 발 위축에 이르기까지 다양합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DiI 관류를 위한 동물 해부 및 장비 설정 및 이미징을 위한 마우스 발의 장착. (A) DiI 관류 중 뮤린 해부학의 해부학적 사진. 복부와 흉강이 열리고 흉골이 반사되며 갈비뼈가 흉골의 양쪽에서 절단됩니다. 스톱콕 어셈블리에 연결된 25G 나비 바늘이 좌심실에 삽입됩니다. (B) 3개의 3방향 스톱콕이 직렬로 연결된다. 세 개의 10 mL 주사기가 고정제, DiI 및 PBS로 채워지고 스톱콕 어셈블리에 연결된다. 25G 나비 바늘은 근위 스토콕의 유출 포트에 연결됩니다. (C) 접힌 폼 생검 패드와 바인더 클립이 있는 두 개의 현미경 슬라이드 사이에 스키닝된 발을 양쪽 끝에 장착하여 슬라이드를 함께 압축합니다. (D) 현미경 슬라이드 사이에 압축된 피부 발의 대안적인 관점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 정량화된 혈관 밀도를 갖는 DiI 관류에 이어 마우스 풋패드의 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 얻어진 대표적인 5x 이미지는 ROI의 퍼센트로서 표현된다. (A) 정상 풋패드 혈관구조. (B) 대퇴동맥 및 정맥 응고 후 5일 후에 풋패드 혈관구조는 혈관 혼탁을 최소화하면서 심하게 감소된 관류를 나타낸다. (C) 대퇴골 동맥 및 정맥 응고 후 20 일 후에 발판 혈관 구조는 중족골 및 디지털 동맥으로의 원위 흐름의 재구성을 입증한다. (d) 미세혈관 혼탁에 비해 최소 큰 혈관을 나타내는 대퇴동맥 및 정맥 응고 20일 후에 얻어진 추가의 마우스 풋패드의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 풋패드 혈관구조의 확대된 이미지. (a) 중족골 및 디지털 동맥을 통한 온전한 관류를 보여주는 제어 발판 혈관구조의 5x 및 20x 이미지. (b) 수술 후 20일 동안 결찰된 뒷다리로부터의 풋패드의 5x 및 20x 이미지는 더 큰 중족골 동맥 분지를 통한 감소된 관류를 보여주지만 광범위하고 봉제 모세관 네트워크의 발달을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 풋패드 혈관의 3D 표면 렌더링 애니메이션. 풋패드 혈관구조의 표면 렌더링을 표시하는 비디오는 설명된 프로토콜로 달성할 수 있는 3D 해상도를 예시한다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: DiI 관류 이미지의 표면 렌더링 단계. (A) 이미지 분석 및 처리 소프트웨어로 가져온 원본 DiI 관류 이미지. (B) 임계 강도를 설정하는 동안 DiI 관류 이미지에 오버레이된 표면 렌더링. (C) DiI 관류 현미경 이미지의 최종 3D 표면 렌더링. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마우스 뒷다리 허혈은 PAD 및 CLTI에서 신생혈관화를 연구하기 위해 가장 널리 사용되는 전임상 모델이지만, 사용된 특정 마우스 균주 및 동맥 파괴의 부위, 수 및 방법에 따라 허혈 중증도 및 회복에 상당한 차이가 있다. 대퇴골 동맥 결찰 및 L-NAME의 IP 투여의 조합은 FVB 마우스11에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 확실하게 유도할 수 있다. 동일한 치료로 C57BL/6 마우스에서 조직 손실이 없는 뒷다리 허혈이 발생하는 반면, BALB/c 마우스에서는 발이나 다리의 자동 절단이 대퇴골 동맥 결찰만으로 유도될 수 있습니다. 이와 같이, 허혈 모욕에 대한 중간 반응을 갖는 FVB 마우스에서 L-NAME 동시 투여를 통한 대퇴골 동맥 응고의 전술한 기술은 CLTI로 이어지는 질환의 가장 심각한 징후에서 보여지는 것과 유사한 발판 괴저의 독특하고 재현 가능한 모델을 제공한다. 이 모델에서 관찰 된 조직 손실의 정도는 허혈성 손톱 몇 개에서 여러 괴저성 숫자까지 다양 할 수 있지만 발이나 다리의 자동 절단으로 거의 진행되지 않아 사지 재관류 및 기능의 종방향 평가가 가능합니다. 일반적으로 일주일 이내에 사지 자동 절단이 발생하여 괴저의 발병이 빠른 BALB / c 마우스와는 달리,이 FVB 마우스 괴저 모델에서 조직 손실의 발병이 지연됩니다. 대퇴골 동맥 응고는 뒷다리로의 혈류를 급격하게 제한합니다. 그럼에도 불구하고, 수술 후 0-3일에 L-NAME 투여로 인한 산화 스트레스의 축적은 7-14일 사이에 관찰된 피크 위축성 변화와 함께 더욱 점진적이다. 따라서이 모델은 재관류를 정량화하고 사지 기능을 평가하는 것 외에도 총 조직 외관 및 조직 손실의 구조에 대한 특정 개입의 효과를 평가하기 위해 개선 된 치료 창을 제공합니다.
외과 적 기술과 관련하여 대퇴 동맥과 정맥의 응고 또는 결찰은 대퇴 동맥의 격리와 비교하여이 수술의 상대적 용이성 때문에 선호됩니다. 이 기술은 정맥 혈전증과 부전으로 이어질 수 있지만, 허혈성 모욕을 합성하고 괴짜 변화를보다 안정적으로 유도하는 데 도움이됩니다. 또한 만성 정맥 부전 (CVI)은 일반 인구에서 매우 널리 퍼져 있으며 성인의 10 % -30 %가 영향을받습니다. 일관되게 PAD 환자의 약 20 %, 특히 중증 동맥 부전 환자의 약 20 %가 CVI21,22를 동반합니다. 대퇴골 정맥을 절제하거나 응고하기로 결정하든 관계없이 대퇴골 동맥 파괴의 특정 부위를 실험 그룹에 걸쳐 일정하게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 장골 동맥의 그것과 같은 더 근위 결찰은 추가적인 하류 담보의 폐색으로 이어지고 동맥 생성의 가능성을 제한한다8,16. 그러나 사지의 원위 부분, 특히 위장관 근육의 혈관 신생은 여전히 촉발되어야합니다. FVB 마우스에서, 대퇴골 동맥의 이중 결찰 또는 응고는 측방둘레 대퇴골 동맥에 바로 근접하고 사페노포플리탈 분기에 근접하여 단일 결찰 또는 응고 부위보다 괴저(gangrene)를 더욱 일관되게 유도한다.
PAD 및 CLTI 환자에서 사지 허혈은 죽상 경화성 폐쇄 (만성 과정)에 의해 유발된다는 점에 유의해야합니다. 대조적으로, 마우스 모델에서, 사지 허혈은 외과적으로 유도된다 (급성 과정). 이러한 FVB 마우스 뒷다리 괴저 모델은 조직 손실의 지연된 피크 중증도와 함께 괴저의 비교적 느린 발병을 갖지만, PAD 및 CLTI의 만성적이고 진행성 동맥 협착증 특성과 직접적으로 필적할 만하지는 않다. 다른 그룹들은 외부 금속 슬리브와 점차적으로 스스로 팽창하는 수분 흡수 물질의 내부 층으로 구성된 아메로이드 수축기를 사용하여 아메로이드 수축 기술을 개발했습니다. 이 기술은 염증 마커의 발현 감소, 4-5 주째에 혈류 회복 감소, 근육 괴사 감소23,24를 초래하는 것으로 나타났습니다. 허혈 예민함의 차이 외에도 젊고 건강한 동물을 사용하는 전임상 모델은 당뇨병, 고혈압, 비만, 고지혈증, 흡연 및 감염과 같은 위험 요소를 복제하지 못하여 주요 부작용 및 혈관 질환의 부담에 기여합니다.
뮤린 뒷다리 허혈에 대한 대부분의 연구에서, 허혈성 뒷다리로의 혈류 회복은 전형적으로 LDPI24,25를 통해 평가된다. 이 방법은 비 침습적이고 반복 가능하지만 핵심 체온, 마취 사용, 모발 존재 및 뒷다리의 위치 26에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이러한 절차를 표준화하고 결찰되지 않은 뒷다리를 내부 대조군으로 사용하면 모든 변형을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. LDPI와는 달리, 마이크로 CT 및 MRA는 고해상도의 3D 해부학 정보를 제공하지만 전통적으로 조영제16의 주입이 필요합니다. X선 미세혈관조영술은 또한 침습적이며 기술적으로 도전적이다16,27. DiI와 마찬가지로, 방사선 불투과성 실리콘 주조제를 사용한 관류는 말초 혈관구조의 사후 3D 재구성을 가능하게 한다28. 형광 렉틴의 심장 내 또는 꼬리 정맥내 주사는 또한 조직 혈관구조의 표지29에 대해 기술되었다. 관심있는 조직의 수확 후, 내피 특이적 마커 (예를 들어, CD31, 폰 빌레브란트 인자)를 사용한 면역조직화학적 염색이 모세관 밀도를 정량화하기 위해 종종 사용된다30.
위에서 언급한 기술과 비교하여, DiI 관류는 몇 가지 이점을 제공한다. 첫째, 필요한 시약 및 재료는 비교적 저렴하며, 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 대한 접근이 가능하다. 이 방법은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있는 혈관 구조의 3D 재구성을 허용합니다. 이 프로토콜은 풋패드 혈관구조에 초점을 맞추는 반면, 다른 뮤린 뒷다리 조직, 특히 위장관 및 부가체 근육의 전체 마운트 이미징은 또한 혈관형성 및 동맥 형성19 연구와 관련이 있으며 실현 가능하고 관련이 있습니다. 이 기술은 관류 용액의 부피를 증가시킴으로써 쥐와 토끼를 포함한 더 큰 동물 모델에 대해 변형 될 수 있습니다. 그러나, 조직 크기에 관한 영상화 제약은 하기에 기술된다.
DiI 관류의 임계 부분은 다음과 같다. 장치 내의 기포는 작은 혈관을 폐색시키고 혈관 구조 전체에 걸쳐 DiI의 분포를 방해하여 이미징 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 관류 전에 스톱콕 장치 및 튜브의 기포를 제거하도록주의해야합니다. 0.22 μm 병 상단 필터를 통해 DiI를 제외한 모든 용액을 여과하는 것도 미세입자를 제거하는 것이 좋습니다. 심장 내 관류 중에는 폐를주의 깊게 모니터링하십시오. 그들이 확대되고 분홍색으로 변하면 나비 바늘이 우심실로 침투하여 약간 수축해야한다는 신호입니다.
DiI 관류의 중요한 한계는 반복적 인 측정을 허용하지 않는 절차의 말단 특성입니다. 열악한 관류 결과는 근본적인 동맥 기능 부전 또는 기술적 오류를 반영 할 수 있기 때문에 내부 대조군으로 결찰되지 않은 뒷다리를 수확하고 이미징하는 것이 좋습니다. 이미징과 관련하여 레이저 침투를위한 최적의 조직 두께는 압축 후 ~ 1mm입니다. 결과적으로, 더 큰 조직은 슬라이드에 장착되고 현미경 단계에 수용되고 비례적으로 더 긴 이미지 획득 시간을 위해 더 작은 조각으로 단면화되어야합니다.
요약하면,이 프로토콜은 PAD 및 CLTI를 연구하기위한 독특한 전임상 모델을 설명합니다. 구체적으로, 대퇴동맥 및 NOS 억제제인 L-NAME의 동시 투여와 정맥 응고는 FVB 마우스의 발판에서 조직 손실을 확실하게 유도한다. 사후, 심장 내 DiI 관류는 이어서 혈관구조를 형광성으로 표지하기 위해 사용된다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 수확된 발의 후속 전체 마운트 이미징은 풋패드 혈관구조의 고해상도, 3D 재구성 및 뒷다리 허혈 모델에서 재관류를 평가하는 전통적인 수단을 보완하는 동맥 및 모세관 네트워크의 시각화를 가능하게 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 (R01HL149452 및 VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS))의 Z-J L 및 OC V에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 또한 마이애미 의과 대학의 마비를 치료하기위한 마이애미 프로젝트의 현미경 검사 및 이미징 시설에 감사 드리며 이미지 분석 및 처리 소프트웨어에 대한 액세스를 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
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