Summary
Bu makalede, mikroakışkan akustoforez tekniği ve Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde izole edilmesi için kullanılabilecek aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak mikroakışkan akustohoretik çiplerin üretimi ve işletilmesi açıklanmaktadır.
Abstract
Bu makalede, mikroakışkan akustoforez tekniği ve Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde izole edilmesi için kullanılabilecek aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak mikroakışkan akustohoretik çiplerin üretimi ve işletilmesi açıklanmaktadır. Bu yöntem, uzun, kare mikro kanalların bir karışımını kullanarak ayırma verimliliğini artırır. Bu sistemde, numune ve tampon bir akış kontrolörü aracılığıyla giriş portuna enjekte edilir. Boncuk merkezleme ve numune ayırma için, AC gücü, mikrokanalda akustik radyasyon kuvveti üretmek için bir güç amplifikatörü ile bir fonksiyon üreteci aracılığıyla piezoelektrik dönüştürücüye uygulanır. Hem giriş hem de çıkışta çatallı bir kanal vardır, bu da aynı anda ayırma, saflaştırma ve konsantrasyon sağlar. Cihaz,% >98'lik bir iyileşme oranına ve% 97.8'lik bir saflığa, 10x doz konsantrasyonuna kadar% 97.8'lik bir saflığa sahiptir. Bu çalışma, bakterileri ayırmak için mevcut yöntemlerden daha yüksek bir iyileşme oranı ve saflık göstermiştir, bu da cihazın bakterileri verimli bir şekilde ayırabileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Dielektrik transfer, manyetoforez, boncuk ekstraksiyonu, filtreleme, santrifüjlü mikroakışkanlar ve atalet etkileri ve yüzey akustik dalgaları 1,2'ye dayalı yöntemlere ek olarak, bakterileri tıbbi ve çevresel örneklerden izole etmek için mikroakışkan platformlar geliştirilmektedir. Patojenik bakterilerin tespiti polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak devam eder, ancak genellikle zahmetli, karmaşık ve zaman alıcıdır 3,4. Mikroakışkan akustoforez sistemleri, makul verim ve temassız hücre izolasyonu 5,6,7 yoluyla bunu ele almak için bir alternatiftir. Akustoforez, bir ses dalgası boyunca maddi hareket fenomenini kullanarak boncukları ayıran veya yoğunlaştıran bir teknolojidir. Ses dalgaları mikrokanala girdiğinde, boncukların büyüklüğüne, yoğunluğuna vb. göre sıralanır ve hücreler, süspansiyon ortamı 7,8'in biyokimyasal ve elektriksel özelliklerine göre ayrılabilir. Buna göre, birçok akustophoretic çalışma aktif olarak 9,10,11 takip edilmiş ve son zamanlarda, ayakta duran yüzey akustik dalga mikroakışkanlarında sınır güdümlü akustik akış tarafından indüklenen akustophoretik hareketin 3D sayısal simülasyonları tanıtılmıştır 12.
Çeşitli alanlardaki çalışmalar antikorların nasıl değiştirileceğini incelemektedir 2,3. Aptamer, yüksek seçiciliğe ve özgüllüğe sahip bir hedef malzemedir vebirçok çalışma 2,9,10,13 yürütülmektedir. Aptamerler, antikorlara kıyasla küçük boyutlu, mükemmel biyolojik stabilite, düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik avantajlarına sahiptir ve tanı ve tedavi uygulamalarında incelenmektedir 2,3,14.
Burada, bu makalede, aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak Gram-negatif (GN) bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde ayrılması için kullanılabilecek bir mikroakışkan akustoforez teknolojisi protokolü açıklanmaktadır. Bu sistem, uzun bir dikdörtgen mikrokanal içindeki iki ortogonal rezonansı aynı anda uyararak, ayırma verimliliği için düğüm ve anti-düğüm noktalarında aptamer bağlı mikroboncukları hizalamak ve odaklamak için tek piezoelektrik çalıştırma yoluyla iki boyutlu (2B) akustik durağan bir dalga üretir 2,11,15,16 . Hem giriş hem de çıkışta çatallı bir kanal vardır, bu da aynı anda ayırma, saflaştırma ve konsantrasyon sağlar.
Bu protokol, bakteriyel bulaşıcı hastalıkların erken teşhisi ve gerçek zamanlı su izleme yoluyla patojenik bakteriyel enfeksiyonlara hızlı, seçici ve hassas bir yanıt alanında yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroakışkan akustoforez çip tasarımı
NOT: Şekil 1 , hedef mikroboncukların mikrokanallardan akustoforez ile ayrılması ve toplanmasının bir şemasını göstermektedir. Mikroakışkan akustoforez çipi bir CAD programı ile tasarlanmıştır.
- Cihazın ayırma performansını incelemek için bakterilerin boyutuna karşılık gelen aptamer modifiye boncuklar ve streptavidin kaplı polistiren (PS) boncukların bir karışımını kullanan mikroakışkan bir akustoforez çipi tasarlayın.
- PS boncuklarını hedef çıkışta toplayan ve numune girişine bir PS numune karışımı enjekte ettikten sonra geri kalanını çıkıştan atan bir mikroakışkan akustoforez çipi tasarlayın (bkz. Şekil 2 ve Tablo 1).
NOT: Bu amaçla, akustoakışkan çip, numunelerin ve tamponun enjekte edilmesi için iki girişten, mikroboncukların merkezi olarak hizalanmasını sağlamak için bağlı bir piezoelektrik dönüştürücüye (PZT) sahip bir ana kanaldan ve numunelerin toplandığı ve atıkların boşaltıldığı iki çıkıştan oluşan tasarlanmıştır (Şekil 3A) - Mikroboncukların, tamponların, bakterilerin ve aptamerlerin ana kanaldan geçtiği, mikroboncukların PZT tarafından indüklenen çip içi akustoforez yoluyla merkezi olarak hizalandığı bir mikroakışkan akustoforez çipi tasarlayın (Şekil 3B, C)
2. Mikroakışkan akustoforez çip imalatı
NOT: Dört katmanı aşağıdaki sırayla birleştirin: Şekil 3A, B'de gösterildiği gibi bir borosilikat cam-silikon tabaka, bir silikon tabaka, bir borosilikat cam tabaka ve bir PZT tabakası.
- Polietereterikon (PEEK) tüplerini bağlamak için giriş ve çıkışta17 kumlama ile 2 mm çapında deliklere sahip borosilikat cam (en üst tabaka) hazırlayın. Borosilikat cam 20 × 80 × 0,5mm3 ölçer.
- Bir fotodirenç ve derin reaktif iyon aşındırma (RIE)18 ile elde edilen bir silikon desen kullanılarak oluşturulmuş 0,2 ×0,2 mm2 kesit alanına sahip bir mikrokanala sahip 200 μm kalınlığında bir silikon kanal tabakası hazırlayın. Reaktif iyon aşındırma sırasında numune ve tampon giriş kanalları ile toplama ve atık çıkış kanalları için 1 mm çapında delikler açın.
NOT: Burada, iyon aşındırma, mikrokanallar oluşturmak için RIE işlemini kullanır. Silikon kanal tabakası için silikon gofret üzerinde bir kanal şeklinde bir fotodirenç uygulandı. PR kaplı silikon gofret, flor18'e 13.56 Mhz uygulanarak üretilen plazma ile kazındı. - Adım 2.1'de borosilikat cama bağlanmış 2.2 (20 × 80 × 0.5 mm 3) 'de hazırlanan silikon tabakanın (20 × 80 × 0.5 mm3) üstündeki ve altındaki katmanlarla bir çip ve 1.000 V ve 400 ° C19'da eloksal kullanılarak üçüncü bir borosilikat cam tabakası hazırlayın.
- Bir siyanoakrilat yapıştırıcı (10 μL veya daha az) kullanarak mikroakışkan kanal boyunca borosilikat cam tabakaya bir PZT (20 × 40mm2) takın.
NOT: Yükseklikteki herhangi bir değişikliği en aza indirmek için yapıştırıcıyı kanalda çok ince bir tabaka halinde pamuklu çubukla uygulayın. Şekil 3C , cihazın bir resmidir.
3. Bakteri suşları ve kültürü
NOT: Deneyler için GN ve Gram-pozitif (GP) bakterileri seçmek ve inkübe etmek için Tablo 2'ye bakınız. Kültür yöntemi için 3.1-3.4 numaralı adımlara bakın. Tüm bakteriler, 600 nm'de (OD 600) 0.4'lük bir absorbans elde edilene kadar aerobik koşullar altında inkübe edilmelidir.
- Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae ve Pseudomonas pictorum gibi GN bakterileri ve Staphylococcus epidermidis ve Staphylococcus pasteuri gibi GP bakterileri için, Luria-Bertani ortamında 37 ° C'de ve 16 saat boyunca 220 rpm'de kuluçkaya yatırılır.
- Enterobacter (GN) ve Bacillus megaterium (GP; KCTC 1021), 37 ° C'de ve 16 saat boyunca 220 rpm'de besin suyu ortamında inkübe edin.
- Enterococcus thailandicus (GP) için, de Man, Rogosa ve Sharpe (MRS) ortamında 37 ° C'de ve 16 saat boyunca 220 rpm'de inkübe edin.
- Listeria grayi (GP) için, beyin kalp infüzyon ortamında 37 ° C'de ve 16 saat boyunca 220 rpm'de inkübe edin.
- Kültürlenmiş bakterileri oda sıcaklığında (RT) 1 dakika boyunca santrifüj (9056 x g), daha sonra 1x fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ile iki kez yıkayın.
- Seçilen GN ve GP bakterilerini PBS tamponunda yeniden askıya alarak analiz için hazırlayın.
4. Mikroboncuklar ve aptamer'in mikroboncuklar üzerine immobilizasyonu
- Streptavidin kaplı mikroboncuk (10 μm) karışımını (Malzeme Tablosu) kullanmadan önce tekrar askıya alın (20 saniye boyunca vorteks yoluyla karıştırın).
- Aptamer'i 3 dakika boyunca 95 °C'de denatüre ederek ve ardından 2 dakika boyunca 0 °C'de tekrar katlayarak hazırlayın.
- Yeniden askıya alınmış streptavidin kaplı mikroboncuk karışımının 250 μL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve RT'de Tris-HCl tamponu (50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl) ile yıkayın. Daha sonra tüpe 100 μL biyotinillenmiş DNA aptamer ekleyin.
- RT'de karışımı döndürürken (25 rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Santrifüjlemeden sonra (9056 x g), tüpü RT'de 200 μL Tris-HCl tamponu ile iki kez yıkayın.
- Yıkanmış numune tüpüne 10 μL BSA (100 mg/mL) ekleyin ve RT'de rotasyonla (25 rpm) 30 dakika inkübe edin.
- Son olarak, aptamer modifiye mikroboncukları RT'de Tris-HCl tamponunda santrifüjleme (9056 x g) ile iki kez yıkayın.
5. Akustoforez kurulumu ve çalışması
- PEEK tüplerini, iki numune ve tampon enjekte etmek için iki girişe ve atıkların toplanması ve boşaltılması için iki çıkışa bağlayın (Şekil 4).
- Mikroakışkan akustoforez kanalını, 10 mL'lik bir şırınga kullanarak kabarcıksız demineralize su ile manuel olarak doldurun.
- Sıvı akışını kontrol etmek için iki veya daha fazla çıkış kanalına sahip hassas bir basınç kontrolörü hazırlayın. Ardından, şişeleri sırasıyla kapaklarında iki delik bulunan numune ve tamponla yarı yarıya doldurun ve talaş girişine bağlayın.
NOT: İki veya daha fazla çıkış kanalına sahip bir hassas basınç kontrolörü, birden fazla hassas basınç kontrolörü ile değiştirilebilir. Tampon girişinde, numune enjeksiyonu sırasında numunenin merkeze hareket etmesini önleyen laminer bir akış oluşturabilen bir tampon, bir akış kontrolörü aracılığıyla enjekte edilir. - Cihazı hazırladıktan sonra, hassas basınç kontrol cihazını kullanarak numune girişine 2 kPa ve tampon girişine 4 kPa basınç uygulayarak numuneyi ve tamponu enjekte edin.
NOT: Şu anda, pürüzsüz laminer akış için, tamponun enjeksiyon basıncı, numunenin enjeksiyon basıncından daha yüksek olmalıdır. Akış, giriş kanalına bağlı aspiratöre sabitlenmiş bir akış kontrolörü ile kontrol edilir. - Mikroskoptan kontrol ederken PZT'yi kullanarak mikroakışkan kanalın merkezine taşımak için bir boncuğa odaklanın.
NOT: Boncuk ne kadar büyük olursa, dalga formu üzerindeki etki o kadar büyük olur, bu nedenle düğüm noktasıyla hizalamak daha kolaydır. Amplifikatörlü fonksiyon üreteci, mikrokanalda sinüs dalgası üretmek için PZT'ye güç uygular. Mikrokanalın üst ve alt kısımları camdan yapıldığı için, üretilen sinüs dalgası yansır ve bir düğüm noktası7 oluşturur. - Tek kanallı bir fonksiyon üreteci kullanarak 3,66 MHz'lik bir rezonans frekansı oluşturun ve bir güç amplifikatörü kullanarak tipik bir sinyali 16 dB (yaklaşık dokuz kat) yükseltin (Şekil 4).
NOT: Aktüatörün rezonans frekansı kanalın boyutuyla eşleşmelidir; Kanal kare olduğundan, PZT tek bir düğüm oluşturmak için doğru bir frekansta çalışır. - Bir floresan mikroskobu ve 1.200 fps'de çalışan yüksek hızlı bir kamera ile akustoakışkan çip üzerindeki ayırma ve zenginleştirme işlemlerini gözlemleyin.
- GN bakterilerinin ve GP bakterilerinin varlığını veya yokluğunu, toplama ve atık çıkış numuneleri yoluyla boşaltılan bakteri bağlı boncukların ve bakterilerin floresan mikroskop kamerasıyla çekilen görüntüleri kontrol ederek ölçün ve analiz edin.
NOT: Tampon, bakteri ve aptamer içeren mikroboncuklar ana kanaldan geçer ve mikroboncuklar PZT tarafından indüklenen çip içi akustoforez yoluyla merkezi olarak hizalanır. Son olarak, GN bakterilerini bağlayan mikroboncuklar toplama çıkışında toplanır ve toplanmamış bakteriler atık çıkışından boşaltılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 5, PZT voltajının bir fonksiyonu olarak boncuk akışının görüntüsünü göstermektedir (KAPALI, 0,1 V, 0,5 V, 5 V). Bu çalışmada tanıtılan akustophoretic çip durumunda, PZT'nin voltajı arttıkça, 10 μm büyüklüğündeki boncukların merkezi konsantrasyonunun arttığı doğrulanmıştır. 10 μm büyüklüğündeki boncukların çoğu, PZT voltajının 5 V'unda merkezde yoğunlaşmıştır. Bu sonuç sayesinde, tek kanallı bir fonksiyon üretecinde 3.66 MHz'lik bir rezonans frekansı üretildi ve bir güç amplifikatörü kullanılarak genel bir sinyal 16 dB (yaklaşık 9 kat) yükseltildi.
Tablo 3'te bu çalışmada kullanılan akustik akışkan çipine 1 μm (hücre boyutu) ve 10 μm (aptamer ekli boncuk) mikroboncuk karışımının enjekte edildiği ve çıkış akış hızına (400, 450 ve 475 μL/dak) göre talaş ayırma performansının değerlendirilmesi sonucu olduğu görülmektedir. Geri kazanım oranı, çıkışta toplanan boncuk sayısının, sırasıyla% 98 ±% 2.2,% 98 ve% 2.5 ve% 90 ±% 9.8 olan 10 μm büyüklüğündeki boncuklar için enjekte edilen toplam boncuk sayısına oranıdır. % 9.8 ±. Saflık, 10-μm boyutundaki boncuk sayısının toplanan toplam boncuk sayısına oranıdır, bunlar% 97.1 ±% 3.6,% 97.6 ±% 2.4 ve% 99.4 ±% 0.6 idi. Bu, cihazın 10-μm boyutundaki boncuklar için yüksek bir ayırma verimliliğine sahip olduğunu göstermektedir.
Şekil 6 , boncuk başına bakterilere bağlı sayıların görüntülerini ve grafiğini göstermektedir. Hedef ve atık numuneleri ile ilgili akustoforez talaş operasyonuna ilişkin veriler sırasıyla çıkış ve girişte toplanmıştır. Tüm numuneler toplama tüplerinde 10-μL örneklemeye tabi tutuldu ve mikroboncuklara bağlanan bakteri sayısı floresan mikroskobu altında gözlendi. Birçok GN bakterisi (örneğin, E. Coli DH5α) tüm boncuklara bağlanırken, birkaç GP bakterisi (örneğin, Listeria grayi) bazı boncuklara bağlanır. Her aptamer modifiye mikroboncuğuna (25 boncuktan) bağlı GN ve GP bakterilerinin sayısı, yüksek hızlı kameralı bir mikroskop kullanılarak ölçüldü. Beş GN bakterisinin tümü boncuklara (her biri 4.96 ± 0.77) bağlanırken, test edilen maddelere (her biri 0.08 ± 0.08) önemli ölçüde daha az GP bakteri bağlandı. Sinyal gücü, GN ve GP bakterileri arasında önemli ölçüde farklılık gösterdi. Bu veriler, bu cihazın GN bakterilerini izole etmede başarılı olduğunu doğrulamaktadır.
Şekil 1: Mikrokanalların şeması, mikroboncukların akustoforez yoluyla merkezi hizalanması ve hedeflerin toplanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Aptamer afinite boncukları kullanılarak GN bakterilerinin ayrılması için Mikroakışkan akustoforez çipinin CAD görüntüsü . (A) Silikon kanal tabakası. (B) Üst cam tabaka. (1 ile 4 arasındaki boyutlar için bkz. Tablo 1). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Akustoforez mikrocihazının yapısı . (A) Zemin grafiği, (B) kesit planı ve (C) cihazın fotoğrafı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hücreleri ayırmak ve toplamak için kullanılan akustoakışkan sistemin şeması. Numune veya tampon çözeltisi, akış kontrolörü aracılığıyla giriş portuna enjekte edilir. Boncuk merkezleme ve numune ayırma için, AC gücü, mikrokanalda akustik radyasyon kuvveti oluşturmak için bir güç amplifikatörü olan bir fonksiyon üreteci aracılığıyla PZT'ye uygulanır. Ayrılan hedef numune bir toplama tüpünden toplanır ve kalan atık sıvı başka bir çıkıştan geri kazanılır. Ayrımı görselleştirmek için yüksek hızlı bir kamera modülü kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: PZT voltajının bir fonksiyonu olarak boncuk akışının görüntüsü. (A) PZT KAPALI, (B) PZT 0,1 V, (C) PZT 0,5 V, (D) PZT 5 V. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Aptamer modifiye mikroboncuklara bağlı GN (E. coli DH5α) ve GP (Listeria grayi) bakterilerinin sayıları (n = 25 , hata çubuğu = standart hata). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sayı | Aygıt | Genişlik (W) veya Çap (D) (μm) |
| 1 | Giriş ve Çıkış portu (silikon) | 1000 (D) |
| 2 | Mikroakışkan kanal | 200 (G) |
| 3 | Giriş ve Çıkış kanalı | 400 (G) |
| 4 | Giriş ve Çıkış portu (cam) | 1500 (D) |
Tablo 1: Pnömatik mikroakışkan platformun boyutları ( Şekil 2'de 1 ila 4).
| GN bakterileri | GP bakterileri |
| Escherichia coli (DH5α) | Basil megateryum (KCTC 1021) |
| Enterobacter cloacae | Staphylococcus epidermidis |
| Sfengomonas insulae | Listeria grayi |
| Escherichia coli KCTC 2571 | Enterococcus thailandicus |
| Pseudomonas pictorum | Staphylococcus pasteuri |
Tablo 2: İncelenen GN ve GP bakterileri.
| Wate çıkışında akış hızı (μL/dak) | İyileşme oranı (%) | Saflık (%) |
| 400 (5x volümetrik konsetrasyon) | 98 ± 2,2 | 97,1 ± 3,6 |
| 450 (10x volümetrik konsetrasyon) | 98 ± 2,5 | 97,6 ± 2,4 |
| 475 (20x volümetrik konsetrasyon) | 90 ± 9,8 | 99,4 ± 0,6 |
Tablo 3: Geri kazanım hızı ve ayırmanın saflığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GN bakterilerini kültür örneklerinden boyutlarına ve türlerine göre sürekli çalışan bir yönteme ve aptamer modifiye edilmiş mikro boncuklara dayanarak yüksek hızda yakalamak ve aktarmak için sonik bir levitasyon mikroakışkan cihazı geliştirdik. Uzun, kare mikrokanal, 2D akustoforez için daha önce bildirilen 20,21,22,23,24,25,26'dan daha basit bir tasarım ve daha fazla maliyet verimliliği sağlar. Cihaz, 10x doz konsantrasyonuna kadar% >98'lik bir iyileşme oranına sahiptir. Bu çalışma, bakterileri ayırmak için mevcut etiketsiz yöntemler 20,21,22,23,24 ve afinite boncuk yöntemleri25,26'dan daha yüksek bir geri kazanım oranı ve saflık göstermektedir. Bu, cihazın bakterileri verimli bir şekilde ayırabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, 10-μm boncuklar yan kanallara akabildiğinden, bir performans testinde akustik radyasyonu engelleyen kapalı çıkıştan kaynaklanan güçlü geri çekilme kuvveti nedeniyle geri kazanım oranı 20x doz konsantrasyonunda% 90'a düşürülür. Çip üzerindeki geri kazanım oranı% 98'e ulaşabilirken, inhaler içindeki boncukların çökelmesi veya inhaleri çipe bağlayan tüpün tıkanması gibi çeşitli faktörler geri kazanım oranını azaltır.
Bu akustophoretic çipi yapmak ve çalışmasını sağlamak için gereken birkaç önemli nokta var. PZT'yi tutturmak için kullanılan yapıştırıcı, oluklu mukavvanın doğruluğu için mümkün olduğunca az kullanılmalı ve PZT ve mikrokanal paralel olmalıdır. Bu adımdaki hatalar, yanlış dalga formlarının PZT üzerinden çipe iletilmesine neden olur ve bu da boncukların yanlış hizalanması olarak kendini gösterir. Ayrıca, çalışırken dikkatli olun, çünkü boncukların şırıngadan çökelmesi veya bağlantı tüpünün şırıngadan cipslerle tıkanması gibi çeşitli faktörler iyileşme oranını kötüleştirebilir.
Bu cihaz sadece bakteriyel bulaşıcı hastalıkların erken teşhisi alanında canlı bakterileri veya bakteri kaynaklı biyobelirteçleri tespit etmek için kullanılamaz, aynı zamanda biyoterörizm ve patojenik bakteriyel enfeksiyonların tanımlanmasına yardımcı olacak su kontaminasyonunu izlemeye de genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kore hükümeti (Bilim ve BİT Bakanlığı) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) hibesi tarafından desteklenmiştir. (Hayır. NMK-2021R1A2C1011380)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, New Jersey. (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al.
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
