Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

एप्टामर आत्मीयता मोतियों का उपयोग करके ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के पृथक्करण के माध्यम से प्रवाह के लिए माइक्रोफ्लुइडिक एकोस्टोफोरेसिस

Published: October 17, 2022 doi: 10.3791/63300
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,2,4
1Department of Digital Anti-Aging Health Care, Inje University, 2Micro device Lab Co., Ltd, 3Biohealth Products Research Center (BPRC), Inje University, 4Department of Biomedical Engineering, Inje University

Summary

यह पत्र माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस तकनीक और एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोरेटिक चिप्स के निर्माण और संचालन का वर्णन करता है जिसका उपयोग माध्यम से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के तेज, कुशल अलगाव के लिए किया जा सकता है।

Abstract

यह लेख माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस तकनीक और एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोरेटिक चिप्स के निर्माण और संचालन का वर्णन करता है जिसका उपयोग माध्यम से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के तेज, कुशल अलगाव के लिए किया जा सकता है। यह विधि लंबे, चौकोर माइक्रोचैनलों के मिश्रण का उपयोग करके पृथक्करण दक्षता को बढ़ाती है। इस प्रणाली में, नमूना और बफर को प्रवाह नियंत्रक के माध्यम से इनलेट पोर्ट में इंजेक्ट किया जाता है। मनका केंद्रित और नमूना पृथक्करण के लिए, एसी पावर माइक्रोचैनल में ध्वनिक विकिरण बल उत्पन्न करने के लिए पावर एम्पलीफायर के साथ एक फ़ंक्शन जनरेटर के माध्यम से पीजोइलेक्ट्रिक ट्रांसड्यूसर पर लागू होता है। इनलेट और आउटलेट दोनों पर एक विभाजित चैनल है, जो एक साथ पृथक्करण, शुद्धिकरण और एकाग्रता को सक्षम करता है। डिवाइस में >98% की रिकवरी दर और 10x खुराक एकाग्रता तक 97.8% की शुद्धता है। इस अध्ययन ने बैक्टीरिया को अलग करने के लिए मौजूदा तरीकों की तुलना में अधिक वसूली दर और शुद्धता का प्रदर्शन किया है, यह सुझाव देते हुए कि डिवाइस बैक्टीरिया को कुशलतापूर्वक अलग कर सकता है।

Introduction

ढांकता हुआ हस्तांतरण, मैग्नेटोफोरेसिस, मनका निष्कर्षण, फ़िल्टरिंग, केन्द्रापसारक माइक्रोफ्लुइडिक्स और जड़त्वीय प्रभाव, और सतह ध्वनिक तरंगों 1,2 पर आधारित तरीकों के अलावा, चिकित्सा और पर्यावरणीय नमूनों से बैक्टीरिया को अलग करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिकप्लेटफार्मों को विकसित किया जा रहा है। रोगजनक बैक्टीरिया का पता लगाना पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करके जारी रखा जाता है, लेकिन यह आमतौर पर श्रमसाध्य, जटिल और समय लेने वाला 3,4 होता है। माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस सिस्टम उचित थ्रूपुट और गैर-संपर्क सेल अलगाव 5,6,7 के माध्यम से इसे संबोधित करने का एक विकल्प है। ध्वनिकोफोरेसिस एक ऐसी तकनीक है जो ध्वनि तरंग के माध्यम से सामग्री आंदोलन की घटना का उपयोग करके मोतियों को अलग या केंद्रित करती है। जब ध्वनि तरंगें माइक्रोचैनल में प्रवेश करती हैं, तो उन्हें मोतियों के आकार, घनत्व आदि के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है, और कोशिकाओं को निलंबन माध्यम 7,8 के जैव रासायनिक और विद्युत गुणों के अनुसार अलग किया जा सकता है। तदनुसार, कई ध्वनिक अध्ययनों को सक्रिय रूप से 9,10,11 का पीछा किया गया है, और हाल ही में, खड़े सतह ध्वनिक तरंग माइक्रोफ्लुइडिक्स में सीमा-चालित ध्वनिक स्ट्रीमिंग द्वारा प्रेरित ध्वनिक गति के 3 डी संख्यात्मक सिमुलेशन पेश किए गए हैं।

विभिन्न क्षेत्रों में अध्ययन एंटीबॉडी 2,3 को बदलने के तरीके की जांच कर रहे हैं। एप्टामर एक लक्ष्य सामग्री है जिसमें उच्च चयनात्मकता और विशिष्टता है, और कई अध्ययन 2,9,10,13 आयोजित किए जा रहे हैं। एप्टामर्स में एंटीबॉडी की तुलना में छोटे आकार, उत्कृष्ट जैविक स्थिरता, कम लागत और उच्च प्रजनन क्षमता के फायदे हैं और नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों 2,3,14 में अध्ययन किया जा रहा है।

यहां, यह लेख एक माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस प्रौद्योगिकी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उपयोग एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माध्यम से ग्राम-नकारात्मक (जीएन) बैक्टीरिया के तेजी से, कुशल पृथक्करण के लिए किया जा सकता है। यह प्रणाली एकल पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएशन के माध्यम से एक द्वि-आयामी (2 डी) ध्वनिक स्थायी तरंग उत्पन्न करती है, साथ ही एक लंबे आयताकार माइक्रोचैनल के भीतर दो ऑर्थोगोनल अनुनादों को उत्तेजित करके नोड पर एप्टामर-संलग्न माइक्रोबीड्स को संरेखित और फोकस करने के लिए और पृथक्करण दक्षता 2,11,15,16 के लिए एंटी-नोड बिंदुओं को उत्तेजित करती है . इनलेट और आउटलेट दोनों पर एक विभाजित चैनल है, जो एक साथ पृथक्करण, शुद्धिकरण और एकाग्रता को सक्षम करता है।

यह प्रोटोकॉल बैक्टीरिया संक्रामक रोगों के प्रारंभिक निदान के क्षेत्र में सहायक हो सकता है, साथ ही वास्तविक समय के पानी की निगरानी के माध्यम से रोगजनक जीवाणु संक्रमण के लिए तेजी से, चयनात्मक और संवेदनशील प्रतिक्रिया भी हो सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप डिजाइन

नोट: चित्रा 1 ध्वनिकफोरेसिस द्वारा माइक्रोचैनलों से लक्ष्य माइक्रोबीड्स के पृथक्करण और संग्रह का एक योजनाबद्ध दिखाता है। माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप को सीएडी प्रोग्राम के साथ डिज़ाइन किया गया है।

  1. एक माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप डिजाइन करें जो डिवाइस के पृथक्करण प्रदर्शन का अध्ययन करने के लिए बैक्टीरिया के आकार के अनुरूप एप्टामर-संशोधित मोतियों और स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित पॉलीस्टाइनिन (पीएस) मोतियों के मिश्रण का उपयोग करता है।
  2. एक माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप डिज़ाइन करें जो लक्ष्य आउटलेट पर पीएस मोती एकत्र करता है और नमूना इनलेट में पीएस नमूना मिश्रण को इंजेक्ट करने के बाद आउटलेट के माध्यम से बाकी को त्याग देता है ( चित्रा 2 और तालिका 1 देखें)।
    नोट: इस उद्देश्य के लिए, ध्वनिक द्रव्य चिप को नमूने और बफर इंजेक्शन के लिए दो इनलेट से मिलकर डिज़ाइन किया गया है, एक संलग्न पीज़ोइलेक्ट्रिक ट्रांसड्यूसर (पीजेडटी) के साथ एक मुख्य चैनल माइक्रोबीड्स को केंद्रीय रूप से संरेखित करने की अनुमति देता है, और दो आउटलेट जिसके माध्यम से नमूने एकत्र किए जाते हैं और अपशिष्ट का निर्वहन किया जाता है (चित्रा 3 ए)
  3. एक माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप डिजाइन करें जिसमें माइक्रोबीड्स, बफर, बैक्टीरिया और एप्टामर मुख्य चैनल से गुजरते हैं, जिसमें माइक्रोबीड्स पीजेडटी (चित्रा 3 बी, सी) द्वारा प्रेरित इन-चिप ध्वनिकोफोरेसिस के माध्यम से केंद्रीय रूप से गठबंधन किए जाते हैं

2. माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप निर्माण

नोट: निम्नलिखित क्रम में चार परतों को इकट्ठा करें: एक बोरोसिलिकेट ग्लास-सिलिकॉन परत, एक सिलिकॉन परत, एक बोरोसिलिकेट ग्लास परत, और एक पीजेडटी परत, जैसा कि चित्रा 3 ए, बी में दिखाया गया है।

  1. पॉलीथरेथरकटोन (पीक) ट्यूबों को जोड़ने के लिए इनलेट और आउटलेट पर सैंडब्लास्ट17 द्वारा 2 मिमी व्यास के छेद के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास (सबसे ऊपरी परत) तैयार करें। बोरोसिलिकेट ग्लास 20 × 80 × 0.5 मिमी 3 मापताहै।
  2. एक फोटोरेसिस्ट और गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (आरआईई) 18 के माध्यम से प्राप्त सिलिकॉन पैटर्न का उपयोग करके गठित 0.2 × 0.2 मिमी 2 के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र के साथ एक माइक्रोचैनल के साथ एक 200-μm-मोटी सिलिकॉन चैनल परत तैयार करें। प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी के दौरान नमूना और बफर इनलेट चैनलों और संग्रह और अपशिष्ट आउटलेट चैनलों के लिए ड्रिल 1 मिमी व्यास छेद।
    नोट: यहां, आयन-नक़्क़ाशी माइक्रोचैनल बनाने के लिए आरआईई प्रक्रिया का उपयोग करती है। सिलिकॉन चैनल परत के लिए एक सिलिकॉन वेफर पर एक चैनल के आकार में एक फोटोरेसिस्ट लागू किया गया था। पीआर-लेपित सिलिकॉन वेफर को फ्लोरीन18 में 13.56 मेगाहर्ट्ज लगाकर उत्पन्न प्लाज्मा के साथ उकेरा गया था।
  3. चरण 2.2 (20 × 80 × 0.5 मिमी3) में तैयार सिलिकॉन परत (20 × 80 × 0.5 मिमी 3) के ऊपर और नीचे कीपरतों × के साथ एक चिप तैयार करें चरण 2.1 में बोरोसिलिकेट ग्लास से बंधे और 1,000 वी और 400 डिग्री सेल्सियस19 पर एनोडाइजेशन का उपयोग करके एक तीसरी बोरोसिलिकेट ग्लास परत।
  4. साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला (10 μL या उससे कम) का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास परत के लिए एक पीजेडटी (20 × 40 मिमी 2) संलग्न करें।
    नोट: ऊंचाई में किसी भी बदलाव को कम करने के लिए कपास झाड़ू का उपयोग करके चैनल में बहुत पतली परत के रूप में चिपकने वाला लागू करें। चित्रा 3 सी डिवाइस की एक तस्वीर है।

3. जीवाणु उपभेदों और संस्कृति

नोट: प्रयोगों के लिए जीएन और ग्राम पॉजिटिव (जीपी) बैक्टीरिया का चयन और सेते हैं, तालिका 2 देखें। संस्कृति विधि के लिए, चरण 3.1-3.4 देखें। सभी बैक्टीरिया को एरोबिक स्थितियों के तहत ऊष्मायन किया जाना चाहिए जब तक कि 600 एनएम(ओडी 600) पर 0.4 का अवशोषण प्राप्त नहीं हो जाता है।

  1. जीएन बैक्टीरिया जैसे एस्चेरिचिया कोलाई डीएच 5 α, एस्चेरिचिया कोलाई केसीटीसी 2571, स्फिंगोमोनास इन्सुला, और स्यूडोमोनास पिक्टोरम और जीपी बैक्टीरिया जैसे स्टेफिलोकोकस एपिडर्मिडिस और स्टैफिलोकोकस पेस्टुरी के लिए, लुरिया-बर्टानी माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस और 16 घंटे के लिए 220 आरपीएम पर सेते हैं।
  2. एंटरोबैक्टर (जीएन) और बेसिलस मेगाटेरियम (जीपी) के लिए; केसीटीसी 1021), 37 डिग्री सेल्सियस पर पोषक तत्व शोरबा माध्यम में सेते हैं और 16 घंटे के लिए 220 आरपीएम।
  3. एंटरोकोकस थाईलैंडिकस (जीपी) के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर डी मैन, रोगोसा और शार्प (एमआरएस) माध्यम और 16 घंटे के लिए 220 आरपीएम में सेते हैं।
  4. लिस्टेरिया ग्रेई (जीपी) के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क हृदय जलसेक माध्यम और 16 घंटे के लिए 220 आरपीएम में सेते हैं।
  5. अपकेंद्रित्र (9056 एक्स जी) कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिनट के लिए सुसंस्कृत बैक्टीरिया, फिर 1 एक्स फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) बफर के साथ दो बार धो लें।
  6. पीबीएस बफर में पुन: निलंबित करके विश्लेषण के लिए चयनित जीएन और जीपी बैक्टीरिया तैयार करें।

4. माइक्रोबीड्स पर एप्टामर का माइक्रोबीड्स और स्थिरीकरण

  1. उपयोग से पहले स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित माइक्रोबीड्स (10 μm) मिश्रण (सामग्री की तालिका) को फिर से निलंबित करें (20 एस के लिए भंवर के माध्यम से मिश्रण)।
  2. 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृत करके एप्टामर तैयार करें और फिर 2 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर फिर से जोड़ना।
  3. 1.5 एमएल ट्यूब में पुन: निलंबित स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित माइक्रोबीड्स मिश्रण के 250 μL को स्थानांतरित करें और आरटी पर ट्रिस-एचसीएल बफर (50 एमएम ट्रिस, पीएच 7.4, 1 एमएम एमजीसीएल2, 5 एमएम केसीएल, 100 एमएम एनएसीएल) के साथ धो लें। फिर ट्यूब में बायोटिनिलेटेड डीएनए एप्टामर के 100 μL जोड़ें।
  4. घूर्णन करते समय 30 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण सेते हैं (25 आरपीएम)।
  5. सेंट्रीफ्यूजेशन (9056 एक्स जी) के बाद, आरटी पर ट्रिस-एचसीएल बफर के 200 μL के साथ ट्यूब को दो बार धो लें।
  6. धोया नमूना ट्यूब के लिए बीएसए (100 मिलीग्राम / एमएल) के 10 μL जोड़ें और रोटेशन (25 आरपीएम) के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. अंत में, आरटी पर ट्रिस-एचसीएल बफर में सेंट्रीफ्यूजेशन (9056 एक्स जी) द्वारा एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स को दो बार धो लें।

5. ध्वनिकफोरेसिस सेटअप और ऑपरेशन

  1. दो नमूने और बफर इंजेक्शन और कचरे को इकट्ठा करने और निर्वहन के लिए दो आउटलेट (चित्रा 4) के लिए दो इनलेट करने के लिए पीक ट्यूबों कनेक्ट करें।
  2. मैन्युअल रूप से 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके बुलबुला मुक्त डिमिनरलाइज्ड पानी के साथ माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चैनल भरें।
  3. द्रव प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए दो या दो से अधिक आउटपुट चैनलों के साथ एक सटीक दबाव नियंत्रक तैयार करें। फिर, क्रमशः उनकी टोपी में दो छेद के साथ नमूना और बफर के साथ शीशियों को आधा भरें, और चिप इनलेट से कनेक्ट करें।
    नोट: दो या दो से अधिक आउटपुट चैनलों के साथ एक सटीक दबाव नियंत्रक को कई सटीक दबाव नियंत्रकों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। बफर इनलेट पर, एक लामिना प्रवाह उत्पन्न करने में सक्षम एक बफर जो नमूना इंजेक्शन के दौरान नमूने को केंद्र में जाने से रोकता है, एक प्रवाह नियंत्रक के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है।
  4. डिवाइस तैयार करने के बाद, सटीक दबाव नियंत्रण डिवाइस का उपयोग करके नमूना इनलेट में 2 केपीए और बफर इनलेट में 4 केपीए का दबाव लागू करके नमूना और बफर इंजेक्ट करें।
    नोट: इस समय, चिकनी लामिना प्रवाह के लिए, बफर का इंजेक्शन दबाव नमूने के इंजेक्शन दबाव से अधिक होना चाहिए। प्रवाह को इनलेट चैनल से जुड़े एस्पिरेटर के लिए तय किए गए प्रवाह नियंत्रक द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
  5. माइक्रोस्कोप के माध्यम से जांच करते समय पीजेडटी का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के केंद्र में स्थानांतरित करने के लिए एक मनका पर ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: मनका जितना बड़ा होगा, तरंग पर प्रभाव उतना ही अधिक होगा, इसलिए नोड बिंदु के साथ संरेखित करना आसान है। एम्पलीफायर के साथ फ़ंक्शन जनरेटर माइक्रोचैनल में साइन तरंग उत्पन्न करने के लिए पीजेडटी पर बिजली लागू करता है। चूंकि माइक्रोचैनल के ऊपरी और निचले हिस्से कांच से बने होते हैं, इसलिए उत्पन्न साइन तरंग परिलक्षित होती है और एक नोड बिंदु7 बनाती है।
  6. एक एकल चैनल फ़ंक्शन जनरेटर का उपयोग करके 3.66 मेगाहर्ट्ज की अनुनाद आवृत्ति उत्पन्न करें और पावर एम्पलीफायर (चित्रा 4) का उपयोग करके 16 डीबी (लगभग नौ गुना) द्वारा एक विशिष्ट संकेत को बढ़ाएं।
    नोट: एक्ट्यूएटर की अनुनाद आवृत्ति चैनल के आकार से मेल खाना चाहिए; क्योंकि चैनल वर्ग है, पीजेडटी एक एकल नोड बनाने के लिए सटीक आवृत्ति पर संचालित होता है।
  7. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और 1,200 एफपीएस पर काम करने वाले एक उच्च गति वाले कैमरे के साथ ध्वनिक चिप पर पृथक्करण और संवर्धन प्रक्रियाओं का निरीक्षण करें।
  8. संग्रह और अपशिष्ट आउटलेट नमूनों के माध्यम से छुट्टी दे दी बैक्टीरिया बाध्य मोती और बैक्टीरिया के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप कैमरे के साथ ली गई छवियों की जांच करके जीएन बैक्टीरिया और जीपी बैक्टीरिया की उपस्थिति या अनुपस्थिति की मात्रा और विश्लेषण करें।
    नोट: बफर, बैक्टीरिया और एप्टामर के साथ माइक्रोबीड्स मुख्य चैनल से गुजरते हैं, और माइक्रोबीड्स को पीजेडटी द्वारा प्रेरित इन-चिप ध्वनिकोफोरेसिस के माध्यम से केंद्रीय रूप से संरेखित किया जाता है। अंत में, जीएन बैक्टीरिया को बाध्य करने वाले माइक्रोबीड्स को संग्रह आउटलेट पर एकत्र किया जाता है, और असंग्रहित बैक्टीरिया को अपशिष्ट आउटलेट के माध्यम से छुट्टी दे दी जाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 5 पीजेडटी वोल्टेज (ऑफ, 0.1 वी, 0.5 वी, 5 वी) के एक समारोह के रूप में मनका प्रवाह की छवि दिखाता है। इस अध्ययन में पेश किए गए ध्वनिक चिप के मामले में, यह पुष्टि की गई थी कि जैसे-जैसे पीजेडटी का वोल्टेज बढ़ता गया, 10 μm आकार के मोतियों की केंद्रीय एकाग्रता में वृद्धि हुई। 10 μm आकार के मोतियों में से अधिकांश पीजेडटी वोल्टेज के 5 वी पर केंद्र में केंद्रित थे। इस परिणाम के माध्यम से, एक एकल चैनल फ़ंक्शन जनरेटर में 3.66 मेगाहर्ट्ज की गुंजयमान आवृत्ति उत्पन्न हुई थी, और पावर एम्पलीफायर का उपयोग करके 16 डीबी (लगभग 9 गुना) द्वारा एक सामान्य सिग्नल प्रवर्धित किया गया था।

तालिका 3 से पता चलता है कि 1 μm (सेल आकार) और 10 μm (एप्टामर संलग्न मनका) के माइक्रोबीड्स मिश्रण को इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ध्वनिक द्रव चिप में इंजेक्ट किया गया था, और आउटलेट प्रवाह दर (400, 450 और 475 μL / वसूली दर आउटलेट पर एकत्र किए गए मोतियों की संख्या का अनुपात 10 μm आकार के मोतियों के लिए इंजेक्शन मोतियों की कुल संख्या से है, जो क्रमशः 98% ± 2.2%, 98% ± 2.5% और 90% ± 9.8% थे। शुद्धता एकत्र किए गए मोतियों की कुल संख्या के लिए 10-μm आकार के मोतियों की संख्या का अनुपात है, जो क्रमशः 97.1% ± 3.6%, 97.6% ± 2.4% और 99.4% ± 0.6% थे। इससे पता चलता है कि डिवाइस में 10-μm के आकार के साथ मोतियों के लिए एक उच्च पृथक्करण दक्षता है।

चित्रा 6 छवियों और मनका प्रति बैक्टीरिया बाध्य संख्या का एक ग्राफ से पता चलता है. लक्ष्य और अपशिष्ट नमूनों के बारे में ध्वनिकफोरेसिस चिप ऑपरेशन से संबंधित डेटा क्रमशः आउटलेट और इनलेट पर एकत्र किए गए थे। सभी नमूनों को संग्रह ट्यूबों में 10-μL नमूने के अधीन किया गया था, और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोबीड्स के लिए बाध्यकारी बैक्टीरिया की संख्या देखी गई थी। कई जीएन बैक्टीरिया (जैसे, ई। कोलाई डीएच 5α) सभी मोतियों से बंधे होते हैं, जबकि कुछ जीपी बैक्टीरिया (जैसे, लिस्टेरिया ग्रेई) कुछ मोतियों से बंधे होते हैं। प्रत्येक एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड (25 मोतियों के) से बंधे जीएन और जीपी बैक्टीरिया की संख्या को उच्च गति वाले कैमरे के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मापा गया था। सभी पांच जीएन बैक्टीरिया मोतियों (4.96 ± 0.77 प्रत्येक) के लिए बाध्य थे, जबकि काफी कम जीपी बैक्टीरिया परीक्षण किए गए पदार्थों (0.08 ± 0.08 प्रत्येक) से बंधे थे। सिग्नल की ताकत जीएन और जीपी बैक्टीरिया के बीच काफी भिन्न थी। ये आंकड़े इस बात की पुष्टि करते हैं कि यह डिवाइस जीएन बैक्टीरिया को अलग करने में सफल रहा।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोचैनलों की योजनाबद्धता, ध्वनिकोफोरेसिस के माध्यम से माइक्रोबीड्स का केंद्रीय संरेखण, और लक्ष्यों का संग्रह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एप्टामर आत्मीयता मोती का उपयोग करके जीएन बैक्टीरिया के पृथक्करण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस चिप की सीएडी छवि। (बी) ऊपरी कांच की परत। (1 से 4 के आयामों के लिए, तालिका 1 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ध्वनिक वैद्युतकणसंचलन माइक्रोडिवाइस की संरचना ( ए) फर्श साजिश, (बी) क्रॉस-सेक्शन योजना, और (सी) डिवाइस की तस्वीर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कोशिकाओं को अलग करने और इकट्ठा करने के लिए उपयोग की जाने वाली ध्वनिक प्रणाली की योजनाबद्ध। नमूना या बफर समाधान प्रवाह नियंत्रक के माध्यम से इनलेट पोर्ट में इंजेक्ट किया जाता है। मनका केंद्रित और नमूना पृथक्करण के लिए, एसी पावर माइक्रोचैनल में ध्वनिक विकिरण बल उत्पन्न करने के लिए पावर एम्पलीफायर के साथ एक फ़ंक्शन जनरेटर के माध्यम से पीजेडटी पर लागू होता है। अलग लक्ष्य नमूना एक संग्रह ट्यूब के माध्यम से एकत्र किया जाता है, और शेष अपशिष्ट तरल पदार्थ को एक अन्य आउटलेट के माध्यम से पुनर्प्राप्त किया जाता है। पृथक्करण की कल्पना करने के लिए एक उच्च गति कैमरा मॉड्यूल का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पीजेडटी वोल्टेज के एक समारोह के रूप में मोतियों के प्रवाह की छवि। (ए) पीजेडटी ऑफ, (बी) पीजेडटी 0.1 वी, (सी) पीजेडटी 0.5 वी, (डी) पीजेडटी 5 वी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: जीएन (ई कोलाई डीएच 5 α) और जीपी (लिस्टेरिया ग्रेई) बैक्टीरिया की संख्या एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स (एन = 25, त्रुटि बार = मानक त्रुटि) से बंधे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संख्या उपकरण चौड़ाई (डब्ल्यू) या व्यास (डी) (μm)
1 इनलेट और आउटलेट पोर्ट (सिलिकॉन) 1000 (डी)
2 माइक्रोफ्लुइडिक चैनल 200 (डब्ल्यू)
3 इनलेट और आउटलेट चैनल 400 (डब्ल्यू)
4 इनलेट और आउटलेट पोर्ट (ग्लास) 1500 (डी)

तालिका 1: वायवीय माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म के आयाम ( चित्रा 2 में 1 से 4)।

जीएन बैक्टीरिया जीपी बैक्टीरिया
एस्चेरिचिया कोलाई (डीएच 5α) बेसिलस मेगाटेरियम (केसीटीसी 1021)
एंटरोबैक्टर क्लोका स्टैफिलोकोकस एपिडर्मिडिस
स्फिंगोमोना ने किया विरोध लिस्टेरिया ग्रेई
एस्चेरिचिया कोलाई केसीटीसी 2571 एंटरोकोकस थाईलैंडिकस
स्यूडोमोनास पिक्टोरम स्टैफिलोकोकस पेस्टुरी

तालिका 2: जीएन और जीपी बैक्टीरिया का अध्ययन किया गया।

वाट आउटलेट पर प्रवाह दर (μL / रिकवरी दर (%) शुद्धता (%)
400 (5x वॉल्यूमेट्रिक कॉन्सेनेशन) 98 ± 2.2 97.1 ± 3.6
450 (10x वॉल्यूमेट्रिक कॉन्सेनेशन) 98 ± 2.5 97.6 ± 2.4
475 (20x वॉल्यूमेट्रिक कॉन्सेनरेशन) 90 ± 9.8 99.4 ± 0.6

तालिका 3: वसूली दर और पृथक्करण की शुद्धता।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हमने अपने आकार और प्रकार के अनुसार निरंतर चलने वाली विधि के आधार पर उच्च गति पर संस्कृति के नमूनों से जीएन बैक्टीरिया को कैप्चर करने और स्थानांतरित करने के लिए एक ध्वनि उत्तोलन माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विकसित किया, और एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स। लंबा, वर्ग माइक्रोचैनल 2 डी ध्वनिकफोरेसिस के लिए एक सरल डिजाइन और अधिक लागत-दक्षता को सक्षम बनाता है, जो पहले 20,21,22,23,24,25,26 की रिपोर्ट की गई थी। डिवाइस में 10x खुराक एकाग्रता तक >98% की रिकवरी दर है। यह अध्ययन बैक्टीरिया को अलग करने के लिए मौजूदा लेबल-मुक्त विधियों20,21,22,23,24 और आत्मीयता मनका विधियों25,26 की तुलना में उच्च वसूली दर और शुद्धता दिखाता है। इससे पता चलता है कि डिवाइस बैक्टीरिया को कुशलता से अलग कर सकता है। हालांकि, जैसा कि 10-μm मोती साइड चैनलों में प्रवाहित हो सकते हैं, प्रदर्शन परीक्षण में ध्वनिक विकिरण को अवरुद्ध करने वाले बंद आउटलेट से उत्पन्न मजबूत वापसी बल के कारण 20x खुराक एकाग्रता पर वसूली दर 90% तक कम हो जाती है। जबकि चिप पर वसूली दर 98% तक पहुंच सकती है, कई कारक वसूली दर को कम करते हैं, जैसे कि इनहेलर में मोतियों की वर्षा या इनहेलर को चिप से जोड़ने वाली ट्यूब का क्लॉगिंग।

इस ध्वनिक चिप को बनाने और इसे काम करने के लिए कुछ प्रमुख बिंदुओं की आवश्यकता होती है। पीजेडटी को संलग्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चिपकने वाले का उपयोग नालीदार की सटीकता के लिए जितना संभव हो उतना कम किया जाना चाहिए और पीजेडटी और माइक्रोचैनल समानांतर होना चाहिए। इस चरण में त्रुटियों के परिणामस्वरूप पीजेडटी के माध्यम से चिप में गलत तरंगों का संचरण होता है, जो मोती गलत संरेखण के रूप में प्रकट होता है। इसके अलावा, ऑपरेटिंग करते समय सावधान रहें, क्योंकि कई कारक वसूली दर को खराब कर सकते हैं, जैसे कि सिरिंज से मोतियों का अवसादन या सिरिंज से चिप्स के साथ कनेक्टिंग ट्यूब की रुकावट।

इस उपकरण का उपयोग न केवल जीवाणु संक्रामक रोगों के प्रारंभिक निदान के क्षेत्र में जीवित बैक्टीरिया या जीवाणु-व्युत्पन्न बायोमार्कर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, बल्कि जल संदूषण की निगरानी के लिए भी बढ़ाया जा सकता है, जो जैव आतंकवाद और रोगजनक जीवाणु संक्रमण की पहचान करने में मदद करेगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को कोरियाई सरकार (विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। (नं. एनआरएफ-2021आर1ए2सी1011380)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm polystyrene microbeads Bang Laboratories PS04001 Cell size beads
10 µm Streptavidin-coated microbeads Bang Laboratories CP01007 Aptamer affinity beads
4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold 4science 29-03573-01 Components of chip
Aptamer Integrated DNA Technologies GN3-6' RNA for bacteria conjugation
Borosilicate glass Schott BOROFLOAT 33 Components of chip
Centrifuge Daihan CF-10 Wasing particles
Cyanoacrylate glue 3M AD100 Attach PZT to microchip
Escherichia coli DH5α KCTC KCTC2571 Target bacteria
Functional generator GW Instek AFG-2225 Generate frequency
High-speed camera Photron FASTCAM Mini Observation of separation
Hot plate As one HI-1000 Heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe Koreavaccine 22G-10ML Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS Dow Corning Inc. Sylgard 184 Components of chip
LB Broth Miller BD Difco 244620 Cell culture (Luria-Bertani medium)
Microscope Olympus Corp. IX-81 Observation of separation
PBS buffer Capricorn scientific PBS-1A Wasing bacteria
PEEK Tubes Saint-Gobain Ppl Corp. AAD04103 Inject or collect particles
Piezoelectric transducer Fuji Ceramics C-213 Generate specific wave in channel
Power amplifier Amplifier Research 75A250A Amplify frequency
Pressure controller/μflucon AMED AMED-μflucon Control of air pressure/flow controller
Tris-HCl buffer invitrogen 15567027 Wasing particles
Tube rotator SeouLin Bioscience SLRM-3 Modifiying aptamer and bead

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
  2. Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
  3. Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
  4. Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
  5. Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
  6. Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
  7. Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
  8. Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
  9. Klussmann, S. The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, New Jersey. (2006).
  10. Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  11. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  12. Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
  13. Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
  14. Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
  15. Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  16. Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
  17. Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
  18. Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
  19. Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
  20. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
  21. Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
  22. Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
  23. Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  24. Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
  25. Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
  26. Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).

Tags

इंजीनियरिंग अंक 188 एप्टामर ध्वनिकफोरेसिस माइक्रोफ्लुइडिक्स ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया
एप्टामर आत्मीयता मोतियों का उपयोग करके ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के पृथक्करण के माध्यम से प्रवाह के लिए माइक्रोफ्लुइडिक एकोस्टोफोरेसिस
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, H. J., Kim, B. W., Lee, S.,… More

Choi, H. J., Kim, B. W., Lee, S., Jeong, O. C. Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads. J. Vis. Exp. (188), e63300, doi:10.3791/63300 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter