Summary
Este documento describe la fabricación y operación de chips acústoforeticos microfluídicos utilizando la técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio.
Abstract
Este artículo describe la fabricación y operación de chips acústoforéticos microfluídicos utilizando una técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio. Este método mejora la eficiencia de separación utilizando una mezcla de microcanales largos y cuadrados. En este sistema, la muestra y el búfer se inyectan en el puerto de entrada a través de un controlador de flujo. Para el centrado de cuentas y la separación de muestras, la alimentación de CA se aplica al transductor piezoeléctrico a través de un generador de funciones con un amplificador de potencia para generar fuerza de radiación acústica en el microcanal. Hay un canal bifurcado tanto en la entrada como en la salida, lo que permite la separación, purificación y concentración simultáneas. El dispositivo tiene una tasa de recuperación del >98% y una pureza del 97,8% hasta una concentración de dosis 10x. Este estudio ha demostrado una tasa de recuperación y pureza más alta que los métodos existentes para separar las bacterias, lo que sugiere que el dispositivo puede separar las bacterias de manera eficiente.
Introduction
Se están desarrollando plataformas microfluídicas para aislar bacterias de muestras médicas y ambientales, además de métodos basados en transferencia dieléctrica, magnetoforesis, extracción de perlas, filtrado, microfluídica centrífuga y efectos inerciales, y ondas acústicas superficiales 1,2. La detección de bacterias patógenas se continúa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero suele ser laboriosa, compleja ylenta 3,4. Los sistemas de acustoforesis microfluídica son una alternativa para abordar esto a través de un rendimiento razonable y aislamiento celular sin contacto 5,6,7. La acustoforesis es una tecnología que separa o concentra cuentas utilizando el fenómeno del movimiento del material a través de una onda sonora. Cuando las ondas sonoras entran en el microcanal, se clasifican según el tamaño, la densidad, etc., de las perlas, y las células se pueden separar de acuerdo con las propiedades bioquímicas y eléctricas del medio de suspensión 7,8. En consecuencia, se han realizado activamente muchos estudios acustoforéticos 9,10,11, y recientemente, se han introducido simulaciones numéricas 3D del movimiento acustoforético inducido por la corriente acústica impulsada por límites en microfluídica de onda acústica de superficie estacionaria 12.
Estudios en diversos campos están examinando cómo reemplazar los anticuerpos 2,3. El aptámero es un material diana de alta selectividad y especificidad, y se están realizando muchos estudios 2,9,10,13. Los aptámeros tienen ventajas de pequeño tamaño, excelente estabilidad biológica, bajo costo y alta reproducibilidad en comparación con los anticuerpos y están siendo estudiados en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas 2,3,14.
Aquí, este artículo describe un protocolo de tecnología de acustoforesis microfluídica que se puede utilizar para la separación rápida y eficiente de bacterias Gram-negativas (GN) de un medio utilizando microperlas modificadas con aptámero. Este sistema genera una onda estacionaria acústica bidimensional (2D) a través de un solo accionamiento piezoeléctrico al estimular simultáneamente dos resonancias ortogonales dentro de un microcanal rectangular largo para alinear y enfocar microperlas unidas a aptámeros en los puntos nodo y antinodo para una eficiencia de separación 2,11,15,16 . Hay un canal bifurcado tanto en la entrada como en la salida, lo que permite la separación, purificación y concentración simultáneas.
Este protocolo puede ser útil en el campo del diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas bacterianas, así como una respuesta rápida, selectiva y sensible a las infecciones bacterianas patógenas a través del monitoreo del agua en tiempo real.
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Protocol
1. Diseño del chip de acustoforesis microfluídica
NOTA: La Figura 1 muestra un esquema de la separación y recolección de microperlas diana de microcanales por acustoforesis. El chip de acustoforesis microfluídica está diseñado con un programa CAD.
- Diseñe un chip de acustoforesis microfluídica que utilice una mezcla de perlas modificadas con aptámero y perlas de poliestireno (PS) recubiertas de estreptavidina correspondientes al tamaño de las bacterias para estudiar el rendimiento de separación del dispositivo.
- Diseñe un chip de acustoforesis microfluídica que recoja las perlas de PS en la salida objetivo y deseche el resto a través de la salida después de inyectar una mezcla de muestra de PS en la entrada de la muestra (ver Figura 2 y Tabla 1).
NOTA: Para este propósito, el chip acustofluídico está diseñado y consta de dos entradas para inyectar muestras y tampón, un canal principal con un transductor piezoeléctrico conectado (PZT) para permitir que las microperlas se alineen centralmente, y dos salidas a través de las cuales se recogen las muestras y se descargan los desechos (Figura 3A) - Diseñar un chip de acustoforesis microfluídica en el que las microperlas, el tampón, las bacterias y los aptámeros pasan a través del canal principal, con las microperlas alineadas centralmente a través de la acustoforesis en chip inducida por el PZT (Figura 3B, C)
2. Fabricación de chips de acustoforesis microfluídica
NOTA: Ensamble cuatro capas en el siguiente orden: una capa de vidrio-silicio de borosilicato, una capa de silicio, una capa de vidrio de borosilicato y una capa de PZT, como se muestra en la Figura 3A,B.
- Prepare vidrio de borosilicato (la capa superior) con orificios de 2 mm de diámetro mediante chorro de arena17 en la entrada y salida para conectar tubos de polieteretercetona (PEEK). El vidrio borosilicato mide 20 × 80 × 0,5 mm3.
- Preparar una capa de canal de silicio de 200 μm de espesor con un microcanal con un área de sección transversal de 0,2 × 0,2 mm2 formado mediante una fotorresistencia y un patrón de silicio obtenido mediante grabado iónico reactivo profundo (RIE)18. Taladrar orificios de 1 mm de diámetro para los canales de entrada de muestras y tampón y los canales de recogida y salida de residuos durante el grabado iónico reactivo.
NOTA: Aquí, el grabado iónico utiliza el proceso RIE para formar microcanales. Se aplicó una fotorresistencia en forma de canal en una oblea de silicio para la capa del canal de silicio. La oblea de silicio recubierta de PR se grabó con plasma generado mediante la aplicación de 13,56 Mhz al flúor18. - Preparar un chip con las capas por encima y por debajo de la capa de silicio (20 × 80 × 0,5 mm 3) preparado en el paso 2.2 (20 × 80 × 0,5 mm3) unido al vidrio de borosilicato en el paso 2.1 y una tercera capa de vidrio de borosilicato utilizando anodización a 1.000 V y 400 °C19.
- Fijar un PZT (20 × 40 mm2) a la capa de vidrio de borosilicato a lo largo del canal microfluídico utilizando un adhesivo de cianoacrilato (10 μL o menos).
NOTA: Aplique el adhesivo como una capa muy delgada en el canal utilizando un hisopo de algodón para minimizar cualquier cambio en la altura. La figura 3C es una imagen del dispositivo.
3. Cepas bacterianas y cultivo
NOTA: Consulte la Tabla 2 para seleccionar e incubar bacterias GN y Gram-positivas (GP) para experimentos. Para el método de cultivo, consulte los pasos 3.1-3.4. Todas las bacterias deben incubarse en condiciones aeróbicas hasta obtener una absorbancia de 0,4 a 600 nm (OD600).
- Para bacterias GN como Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae y Pseudomonas pictorum y bacterias GP como Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus pasteuri, incubar en medio Luria-Bertani a 37 °C y 220 rpm durante 16 h.
- Para Enterobacter (GN) y Bacillus megaterium (GP; KCTC 1021), incubar en medio caldo nutritivo a 37 °C y 220 rpm durante 16 h.
- Para Enterococcus thailandicus (GP), incubar en de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) medio a 37 °C y 220 rpm durante 16 h.
- Para Listeria grayi (GP), incubar en medio de infusión cerebral corazón a 37 °C y 220 rpm durante 16 h.
- Centrifugar (9056 x g) las bacterias cultivadas durante 1 minuto a temperatura ambiente (RT), luego lavar dos veces con 1x tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Prepare las bacterias GN y GP seleccionadas para el análisis resuspendiendo en tampón PBS.
4. Microperlas e inmovilización del aptámero en microperlas
- Resuspender la mezcla de microperlas recubiertas de estreptavidina (10 μm) (Tabla de materiales) antes de usarla (mezclar mediante vórtice durante 20 s).
- Preparar el aptámero desnaturalizando a 95 °C durante 3 min y luego volver a plegarlo a 0 °C durante 2 min.
- Transfiera 250 μL de la mezcla de microperlas resuspendidas recubiertas de estreptavidina a un tubo de 1,5 ml y lave con tampón Tris-HCl (50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl) a RT. Luego agregue 100 μL de aptámero de ADN biotinilado al tubo.
- Incubar la mezcla a RT durante 30 min mientras gira (25 rpm).
- Después de la centrifugación (9056 x g), lavar el tubo dos veces con 200 μL de tampón Tris-HCl a RT.
- Añadir 10 μL de BSA (100 mg/ml) al tubo de muestra lavado e incubar durante 30 min a RT con rotación (25 rpm).
- Finalmente, lave las microperlas modificadas con aptámero dos veces por centrifugación (9056 x g) en tampón Tris-HCl a RT.
5. Configuración y funcionamiento de la acustoforesis
- Conecte los tubos de PEEK a las dos entradas para inyectar dos muestras y tampón y las dos salidas para recoger y descargar los residuos (Figura 4).
- Llene manualmente el canal de acustoforesis microfluídica con agua desmineralizada sin burbujas con una jeringa de 10 ml.
- Prepare un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida para controlar el flujo de fluido. Luego, llene los viales con muestra y tampón con dos orificios en sus tapas, respectivamente, y conéctelos a la entrada del chip.
NOTA: Un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida se puede reemplazar con múltiples controladores de presión de precisión. En la entrada del tampón, un tampón capaz de generar un flujo laminar que evita que la muestra se mueva hacia el centro durante la inyección de la muestra se inyecta a través de un controlador de flujo. - Después de preparar el dispositivo, inyecte la muestra y el tampón aplicando una presión de 2 kPa a la entrada de la muestra y de 4 kPa a la entrada del tampón utilizando el dispositivo de control de presión de precisión.
NOTA: En este momento, para un flujo laminar suave, la presión de inyección del tampón debe ser mayor que la presión de inyección de la muestra. El flujo es controlado por un controlador de flujo fijado al aspirador conectado al canal de entrada. - Concéntrese en una cuenta para moverla hacia el centro del canal microfluídico usando el PZT mientras verifica a través del microscopio.
NOTA: Cuanto más grande sea la cuenta, mayor será el efecto en la forma de onda, por lo que es más fácil alinearla con el punto de nodo. El generador de funciones con amplificador aplica potencia a PZT para generar onda sinusoidal en el microcanal. Dado que las partes superior e inferior del microcanal están hechas de vidrio, la onda sinusoidal generada se refleja y crea un punto de nodo7. - Genere una frecuencia de resonancia de 3,66 MHz utilizando un generador de funciones de un solo canal y amplifique una señal típica en 16 dB (aproximadamente nueve veces) utilizando un amplificador de potencia (Figura 4).
NOTA: La frecuencia de resonancia del actuador debe coincidir con el tamaño del canal; debido a que el canal es cuadrado, el PZT opera a una frecuencia precisa para crear un solo nodo. - Observe los procesos de separación y enriquecimiento en el chip acustofluídico con un microscopio de fluorescencia y una cámara de alta velocidad que funciona a 1.200 fps.
- Cuantificar y analizar la presencia o ausencia de bacterias GN y bacterias GP verificando las imágenes tomadas con la cámara de microscopio de fluorescencia de las perlas y bacterias unidas a bacterias descargadas a través de las muestras de recolección y salida de desechos.
NOTA: Las microperlas con tampón, bacterias y aptámeros pasan a través del canal principal, y las microperlas se alinean centralmente a través de la acustoforesis en chip inducida por el PZT. Finalmente, las microperlas que se han unido a las bacterias GN se recolectan en la salida de recolección, y las bacterias no recolectadas se descargan a través de la salida de desechos.
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Representative Results
La Figura 5 muestra la imagen del flujo de cuentas en función del voltaje PZT (OFF, 0.1 V, 0.5 V, 5 V). En el caso del chip acústoforético introducido en este estudio, se confirmó que a medida que aumentaba el voltaje del PZT, aumentaba la concentración central de las perlas de 10 μm. La mayoría de las perlas de 10 μm se concentraron en el centro a 5 V del voltaje PZT. A través de este resultado, se generó una frecuencia resonante de 3.66 MHz en un generador de funciones de un solo canal, y una señal general se amplificó en 16 dB (aproximadamente 9 veces) utilizando un amplificador de potencia.
La Tabla 3 muestra que la mezcla de microperlas de 1 μm (tamaño celular) y 10 μm (perla unida al aptámero) se inyectó en el chip de fluido acústico utilizado en este estudio, y el rendimiento de separación del chip de acuerdo con el caudal de salida (400, 450 y 475 μL / min) es el resultado de la evaluación. La tasa de recuperación es la relación entre el número de perlas recogidas en la salida y el número total de perlas inyectadas para perlas de 10 μm, que fueron 98% ± 2,2%, 98% ± 2,5% y 90% ± 9,8%, respectivamente. La pureza es la relación entre el número de cuentas de tamaño de 10 μm y el número total de cuentas recolectadas, que fueron 97.1% ± 3.6%, 97.6% ± 2.4% y 99.4% ± 0.6%, respectivamente. Esto muestra que el dispositivo tiene una alta eficiencia de separación para perlas con un tamaño de 10 μm.
La Figura 6 muestra imágenes y un gráfico de números unidos a bacterias por cuenta. Los datos relativos al funcionamiento del chip de acustoforesis con respecto al objetivo y las muestras de residuos se recogieron en la salida y la entrada, respectivamente. Todas las muestras se sometieron a un muestreo de 10 μL en tubos de recolección, y se observó el número de bacterias que se unen a las microperlas bajo un microscopio de fluorescencia. Muchas bacterias GN (por ejemplo, E. Coli DH5α) están unidas a todas las perlas, mientras que algunas bacterias GP (por ejemplo, Listeria grayi) están unidas a algunas cuentas. El número de bacterias GN y GP unidas a cada microperla modificada con aptámero (de 25 perlas) se midió utilizando un microscopio con una cámara de alta velocidad. Las cinco bacterias GN se unieron a perlas (4,96 ± 0,77 cada una), mientras que significativamente menos bacterias GP se unieron a las sustancias (0,08 ± 0,08 cada una) probadas. La intensidad de la señal difirió significativamente entre las bacterias GN y GP. Estos datos confirman que este dispositivo tuvo éxito en el aislamiento de bacterias GN.
Figura 1: Esquema de los microcanales, alineación central de microperlas mediante acustoforesis y recolección de los objetivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen CAD del chip de acustoforesis microfluídica para la separación de bacterias GN utilizando perlas de afinidad aptámero . (A) Capa de canal de silicio. (B) Capa superior de vidrio. (Para las dimensiones de 1 a 4, véase el cuadro 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estructura del microdispositivo de acustoforesis . (A) Parcela de piso, (B) plano de sección transversal y (C) fotografía del dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Esquema del sistema acustofluídico utilizado para separar y recoger células. La muestra o solución tampón se inyecta en el puerto de entrada a través del controlador de flujo. Para el centrado de perlas y la separación de muestras, la alimentación de CA se aplica al PZT a través de un generador de funciones con un amplificador de potencia para generar una fuerza de radiación acústica en el microcanal. La muestra objetivo separada se recoge a través de un tubo de recolección, y el fluido residual restante se recupera a través de otra salida. Se utiliza un módulo de cámara de alta velocidad para visualizar la separación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imagen del flujo de perlas en función del voltaje PZT. (A) PZT OFF, (B) PZT 0.1 V, (C) PZT 0.5 V, (D) PZT 5 V. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Número de bacterias GN (E. coli DH5α) y GP (Listeria grayi) unidas a microperlas modificadas con aptámero (n = 25 , barra de error = error estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número | Dispositivo | Anchura (W) o diámetro (D) (μm) |
| 1 | Puerto de entrada y salida (silicio) | 1000 (D) |
| 2 | Canal microfluídico | 200 (A) |
| 3 | Canal de entrada y salida | 400 (A) |
| 4 | Puerto de entrada y salida (vidrio) | 1500 (D) |
Tabla 1: Dimensiones de la plataforma microfluídica neumática (1 a 4 en la Figura 2).
| Bacterias GN | Bacterias GP |
| Escherichia coli (DH5α) | Bacillus megaterium (KCTC 1021) |
| Enterobacter cloacae | Staphylococcus epidermidis |
| Sphingomonas insulae | Listeria grayi |
| Escherichia coli KCTC 2571 | Enterococcus thailandicus |
| Pseudomonas pictorum | Staphylococcus pasteuri |
Tabla 2: Las bacterias GN y GP estudiadas.
| Caudal a la salida del agua (μL/min) | Tasa de recuperación (%) | Pureza (%) |
| 400 (5x concepto volumétrico) | 98 ± 2.2 | 97,1 ± 3,6 |
| 450 (concepto volumétrico 10x) | 98 ± 2,5 | 97,6 ± 2,4 |
| 475 (concepto volumétrico 20x) | 90 ± 9,8 | 99,4 ± 0,6 |
Tabla 3: Tasa de recuperación y pureza de la separación.
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Discussion
Desarrollamos un dispositivo microfluídico de levitación sónica para capturar y transferir bacterias GN de muestras de cultivo a alta velocidad basado en un método de funcionamiento continuo según su tamaño y tipo, y microperlas modificadas con aptámero. El microcanal largo y cuadrado permite un diseño más simple y una mayor rentabilidad para la acustoforesis 2D que la reportada anteriormente 20,21,22,23,24,25,26. El dispositivo tiene una tasa de recuperación del >98% hasta una concentración de dosis de 10x. Este estudio muestra una mayor tasa de recuperación y pureza que los métodos existentes sin etiqueta 20,21,22,23,24 y los métodos de cuentas de afinidad 25,26 para separar bacterias. Esto sugiere que el dispositivo puede separar las bacterias de manera eficiente. Sin embargo, como las perlas de 10 μm pueden fluir hacia los canales laterales, la tasa de recuperación se reduce al 90% a una concentración de dosis de 20x debido a la fuerte fuerza de extracción que surge de la salida cerrada que bloquea la radiación acústica en una prueba de rendimiento. Si bien la tasa de recuperación en el chip puede alcanzar el 98%, varios factores reducen la tasa de recuperación, como la precipitación de perlas en el inhalador o la obstrucción del tubo que conecta el inhalador al chip.
Hay algunos puntos clave necesarios para hacer este chip acústiforeto y hacer que funcione. El adhesivo utilizado para fijar el PZT debe usarse lo menos posible para la precisión de la corrugación y el PZT y el microcanal deben ser paralelos. Los errores en este paso resultan en la transmisión de formas de onda incorrectas a través del PZT al chip, que se manifiesta como desalineación de las perlas. Además, tenga cuidado al operar, ya que varios factores pueden empeorar la tasa de recuperación, como la sedimentación de las perlas de la jeringa o el bloqueo del tubo de conexión con chips de la jeringa.
Este dispositivo no solo se puede utilizar para detectar bacterias vivas o biomarcadores derivados de bacterias en el campo del diagnóstico precoz de enfermedades infecciosas bacterianas, sino que también se puede extender al monitoreo de la contaminación del agua, lo que ayudará a identificar el bioterrorismo y las infecciones bacterianas patógenas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (Ministerio de Ciencia y TIC). (No. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
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