Summary
神经肽的质谱表征提供序列、定量和定位信息。这种优化的工作流程不仅对神经肽研究有用，而且对其他内源性肽也很有用。此处提供的方案描述了使用 LC-ESI-MS、MALDI-MS 点斑和 MALDI-MS 成像的神经肽的样品制备、MS 采集、MS 分析和神经肽的数据库生成。
Abstract
神经肽是调节几乎所有生理和行为过程的信号分子，如发育，繁殖，食物摄入和对外部压力源的反应。然而，神经肽的生化机制和完全补充及其功能作用仍然知之甚少。这些内源性肽的表征受到这类信号分子中巨大多样性的阻碍。此外，神经肽在浓度比神经递质低100倍 -1000倍时具有生物活性，并且在突触释放后容易发生酶降解。质谱（MS）是一种高度灵敏的分析工具，无需全面的 先验 知识即可识别，定量和定位分析物。它非常适合全局分析神经肽并帮助发现新型肽。由于这类肽的低丰度和高化学多样性，几种样品制备方法，MS采集参数和数据分析策略已从蛋白质组学技术中改编，以实现最佳的神经肽表征。在这里，描述了使用液相色谱（LC）-MS和基质辅助激光解吸/电离（MALDI）-MS从复杂生物组织中分离神经肽的方法，以进行序列表征，定量和定位。包括从蓝蟹Callinectes sapidus（一种没有全面基因组信息的生物体）制备神经肽数据库的方案。这些工作流程可以适应使用各种仪器研究不同物种中的其他类别的内源性肽。
Introduction
神经系统是复杂的，需要一个神经元网络来传递整个生物体的信号。神经系统协调感觉信息和生物反应。信号传输中涉及的复杂和复杂的相互作用需要许多不同的信号分子，如神经递质，类固醇和神经肽。由于神经肽是最多样化和最有效的信号分子，在激活对压力和其他刺激的生理反应中起关键作用，因此确定它们在这些生理过程中的特定作用是有趣的。神经肽功能与其氨基酸结构有关，这决定了迁移性，受体相互作用和亲和力1。诸如组织化学之类的技术很重要，因为神经肽可以在组织的不同区域合成，储存和释放，并且电生理学已被用于研究神经肽结构和功能2，3，4，但这些方法受到通量和特异性的限制，以解决神经肽的巨大序列多样性。
质谱（MS）能够对神经肽结构和丰度进行高通量分析。这可以通过不同的MS技术进行，最常见的是液相色谱 - 电喷雾电离MS（LC-ESI-MS）5 和基质辅助激光解吸/电离MS（MALDI-MS）6。利用高精度的质量测量和MS片段化，MS提供了在没有 先验 知识的情况下将氨基酸序列和翻译后修饰（PTM）状态分配给复杂混合物中的神经肽的能力，以帮助确定其功能7，8。除定性信息外，MS还通过无标记定量（LFQ）或基于标记的方法（如同位素或等压标记）实现神经肽的定量信息9。LFQ的主要优点包括其简单性，分析成本低，样品制备步骤减少，可以最大限度地减少样品损失。然而，LFQ的缺点包括仪器时间成本增加，因为它需要多次技术重复来解决运行间变异性的定量误差。这也导致准确量化微小变异的能力下降。基于标记的方法受到的系统变化较小，因为可以使用各种稳定同位素对多个样品进行差异标记，组合成一个样品，并同时通过质谱分析。这也增加了通量，尽管同位素标记可能非常耗时且成本高昂，用于合成或购买。全扫描质谱（MS1）光谱复杂性也随着多重检测的增加而增加，这减少了能够被分割并因此被鉴定的独特神经肽的数量。相反，等压标记不会增加MS1水平的光谱复杂性，尽管它为低丰度分析物（如神经肽）带来了挑战。由于等压定量是在片段离子质谱（MS2）水平上进行的，因此低丰度神经肽可能无法定量，因为可以选择更丰富的基质成分进行片段化，并且选择的那些可能没有足够高的丰度来量化。通过同位素标记，可以对每个鉴定的肽进行定量。
除了鉴定和定量外，MS还可以通过MALDI-MS成像（MALDI-MSI）10获得定位信息。通过在样品表面上对激光进行光栅，可以将MS光谱编译为每个 m / z 值的热图图像。绘制不同区域不同条件下瞬时神经肽信号强度的图谱可以为功能测定11提供有价值的信息。神经肽的定位尤其重要，因为神经肽功能可能因位置12而异。
神经肽在 体内 的丰度低于其它信号分子，例如神经递质，因此需要灵敏的检测方法13。这可以通过去除更高丰度的基质成分来实现，例如脂质11，14。与常见的蛋白质组学工作流程相比，需要对神经肽分析进行其他考虑，主要是因为大多数神经肽组学分析忽略了酶消化。这限制了神经肽数据分析的软件选项，因为大多数都是使用基于蛋白质组学数据和肽检测通知的蛋白质匹配的算法构建的。然而，许多软件如PEAKS15 由于其 从头 测序功能而更适合神经肽分析。从提取方法到MS数据分析，神经肽的分析需要考虑几个因素。
这里描述的方案包括用于样品制备和二甲基同位素标记，数据采集以及通过LC-ESI-MS，MALDI-MS和MALDI-MSI对神经肽进行数据分析的方法。通过来自几个实验的代表性结果，证明了这些方法鉴定，定量和定位来自蓝蟹 Callinectes sapidus的神经肽的效用和能力。为了更好地理解神经系统，通常使用模型系统。许多生物体没有完全测序的基因组，这阻碍了肽水平的全面神经肽发现。为了减轻这一挑战，包括一种用于鉴定新型神经肽和转录组挖掘的协议，以生成没有完整基因组信息的生物体的数据库。这里介绍的所有方案都可以针对任何物种的神经肽样品进行优化，并应用于任何内源性肽的分析。
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Protocol
所描述的所有组织采样均按照威斯康星大学麦迪逊分校的指南进行。
1. 神经肽的LC-ESI-MS分析
- 神经肽提取和脱盐
- 在组织获取之前，制备酸化甲醇（acMeOH）（90：9：1 MeOH：水：乙酸），如16所述。
- 从甲壳类动物17 中收集脑组织，并使用镊子立即将每个组织放入含有20μLacMeOH的0.6mL管中。
注意：不同动物和不同组织类型的组织解剖方案差异很大。读者参考了协议17 ，以获取有关如何从甲壳类动物中解剖脑组织和多种其他组织类型的详细说明。样品可以在-80°C下储存直到使用（理想情况下在6个月内）。所描述的体积用于 Callinectes sapidus的单个大脑。应根据组织大小调整体积。组织可以在没有溶剂的情况下立即快速冷冻，尽管不建议这样做，因为内源性蛋白水解酶不会受到抑制并保持活性，尽管在寒冷时速度较慢。 - 向样品中加入150μL acMeOH。在超声均质机上将总超声处理时间设置为24 s，脉冲时间设置为8 s，暂停时间设置为15 s，振幅设置为50%，并在冰上均质化样品。
注：有不同的均质化系统可用。根据样品类型和设备调整设置和条件。 - 将样品在4°C下以20，000× g 离心20分钟。用移液器，将上清液转移到管中，并在约35°C的真空浓缩器（266 x g，1 x 10-4 Torr）中干燥。
注意：干燥的样品可以在-80°C下储存直到使用（理想情况下在6个月内）。必须谨慎加热真空浓缩器。虽然热量缩短了干燥时间，但在所有液体蒸发后，必须立即将样品从浓缩器中取出，以最大限度地减少肽降解。为了避免这种情况，可以在此步骤和所有后续步骤中省略加热。 - 对于脱盐，在20μL0.1%甲酸（FA）中重构提取的组织样品，充分涡旋，并在室温下在水浴中超声处理1分钟。
注意：有不同的脱盐材料可供选择。根据树脂特性和神经肽量调整溶液和体积。总肽量可以使用商业肽定量测定法估计（参见 材料表）。 - 将0.5μL样品涂在pH条上，以确认pH值<4。如果pH值较高，加入1μL等分试样10%FA，直到pH值<4。
- 遵循制造商的脱盐协议18.制备含有100μL50%乙腈（ACN）的润湿溶液，含有100μL0.1%FA的平衡溶液，含有100μL0.1%FA的洗涤溶液，以及含有20μL25%ACN / 0.1%FA，20μL50%ACN / 0.1%FA和20μL75%ACN / 0.1%FA的洗脱溶液。
- 用C18树脂获得10μL脱盐头（参见 材料表）。
- 将脱盐吸头放在设置为15μL的20μL移液器上。一旦脱盐吸头变湿，在脱盐时保持移液器压低，直到它被丢弃，以防止空气通过。
- 用润湿溶液吸出尖端3倍，用平衡溶液吸出3倍。在样品中吸取10x，然后在洗涤溶液中洗涤3x，每次洗涤丢弃。通过在每个洗脱溶液中吸取10倍以增加ACN的顺序进行洗脱。
注意：洗脱分数可以分开或组合，以便进一步分析。 - 丢弃用过的脱盐吸头，并在约35°C的真空浓缩器（266× g，1×10-4 Torr）中干燥洗脱的神经肽。
注意：这可以储存在-80°C直至使用（理想情况下在6个月内）。
- 组织提取物中神经肽的同位素标记
注意：此步骤是可选的，仅在需要定量时使用。- 在通风橱中制备2-plex同位素二甲基标记溶液：1%CH2OH2 （13.5μL储备37重量/重量百分比（重量百分比（重量%）在486.5μL水中的水溶液），1%CH2OD2（25μL 储备液20重量%溶液在475μL水中）和0.03M硼烷吡啶（3.75μL储备8M溶液在996.25μL水中）。
注意：甲醛是有毒的，所以所有的溶液都应该放在通风的烟罩里。戴上手套、实验室外套、护目镜和不透水的鞋子。使用这种材料时不应佩戴隐形眼镜。
注：有不同的同位素试剂;根据所需的样品类型和标记通道数量选择合适的。 - 将粗神经肽提取物溶解在10μL水中并超声处理10分钟。
- 向每个不同的实验条件下加入10μL不同的同位素甲醛溶液（即CH2OH2，CH2OD2等）进行定量测定。涡旋充分混合，并以2，000× g短暂离心每个样品。
- 向每个样品管中加入10μL0.03M硼烷吡啶。涡旋充分混合，并以2，000× g短暂离心每个样品。
- 将样品在37°C下在水浴中孵育15分钟。
- 从水浴中取出样品，加入10μL100mM碳酸氢铵。涡旋充分混合，并以2，000× g短暂离心每个样品。
- 将标记的样品合并为一个2-plex样品，并在约35°C的真空浓缩器（266 x g，1 x 10-4 Torr）中干燥神经肽。
- 通过重新执行步骤1.1.5 - 1.1.10对标记的神经肽进行脱盐，并将它们储存起来，直到准备好进行数据采集。
- 在通风橱中制备2-plex同位素二甲基标记溶液：1%CH2OH2 （13.5μL储备37重量/重量百分比（重量百分比（重量%）在486.5μL水中的水溶液），1%CH2OD2（25μL 储备液20重量%溶液在475μL水中）和0.03M硼烷吡啶（3.75μL储备8M溶液在996.25μL水中）。
- 数据采集
- 在12μL3%ACN / 0.1%FA中重建干燥的脱盐神经肽，充分涡旋，在37°C水浴中超声处理1分钟，并在2，000× g下短暂离心。将每个样品转移到自动进样器小瓶中。
注意：根据神经肽量将样品体积调节至每μL〜1μg肽的浓度，总肽量可以使用商业肽定量测定法估计（参见 材料表）。 - 使用自动进样器将1μL样品注入高分辨率纳米LC-MS / MS仪器中（参见 材料表）。
- 使用约15厘米长的反相（RP）C18柱（见 材料表）在水中以0.1%的FA作为流动相A和在ACN中以0.1%的FA作为流动相B运行样品。以300 nL / min的速率以3%-95%的B梯度运行样品超过11分钟。
- 对于此处使用的 MS 仪器，使用常见的 MS 条件，即喷雾电压为 2.00 kV，毛细管温度为 275 °C。
- 获取 200 - 2，000 m/z 范围内的 MS 光谱，分辨率为 60，000，自动增益控制 （AGC） 目标为 1 x 106，最大离子注入时间 （IT） 为 150 ms。
- 选择15个最强烈的离子（最小强度为3.2 x 104）进行高能碰撞解离（HCD）碎片，使用归一化碰撞能量30，隔离窗口为2.0 m / z，分辨率为15，000，AGC目标为2 x 105，最大IT为250 ms。
- 将动态排除窗口设置为 30 秒。排除电荷为1或≥8的离子和具有未识别电荷状态的离子。
- 在12μL3%ACN / 0.1%FA中重建干燥的脱盐神经肽，充分涡旋，在37°C水浴中超声处理1分钟，并在2，000× g下短暂离心。将每个样品转移到自动进样器小瓶中。
- 神经肽鉴定和定量
注意：有许多用于数据库搜索和肽定量的软件（开源和商业软件）。在这里，将使用PEAKS Studio（蛋白质组学软件）15 。- 使用 1.4.2 - 1.4.6 中概述的步骤执行数据库搜索。
- 创建一个新项目并添加LC-MS数据，为酶选择 无 ，为仪器选择 Orbitrap ，为片段选择 HCD ，为采集选择数据依赖性采集（DDA）。
注：根据数据采集参数选择适当的参数。 - 选择“标识”，然后选择“正确的前体 [DDA] ”和“仅质量”。
- 选择 数据库搜索 ，并使用单同位素质量对前体质量设置 20.0 ppm 的容错能力，对片段离子质量使用 0.02 Da ，对酶类型设置 无 ，对消化模式 不具体 ，对最大缺失裂解设置 100 ，以及以下可变 PTM，每个肽的最大允许可变 PTM 为 3： 酰胺化、氧化 （M）、 来自 E 的火焰胶、 和 来自Q的Pyro-glu。
- 选择 神经肽数据库，通过诱饵融合估计错误发现率（FDR）。
注意：应调整质量公差误差以匹配收集的数据。使用示例类型的相应数据库。未选择酶时，最大漏解片段参数不会影响搜索。但是，如果软件没有“ 未指定摘要”模式作为选项，则需要大量遗漏的解理。 - 如果需要无标记定量，请选择 定量，选择 无标记 ，并将误差容差设置为 20.0 ppm ，保留时间公差为 1.0 分钟。
- 如果执行同位素标记的步骤1.2，则执行前体离子定量。
- 选择 定量，选择 前体离子定量，使用 1.0分钟的保留时间范围，并使用 1%的FDR阈值。
- 从选择方法下拉菜单中选择预设或自定义量化 方法 。
- 若要创建新的自定义方法，请单击“ 窗口>配置”>“标记 Q 方法>新建”。命名新方法，并为“方法类型”选择 “前体离子定量 ”。选择 添加行 ，然后从“PTM 选项”列表中选择“修改”。
- 添加LC-MS数据并选择 参考条件 作为实验对照条件对神经肽的修饰。
- 按照步骤 1.4.9 - 1.4.11 中所述评估搜索结果。
- 通过摘要选项卡筛选 -10lgP ≥ 20 的肽和蛋白质的结果，选择 ≥ 1 个唯一肽，然后选择标记为“ 使用重要肽”的框。
- 评估数据库搜索结果，其中蛋白质.csv代表神经肽鉴定，肽.csv代表神经肽片段鉴定。
- 检查数据库搜索蛋白质和肽评分、质量准确性和序列覆盖率。
注：每个数据库搜索软件都使用独特的评分算法，可能需要进行相应的评估。可以通过手动检查观察到的光谱来评估含有完整片段离子系列的已鉴定肽的鉴定。
2. 神经肽的MALDI-MS点斑分析
- 样品制备
- 如果需要定量，请遵循步骤1.1或步骤1.1 - 1.2，但不包括步骤1.2.8（在MALDI-MS分析之前不需要在同位素标记后脱盐）。
- 在5μL0.1%FA中重建干燥的脱盐神经肽，充分涡旋，在37°C水浴中超声处理1分钟，并在2，000× g下短暂离心。
- 为了在甲壳类组织中发现神经肽，在50%甲醇（MeOH）/ 0.1%FA（v / v）中制备150mg / mL 2，5-二羟基苯甲酸（DHB）作为基质。
- 将3μL样品液滴移液到疏水膜上（参见 材料表），并将3μL基质直接移液到样品液滴上。上下移液以混合。
- 移液器1μL的1：1样品：基质混合物进入MALDI不锈钢靶板的孔中。使用移液器吸头将每种混合物分散到样品孔的边缘。样品必须接触孔雕刻的边缘，以促进均匀分布（图4A）。
- Spot 1 μL 1：1校准剂：基质混合物（商业或定制校准混合物，聚合物材料（即溶解在MeOH中的红磷）或普通基质团簇离子）12 放入样品附近的孔中。
注意：红磷在斑点前不需要与基质混合。
- 数据采集
- 将含有干燥样品斑点的目标板插入MALDI串联飞行时间（TOF / TOF）仪器（见 材料表）。
- 对于 DHB 基质，将激光功率设置为 95%，选择 自动最佳检测器增益和 智能 - 完整样品 载流子移动模式。获取200 - 3200 m/z 范围内的MS光谱，并将每个点的多个光谱相加，以提高神经肽的信噪比。
注意：优化激光功率百分比、检测器增益，并选择适当的样品载流子移动模式，以便每次采集大致覆盖整个光斑，后续采集不会进入先前位置。 - 校准仪器。
注意：调整质量范围以包含所需的神经肽范围。
- 数据分析
- 在数据分析软件中打开MALDI-MS文件（参见 材料表），然后单击此处使用的软件的 基线减法 。
- 通过单击“ 查找物料清单”执行峰值拣选。如果峰值太少，请选择“编辑质量列表”手动编辑 质量列表 ，然后单击频谱中的峰值以将其添加到质量列表中。
- 通过将质量列表与包含[M + H ] + m / z值的神经肽数据库进行比较来执行准确的质量匹配（±200 ppm误差）。
注意：常见的盐加合物，如[M+K]+、[M+Na]+和[M+NH4]+，也应包含在准确的质量匹配目标列表中。 - 要验证已识别的峰，请生成感兴趣的 m / z 列表并执行MS / MS实验。
3. 神经肽的MALDI-MS成像分析
- 样品制备
注意：对于太薄而无法切片的组织，不需要包埋和切片步骤。- 用明胶（37°C，100mg / mL在去离子水中）填充半个低温恒温杯，并使其在室温下固化。将剩余的液体明胶在37°C水浴中保温。
- 从动物中收集所需的神经元组织，并使用镊子立即将组织浸入含有去离子水的0.6mL管中1秒。
注：神经元组织解剖参考步骤1.1.2注。 - 将组织放在固体明胶的顶部，并用液体明胶填充冷冻机杯的其余部分。使用镊子定位组织。
- 将低温恒温杯放在平坦的表面上，用干冰冷冻。
注意：将样品储存在-80°C直至使用（理想情况下在6个月内）。 - 对于切片制备，通过将模具切掉，将明胶嵌入的样品从低温恒温器模具中分离出来。
- 通过将1 mL去离子水滴移液到卡盘上并立即将包埋的组织压到液滴上，将包埋的组织安装到低温恒温器卡盘上。
- 冷冻后，在组织周围移液更多的去离子水，以进一步将其固定在卡盘上。在-20°C的低温恒温器盒（见 材料表）内执行这些步骤。
- 将组织切成大约一个细胞厚度（8-20μm，取决于样品类型），并将每个切片解冻安装到氧化铟锡（ITO）涂层的载玻片上，方法是将载玻片的一侧靠近该部分，并将手指放在载玻片的另一侧以缓慢加热玻璃并使该部分粘附在载玻片上。
注意：组织切片也可以通过用镊子（冷却至-20°C）拾取明胶的一个边缘来解冻，将其放在ITO涂层的载玻片上，然后将手指放在载玻片的另一侧以缓慢加热玻璃并使切片粘附在载玻片上。 - 通过使用疏水笔在组织部分附近绘制一个小圆圈并在圆圈内发现校准剂，发现要用作校准剂的样品（参见步骤2.1.6以了解校准剂选项）。
- 用一支涂白笔标记幻灯片的每个角落，其中小形状包含要用作教学点的锋利边缘（即x）。
- 将载玻片放入 MALDI 载玻片适配板中，并使用扫描仪进行高分辨率 （≥2400 DPI） 光学图像扫描。
- 使用自动喷雾器在组织部分喷涂基质（有关喷雾器的详细信息和说明，请参见 材料表 ）。
- 对于甲壳类组织中神经肽的微星，使用40mg / mL DHB在50%甲醇/ 0.1%FA（v / v）中作为基质，将喷嘴温度设置为80°C，速度设置为1，250 mm / min，流速为0.1 mL / min，通过次数为12，并且自动喷雾器每次通过之间30秒。
- 数据采集
- 插入完全干燥的目标板，其中包含喷洒基质的解冻安装的组织切片。
- 设置MS成像采集文件参数，使激光直径小于光栅步长。
- 加载扫描的光学图像并使用x示教点校准样品板。定义要测量的比实际组织部分稍大的感兴趣组织区域，以包括仅包含基质的区域。
- 校准仪器并获取 200 - 3200 m/z 范围内的光谱。调整质量范围以包含所需的神经肽范围。
- 数据分析
- 要处理数据，请将 MS 成像数据集导入所需的软件，选择基线去除算法，然后使用 总离子计数归一化数据。
注意：选择不同的归一化算法（如中位数、均方根 （RMS） 值或参考 m/z 值的强度）可能会更改许多 m/z 值的空间分布。选择最适合所需分析物的归一化算法。 - 要从理论峰值列表为每个m / z值生成图像，请上传包含神经肽[M + H]+，[M + Na]+，[M + NH4]+等的逗号分隔值（CSV）文件。通过单击“文件”>“导入”>峰值列表“获取 m/z 值。为峰值列表命名。
- 为了估计适当的ppm误差阈值，首先手动识别MS光谱中的神经肽峰，并将其与神经肽理论质量进行比较。计算 ppm 错误，然后单击 文件>文件属性>间隔宽度 和输入 ppm 错误。
- 从下拉菜单中选择峰值列表，然后单击 为峰值列表的每个间隔创建 m/z 图像。
- 通过单击保存每个 m/z 图像的屏幕截图来保存每个 m/z 图像。
注意：推定的神经肽鉴定可以通过识别 m / z 图像来执行，其中分析物信号仅局限于组织内而不是周围基质中。 - 要验证峰值身份，请生成感兴趣的 m / z 列表并执行MS / MS实验。
- 要处理数据，请将 MS 成像数据集导入所需的软件，选择基线去除算法，然后使用 总离子计数归一化数据。
4. 使用 从头 测序发现新的推定神经肽
- 执行步骤 1.4.2 - 1.4.5。
- 仅从PIPS软件出口从头.csv肽，平均局部置信度（ALC）评分 为≥75。
注意：有许多软件可用于执行 从头 测序，每个软件都有自己的评分算法，应进行相应的评估。 - 在肽列表中搜索已知的序列基序，这些基序指示属于特定神经肽家族19的神经肽。
注意：虽然各物种的基序通常保存完好，但应根据样本生物体来选择所搜索的基序。
5. 预测神经肽序列的转录组挖掘
注意：此步骤是可选的，仅用于添加到现有的神经肽数据库或构建新的神经肽数据库。
- 选择已知的目标前激素前氨基酸序列并使用 tBLASTn （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
_LOC=blasthome）来搜索查询前激素序列，包括nr / nt，Refseq_genomes，EST和TSA。
注意：要根据蛋白质数据库搜索查询序列，请使用 BLASTp （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn）。- 选择目标生物体（税号），并将 预期阈值 算法参数更改为 1000 以包括低分对齐。
- 运行 BLAST 程序，然后检查结果，在查询序列和受试者序列之间是否有高同源性分数，从而产生显著的比对。保存包含核苷酸序列的 FASTA 文件。
注意：如果有多个受试者序列具有相似的同源性评分，请执行MAFFT比对以缩小推定序列20，21的范围。
- 使用 Expasy翻译 工具（https://web.expasy.org/translate/）将前激素原核苷酸序列翻译成前激素前肽序列。对于 C. sapidus，选择 无脊椎动物线粒体 作为遗传密码。
- 使用 SignalP 检查肽序列中的信号肽序列和激素原裂解位点（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）。
注意：与已知的前激素前处理方案的同源性也可用于识别激素前裂解位点。如果需要，可以预测信号肽可能的翻译后修饰。硫化剂（https://web.expasy.org/sulfinator/）可用于预测酪氨酸残基的硫酸化状态。DiANNA（http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/）可用于预测二硫键连接。
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Representative Results
样品制备和MS分析的工作流程如图 1所示。解剖神经元组织后，进行均质化，提取和脱盐以纯化神经肽样品。如果需要基于同位素标记的定量，则再次标记样品并脱盐。通过LC-MS / MS分析所得样品以进行神经肽鉴定和定量。
通过蛋白质组学软件鉴定的神经肽应具有良好的肽片段化序列覆盖率，然而，这并不是全局定义或标准化的。对于绝对鉴定，每个氨基酸都应该产生一个片段离子，提供明确的鉴定和定位。这还必须与合成的肽进行比较，以确认每个片段离子的强度。由于在每个推定的鉴定上执行此操作的成本是不可行的，因此通常基于置信度来描述鉴定，其中观察到的片段离子越多，肽鉴定置信度就越高。虽然 图2A，B 描绘了两种神经肽，它们都具有100%的序列覆盖率和由0.02 Da的最大极限定义的低质量误差，但仅观察到 图2B 中神经肽的破碎覆盖率差（仅来自三个离子）降低了鉴定特定亚型的置信度。 图2C 描绘了提取的离子色谱图（XICs），这是一个包含所选 m / z 值的信号强度作为保留时间函数的曲线，在用于LFQ的两个样品中检测到。神经肽的保留时间略有不同，因为它是在两次单独和连续的运行中鉴定的;但是，差异在1分钟的可靠阈值内。因此，软件计算的面积在曲线下从XIC的比率用于该神经肽的LFQ。
对于二甲基标记神经肽的定量，MS1谱应包含理论神经肽 m / z 值处的峰值和 m / z 值处的峰值，其质量偏移与所使用的同位素标记试剂之间的质量差相关。在 图2D中，该2-plex二甲基标记样品的质量偏移为4.025 Da。然后由软件计算来自其XIC的前体离子曲线下的面积，并用于计算相对丰度比。蛋白质组学软件导出表的简化版本，其中包含已鉴定的神经肽及其LFQ比值，示于 表1中。同位素标记的神经肽也获得了类似的结果。
软件算法能够对光谱进行 从头 测序，以检测新的假定神经肽。在要求检测推定的新型神经肽时，高置信度鉴定是基于片段离子观察明确鉴定和定位所有氨基酸的理想情况。 图3 描绘了在C端含有-RYamide基序的 从头 测序肽的光谱，C端是甲壳类RYamide家族22的已知神经肽共享的保守序列基序基序。从数据库中匹配肽，具有100%的序列覆盖率，观察到所有氨基酸形成片段离子，由0.02 Da的最大极限定义的低片段离子质量误差，并含有高斯洗脱曲线。这些结果表明，观察到属于甲壳类动物 - RYamide神经肽家族的内源性肽。
MALDI-MS点测量可以提供与LC-ESI-MS鉴定相辅相成的神经肽鉴定，并提供更高的通量能力。在提取粗组织匀浆以制备神经肽，脱盐和标记（如果需要）后，样品可以与基质混合并点在MALDI不锈钢靶板上，如图 4A所示。成功移液均匀的样品斑点会产生清晰分辨的峰，特别是在校准光谱内（图4B）。使用MALDI-TOF仪器时，必须在每次实验开始时校准仪器。任何具有已知质量的分析物都可用于校准仪器，如果它在样品的所需质量范围内。在这里，红磷用于仪器的正离子质量校准。与使用肽校准混合物相比，它具有优势，因为它在室温下具有稳定性，成本低廉，由于其聚合而具有丰富的峰，高信噪比，并且不需要基质进行电离。
对于神经肽的MALDI-MS成像，所使用的MALDI TOF / TOF仪器需要对ITO涂层载玻片进行手动图像校准（步骤3.1.10），以将光学图像与样品相关联。 图5 中的图表显示了用作示教点的白光十字准线的正确位置，以使仪器能够将扫描的光学图像与实际样品板相关联。它还说明了用户应避免的ITO涂层载玻片区域（即，不包含样品或基质）。对于质量校准，由于飞行时间质量分析仪的固有性质，校准样品点相对于组织样品在ITO涂层载玻片上的放置直接影响质量误差，尽管这个问题的大小取决于目标分析物的丰度。这个问题的解决方案是手动检查来自不同组织切片的MS1光谱的峰，以寻找峰偏移的证据。如果存在移峰，请考虑在每个组织切片旁边的ITO涂层载玻片上添加额外的质量校准点。从那里，用户可以一起平均校准点的光谱，或者一次只使用最靠近组织部分的校准点对一个组织部分进行MS成像。收集样品后，在分配推定的神经肽鉴定之前，验证来自 m / z 值对应于神经肽的信号仅定位在组织区域内（图6）。
图1：用于质谱分析的神经肽样品制备工作流程。 用于组织提取物分析，粗组织匀浆脱盐，用稳定同位素标记标记，再次脱盐，并用MS分析。用于成像分析，将完整的组织包埋，冷冻切片，用基质施加，并通过MALDI-MSI进行分析。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：通过蛋白质组学软件进行的鉴定和定量。 神经肽通过具有（A）良好或（B）较差MS2片段化覆盖率的测距质量谱进行检测。片段离子质量匹配误差显示在光谱下方。（C）XIC轮廓形状和保留时间（RT）可以手动检查通过LFQ定量的神经肽。（D）MS1光谱用于检测和定量二甲基标记的神经肽。 请点击此处查看此图的大图。
图3：用于新型神经肽检测的从头测序。（A）推定的新型RYamide的MS2谱显示出良好的片段覆盖率，每个片段的质量误差较低。（B）将鉴定出的碎片离子列作人工检查。（C）手动检查新型神经肽的XIC的高斯峰形状。缩写：RT = 保留时间。请点击此处查看此图的大图。
图 4：MALDI-MS 光斑和校准光谱。 （A）MS光谱质量依赖于MALDI不锈钢靶井中均匀的基质肽分布。左边的三个斑点是接触井雕刻边缘的好斑点的例子，右边的三个斑点是坏点的例子。两个斑点都含有α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质和肽标准混合物。（B） 使用 500 - 3200 m/z 的红磷团簇校准光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：ITO 涂层载玻片的描绘。 （A） 标注了重要区域的示意图：放置组织切片的位置（浅蓝色矩形）、应避免的自动示教点位置（红色矩形）、可绘制示教点的示例位置（白色十字准线）以及螺钉连接到转接板上并应避免的位置（深蓝色椭圆形）。（B）包含两个组织切片的载玻片的照片，包含校准混合物的点和十字准线标记。组织部分和校准点的位置在载玻片的另一侧勾勒出来。 请点击此处查看此图的大图。
图6：萨皮杜斯锥虫窦腺的MS图像。显示（A）HL / IGSL / IYRamide（m / z 844.48），（B）阿伐他汀A型NPYAFGLamide或GGPYAFGLamide（m / z 780.40），（C）阿伐他汀A型GQYAFGLamide（m / z 754.39）和（D）RFamide GRNFLRFamide（m / z 908.52）的神经肽[M + H]+离子分布图像。使用± 50 ppm 窗口生成图像，该窗口距离理论 m/z 值不远。色条表示从 0 到 100% 的信号强度范围。请点击此处查看此图的大图。
表 1：数据库搜索和 LFQ 结果。 通过LC-MS和蛋白质组学软件鉴定和定量的神经肽。将鉴定出的PTM与两个样品中检测到的LFQ肽的强度以及产生的LFQ比值一起列出。列出了FASTA文件中的平均质量和观察到的神经肽描述。 请按此下载此表格。
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Discussion
在神经系统中发现的神经肽和内源性肽的准确鉴定，定量和定位对于理解其功能至关重要23，24。质谱是一种强大的技术，可以完成所有这些工作，即使在没有完全测序基因组的生物体中也是如此。该协议通过LC-ESI-和MALDI-MS的组合检测，定量和定位从 C. sapidus 收集的组织中的神经肽的能力得到了证明。
在LC-ESI-MS分析的样品制备过程中，必须考虑。虽然MS是一种敏感技术，但神经元组织的低肽浓度（低至ftomolar范围25）构成了严重的限制。需要仔细的样品制备，不仅要去除更丰富和干扰的基质组分，例如蛋白质和脂质，而且还要最大限度地减少每个步骤中神经肽的损失26，27。例如，通过使用抵抗肽吸附的微量离心管可以减少样品损失。根据目标组织的组成，可以使用各种溶剂（用于提取或沉淀）或固相提取材料来分离具有不同尺寸和化学性质的生物分子。为了确保神经肽提取物中存在亲水性或疏水性肽，可以选择性地使用多种提取溶剂系统来靶向具有不同物理化学性质的神经肽。这些，连同蛋白酶抑制剂的使用，可能需要进行修饰以优化纯化以改善神经肽恢复28。使用多个提取系统的缺点是需要合并几个神经元组织以满足整体更高的肽含量要求，以及降低通量。许多步骤，如脱盐，同位素标记和MS注射推荐某些起始肽量。对于珍贵样品（如神经肽）的表征，通常避免进行肽测定，以防止外来肽消耗。此外，还开发了肽测定以确定蛋白质消化物的准确肽浓度，蛋白质消化物具有与内源性肽不同的化学性质。为了克服未知神经肽浓度的并发症，可以使用池化神经元组织提取物进行初始肽测定，其中结果用作所有后续分析的估计值，尽管必须记住测量溶液中的所有肽，并且并非所有这些肽都是神经肽29。这种方法的其他局限性包括对非极性和疏水性神经肽的潜在偏倚以及缺乏天然结构守恒。可以对溶剂组合物和材料进行修改，例如使用更疏水的溶液或省略使用有机溶剂，以解决此问题。
MALDI-MS测量依赖于仔细的样品制备步骤以获得一致的结果，并且可能与LC-ESI-MS测量具有不同的样品考虑因素。在MS分析之前将神经肽提取物保存在冰上等步骤仍然适用。防止神经肽降解的其他方法包括在解剖后将含有解冻上衣的组织切片的载玻片保存在干燥剂盒中，以防止冷凝积聚30，尽管在干燥后将组织样品留在干燥器中也可能导致样品降解。建议在基质施用前立即将组织载玻片置于真空干燥器（室温下最终压力：1x10-4 Torr）中5-10分钟。基质沉积到组织载玻片上后，可以在MALDI-MS成像测量之前将其保存在冰箱或冷冻室中过夜，并在真空干燥器中干燥。对于MALDI点测量，基质肽晶体结构在整个MALDI靶标中分布不均匀，即使它看起来如此。有一些方法可以减轻由于该过程而导致的技术重复的质谱变化。首先，使用多次激光拍摄（通常为数百到数千次）从每个孔中获取平均光谱，其中激光在孔中随机栅格化（即，在仪器参数中选择SMART或随机样品载波运动）。为每种样品类型获取至少五个技术重复，并选择三个技术重复，其中所需峰的信号强度变化最小。这里的权衡是实验吞吐量。对于所有采集的光谱，有必要保持激光拍摄次数，激光直径和其他仪器设置等参数一致。理想情况下，使用相同的基质溶液和仪器校准同时分析所有技术重复和生物重复。神经肽鉴定可以通过精确的质量匹配到包含理论[M + H]+，[M + Na]+，[M + NH4]+，[M + K]+和其他盐加合物的峰值列表来执行，该加合物产生带单电荷的离子m / z值。数据归一化对于最大限度地减少MALDI-MS实验中的系统伪影至关重要。当使用MALDI-MS点测量通过稳定同位素标记（SIL）进行神经肽定量时，重现性评估尤为重要。样品制备和数据采集的质量可以通过取肽标准品或神经肽提取物，将其分成两个相等的等分试样，通过SIL差异标记每个样品，并分析样品以确保配对峰的相对强度为1：1来评估。从这些比率报告的变异可用于估计归因于用户误差的整体实验中的方差水平。
必须指出的是，MALDI-MS还能够提供序列和定量信息;然而，通常由MALDI产生的单电荷离子限制了肽片段的检测，使得获得完整的序列和抑制LC-ESI-MS所讨论的定量方法变得更加困难。无论如何，MALDI-MS是一种有吸引力的方式，因为它具有高通量的能力，以及对样品12，31内盐和杂质的更高耐受性。此外，MALDI-MS成像比其他需要抗体的传统成像技术具有优势。在大多数MS模式中，降低质量分辨率将提高灵敏度，从而改善对低丰度神经肽的检测。这种策略对于MALDI-TOF/TOF仪器可能比LC-ESI-MS仪器更实用，因为每个实验都易于校准MALDI仪器。MALDI对神经肽组学有利的另一种方式是通过光谱平均。通常，不使用LC-ESI-MS测量的平均光谱，因为它否定了LC分离的好处;因此，生物信息学软件被严重依赖来识别神经肽，并且识别是手动验证的。然而，从MALDI-MS测量中平均光谱的后果较少，因为没有初始分离;因此，原始数据更小，更易于用户手动梳理。数据管理的易用性非常重要，因为它改变了用户接近神经肽鉴定和验证策略的顺序。虽然对LC-ESI-MS神经肽鉴定的信心可以从提高数据分析软件中的阈值严格程度中受益，但这种策略不太可能有利于MALDI-MS鉴定。在甲壳类神经肽的例子中，来自实验室建立的数据库的条目少于1000个（即，最多<1000个光谱峰或MS图像需要手动扫描）的事实使得可以首先过滤具有大质量误差阈值的MALDI-MS数据，然后通过检查MS1水平的同位素包络来手动验证这些标识， 以及代表性结果部分讨论的其他验证方法。流行的MS成像数据分析软件可以与神经肽质量数据库进行精确的质量匹配，并提取相应的MS图像。对于基于临床的研究问题，例如生物标志物发现，这些软件能够提取感兴趣的组织区域（通常称为感兴趣区域（ROI）分析）32所特有的m / z值，并执行统计测试以量化两个组织区域的不同程度。同样值得注意的是，与LC-ESI-MS相比，用于MS成像的数据分析软件选项也更少。
执行LC-ESI-MS数据库搜索神经肽通常需要使用为分析消化肽而构建的软件算法。因此，软件能够执行非特异性酶数据库搜索或完成搜索所需的时间有限。目前，内源性肽搜索是在缺失的裂解次数最多的情况下进行的，但该数量仍然有限，导致可能遗漏的鉴定。当一个物种的基因组没有完全测序时，如 C. sapidus，可以进行 从头 测序以通过已知的保守神经肽序列基序来鉴定未知/新型神经肽，尽管该方法无法识别具有未知基序或不包含用作神经肽家族标识符的基序的神经肽19。例如，WSSMRGAWamide是尿囊抑素B型神经肽家族19的基序。本文揭示了转录组挖掘对于没有完全解码的基因组序列的物种33的预测神经肽序列的意义。然后通过合成推定的肽序列并比较来自合成肽和生物组织的MS / MS光谱34来确认神经肽鉴定。即使在序列被验证之后，有时也不知道它是完整的神经肽序列还是降解产物。值得注意的是，MALDI和ESI-MS电离源之间的差异（ESI是一种比MALDI更柔和的电离方法）可能导致不同的人工降解速率（即源内碎片化）。为了区分肽的截断版本与人工诱导的（即，不是 体内）降解产物，必须知道该神经肽的预激素处理途径。由于通常情况并非如此，因此肽的合成形式应用于生理测定并验证其生物活性。
总体而言，这里举例说明的神经肽分析工作流程可以使各种不同的领域受益。它填补了肽的中下MS分析中的技术空白，因为它针对内源性肽进行了优化，这些肽比通常通过自下而上或自上而下的MS分析分析的蛋白质小。因此，神经肽组学使用的样品制备方法应在很大程度上可转化为其他生物活性内源性肽，例如药物化学家针对抗菌特性的那些35。该协议的一个好处是，它利用了来自流行供应商的通用工具，还提供了一定程度的可翻译性。通过这种方式，工作流程可用于学术和商业环境，例如筛选候选药物或药物靶点。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国家科学基金会（CHE-1710140和CHE-2108223）和美国国立卫生研究院（NIH）通过R01DK071801的支持。AP得到了NIH化学 - 生物学界面培训补助金（T32 GM008505）的部分支持。N.V.Q.得到了美国国立卫生研究院的部分支持，从国家心肺和血液研究所到威斯康星大学麦迪逊分校心血管研究中心（T32 HL007936）的Ruth L. Kirschstein国家研究服务奖。L.L.感谢NIH拨款R56 MH110215，S10RR029531和S10OD025084，以及Vilas杰出成就教授职位和Charles Melbourne Johnson教授职位的资金支持，由威斯康星州校友研究基金会和威斯康星大学麦迪逊分校药学院提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
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