Summary
뉴로펩타이드의 질량 분광학적 특성화는 서열, 정량 및 국소화 정보를 제공한다. 이 최적화 된 워크 플로는 신경 펩티드 연구뿐만 아니라 다른 내인성 펩타이드에도 유용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 스포팅 및 MALDI-MS 이미징을 사용하는 뉴로펩타이드의 샘플 준비, MS 획득, MS 분석 및 데이터베이스 생성을 기술한다.
Abstract
뉴로펩타이드는 발달, 번식, 음식 섭취, 외부 스트레스 요인에 대한 반응과 같은 거의 모든 생리적 및 행동 과정을 조절하는 신호 전달 분자입니다. 그러나 생화학 적 메커니즘과 신경 펩티드의 완전한 보완 및 그 기능적 역할은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 이들 내인성 펩티드의 특성화는 신호전달 분자의 이러한 부류 내의 엄청난 다양성에 의해 방해된다. 또한, 뉴로펩타이드는 신경전달물질보다 100x - 1000배 낮은 농도에서 생리활성이며 시냅스 방출 후 효소적 분해가 발생하기 쉽다. 질량 분광법 (MS)은 포괄적 인 선험적 지식없이 분석물을 식별, 정량화 및 현지화 할 수있는 매우 민감한 분석 도구입니다. 전 세계적으로 뉴로펩타이드를 프로파일링하고 새로운 펩타이드의 발견을 돕는 데 매우 적합합니다. 이러한 부류의 펩티드의 낮은 풍부도와 높은 화학적 다양성으로 인해, 몇몇 샘플 준비 방법, MS 획득 파라미터 및 데이터 분석 전략은 최적의 뉴로펩타이드 특성화를 허용하기 위해 프로테오믹스 기술로부터 적응되었다. 여기에서는 액체 크로마토그래피 (LC)-MS 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)-MS를 사용하여 서열 특성화, 정량 및 국소화를 위해 복잡한 생물학적 조직으로부터 신경 펩티드를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 블루 크랩으로부터 뉴로펩타이드 데이터베이스를 제조하기 위한 프로토콜로, 포괄적인 게놈 정보가 없는 유기체인 Callinectes sapidus가 포함된다. 이러한 워크플로우는 다양한 장비를 사용하여 다른 종의 내인성 펩타이드의 다른 클래스를 연구하도록 조정할 수 있습니다.
Introduction
신경계는 복잡하며 유기체 전체에 신호를 전달하기 위해 뉴런 네트워크가 필요합니다. 신경계는 감각 정보와 생물학적 반응을 조정합니다. 신호 전달과 관련된 복잡하고 복잡한 상호 작용에는 신경 전달 물질, 스테로이드 및 신경 펩티드와 같은 많은 다른 신호 분자가 필요합니다. 뉴로펩타이드는 스트레스 및 기타 자극에 대한 생리적 반응을 활성화시키는 데 중요한 역할을 하는 가장 다양하고 강력한 신호전달 분자이기 때문에, 이러한 생리적 과정에서 이들의 특정 역할을 결정하는 것이 관심의 대상이다. 뉴로펩타이드 기능은 이동성, 수용체 상호작용 및 친화도를 결정하는 아미노산 구조와 관련이 있다1. 신경 펩티드가 조직의 다른 영역에서 합성, 저장 및 방출 될 수 있기 때문에 중요한 조직 화학과 같은 기술 및 전기 생리학은 신경 펩티드 구조 및 기능 2,3,4를 조사하기 위해 사용되었지만 이러한 방법은 신경 펩티드의 광대 한 서열 다양성을 해결하기위한 처리량 및 특이성에 의해 제한됩니다.
질량 분광법 (MS)은 신경 펩티드 구조 및 풍부도의 높은 처리량 분석을 가능하게합니다. 이것은 상이한 MS 기술, 가장 일반적으로 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화 MS (LC-ESI-MS)5 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 MS (MALDI-MS)6를 통해 수행될 수 있다. 고정밀 질량 측정 및 MS 단편화를 활용하여, MS는 그들의 기능 7,8을 확인하는 것을 돕기 위해 선험적 지식 없이 복잡한 혼합물로부터 뉴로펩티드에 아미노산 서열 및 번역 후 변형(PTM) 상태를 할당하는 능력을 제공한다. 정성적 정보 이외에, MS는 무표지 정량(LFQ) 또는 동위원소 또는 등압 표지9와 같은 표지 기반 방법을 통해 신경펩티드의 정량적 정보를 가능하게 한다. LFQ의 주요 장점은 단순성, 낮은 분석 비용 및 샘플 손실을 최소화 할 수있는 샘플 준비 단계 감소입니다. 그러나 LFQ의 단점은 실행 간 변동성으로 인한 정량적 오류를 해결하기 위해 여러 기술 반복실험이 필요하기 때문에 계측기 시간 비용이 증가한다는 것입니다. 이것은 또한 작은 변화를 정확하게 정량화하는 능력을 감소시킵니다. 라벨 기반 방법은 여러 샘플이 다양한 안정한 동위원소를 사용하여 차등적으로 표지되고, 하나의 샘플로 결합되고, 질량 분광법을 통해 동시에 분석 될 수 있기 때문에 덜 체계적인 변형을 겪습니다. 이것은 또한 처리량을 증가시키지만, 동위원소 라벨은 합성하거나 구매하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다. 전체 스캔 질량 스펙트럼(MS1) 스펙트럼 복잡성 또한 멀티플렉싱이 증가함에 따라 증가하며, 이는 단편화될 수 있는 독특한 뉴로펩티드의 수를 감소시키고, 따라서 식별된다. 반대로, 등압 표지는 MS1 수준에서 스펙트럼 복잡성을 증가시키지 않지만, 뉴로펩타이드와 같은 낮은 풍부 분석물에 대한 도전을 도입한다. 등압 정량이 단편 이온 질량 스펙트럼(MS2) 수준에서 수행됨에 따라, 저풍부 뉴로펩티드는 단편화를 위해 더 풍부한 매트릭스 성분이 선택될 수 있고 선택된 것들은 정량화되기에 충분한 풍부도를 갖지 않을 수 있기 때문에 정량화될 수 없을 수 있다. 동위원소 표지를 사용하면 확인된 모든 펩티드에 대해 정량을 수행할 수 있습니다.
식별 및 정량화 이외에도, 국소화 정보는 MALDI-MS 이미징(MALDI-MSI)10을 통해 MS에 의해 획득될 수 있다. 샘플 표면을 가로질러 레이저를 래스터링함으로써, MS 스펙트럼은 각 m/z 값에 대한 히트 맵 이미지로 컴파일될 수 있다. 조건에 걸쳐 상이한 영역에서의 일시적 뉴로펩타이드 신호 세기를 매핑하는 것은 기능 결정(11)에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 뉴로펩티드의 국소화는 뉴로펩티드 기능이 위치12에 따라 다를 수 있기 때문에 특히 중요하다.
뉴로펩티드는 신경전달물질과 같은 다른 신호전달 분자들보다 낮은 풍부도의 생체내에서 발견되며, 따라서 검출을 위한 민감한 방법들(13)을 필요로 한다. 이는 지질11,14와 같은 더 높은 풍부 매트릭스 성분의 제거를 통해 달성될 수 있다. 신경 펩티드의 분석을위한 추가적인 고려 사항은 일반적인 프로테오믹스 워크 플로우와 비교할 때 이루어져야하며, 주로 대부분의 neuropeptidomic 분석이 효소 소화를 생략하기 때문입니다. 이것은 뉴로펩타이드 데이터 분석을 위한 소프트웨어 옵션을 제한하는데, 이는 대부분 프로테오믹스 데이터와 펩티드 검출에 의해 정보화된 단백질 일치를 기반으로 하는 알고리즘으로 구축되었기 때문이다. 그러나, PEAKS15와 같은 많은 소프트웨어는 그들의 de novo 시퀀싱 능력으로 인해 뉴로펩타이드 분석에 더 적합하다. 추출 방법에서 MS 데이터 분석에 이르기까지 신경 펩티드의 분석을 위해 몇 가지 요인을 고려해야합니다.
여기에 기술된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 및 MALDI-MSI에 의한 뉴로펩티드의 샘플 제조 및 디메틸 동위원소 표지, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 방법을 포함한다. 여러 실험의 대표적인 결과를 통해 푸른 게, Callinectes sapidus에서 신경 펩티드를 식별, 정량화 및 국소화하는 이러한 방법의 유용성과 능력이 입증됩니다. 신경계를 더 잘 이해하기 위해 모델 시스템이 일반적으로 사용됩니다. 많은 유기체는 완전히 서열화된 게놈을 이용할 수 없으며, 이는 펩티드 수준에서 포괄적인 뉴로펩티드 발견을 방지한다. 이러한 도전을 완화하기 위해, 완전한 게놈 정보 없이 유기체에 대한 데이터베이스를 생성하기 위해 신규한 뉴로펩티드 및 전사체 마이닝을 확인하기 위한 프로토콜이 포함된다. 여기에 제시된 모든 프로토콜은 모든 종의 뉴로펩타이드 샘플에 최적화될 수 있을 뿐만 아니라 임의의 내인성 펩티드의 분석에도 적용될 수 있다.
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Protocol
설명된 모든 조직 샘플링은 위스콘신-매디슨 대학교 가이드라인에 따라 수행되었다.
1. 신경펩타이드의 LC-ESI-MS 분석
- 뉴로펩타이드 추출 및 탈염
- 조직 획득에 앞서,도 16에 기재된 바와 같이 산성화된 메탄올(acMeOH)(90:9:1 MeOH:물:아세트산)을 준비한다.
- 갑각류17 로부터 뇌 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 20 μL의 acMeOH가 들어있는 0.6 mL 튜브에 각각 하나의 조직을 즉시 배치하십시오.
참고: 조직 해부 프로토콜은 동물과 조직 유형에 따라 크게 다릅니다. 독자는 갑각류로부터 뇌 조직 및 다수의 다른 조직 유형을 해부하는 방법에 대한 상세한 설명을 위해 프로토콜17 을 참조한다. 샘플은 사용 전까지 -80°C에서 보관할 수 있다(이상적으로는 6개월 이내). 설명 된 볼륨은 Callinectes sapidus의 단일 뇌에 사용됩니다. 부피는 조직 크기에 맞게 조정되어야 합니다. 조직은 용매 없이 즉시 플래시 동결될 수 있지만, 내인성 단백질 분해 효소가 억제되지 않고 활성 상태를 유지하므로 권장되지 않지만, 추울 때는 느린 속도로 유지됩니다. - 150 μL의 acMeOH를 샘플에 첨가한다. 초음파 균질기에서 총 초음파 처리 시간을 24 초, 펄스 시간을 8 초, 일시 중지 시간을 15 초, 진폭을 50 %로 설정하고 얼음 위에서 샘플을 균질화하십시오.
참고: 다양한 균질화 시스템을 사용할 수 있습니다. 샘플 유형 및 장비에 따라 설정과 조건을 조정하십시오. - 샘플을 20분 동안 20,000 x g 에서 4°C에서 원심분리한다. 피펫으로, 상청액을 튜브에 옮기고 대략 35°C의 진공 농축기 (266 x g, 1 x 10-4 Torr)에서 건조시킨다.
참고: 건조된 샘플은 사용 전까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다(이상적으로는 6개월 이내). 진공 농축기 가열은 주의해서 수행해야합니다. 열이 건조 시간을 단축시키는 동안, 펩티드 분해를 최소화하기 위해 모든 액체가 증발된 직후에 샘플을 농축기로부터 제거해야 한다. 이를 피하기 위해, 가열은 이 단계와 모든 후속 단계로부터 생략될 수 있다. - 탈염을 위해, 추출된 조직 샘플을 0.1% 포름산(FA)의 20 μL로 재구성하고, 잘 와류하고, 실온에서 1분 동안 수조에서 초음파 처리한다.
참고 : 다양한 탈염 재료가 있습니다. 수지 동일성 및 뉴로펩타이드 양에 따라 용액 및 부피를 조절한다. 총 펩티드 양은 상업적 펩티드 정량 검정( 표 문헌 참조)을 사용하여 추정될 수 있다. - 0.5 μL의 샘플을 pH 스트립에 도포하여 pH가 4< 것을 확인하였다. pH가 더 높으면 pH가 4가 될 때까지 10% FA의 분취량 1μL 분취량을 첨가<다.
- 탈염에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오18. 100 μL의 50% 아세토니트릴(ACN), 0.1% FA를 함유하는 100 μL의 평형 용액, 0.1% FA의 100 μL를 함유하는 세척 용액, 및 20 μL의 25% ACN/0.1% FA, 20 μL의 50% ACN/0.1% FA, 및 20 μL의 75% ACN/0.1% FA를 함유하는 용출 용액을 제조하였다.
- 10 μL 탈염 팁을 C18 수지로 얻었다( 표 참조).
- 탈염 팁을 15 μL로 설정된 20 μL 피펫 상에 놓는다. 탈염 팁이 젖으면 피펫이 폐기 될 때까지 용액에서 벗어날 때 피펫을 우울하게 유지하여 공기가 통과하는 것을 방지하십시오.
- 팁을 습윤 용액으로 3x, 평형 용액으로 3x를 흡인하십시오. 시료 10x에서 흡인물은 세척액에서 3x 세척한 후, 각 세척액을 버린다. ACN을 증가시키기 위해 각각의 용출 용액에서 10x를 흡인하여 몫을 묽는다.
참고: 용출 분율은 추가 분석을 위해 별도로 유지하거나 결합할 수 있습니다. - 사용된 탈염 팁을 버리고 용출된 뉴로펩티드를 대략 35°C의 진공 농축기(266 x g, 1 x 10-4 Torr)에서 건조시킨다.
참고: 이 제품은 사용 전까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다(이상적으로는 6개월 이내).
- 조직 추출물에서 신경 펩티드의 동위원소 표지
참고: 이 단계는 선택 사항이며 정량화가 필요한 경우에만 사용됩니다.- 흄 후드에서 2-플렉스 동위원소 디메틸 라벨링 용액을 제조하였다: 물 486.5 μL의 물 중 1% CH2OH2 (13.5 μL의 스톡 37 중량/중량 퍼센트 (중량%)), 1%CH2OD2(475 μL의 물 중 20 중량% 용액의 25 μL), 및 0.03 M 보란 피리딘 (996.25 μL의 물 중 3.75 μL의 스톡 8 M 용액).
주의: 포름알데히드는 독성이 있으므로 모든 용액은 통풍이 잘되는 후드에 보관해야 합니다. 장갑, 실험실 코트, 눈 보호 및 불침투성 신발을 착용하십시오. 콘택트 렌즈는이 재료로 작업 할 때 착용해서는 안됩니다.
참고: 다른 동위원소 시약이 있습니다. 샘플 유형 및 원하는 라벨링 채널 수에 따라 적절한 것을 선택하십시오. - 조 뉴로펩타이드 추출물을 10 μL의 물에 녹이고 10분 동안 초음파 처리한다.
- 10 μL의 상이한 동위원소 포름알데히드 용액 (즉, CH2OH2,CH2OD2등)을 정량적으로 측정되는 각각의 상이한 실험 조건에 첨가한다. 소용돌이를 잘 섞어서 각 샘플을 2,000 x g에서 간단히 원심분리한다.
- 10 μL의 0.03 M 보란피리딘을 각 샘플 튜브에 첨가한다. 소용돌이를 잘 섞어서 각 샘플을 2,000 x g에서 간단히 원심분리한다.
- 샘플을 수조에서 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 수조에서 샘플을 제거하고 100 mM 중탄산 암모늄 10 μL를 첨가하십시오. 소용돌이를 잘 섞어서 각 샘플을 2,000 x g에서 간단히 원심분리한다.
- 표지된 샘플을 하나의 2-플렉스 샘플에 결합하고, 뉴로펩티드를 대략 35°C에서 진공 농축기 (266 x g, 1 x 10-4 Torr)에서 건조시킨다.
- 단계 1.1.5 - 1.1.10을 재수행하여 표지된 뉴로펩티드를 탈염하고 데이터 수집을 위해 준비될 때까지 저장한다.
- 흄 후드에서 2-플렉스 동위원소 디메틸 라벨링 용액을 제조하였다: 물 486.5 μL의 물 중 1% CH2OH2 (13.5 μL의 스톡 37 중량/중량 퍼센트 (중량%)), 1%CH2OD2(475 μL의 물 중 20 중량% 용액의 25 μL), 및 0.03 M 보란 피리딘 (996.25 μL의 물 중 3.75 μL의 스톡 8 M 용액).
- 데이터 수집
- 건조된 탈염된 뉴로펩티드를 12 μL의 3% ACN/0.1% FA, 와류 웰, 37°C 수조에서 1분 동안 초음파 처리하고, 2,000 x g에서 간단히 원심분리하여 재구성한다. 각 샘플을 자동 시료 주입기 바이알로 옮깁니다.
참고: 뉴로펩타이드 양에 따라 시료 부피를 μL 당 ∼1 μg의 펩티드 농도로 조정하십시오. 총 펩티드 양은 상업적 펩티드 정량 분석법을 사용하여 추정할 수 있다( 표 참조). - 자동 시료 주입기를 사용하여 1μL의 샘플을 고해상도 나노-LC-MS/MS 기기에 주입 합니다(자료 표 참조).
- 이동상 A로서 물에 0.1% FA를 가졌고, 이동상 B로서 ACN에서 0.1% FA로 샘플을 실행하기 위해 대략 15cm 길이의 역상(RP) C18 컬럼( 재료 표 참조)을 사용하십시오. 샘플을 300nL/min의 속도로 3% - 95%의 기울기로 11분 이상 동안 300nL/min의 속도로 실행하십시오.
- 여기에 사용된 MS 기기의 경우 스프레이 전압의 경우 2.00kV, 모세관 온도의 경우 275°C의 일반적인 MS 조건을 사용합니다.
- 분해능 60,000개, 자동 이득 제어(AGC) 목표 1 x 106 및 150ms의 최대 이온 주입 시간(IT)으로 200 - 2,000m/z 범위의 MS 스펙트럼을 획득합니다.
- 30의 정규화된 충돌 에너지, 2.0m/z의 절연 창, 15,000의 분해능, 2 x 10 5의 AGC 목표 및 250ms의 최대 IT를 사용하여 고에너지 충돌 해리(HCD) 단편화를 위해 가장 강렬한 이온15개(최소 강도 3.2 x 104)를 선택합니다.
- 동적 제외 창을 30초로 설정합니다. 전하가 1 또는 8인 이온과 인식되지 않≥ 전하 상태를 갖는 이온을 제외합니다.
- 건조된 탈염된 뉴로펩티드를 12 μL의 3% ACN/0.1% FA, 와류 웰, 37°C 수조에서 1분 동안 초음파 처리하고, 2,000 x g에서 간단히 원심분리하여 재구성한다. 각 샘플을 자동 시료 주입기 바이알로 옮깁니다.
- 뉴로펩타이드 동정 및 정량화
참고: 데이터베이스 검색 및 펩티드 정량화(오픈 소스 및 상용 모두)를 위한 많은 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 여기서, PEAKS Studio(프로테오믹스 소프트웨어)15 가 사용될 것이다.- 1.4.2 - 1.4.6에 설명된 단계를 사용하여 데이터베이스 검색을 수행합니다.
- 새 프로젝트를 만들고 효소에 대해 없음 , 계측기의 경우 Orbitrap , 단편에 대한 HCD 및 수집을 위한 데이터 의존적 수집(DDA)을 선택하는 LC-MS 데이터를 추가합니다.
참고: 데이터 수집 매개변수에 따라 적절한 매개변수를 선택하십시오. - 식별을 선택하고 올바른 전구체 [DDA] 및 질량만을 선택합니다.
- 데이터베이스 검색을 선택하고 전구체 질량에 대해 단동위원소 질량을 사용하여 20.0ppm의 오차 허용오차를 설정하고, 단편 이온 질량에 대해 0.02Da, 효소 유형의 경우 없음, 다이제스트 모드의 경우 비특이성, 최대 누락된 절단에 대해 100개, 펩티드 당 최대 허용 변수 PTM이 3인 다음 가변 PTM을 설정합니다: 아미드화, 산화(M), E의 파이로글루, 그리고 Q의 파이로 글루.
- 뉴로펩타이드 데이터베이스를 선택하고, 디코이 융합으로 거짓 발견률(FDR)을 추정한다.
참고: 질량 공차 오류는 수집된 데이터와 일치하도록 조정해야 합니다. 샘플 유형에 적합한 데이터베이스를 사용합니다. 효소를 선택하지 않은 경우, 최대 누락된 절단 파라미터는 검색에 영향을 주지 않습니다. 그러나 소프트웨어에 옵션으로 지정되지 않은 다이제스트 모드가 없는 경우 많은 수의 누락된 분리가 필요합니다. - 레이블 없는 정량화가 필요한 경우 정량화를 선택하고 레이블 없음 을 선택한 다음 오류 허용 오차를 20.0ppm 으로 설정하고 보존 시간 허용 오차를 1.0분으로 설정합니다.
- 동위원소 표지를 위한 단계 1.2가 수행된 경우 전구체 이온 정량화를 수행한다.
- 정량화를 선택하고, 전구체 이온 정량화를 선택하고, 1.0분의 보존 시간 범위를 사용하고, 1%의 FDR 임계값을 사용합니다.
- [방법 선택] 드롭다운 메뉴에서 사전 설정 또는 사용자 지정 정량화 방법을 선택합니다.
- 새 사용자 지정 메서드를 만들려면 구성 창 > 레이블 Q 메서드 > 새로 만들기> 클릭합니다. 새 메서드의 이름을 지정하고 메서드 유형에 대해 전구체 이온 정량화를 선택합니다. 행 추가를 선택하고 PTM 옵션 목록에서 수정을 선택합니다.
- LC-MS 데이터를 추가하고 실험의 제어 조건으로부터 뉴로펩티드에 대한 변형이 될 참조 조건을 선택한다.
- 단계 1.4.9 - 1.4.11에 설명된 대로 검색 결과를 평가합니다.
- -10lgP ≥ 20을 가진 펩티드 및 단백질에 대한 요약 탭을 통해 결과를 필터링하고, 1 개의 고유 한 펩티드≥ 선택하고, 중요한 펩티드로 표지 된 상자를 선택하십시오.
- Protein.csv는 뉴로펩티드 식별을 나타내고 펩티드.csv는 뉴로펩티드 단편 식별을 나타내는 데이터베이스 검색 결과를 평가한다.
- 데이터베이스 검색에서 단백질 및 펩티드 점수, 질량 정확도 및 서열 커버리지를 검사합니다.
참고: 각 데이터베이스 검색 소프트웨어는 고유한 점수 매기기 알고리즘을 사용하며 그에 따라 평가해야 할 수도 있습니다. 동정은 완전한 단편 이온 계열을 함유하는 확인된 펩티드에 대해 관찰된 스펙트럼을 수동으로 검사함으로써 평가될 수 있다.
2. 신경펩타이드의 MALDI-MS 스포팅 분석
- 샘플 준비
- 정량화가 필요한 경우 단계 1.2.8을 제외한 단계 1.1 또는 단계 1.1 - 1.2를 따르십시오(동위원소 표지 후 탈염은 MALDI-MS 분석 전에 필요하지 않음).
- 건조된 탈염된 뉴로펩티드를 0.1% FA의 5 μL, 와류 웰, 37°C 수조에서 1분 동안 초음파 처리하고, 2,000 x g에서 간단히 원심분리하여 재구성한다.
- 갑각류 조직에서 신경 펩티드를 발견하기 위해 매트릭스로 50 % 메탄올 (MeOH) / 0.1 % FA (v / v)에 150 mg / mL 2,5- 디히드 록시 벤조산 (DHB)을 준비하십시오.
- 3 μL 액적의 샘플을 소수성 필름 상에 피펫팅하고( 표 재질 참조) 3 μL의 매트릭스를 샘플 액적 상에 직접 피펫한다. 피펫을 위아래로 섞습니다.
- 1:1 샘플의 피펫 1 μL:매트릭스 혼합물을 MALDI 스테인리스강 표적 플레이트의 웰에 넣는다. 피펫 팁을 사용하여 각 혼합물을 샘플의 가장자리까지 잘 퍼뜨립니다. 샘플은 균일한 분포를 촉진하기 위해 우물 조각의 가장자리를 만져야 합니다(그림 4A).
- 스팟 1 μL의 1:1 캘리브란트:매트릭스 혼합물(상업적 또는 맞춤형 캘리브레이션 믹스, 폴리머 물질(즉, MeOH에 용해된 적색인) 또는 일반적인 매트릭스 클러스터 이온)12를 샘플 근처의 웰에 넣는다.
참고 : 붉은 인은 발견하기 전에 매트릭스와 혼합 될 필요가 없습니다.
- 데이터 수집
- 건조된 샘플 스팟이 포함된 대상 플레이트를 MALDI 탄뎀 비행 시간(TOF/TOF) 기기에 삽입 합니다(재료 표 참조).
- DHB 매트릭스의 경우 레이저 파워를 95%로 설정하고, 자동 최적 검출기 게인, 스마트 - 완벽한 샘플 샘플 캐리어 이동 모드를 선택합니다. 200 - 3200 m/z 범위의 MS 스펙트럼을 획득하고 각 스팟에서 여러 스펙트럼을 함께 추가하여 뉴로펩타이드 신호 대 잡음비를 증가시킵니다.
참고: 레이저 출력 비율, 검출기 이득을 최적화하고 적절한 샘플 캐리어 이동 모드를 선택하여 모든 수집이 대략 전체 지점을 커버하고 후속 획득이 이전 위치로 이동하지 않도록 합니다. - 계측기를 보정합니다.
참고: 원하는 뉴로펩타이드 범위를 포함하도록 질량 범위를 조정하십시오.
- 데이터 분석
- 데이터 분석 소프트웨어에서 MALDI-MS 파일을 열고( 자료 표 참조) 여기에 사용된 소프트웨어의 기준선 빼기를 클릭합니다.
- 질량 목록 찾기를 클릭하여 피크 선택을 수행합니다. 피크가 너무 적으면 질량 목록 편집을 선택하여 수동으로 질량 목록을 편집하고 스펙트럼에서 피크를 클릭하여 질량 목록에 추가하십시오.
- 질량 목록을 [M+H]+ m/z 값을 포함하는 뉴로펩타이드 데이터베이스와 비교하여 정확한 질량 정합을 수행합니다(± 200ppm 오차).
참고: [M+K]+, [M+Na]+ 및 [M+NH4]+와 같은 일반적인 염 부가물도 정확한 질량 일치 대상 목록에 포함되어야 합니다. - 식별된 피크를 확인하려면 관심 있는 m/z 목록을 생성하고 MS/MS 실험을 수행합니다.
3. 뉴로펩타이드의 MALDI-MS 영상화 분석
- 시료 준비
참고: 임베딩 및 단면화 단계는 너무 얇아서 단면화할 수 없는 조직에는 필요하지 않습니다.- 냉동 컵 반 개를 젤라틴 (37 °C, 탈 이온수 중 100 mg / mL)으로 채우고 실온에서 응고되도록하십시오. 남은 액체 젤라틴을 37°C 수조에서 따뜻하게 유지하십시오.
- 동물로부터 원하는 신경 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 조직을 즉시 탈이온수가 들어있는 0.6 mL 튜브에 1 초 동안 담그십시오.
참고: 신경 조직 해부에 대해서는 1.1.2단계 참고를 참조하십시오. - 조직을 고체 젤라틴 위에 놓고 나머지 냉동 컵을 액체 젤라틴으로 채 웁니다. 포셉을 사용하여 조직을 배치하십시오.
- cryostat 컵을 평평한 표면에 놓고 드라이 아이스로 얼립니다.
참고: 샘플을 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오(이상적으로는 6개월 이내). - 단면화 준비를 위해, 젤라틴 포매된 샘플을 몰드를 절단하여 냉동 주형으로부터 분리한다.
- 매립된 조직을 1 mL 탈이온수 방울을 척 상에 피펫팅하고 매립된 조직을 액적 상에 즉시 눌러서 냉동 척 상에 장착한다.
- 일단 얼면, 피펫은 조직 주위에 더 많은 탈이온수를 제거하여 척에 더 고정시킨다. -20°C로 설정된 냉동 박스 내부( 재료 표 참조) 내부에서 이러한 단계를 수행하십시오.
- 조직을 대략 두께의 한 세포(샘플 유형에 따라 8-20 μm)로 섹션하고, 각 섹션을 인듐 주석 산화물(ITO)이 코팅된 유리 슬라이드 상에 장착하고, 슬라이드의 한쪽 면을 섹션 근처에 배치하고 슬라이드의 다른 측면에 손가락을 올려 놓음으로써 유리를 천천히 따뜻하게 하고 섹션이 슬라이드에 달라붙도록 한다.
참고: 조직 절편은 핀셋(-20°C로 냉각)으로 젤라틴의 한쪽 가장자리를 집어 들고 ITO 코팅 유리 슬라이드 위에 놓고 슬라이드의 다른 쪽에 손가락을 올려 놓고 유리를 천천히 따뜻하게 하고 섹션이 슬라이드에 달라붙도록 하여 해동 장착할 수도 있습니다. - 소수성 펜을 사용하여 조직 섹션 근처에 작은 원을 그리고 원 내부의 교정제를 스팟팅하여 교정제로 사용할 샘플을 스팟팅합니다(교정 옵션에 대해서는 단계 2.1.6 참조).
- 슬라이드의 각 모서리를 날카로운 모서리(예: x)가 포함된 작은 모양의 화이트아웃 펜으로 표시하여 티치 포인트로 사용합니다.
- 유리 슬라이드를 MALDI 슬라이드 어댑터 플레이트에 넣고 스캐너를 사용하여 고해상도(≥2400 DPI) 광학 이미지 스캔을 수행합니다.
- 자동 분무기를 사용하여 조직 섹션에 매트릭스를 분무합니다 (분무기 세부 사항 및 지침은 재료 표 참조).
- 갑각류 조직에서 신경 펩티드의 MSI의 경우 매트릭스로 50% 메탄올/0.1% FA(v/v)에서 40mg/mL DHB를 사용하고, 노즐 온도를 80°C로, 속도를 1,250mm/분으로, 유량을 0.1mL/분으로, 패스 수를 12개로, 자동 분무기를 위해 각 패스 사이에 30초로 설정합니다.
- 데이터 수집
- 매트릭스와 함께 분무된 해동 장착형 조직 절편을 함유하는 완전히 건조된 표적 플레이트를 삽입한다.
- 레이저 직경이 래스터 스텝 크기보다 작도록 MS 이미징 수집 파일 파라미터를 설정하십시오.
- 스캔한 광학 이미지를 로드하고 x 티치 포인트를 사용하여 샘플 플레이트를 보정합니다. 실제 조직 절편보다 약간 더 크게 측정되는 관심 조직 영역을 정의하여 매트릭스만을 포함하는 영역도 포함한다.
- 계측기를 교정하고 200 - 3200 m/z 범위의 스펙트럼을 획득합니다. 원하는 뉴로펩타이드 범위를 포괄하도록 질량 범위를 조정한다.
- 데이터 분석
- 데이터를 처리하려면 MS 이미징 데이터 세트를 원하는 소프트웨어로 가져오고, 기준 제거 알고리즘을 선택하고, 총 이온 수를 사용하여 데이터를 정규화합니다.
참고: 중앙값, RMS(평균 제곱근) 값 또는 기준 m/z 값의 강도와 같은 다른 정규화 알고리즘을 선택하면 많은 m/z 값의 공간 분포가 변경될 수 있습니다. 원하는 분석물에 가장 적합한 정규화 알고리즘을 선택합니다. - 이론적 피크 목록에서 각 m/z 값에 대한 이미지를 생성하려면 뉴로펩타이드 [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+ 등이 포함된 쉼표로 구분된 값(CSV) 파일을 업로드합니다. 파일 > 가져오기를 클릭하여 최대 > 목록을 가져옵니다. 피크 목록의 이름을 지정합니다.
- 적절한 ppm 오차 역치를 추정하기 위해, 먼저 MS 스펙트럼에서 뉴로펩티드 피크를 수동으로 확인하고 이를 뉴로펩티드 이론적 질량과 비교한다. ppm 오류를 계산하고 파일 > 파일 속성 > 간격 너비 및 입력 ppm 오류를 클릭합니다.
- 드롭다운 메뉴에서 피크 목록을 선택하고 피크 목록의 모든 간격에 대해 m/z 이미지 만들기를 클릭합니다.
- 각 m/z 이미지의 스크린샷 저장을 클릭하여 각 m/z 이미지를 저장합니다.
참고: 추정적 신경펩티드 식별은 분석물 신호가 주변 매트릭스가 아닌 조직 내에서만 국한되는 m/z 이미지를 식별하여 수행할 수 있습니다. - 피크 ID를 확인하려면 관심 있는 m/z 목록을 생성하고 MS/MS 실험을 수행합니다.
- 데이터를 처리하려면 MS 이미징 데이터 세트를 원하는 소프트웨어로 가져오고, 기준 제거 알고리즘을 선택하고, 총 이온 수를 사용하여 데이터를 정규화합니다.
4. de novo 시퀀싱을 이용한 신규한 추정적 뉴로펩타이드 발견
- 1.4.2 - 1.4.5단계를 수행합니다.
- PEAKS 소프트웨어에서 .csv 펩티드만 내보내기 데노보(ALC) 점수의 평균은 ≥ 75입니다.
참고: de novo 시퀀싱을 수행하는 데 사용할 수 있는 많은 소프트웨어가 있으며, 각 소프트웨어에는 자체 점수 매기기 알고리즘이 있으므로 그에 따라 평가해야 합니다. - 특정 뉴로펩티드 패밀리(19)에 속하는 뉴로펩티드를 나타내는 공지된 서열 모티프에 대해 펩티드 리스트를 검색한다.
참고 : 모티프는 일반적으로 종에 걸쳐 잘 보존되지만, 검색 된 모티프는 샘플 유기체를 고려하여 선택되어야합니다.
5. 예측된 뉴로펩타이드 서열에 대한 전사체 마이닝
참고: 이 단계는 선택 사항이며 기존 뉴로펩타이드 데이터베이스에 추가하거나 새 뉴로펩타이드 데이터베이스를 구축하는 데만 사용됩니다.
- 관심있는 알려진 프리 프로 호르몬 아미노산 서열을 선택하고 tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE 을 사용하십시오.
_TYPE=블래스트서치&SHOW_DEFAULTS=온&링크
_LOC=blasthome)을 사용하여 nr/nt, Refseq_genomes, EST 및 TSA를 포함한 데이터베이스에 대해 미리 프로호르몬 서열을 검색합니다.
참고: 단백질 데이터베이스에 대해 쿼리 시퀀스를 검색하려면 BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE 를 사용하십시오.
_TYPE=블래스트서치&SHOW_DEFAULTS=온&블라스트
_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).- 표적 유기체(세금 ID)를 선택하고 낮은 점수 정렬을 포함하도록 기대 역치 알고리즘 파라미터를 1000 으로 변경한다.
- BLAST 프로그램을 실행한 다음, 상당한 정렬을 생성하는 질의와 피험자 서열 사이의 높은 상동성 점수에 대한 결과를 확인한다. 뉴클레오티드 서열이 포함된 FASTA 파일을 저장합니다.
참고: 유사한 상동성 스코어를 갖는 몇몇 피험체 서열이 있는 경우, 추정 서열20,21을 좁히기 위해 MAFFT 정렬을 수행하십시오.
- Expasy Translate tool (https://web.expasy.org/translate/)를 사용하여 preprohormone 뉴클레오티드 서열을 preprohormone 펩티드 서열로 번역하십시오. C. sapidus의 경우, 유전자 코드에 대해 무척추동물 미토콘드리아를 선택합니다.
- SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP)를 사용하여 펩티드 서열에서 신호 펩티드 서열 및 전구호르몬 절단 부위를 확인한다.
참고: 알려진 프리프로호르몬 처리 계획과의 상동성은 또한 프로호르몬 절단 부위를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 신호 펩티드에 대한 가능한 번역후 변형은 원하는 경우 예측될 수 있다. 술피네이터(https://web.expasy.org/sulfinator/)는 티로신 잔기의 술페이션 상태를 예측하는데 사용될 수 있다. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/)는 이황화 결합 연결성을 예측하는 데 사용될 수 있습니다.
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Representative Results
샘플 준비 및 MS 분석을 위한 워크플로우는 그림 1에 설명되어 있습니다. 신경 조직의 해부 후, 균질화, 추출 및 탈염이 수행되어 뉴로펩타이드 샘플을 정제한다. 동위원소 라벨-기반 정량화가 필요하다면, 샘플은 라벨링되고 다시 한번 탈염된다. 생성 된 샘플은 신경 펩티드 확인 및 정량을 위해 LC-MS / MS를 통해 분석됩니다.
프로테오믹스 소프트웨어를 통해 확인된 뉴로펩티드는 양호한 펩티드 단편화 서열 커버리지를 가져야 하지만, 이것은 세계적으로 정의되거나 표준화되지 않는다. 절대 식별을 위해, 모든 아미노산은 명확한 식별과 국소화를 제공하는 단편 이온을 생성해야 한다. 이것은 또한 각 단편 이온의 강도의 확인을 위해 합성된 펩티드와 비교되어야 한다. 모든 추정적 동정에 대해 이것을 수행하기 위한 비용이 실현가능하지 않기 때문에, 식별은 일반적으로 더 많은 관찰된 단편 이온이 펩티드 식별 신뢰도를 증가시키는 신뢰에 기초하여 기술된다. 도 2A,B는 0.02 Da의 최대 한계에 의해 정의된 바와 같이 100% 서열 커버리지 및 낮은 질량 오차로 확인된 2개의 뉴로펩티드를 묘사하는 반면, 도 2B에서 뉴로펩티드에 대해서만 관찰된 불량한 단편화 커버리지(단 세 개의 이온으로부터)는 특정 이소형의 확인에 대한 신뢰도를 감소시킨다. 도 2C는 LFQ에 사용된 두 샘플에서 검출된 뉴로펩타이드의 체류 시간의 함수로서 선택된 m/z 값의 신호 강도를 포함하는 플롯인 추출된 이온 크로마토그램(XICs)을 묘사한다. 뉴로펩타이드에 대한 체류 시간은 두 번의 분리되고 연속적인 실행에서 확인되었기 때문에 약간 다르다; 그러나 차이는 신뢰할 수 있는 임계값인 1분 내에 있습니다. 따라서, XIC로부터의 곡선 아래의 소프트웨어 계산된 면적 사이의 비는 이러한 뉴로펩티드의 LFQ에 사용된다.
디메틸 표지된 뉴로펩티드의 정량을 위해, MS1 스펙트럼은 이론적 뉴로펩티드 m/z 값에서의 피크와 사용된 동위원소 표지 시약 사이의 질량 차이와 상관관계가 있는 질량 이동을 갖는 m/z 값에서의 피크를 포함해야 한다. 도 2D에서, 이러한 2-플렉스디메틸 표지된 샘플의 질량 이동은 4.025 Da이다. XICs에서 전구체 이온의 곡선 아래의 면적은 소프트웨어에 의해 계산되고 상대적 풍부 비율을 계산하는 데 사용됩니다. 확인된 뉴로펩티드 및 이들의 LFQ 비율을 함유하는 프로테오믹스 소프트웨어 내보내기 테이블의 단순화된 버전이 표 1에 제시되어 있다. 동위원소로 표지된 뉴로펩티드에 대해 유사한 결과가 얻어진다.
소프트웨어 알고리즘은 스펙트럼의 de novo 시퀀싱이 새로운 추정 신경 펩티드를 검출 할 수있게합니다. 추정적인 신규한 뉴로펩타이드의 검출을 주장할 때, 고신뢰도 식별은 단편 이온 관찰에 기초하여 모든 아미노산이 명확하게 확인되고 국소화되는 이상적인 경우이다. 도 3은 갑각류 RYamide 패밀리22의 공지된 뉴로펩티드에 의해 공유되는 보존된 서열 모티프인 C 말단에서 -RYamide 모티프를 함유하는 데노보 서열화된 펩티드의 스펙트럼을 묘사한다. 펩티드를 100% 서열 커버리지로 데이터베이스로부터 매칭시키고, 모든 아미노산 형성 단편 이온이 관찰되었고, 0.02 Da의 최대 한계에 의해 정의된 바와 같은 낮은 단편 이온 질량 오차 및 가우시안 용출 프로파일을 함유하였다. 이러한 결과는 갑각류-RYamide 신경펩티드 패밀리에 속하는 내인성 펩티드가 관찰되었음을 나타낸다.
MALDI-MS 스팟 측정은 LC-ESI-MS 식별에 상보적인 뉴로펩타이드 식별을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 더 높은 처리량 기능을 제공할 수 있습니다. 조 조직 균질액이 뉴로펩티드에 대해 추출되고, 탈염되고, 표지된 후(원하는 경우), 샘플은 매트릭스와 혼합되고 도 4A에 도시된 바와 같이 MALDI 스테인리스강 표적 플레이트 상에 스팟팅될 수 있다. 균질한 샘플 스팟의 성공적인 피펫팅은 특히 교정 스펙트럼 내에서 명확하게 분해된 피크를 생성합니다(그림 4B). MALDI-TOF 장비를 사용할 때는 각 실험 초기에 계측기를 교정해야 합니다. 알려진 질량을 가진 모든 분석물은 샘플의 원하는 질량 범위 내에 있는 경우 계측기를 교정하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서, 적색인은 계측기의 양이온 질량 교정에 사용된다. 그것은 실온에서 안정성, 저렴한 비용, 중합으로 인한 풍부한 피크, 높은 신호 대 잡음비로 인해 펩티드 캘리브레이션 믹스를 사용하는 것보다 장점이 있으며 이온화를위한 매트릭스를 필요로하지 않습니다.
뉴로펩타이드의 MALDI-MS 이미징을 위해, 사용되는 MALDI TOF/TOF 기기는 광학 이미지를 샘플과 상관시키기 위해 ITO 코팅 슬라이드(3.1.10단계)의 수동 이미지 보정이 필요합니다. 그림 5 의 다이어그램은 계측기가 스캔한 광학 이미지를 실제 샘플 플레이트와 상호 연관시킬 수 있도록 티치 포인트로 사용할 화이트아웃 십자선의 적절한 배치를 보여줍니다. 또한, 사용자가 피해야 하는 ITO 코팅 슬라이드의 영역(즉, 샘플 또는 매트릭스를 포함하지 않음)을 예시한다. 질량 교정의 경우, ITO 코팅 슬라이드 상의 조직 샘플에 대한 교정 샘플 스폿의 배치는 비행 시간 질량 분석기의 고유 특성으로 인해 질량 오차에 직접적으로 영향을 미치지만, 이 문제의 크기는 표적 분석물의 풍부함에 따라 달라집니다. 이 문제에 대한 해결책은 피크 시프팅의 증거를 위해 다른 조직 절편의 MS1 스펙트럼으로부터의 피크를 수동으로 확인하는 것입니다. 피크 시프팅이 있는 경우, 각 조직 섹션 바로 옆에 있는 ITO 코팅 슬라이드에 질량 교정 스폿을 추가하는 것이 좋습니다. 거기에서, 사용자는 교정 스폿으로부터의 스펙트럼을 함께 평균화하거나 조직 절편에 가장 가까운 교정 스폿만을 사용하여 한 번에 하나의 조직 섹션 상에서 MS 이미징을 수행할 수 있다. 샘플을 수집한 후 추정 신경 펩티드 식별을 할당하기 전에 신경 펩티드에 해당하는 m/z 값의 신호가 조직 영역 내에서만 국소화되었는지 확인합니다(그림 6).
그림 1: 질량 분광분석 분석을 위한 뉴로펩타이드 시료 준비 워크플로우. 조직 추출물 분석을 위해 조조직 균질액은 탈염되고, 안정한 동위원소 표지로 표지되고, 다시 탈염되고, MS에 의해 분석된다. 영상 분석을 위해 무손상 조직은 임베디드, 동결절제, 매트릭스와 함께 적용되고, MALDI-MSI에 의해 분석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로테오믹스 소프트웨어를 통해 수행된 식별 및 정량화. 뉴로펩티드는 (A) 양호 또는 (B) 불량한 MS2 단편화 커버리지를 갖는 레인징 품질의 스펙트럼을 통해 검출된다. 단편 이온 질량 정합 오차는 스펙트럼 아래에 도시되어 있다. (c) XIC 프로파일 형상 및 체류 시간(RT)은 LFQ를 통해 정량화된 뉴로펩티드에 대해 수동으로 검사할 수 있다. (d) MS1 스펙트럼은 디메틸 표지된 뉴로펩티드를 검출하고 정량화하는데 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 신규한 뉴로펩타이드 검출을 위한 데노보 시퀀싱. (A) 추정 신규한 RYamide의 MS2 스펙트럼은 각 단편에 대해 낮은 질량 오차로 우수한 단편화 커버리지를 입증한다. (B) 확인된 단편 이온은 수동 검사를 위해 열거된다. (c) 신규한 뉴로펩타이드의 XIC는 가우시안 피크 형상에 대해 수동으로 검사된다. 약어: RT = 보존 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MALDI-MS 스팟 및 교정 스펙트럼. (a) MS 스펙트럼 품질은 MALDI 스테인레스 스틸 타겟 웰에서 균일한 매트릭스-펩티드 분포에 의존한다. 왼쪽 세 지점은 우물 조각의 가장자리에 닿는 좋은 지점의 예이고 오른쪽 세 지점은 나쁜 점의 예입니다. 두 스팟 모두 α-시아노-4-하이드록시신남산(CHCA) 매트릭스 및 펩티드 표준 믹스를 함유한다. (B) 500 - 3200 m/z의 적색 인 클러스터를 사용한 교정 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ITO 코팅 유리 슬라이드의 묘사 . (A) 티슈 섹션을 배치할 위치(연한 파란색 사각형), 피해야 하는 자동 티치 포인트 위치(빨간색 사각형), 티치 포인트를 그릴 수 있는 위치(흰색 십자선), 나사가 어댑터 플레이트에 부착되어 피해야 하는 위치(진한 파란색 타원형)를 포함하는 회로도입니다. (b) 두 개의 조직 절편, 교정 믹스를 포함하는 스폿, 및 십자머리 마크를 포함하는 유리 슬라이드의 사진. 조직 섹션 및 교정 지점의 위치는 유리 슬라이드의 다른면에 윤곽이 그려져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: C. sapidus sinus glands의 MS 이미지. (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844.48), (B) 알라토스타틴 A형 NPYAFGLamide 또는 GGPYAFGLamide (m/z 780.40), (C) 알라토스타틴 A형 GQYAFGLamide (m/z 754.39), 및 (D) RFamide GRNFLRFamide (m/z 908.52)의 뉴로펩타이드 [M+H]+ 이온 분포 이미지가 도시되어 있다. 이미지는 이론적 m/z 값에서 50ppm ± 창을 사용하여 생성됩니다. 컬러 바는 0 내지 100%의 신호 강도의 범위를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 데이터베이스 검색 및 LFQ 결과. 뉴로펩타이드는 LC-MS 및 프로테오믹스 소프트웨어를 통해 확인되고 정량화되었다. 확인된 PTM은 생성된 LFQ 비율과 함께 LFQ에 대한 두 샘플 모두에서 검출된 펩티드의 강도와 함께 열거된다. FASTA 파일에서 평균 질량 및 관찰된 뉴로펩타이드 설명이 나열됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
신경계에서 발견되는 신경 펩티드 및 내인성 펩티드의 정확한 식별, 정량화 및 국소화는 그들의 기능을 이해하는 데 결정적이다23,24. 질량 분광법은 완전히 서열화 된 게놈이없는 유기체에서조차도이 모든 것을 달성 할 수있는 강력한 기술입니다. LC-ESI- 및 MALDI-MS의 조합을 통해 C. sapidus로부터 수집된 조직으로부터 신경펩티드를 검출, 정량화 및 국소화하는 이 프로토콜의 능력이 입증된다.
LC-ESI-MS 분석을 위한 시료 준비 중에 고려해야 합니다. MS가 민감한 기술인 반면, 신경 조직의 낮은 펩티드 농도(펨토몰 범위25까지)는 심각한 한계를 제기한다. 신중한 샘플 준비는 단백질 및 지질과 같은보다 풍부하고 간섭하는 매트릭스 성분을 제거 할뿐만 아니라 각 단계26,27에서 신경 펩티드의 손실을 최소화하기 위해 필요합니다. 예를 들어, 샘플 손실은 펩티드 흡착에 저항하는 마이크로원심분리 튜브를 사용하여 감소될 수 있다. 관심있는 조직의 조성에 따라, 다양한 용매 (추출 또는 침전용) 또는 고상 추출 물질의 사용은 상이한 크기 및 화학적 특성을 갖는 생체 분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 친수성 또는 소수성 펩티드가 뉴로펩티드 추출물에 존재하는지 확인하기 위해, 다중 추출 용매 시스템은 상이한 물리화학적 특성을 갖는 뉴로펩티드를 표적화하기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 이들은 프로테아제 억제제의 사용과 함께, 뉴로펩타이드 회수(28)를 개선하기 위해 최적화된 정제를 위해 변형될 필요가 있을 수 있다. 다중 추출 시스템을 사용할 때의 단점은 전체적으로 더 높은 펩티드 함량 요구 사항을 충족하고 처리량을 줄이기 위해 여러 신경 조직을 풀링해야한다는 것입니다. 탈염, 동위원소 표지 및 MS 주입과 같은 많은 단계는 특정 출발 펩티드 양을 권장합니다. 뉴로펩티드와 같은 귀중한 샘플의 특성화를 위해, 펩티드 분석은 일반적으로 외래 펩티드 소비를 방지하기 위해 회피된다. 추가적으로, 펩티드 분석은 내인성 펩티드와는 다른 화학적 성질을 갖는 단백질 소화물로부터 정확한 펩티드 농도를 결정하기 위해 개발되었다. 알려지지 않은 뉴로펩타이드 농도로부터의 합병증을 극복하기 위해, 초기 펩티드 분석은 풀링된 뉴런 조직 추출물을 사용하여 수행될 수 있으며, 여기서 결과는 모든 후속 분석의 추정치로 사용되지만, 용액 중의 모든 펩티드가 측정된다는 것을 명심해야 하지만, 이들 모두가 뉴로펩티드(29)인 것은 아니다. 이 방법의 다른 한계는 비극성 및 소수성 뉴로펩티드에 대한 잠재적 편향 및 천연 구조 보존의 결여를 포함한다. 용매 조성물 및 물질에 대한 변형은, 예를 들어 더 소수성인 용액을 사용하거나 유기 용매의 사용을 생략하는 것과 같이, 이를 해결하기 위해 수행될 수 있다.
MALDI-MS 측정은 일관된 결과를 위해 신중한 샘플 준비 단계에 의존하며 LC-ESI-MS 측정과 다른 샘플 고려 사항을 가질 수 있습니다. MS 분석 전에 신경펩티드 추출물을 얼음 위에 유지하는 것과 같은 단계들은 여전히 적용된다. 뉴로펩타이드 분해를 방지하는 추가의 방법에는 해부 후 건조제 박스에 해동 장착된 조직 절편을 함유하는 유리 슬라이드를 유지하여 축합이 축적되는 것을 방지하는 것(30)이 포함되지만, 건조 후 조직 샘플을 데시케이터에 남겨두면 샘플 분해도 발생할 수 있다. 조직 슬라이드를 매트릭스 적용 직전에 5-10분 동안 진공 데시케이터(최종 압력: 실온에서 1x10-4 Torr)에 배치하는 것이 제안된다. 매트릭스가 조직 슬라이드 상에 증착된 후, 냉장고 또는 냉동고에 하룻밤 동안 보관하고 MALDI-MS 이미징 측정 전에 진공 데시케이터에서 건조시킬 수 있다. MALDI 스팟 측정의 경우, 매트릭스-펩티드 결정 구조는 그렇게 나타나더라도 MALDI 타겟 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 이 공정으로 인한 기술적 반복실험으로부터의 질량 스펙트럼 변동을 완화하는 방법이 있습니다. 먼저, 레이저가 우물을 가로질러 랜덤하게 래스터링되는 여러 레이저 샷(일반적으로 수백 내지 수천 개)을 사용하여 각 웰로부터 평균 스펙트럼을 획득한다(즉, 계측기 파라미터에서 SMART 또는 랜덤 샘플 캐리어 이동 선택). 각 샘플 유형에 대해 적어도 다섯 개의 기술적 반복실험을 획득하고 원하는 피크에 대한 신호 강도의 변동이 가장 낮은 세 개의 기술적 반복실험을 선택합니다. 여기서 트레이드 오프는 실험적 처리량입니다. 레이저 샷 수, 레이저 직경 및 기타 계측기 설정과 같은 매개 변수를 획득 한 모든 스펙트럼에 대해 일관되게 유지해야합니다. 이상적으로, 모든 기술적 반복실험과 생물학적 반복실험은 동일한 매트릭스 용액과 계측기 교정을 사용하여 동시에 분석됩니다. 뉴로펩타이드 식별은 이론적인 [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+, 및 단독으로 하전된 이온 m/z 값을 생성하는 다른 염 부가물을 포함하는 피크 리스트에 대한 정확한 질량 매칭에 의해 수행될 수 있다. 데이터의 정규화는 MALDI-MS 실험에서 체계적인 아티팩트를 최소화하는 데 중요합니다. 재현성의 평가는 MALDI-MS 스팟 측정이 안정한 동위원소 표지(SIL)에 의한 뉴로펩타이드 정량화에 사용될 때 특히 중요하다. 샘플 준비 및 데이터 수집의 품질은 펩티드 표준 또는 뉴로 펩티드 추출물을 취하여 두 개의 동일한 분취량으로 분할하고, 각 샘플을 SIL로 차별적으로 라벨링하고, 쌍을 이루는 피크의 상대적 강도가 1:1인지 확인하기 위해 샘플을 분석함으로써 평가할 수 있습니다. 이러한 비율에서 보고된 변동은 사용자 오류에 기인하는 전체 실험의 분산 수준을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
MALDI-MS는 또한 서열 및 정량적 정보를 제공할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다; 그러나, 단독으로 하전된 이온은 전형적으로 말디에 의해 생산되는 펩티드 단편 검출을 제한하여, 완전한 서열을 수득하는 것을 더욱 어렵게 하고 LC-ESI-MS에 대해 논의된 정량 방법을 억제한다. 그럼에도 불구하고, MALDI-MS는 높은 처리량에 대한 능력뿐만 아니라 샘플12,31 내의 염 및 불순물에 대한 높은 내성으로 인해 매력적인 양식입니다. 추가적으로, MALDI-MS 이미징은 항체를 필요로 하는 다른 종래의 이미징 기술에 비해 이점을 갖는다. 대부분의 MS 방식에서, 질량 분해능을 낮추면 감도가 향상되어 저풍부 뉴로펩타이드의 검출이 향상됩니다. 이 전략은 각 실험에 대해 MALDI 계측기를 쉽게 교정할 수 있기 때문에 LC-ESI-MS 계측기보다 MALDI-TOF/TOF 계측기에 더 실용적일 수 있습니다. MALDI가 neuropeptidomics에 유리할 수 있는 또 다른 방법은 스펙트럼 평균화를 통해서이다. 일반적으로 LC-ESI-MS 측정의 평균 스펙트럼은 LC 분리의 이점을 무효화하기 때문에 사용되지 않습니다. 따라서 생물 정보학 소프트웨어는 신경 펩티드를 식별하는 데 크게 의존하고 있으며 식별은 수동으로 확인됩니다. 그러나 초기 분리가 없었기 때문에 MALDI-MS 측정에서 스펙트럼을 평균화하는 데 대한 결과는 적습니다. 따라서 원시 데이터는 더 작고 사용자가 수동으로 빗질하기가 더 쉽습니다. 데이터 관리의 용이성은 사용자가 신경 펩티드 식별 및 검증 전략에 접근 할 수있는 순서를 변경하기 때문에 중요합니다. LC-ESI-MS로부터의 뉴로펩타이드 식별에 대한 신뢰는 데이터 분석 소프트웨어 내에서 역치 엄격성 수준을 높임으로써 이익을 얻을 수 있지만, 이 전략은 MALDI-MS 식별에 도움이 될 가능성이 적습니다. 갑각류 신경 펩티드의 예에서, 실험실에서 구축된 데이터베이스로부터 1000개 미만의 엔트리가 존재한다는 사실(즉, 수동으로 스캔하는 최대 <1000개의 스펙트럼 피크 또는 MS 이미지)이 있다는 사실은, 먼저 넉넉한 질량 오차 임계값으로 MALDI-MS 데이터를 필터링한 다음, MS1 레벨에서 동위원소 외피를 검사함으로써 이들 식별을 수동으로 검증할 수 있게 하고, 대표 결과 섹션에서 논의 된 다른 검증 방법뿐만 아니라. 널리 사용되는 MS 이미징 데이터 분석 소프트웨어는 뉴로펩타이드 질량 데이터베이스에 대한 정확한 질량 매칭을 수행하고 상응하는 MS 이미지를 추출할 수 있다. 바이오마커 발견과 같은 임상 기반 연구 질문의 경우, 이러한 소프트웨어는 관심 조직 영역(일반적으로 관심 영역(ROI) 분석이라고 함)32에 고유한 m/z 값을 추출하고 통계 테스트를 수행하여 두 조직 영역이 얼마나 다른지 정량화할 수 있습니다. 또한 LC-ESI-MS보다 MS 이미징을위한 데이터 분석 소프트웨어 옵션이 적다는 점도 주목할 가치가 있습니다.
신경 펩티드에 대한 LC-ESI-MS 데이터베이스 검색을 수행하는 것은 일반적으로 소화 된 펩티드의 분석을 위해 구축 된 소프트웨어 알고리즘의 사용을 수반합니다. 이와 같이, 소프트웨어가 비특이적 효소 데이터베이스 검색을 수행할 수 있거나 검색을 완료하는 데 걸리는 시간에는 한계가 있다. 현재, 내인성 펩티드 검색은 놓친 절단의 최대 수로 수행되지만, 이 수는 여전히 제한되어 잠재적으로 식별을 놓칠 수 있다. C. sapidus와 같이 종에 대한 게놈이 완전히 서열화되지 않은 경우, 알려진 보존된 뉴로펩티드 서열 모티프를 통해 알려지지 않은/신규한 뉴로펩티드를 확인하기 위해 de novo 시퀀싱을 수행할 수 있지만, 이 방법은 알려지지 않은 모티프를 갖거나 뉴로펩티드 패밀리 식별자(19)로 사용되는 모티프를 포함하지 않는 뉴로펩티드를 식별하는데 실패한다. 예를 들어, WSSMRGAWamide는 알라토스타틴 B형 뉴로펩타이드 패밀리19에 대한 모티프이다. 본원은 완전히 해독된 게놈 서열33이 없는 종에 대한 예측된 뉴로펩티드 서열에 대한 전사체 마이닝의 중요성에 놓여 있다. 이어서, 뉴로펩티드 식별은 추정 펩티드 서열을 합성하고 합성 펩티드 및 생물학적 조직(34)으로부터의 MS/MS 스펙트럼을 비교함으로써 확인된다. 서열이 검증된 후에도, 그것이 완전한 뉴로펩타이드 서열인지 분해 산물인지는 때때로 알 수 없다. MALDI와 ESI-MS 이온화 소스 (ESI는 MALDI보다 더 부드러운 이온화 방법) 사이의 차이가 인공 분해 (즉, 소스 내 단편화)의 다른 속도를 초래할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 펩티드의 절단된 버전을 인위적으로 유도된(즉, 생체내 아닌) 분해 생성물로부터 구별하기 위해, 그 뉴로펩티드에 대한 전프로호르몬 처리 경로가 알려져야 한다. 이것은 종종 사실이 아니기 때문에, 펩티드의 합성 형태는 생리학적 검정에 사용되어야 하고 생물학적 활성에 대해 검증되어야 한다.
전반적으로, 뉴로펩타이드 분석을 위해 여기에 예시된 워크플로우는 다양한 분야에 도움이 될 수 있다. 이는 상향식 또는 하향식 MS 분석에 의해 일반적으로 분석되는 단백질보다 작은 내인성 펩티드에 최적화되어 있기 때문에 펩티드의 중간 다운 MS 분석 내의 기술적 격차를 메운다. 따라서, neuropeptidomics에 의해 활용되는 샘플 준비 방법은 항균 특성35에 대해 의약 화학자에 의해 표적화 된 것과 같은 다른 생리활성 내인성 펩티드로 크게 번역 가능해야합니다. 이 프로토콜의 이점은 인기있는 공급 업체의 공통 계측기를 활용하여 추가 수준의 번역 가능성을 제공한다는 것입니다. 이러한 방식으로, 워크플로우는 제약 약물 후보 또는 약물 표적에 대한 스크리닝과 같은 학술 및 상업적 환경에서 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 R01DK071801 보조금을 통해 국립 과학 재단 (CHE-1710140 및 CHE-2108223)과 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. A.P.는 NIH 화학-생물학 인터페이스 교육 보조금(T32 GM008505)에 의해 부분적으로 지원되었다. N.V.Q.는 국립 심장 폐 및 혈액 연구소에서 위스콘신-매디슨 심혈관 연구 센터 (T32 HL007936)에 이르기까지 루스 L. 키르슈타인 국립 연구 서비스 상 (Ruth L. Kirschstein National Research Service Award)에 따라 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지원을 받았다. L.L.은 NIH 보조금 R56 MH110215, S10RR029531 및 S10OD025084뿐만 아니라 위스콘신 동문 연구 재단 및 위스콘신 - 매디슨 약학부에서 제공하는 자금으로 Vilas Distinguished Achievement Professorship 및 Charles Melbourne Johnson 교수직의 자금 지원을 인정하고자합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
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