Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Многогранное масс-спектрометрическое исследование нейропептидов в Callinectes sapidus

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/63322
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

Масс-спектрометрическая характеристика нейропептидов обеспечивает информацию о последовательности, количестве и локализации. Этот оптимизированный рабочий процесс полезен не только для исследований нейропептидов, но и других эндогенных пептидов. Представленные здесь протоколы описывают подготовку образцов, сбор РС, анализ РС и генерацию базы данных нейропептидов с использованием LC-ESI-MS, MALDI-MS и визуализации MALDI-MS.

Abstract

Нейропептиды являются сигнальными молекулами, которые регулируют почти все физиологические и поведенческие процессы, такие как развитие, размножение, потребление пищи и реакция на внешние стрессоры. Тем не менее, биохимические механизмы и полный набор нейропептидов и их функциональные роли остаются плохо изученными. Характеристика этих эндогенных пептидов затруднена огромным разнообразием в этом классе сигнальных молекул. Кроме того, нейропептиды биологически активны в концентрациях 100x - 1000x ниже, чем у нейротрансмиттеров, и склонны к ферментативной деградации после синаптического высвобождения. Масс-спектрометрия (MS) является высокочувствительным аналитическим инструментом, который может идентифицировать, количественно оценивать и локализовать аналиты без всесторонних априорных знаний . Он хорошо подходит для глобального профилирования нейропептидов и помогает в открытии новых пептидов. Из-за низкой численности и высокого химического разнообразия этого класса пептидов несколько методов пробоподготовки, параметров получения РС и стратегий анализа данных были адаптированы из методов протеомики, чтобы обеспечить оптимальную характеристику нейропептидов. Здесь описаны способы выделения нейропептидов из сложных биологических тканей для характеризации последовательностей, квантования и локализации с использованием жидкостной хроматографии (LC)-MS и матричной лазерной десорбции/ионизации (MALDI)-MS. Включен протокол подготовки базы данных нейропептидов синего краба Callinectes sapidus, организма без исчерпывающей геномной информации. Эти рабочие процессы могут быть адаптированы для изучения других классов эндогенных пептидов у разных видов с использованием различных инструментов.

Introduction

Нервная система сложна и требует сети нейронов для передачи сигналов по всему организму. Нервная система координирует сенсорную информацию и биологическую реакцию. Сложные и запутанные взаимодействия, участвующие в передаче сигнала, требуют множества различных сигнальных молекул, таких как нейротрансмиттеры, стероиды и нейропептиды. Поскольку нейропептиды являются наиболее разнообразными и мощными сигнальными молекулами, которые играют ключевую роль в активации физиологических реакций на стресс и другие раздражители, интересно определить их конкретную роль в этих физиологических процессах. Нейропептидная функция связана с их аминокислотной структурой, которая определяет подвижность, рецепторное взаимодействие и сродство1. Такие методы, как гистохимия, которая важна, потому что нейропептиды могут синтезироваться, храниться и высвобождаться в разных областях ткани, и электрофизиология были использованы для исследования структуры и функции нейропептидов 2,3,4, но эти методы ограничены пропускной способностью и специфичностью для разрешения огромного разнообразия последовательностей нейропептидов.

Масс-спектрометрия (МС) позволяет проводить высокопроизводительный анализ структуры и плотности нейропептидов. Это может быть выполнено с помощью различных методов МС, чаще всего жидкостной хроматографии-электрораспылительной ионизации MS (LC-ESI-MS)5 и матричной лазерной десорбции / ионизации MS (MALDI-MS)6. Используя высокоточные измерения массы и фрагментацию РС, МС обеспечивает возможность присваивать нейропептидам из сложных смесей статус последовательности аминокислот и посттрансляционной модификации (ПТМ) без априорных знаний, чтобы помочь в определении их функции 7,8. В дополнение к качественной информации, MS позволяет получать количественную информацию о нейропептидах с помощью количественного определения без меток (LFQ) или методов на основе этикеток, таких как изотопная или изобарическая маркировка9. Основные преимущества LFQ включают в себя его простоту, низкую стоимость анализа и снижение этапов подготовки образцов, что может минимизировать потери образца. Тем не менее, недостатки LFQ включают в себя увеличение затрат времени прибора, поскольку он требует нескольких технических реплик для устранения количественной ошибки от вариативности от запуска к запуску. Это также приводит к снижению способности точно количественно оценивать небольшие вариации. Методы на основе этикеток подвергаются менее систематическому изменению, поскольку несколько образцов могут быть дифференциально маркированы с использованием различных стабильных изотопов, объединены в один образец и проанализированы с помощью масс-спектрометрии одновременно. Это также увеличивает пропускную способность, хотя изотопные этикетки могут быть трудоемкими и дорогостоящими для синтеза или покупки. Спектральная сложность масс-спектров полного сканирования (MS1) также увеличивается по мере увеличения мультиплексирования, что уменьшает количество уникальных нейропептидов, которые могут быть фрагментированы и, следовательно, идентифицированы. И наоборот, изобарическая маркировка не увеличивает спектральную сложность на уровне MS1, хотя и создает проблемы для аналитов с низким содержанием, таких как нейропептиды. Поскольку изобарическое количественное определение выполняется на уровне масс-спектров фрагментов ионов (MS2), нейропептиды с низким содержанием могут быть не в состоянии быть количественно определены, поскольку для фрагментации могут быть выбраны более обильные компоненты матрицы, а выбранные могут не иметь достаточно высокого содержания для количественной оценки. С помощью изотопной маркировки количественное определение может быть выполнено для каждого идентифицированного пептида.

В дополнение к идентификации и количественной оценке, информация о локализации может быть получена РС с помощью визуализации MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Растрируя лазер по поверхности образца, ms-спектры могут быть скомпилированы в изображение тепловой карты для каждого значения m/z . Картирование интенсивности переходного нейропептидного сигнала в различных регионах в разных условиях может предоставить ценную информацию для определения функции11. Локализация нейропептидов особенно важна, поскольку функция нейропептидов может отличаться в зависимости от местоположения12.

Нейропептиды встречаются в меньшем количестве in vivo, чем другие сигнальные молекулы, такие как нейротрансмиттеры, и, таким образом, требуют чувствительных методов для обнаружения13. Это может быть достигнуто путем удаления компонентов матрицы с более высоким содержанием, таких как липиды11,14. Дополнительные соображения для анализа нейропептидов должны быть сделаны по сравнению с обычными рабочими процессами протеомики, главным образом потому, что большинство нейропептидомных анализов опускают ферментативное пищеварение. Это ограничивает программные возможности для анализа данных нейропептидов, поскольку большинство из них были построены с помощью алгоритмов, основанных на данных протеомики и совпадениях белков, основанных на обнаружении пептидов. Тем не менее, многие программы, такие как PEAKS15, больше подходят для анализа нейропептидов из-за их возможностей секвенирования de novo. Для анализа нейропептидов необходимо учитывать несколько факторов, начиная от метода экстракции до анализа данных РС.

Протоколы, описанные здесь, включают методы пробоподготовки и диметилизотопной маркировки, сбора данных и анализа данных нейропептидов LC-ESI-MS, MALDI-MS и MALDI-MSI. С помощью репрезентативных результатов нескольких экспериментов демонстрируется полезность и способность этих методов идентифицировать, количественно оценивать и локализовать нейропептиды синих крабов, Callinectes sapidus. Чтобы лучше понять нервную систему, обычно используются модельные системы. Многие организмы не имеют полностью секвенированного генома, что препятствует всестороннему открытию нейропептидов на пептидном уровне. Чтобы смягчить эту проблему, включен протокол для идентификации новых нейропептидов и анализа транскриптомов для создания баз данных для организмов без полной информации о геноме. Все представленные здесь протоколы могут быть оптимизированы для нейропептидных образцов из любых видов, а также применены для анализа любых эндогенных пептидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Весь описанный забор тканей был выполнен в соответствии с руководящими принципами Университета Висконсин-Мэдисон.

1. LC-ESI-MS анализ нейропептидов

  1. Экстракция и обессоливание нейропептидов
    1. Перед приобретением ткани приготовьте подкисленный метанол (acMeOH) (90:9:1 MeOH:вода:уксусная кислота), как описано в16.
    2. Соберите мозговую ткань у ракообразного17 и используйте щипцы, чтобы немедленно поместить по одной ткани в пробирку объемом 0,6 мл, содержащую 20 мкл acMeOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы рассечения тканей сильно различаются для разных животных и разных типов тканей. Читатель обращается к протоколу17 для подробного описания того, как препарировать ткань мозга и несколько других типов тканей от ракообразных. Образцы могут храниться при -80 °C до использования (в идеале в течение 6 месяцев). Описанные тома используются для одного мозга от Callinectes sapidus. Объемы должны быть масштабированы в соответствии с размером ткани. Ткань может быть мгновенно заморожена без растворителя, хотя это не рекомендуется, так как эндогенные протеолитические ферменты не будут ингибироваться и оставаться активными, хотя и с меньшей скоростью при холоде.
    3. Добавьте к образцу 150 мкл acMeOH. Установите общее время обработки ультразвуком 24 с, время импульса 8 с, время паузы до 15 с и амплитуду до 50% на ультразвуковом гомогенизаторе и гомогенизируйте образцы на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные системы гомогенизации. Отрегулируйте настройки и условия в соответствии с типом образца и оборудованием.
    4. Центрифугирование образца при 4 °C при 20 000 х г в течение 20 мин. С помощью пипетки переложите супернатант в трубку и высушите его в вакуумном концентраторе (266 х г, 1 х 10-4 Торра) при температуре приблизительно 35 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные образцы можно хранить при температуре -80 °C до использования (в идеале в течение 6 месяцев). Нагрев вакуумного концентратора необходимо выполнять с осторожностью. В то время как тепло сокращает время высыхания, образец должен быть удален из концентратора сразу после того, как вся жидкость испарилась, чтобы свести к минимуму деградацию пептида. Чтобы этого избежать, нагрев может быть исключен из этого и всех последующих этапов.
    5. Для обессоливания восстановите извлеченный образец ткани в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты (ФА), вихревой лунке и соник на водяной бане при комнатной температуре в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные обессоливающие материалы. Отрегулируйте растворы и объемы в соответствии с идентичностью смолы и количеством нейропептида. Общее количество пептидов может быть оценено с использованием коммерческого количественного анализа пептидов (см. Таблицу материалов).
    6. Нанесите 0,5 мкл образца на полоску рН, чтобы подтвердить, что рН < 4. Если рН выше, добавьте 1 мкл аликвоты 10% FA до рН < 4.
    7. Следуйте протоколу производителя для обессоливания18. Готовят смачивающий раствор, содержащий 100 мкл 50% ацетонитрила (ACN), раствор для уравновешивания, содержащий 100 мкл 0,1% FA, промывочный раствор, содержащий 100 мкл 0,1% FA, и элюирующие растворы, содержащие 20 мкл 25% ACN/0,1% FA, 20 мкл 50% ACN/0,1% FA и 20 мкл 75% ACN/0,1% FA.
    8. Получите обессолительный наконечник объемом 10 мкл со смолой C18 (см. Таблицу материалов).
    9. Поместите обессоливающий наконечник на пипетку объемом 20 мкл, установленную на 15 мкл. Как только обессоливающий наконечник намокнет, предотвратите прохождение воздуха, удерживая пипетку вдавленной, когда она выйдет из раствора, пока она не будет выброшена.
    10. Аспирировать наконечник 3x смачивающим раствором и 3x с уравновешивающим раствором. Аспират в образце 10x с последующей промывкой 3x в моющем растворе, отбрасывая каждую стирку. Элюировать путем аспирации 10x в каждом из элюционных растворов в порядке увеличения ACN.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Элюционные фракции могут храниться отдельно или комбинироваться для дальнейшего анализа.
    11. Отбросьте использованный обессоливающий наконечник и высушите элюированные нейропептиды в вакуумном концентраторе (266 x g, 1 x 10-4 Torr) при температуре приблизительно 35 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при температуре -80 °C до использования (в идеале в течение 6 месяцев).
  2. Изотопная маркировка нейропептидов в тканевом экстракте
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и используется только тогда, когда требуется количественная оценка.
    1. Готовят 2-плексный изотопный диметиловый раствор для маркировки в вытяжке: 1% CH2OH2 (13,5 мкл запаса 37 масс/вес процент (мас.%) в водном растворе в 486,5 мкл воды), 1% CH2OD2 (25 мкл запаса 20 мас.% раствора в 475 мкл воды) и 0,03 М борана пиридина (3,75 мкл запаса 8 М раствора в 996,25 мкл воды).
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен, поэтому все растворы следует хранить в проветриваемой вытяжке. Носите перчатки, лабораторное пальто, защиту глаз и непроницаемую обувь. Контактные линзы не следует носить при работе с этим материалом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные изотопные реагенты; выбрать подходящие из них в зависимости от типа образца и количества желаемых каналов маркировки.
    2. Растворяют сырой нейропептидный экстракт в 10 мкл воды и ультразвуком в течение 10 мин.
    3. Добавьте 10 мкл различного изотопного раствора формальдегида (т.е. CH2OH2, CH2OD2 и т.д.) к каждому отдельному экспериментальному состоянию, которое будет измерено количественно. Вихрь хорошо перемешать и кратковременно центрифугировать каждый образец при 2000 х г.
    4. Добавьте 10 мкл 0,03 М борана пиридина в каждую пробирку. Вихрь хорошо перемешать и кратковременно центрифугировать каждый образец при 2000 х г.
    5. Инкубируйте образцы в течение 15 мин при 37 °C на водяной бане.
    6. Извлеките образцы с водяной бани и добавьте 10 мкл 100 мМ бикарбоната аммония. Вихрь хорошо перемешать и кратковременно центрифугировать каждый образец при 2000 х г.
    7. Объедините меченые образцы для одного 2-плексного образца и высушите нейропептиды в вакуумном концентраторе (266 х г, 1 х 10-4 Торра) при температуре приблизительно 35 °C.
    8. Опресните меченые нейропептиды путем этапов реперформирования 1.1.5 - 1.1.10 и храните их до тех пор, пока они не будут готовы к сбору данных.
  3. Сбор данных
    1. Восстанавливают высушенные обессоленные нейропептиды в 12 мкл 3% ACN/0,1% FA, вихревые колодцы, ультразвук на водяной бане при 37 °C в течение 1 мин и кратковременно центрифугируют при 2000 х г. Перенесите каждый образец во флаконы автопробоотборника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем образца в соответствии с количеством нейропептидов до концентрации ~1 мкг пептида на мкл. Общее количество пептида может быть оценено с использованием коммерческого количественного анализа пептидов (см. Таблицу материалов).
    2. Используйте автопробоотборник для введения 1 мкл образца в прибор с высоким разрешением nano-LC-MS/MS (см. Таблицу материалов).
    3. Используйте колонку C18 длиной около 15 см (RP) (см. Таблицу материалов) для запуска образца с 0,1% FA в воде в качестве подвижной фазы A и 0,1% FA в ACN в качестве подвижной фазы B. Запускайте образцы с градиентом 3% - 95% B со скоростью 300 нл /мин в течение более 11 мин.
    4. Для инструмента MS, используемого здесь, используйте общие условия MS 2,00 кВ для напряжения распыления и 275 ° C для капиллярной температуры.
    5. Получение спектров MS в диапазоне 200 - 2000 м/z с разрешением 60 000, автоматической регулировкой усиления (AGC) цели 1 x 106 и максимальным временем впрыска ионов (IT) 150 мс.
    6. Выберите 15 наиболее интенсивных ионов (минимальная интенсивность 3,2 x 104) для фрагментации диссоциации столкновений с более высокой энергией (HCD), используя нормализованную энергию столкновения 30, окно изоляции 2,0 м/z, разрешение 15 000, цель АРУ 2 x 105 и максимальную ИТ 250 мс.
    7. Установите динамическое окно исключения 30 с. Исключают ионы с зарядом 1 или ≥ 8 и ионы с нераспознанными состояниями заряда.
  4. Идентификация и количественная оценка нейропептидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доступно много программного обеспечения для поиска в базе данных и количественной оценки пептидов (как с открытым исходным кодом, так и для коммерческих). Здесь будет использоваться PEAKS Studio (программное обеспечение для протеомики)15 .
    1. Выполните поиск по базе данных, выполнив действия, описанные в разделах 1.4.2 - 1.4.6.
    2. Создайте новый проект и добавьте данные LC-MS, выбрав None для фермента, Orbitrap для инструмента, HCD для фрагмента и data-dependent acquisition (DDA) для получения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите соответствующие параметры на основе параметров сбора данных.
    3. Выберите Идентификация и выберите Правильный предшественник [DDA] и Только масса.
    4. Выберите Поиск в базе данных и установите допуск погрешности 20,0 ppm , используя моноизотопную массу для массы предшественника и 0,02 Da для массы ионов фрагмента, None для типа фермента, Unspecific для режима пищеварения, 100 для максимального пропущенного расщепления и следующие переменные PTM с максимально допустимой переменной PTM на пептид 3: Амидирование, Окисление (M), Пиро-клей из E, и пиро-клей из Q.
    5. Выберите базу данных нейропептидов, оцените частоту ложных обнаружений (FDR) с помощью слияния приманок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Погрешность допуска массы должна быть скорректирована в соответствии с собранными данными. Используйте соответствующую базу данных для типа образца. Когда фермент не выбран, параметр max пропущенных расщеплений не влияет на поиск. Тем не менее, большое количество пропущенных расщеплений требуется, если программное обеспечение не имеет режима Unspecified digest в качестве опции.
    6. Если требуется количественная оценка без меток, выберите Количественная оценка, выберите Без меток и установите погрешность 20,0 ppm и допуск времени удержания 1,0 мин.
    7. Выполнить количественную оценку ионов прекурсоров, если был выполнен этап 1.2 для изотопной маркировки.
      1. Выберите Количественная оценка, выберите Количественная оценка ионов прекурсоров, используйте диапазон времени удержания 1,0 мин и используйте пороговое значение FDR в 1%.
      2. Выберите предустановленный или пользовательский метод количественной оценки в раскрывающемся меню Выбор метода .
      3. Чтобы создать новый пользовательский метод, щелкните Конфигурация окна > > Метод Q Label > Создать. Присвойте новому методу имя и выберите Количественное определение ионов предшественников в поле Тип метода. Выберите Добавить строку и выберите изменение из списка Параметры PTM.
      4. Добавьте данные LC-MS и выберите Эталонное условие , чтобы быть модификацией нейропептидов из контрольного состояния эксперимента.
    8. Оцените результаты поиска, как описано в шагах 1.4.9 - 1.4.11.
    9. Отфильтруйте результаты через сводную вкладку для пептидов и белков с -10lgP ≥ 20, выберите ≥ 1 уникальный пептид и выберите поле с меткой «Со значительными пептидами».
    10. Оцените результаты поиска в базе данных, где Белок.csv представляет собой идентификацию нейропептидов, а Пептид.csv представляет идентификацию фрагментов нейропептидов.
    11. Изучите поиск в базе данных по показателям белка и пептидов, точности массы и охвату последовательностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое программное обеспечение для поиска в базе данных использует уникальные алгоритмы оценки и, возможно, потребуется оценить соответствующим образом. Идентификация может быть оценена путем ручного осмотра наблюдаемых спектров на наличие идентифицированных пептидов, содержащих полный ряд фрагментов ионов.

2. MALDI-MS мажущий анализ нейропептидов

  1. Пробоподготовка
    1. Если требуется количественное определение, выполните этап 1.1 или этапы 1.1-1.2, за исключением этапа 1.2.8 (обессоливание после изотопной маркировки не требуется до анализа MALDI-MS).
    2. Восстанавливают высушенные обессоленные нейропептиды в 5 мкл 0,1% FA, вихревые колодцы, обрабатывают ультразвуком на водяной бане 37 °C в течение 1 мин и ненадолго центрифугируют при 2000 х г.
    3. Для обнаружения нейропептидов в тканях ракообразных получают 150 мг/мл 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) в 50% метаноле (MeOH)/0,1% FA (v/v) в качестве матрицы.
    4. Пипетку капли образца объемом 3 мкл на гидрофобную пленку (см. Таблицу материалов) и пипетку 3 мкл матрицы непосредственно на каплю образца. Пипетка вверх и вниз для смешивания.
    5. Пипетка 1 мкл образца 1:1: матричная смесь в скважину из целевой пластины из нержавеющей стали MALDI. Используйте наконечник пипетки, чтобы распределить каждую смесь по краям образца. Образец должен касаться краев гравировки скважины для облегчения равномерного распределения (рисунок 4А).
    6. Поместите 1 мкл калибранта 1:1: матричной смеси (коммерческая или специальная калибровочная смесь, полимерные материалы (т.е. красный фосфор, растворенный в MeOH) или общие матричные кластерные ионы)12 в скважину рядом с образцом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Красный фосфор не нужно смешивать с матрицей перед пятнистостью.
  2. Сбор данных
    1. Вставьте целевую пластину, содержащую высушенные пятна для образцов, в прибор MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (см. Таблицу материалов).
    2. Для матрицы DHB установите мощность лазера на 95%, выберите Автоматическое оптимальное усиление детектора и режим перемещения несущего образца Smart - Complete Sample . Получите спектры MS в диапазоне 200 - 3200 м/z и сложите несколько спектров из каждого пятна вместе, чтобы увеличить отношение сигнала к шуму нейропептидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте процент мощности лазера, коэффициент усиления детектора и выберите соответствующий режим перемещения носителя образца, чтобы каждое приобретение охватывало примерно все пятно, а последующие приобретения не переходили на предыдущие позиции.
    3. Откалибруйте прибор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте диапазон масс, чтобы охватить желаемый диапазон нейропептидов.
  3. Анализ данных
    1. Откройте файл MALDI-MS в программном обеспечении для анализа данных (см. Таблицу материалов) и нажмите Baseline Subtraction для используемого здесь программного обеспечения.
    2. Выполните пиковый выбор, щелкнув Найти массовый список. Если пиков слишком мало, отредактируйте список масс вручную, выбрав Редактировать список масс и нажмите на пики в спектре, чтобы добавить их в список масс.
    3. Выполните точное сопоставление массы, сравнив список масс с базой данных нейропептидов, содержащей значения [M+H]+ m/z (± ошибке 200 ppm).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общие солевые аддукты, такие как [M+K]+, [M+Na]+ и [M+NH4]+, также должны быть включены в целевой список точного сопоставления массы.
    4. Чтобы проверить выявленные пики, сгенерируйте список интересующих m/z и выполните эксперименты MS/MS.

3. MALDI-MS визуализационный анализ нейропептидов

  1. Пробоподготовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы встраивания и секционирования не являются необходимыми для тканей, которые слишком тонкие, чтобы их можно было разделить.
    1. Наполните половину чашки криостата желатином (37 °C, 100 мг/мл в деионизированной воде) и дайте ей затвердеть при комнатной температуре. Держите остатки жидкого желатина в тепле на водяной бане с температурой 37 °C.
    2. Соберите желаемую нейронную ткань у животного и используйте щипцы, чтобы немедленно окунуть ткань в трубку объемом 0,6 мл, содержащую деионизированную воду, на 1 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагу 1.1.2 ПРИМЕЧАНИЕ для рассечения нейронной ткани.
    3. Поместите ткань поверх твердого желатина и заполните остальную часть чашки криостата жидким желатином. Используйте щипцы для позиционирования ткани.
    4. Поместите чашку криостата на ровную поверхность и заморозьте сухим льдом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы при -80 °C до использования (в идеале в течение 6 месяцев).
    5. Для подготовки к секционированию отделите желатиновый образец от криостатной формы, отрезав форму.
    6. Установите внедренную ткань на криостатный патрон, пипетировав каплю деионизированной воды объемом 1 мл на патрон и немедленно надавливая на внедренную ткань на каплю.
    7. После замораживания пипетка больше деионизирует воду вокруг ткани, чтобы дополнительно закрепить ее на патроне. Выполните эти шаги внутри криостата (см. Таблицу материалов), установленного при -20 °C.
    8. Отрежьте ткань приблизительной толщиной в одну ячейку (8-20 мкм в зависимости от типа образца) и установите каждую секцию на стеклянный слайд с оксидом индия-олова (ITO), поместив одну сторону слайда рядом с секцией и поместив палец на другую сторону слайда, чтобы медленно согреть стекло и позволить секции прилипнуть к слайду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Участки ткани также могут быть установлены на размораживание, подбирая один край желатина пинцетом (охлажденным до -20 ° C), помещая его на стеклянный слайд с покрытием ITO и помещая палец на другую сторону слайда, чтобы медленно нагревать стекло и позволять секции прилипать к слайду.
    9. Определите образец, который будет использоваться в качестве калибранта (см. шаг 2.1.6 для вариантов калибранта), нарисовав небольшой круг рядом с участком ткани с помощью гидрофобной ручки и обнаружив калибрант внутри круга.
    10. Пометьте каждый угол слайда белой ручкой с небольшой фигурой, содержащей острые края (т. е. x), которые будут использоваться в качестве учебных точек.
    11. Поместите стеклянный слайд в пластину адаптера MALDI и выполните оптическое сканирование изображения с высоким разрешением (≥2400 DPI) с помощью сканера.
    12. Распыляйте матрицу на участок ткани с помощью автоматизированного опрыскивателя ( подробности и инструкции по опрыскивателю см. в Таблице материалов).
    13. Для MSI нейропептидов в тканях ракообразных используют 40 мг/мл DHB в 50% метаноле/0,1% FA (v/v) в качестве матрицы, устанавливают температуру сопла до 80 °C, скорость до 1,250 мм/мин, скорость до 0,1 мл/мин, количество проходов до 12 и 30 с между каждым проходом для автоматического опрыскивателя.
  2. Сбор данных
    1. Вставьте полностью высушенную целевую пластину, содержащую оттаивающие участки ткани, которые были распылены матрицей.
    2. Настройте параметры файла сбора изображений MS таким образом, чтобы диаметр лазера был меньше размера растрового шага.
    3. Загрузите отсканированное оптическое изображение и откалибруйте образец пластины с помощью x точек обучения. Определите области ткани, представляющие интерес, которые должны быть измерены немного больше, чем фактический участок ткани, чтобы также включить области, содержащие только матрицу.
    4. Калибруйте прибор и получайте спектры в диапазоне 200 - 3200 м/з. Отрегулируйте диапазон масс, чтобы охватить желаемый диапазон нейропептидов.
  3. Анализ данных
    1. Для обработки данных импортируйте набор данных MS imaging в нужное программное обеспечение, выберите базовый алгоритм удаления и нормализуйте данные с помощью общего количества ионов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор различных алгоритмов нормализации, таких как медиана, среднеквадратичное значение (RMS) или интенсивность опорного значения m/z , скорее всего, изменит пространственное распределение многих значений m/z . Выберите алгоритм нормализации, наиболее подходящий для желаемых аналитов.
    2. Чтобы сгенерировать изображение для каждого значения m/z из теоретического пикового списка, загрузите файл с разделителями-запятыми (CSV), содержащий нейропептид [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+ и т.д. Получите значения m/z , щелкнув Файл > Импорт > Пиковый список. Назовите пиковый список.
    3. Чтобы оценить соответствующий порог ошибки ppm, сначала вручную определите пик нейропептида в спектре РС и сравните его с теоретической массой нейропептида. Вычислите ошибку ppm и щелкните Файл > Свойства файла > Ширина интервала и ошибка ввода ppm.
    4. Выберите пиковый список в раскрывающемся меню и нажмите Создать изображения m/z для каждого интервала пикового списка.
    5. Сохраните каждое изображение m/z, нажав кнопку Сохранить скриншот каждого изображения m/z.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагаемая идентификация нейропептидов может быть выполнена путем идентификации m/z изображений, где сигнал анализируемого вещества локализован только в ткани, а не в окружающем матриксе.
    6. Чтобы проверить пиковую идентичность, сгенерируйте список интересующих m/z и выполните эксперименты MS/MS.

4. Открытие новых предполагаемых нейропептидов с использованием секвенирования de novo

  1. Выполните шаги 1.4.2 - 1.4.5.
  2. Экспорт только пептидов de novo.csv из программного обеспечения PEAKS со средним показателем местной достоверности (ALC) ≥ 75.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество программ для выполнения секвенирования de novo , каждое со своими собственными алгоритмами оценки и должно быть оценено соответствующим образом.
  3. Поиск в списке пептидов для известных мотивов последовательности, указывающих на нейропептиды, принадлежащие к конкретным семействам нейропептидов19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как мотивы обычно хорошо сохраняются у разных видов, искомые мотивы следует выбирать с учетом образца организма.

5. Извлечение транскриптома для прогнозируемых последовательностей нейропептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и используется только для добавления в существующую базу данных нейропептидов или создания новой базы данных нейропептидов.

  1. Выберите известную последовательность аминокислот препрогормона, представляющую интерес, и используйте tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=БластПоиск&SHOW_DEFAULTS=на&ССЫЛКА
    _LOC=blasthome) для поиска предпрогормонной последовательности поисковых запросов по базам данных, включая nr/nt, Refseq_genomes, EST и TSA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поиска последовательностей запросов по базе данных белков используйте BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=БластПоиск&SHOW_DEFAULTS=Вкл&БЛАСТ
    _SPEC=&LINK_LOC=бласттаб&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Выберите целевой организм (идентификатор налогоплательщика) и измените параметры алгоритма ожидать порога на 1000 , чтобы включить выравнивание низких баллов.
    2. Запустите программу BLAST , а затем проверьте результаты на наличие высоких оценок гомологии между последовательностями запросов и субъектов, что приводит к значительным выравниваниям. Сохраните файл FASTA, содержащий нуклеотидную последовательность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть несколько последовательностей субъектов с аналогичными показателями гомологии, выполните выравнивание MAFFT, чтобы сузить предполагаемые последовательности20,21.
  2. Перевести препрогормонную нуклеотидную последовательность в препрогормоновые пептидные последовательности с помощью инструмента Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Для C. sapidus выберите митохондриальные беспозвоночные для генетического кода.
  3. Проверьте наличие сигнальных пептидных последовательностей и участков расщепления прогормона в пептидных последовательностях с помощью SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гомология известных схем обработки допрогормона также может быть использована для идентификации участков расщепления прогормона. При желании могут быть предсказаны возможные посттрансляционные модификации сигнальных пептидов. Сульфинатор (https://web.expasy.org/sulfinator/) может быть использован для прогнозирования состояния сульфатации остатков тирозина. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) может быть использована для прогнозирования связности дисульфидных связей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рабочий процесс подготовки образцов и анализа MS показан на рисунке 1. После рассечения нейрональной ткани проводят гомогенизацию, экстракцию и обессоливание для очистки нейропептидных образцов. Если требуется количественная оценка на основе изотопных этикеток, образцы затем маркируются и обессоливаются еще раз. Полученный образец анализируется с помощью LC-MS/MS для идентификации и количественной оценки нейропептидов.

Нейропептиды, идентифицированные с помощью программного обеспечения для протеомики, должны иметь хорошее покрытие последовательности фрагментации пептидов, однако это не является глобально определенным или стандартизированным. Для абсолютной идентификации каждая аминокислота должна производить фрагмент ион, обеспечивающий однозначную идентификацию и локализацию. Это также необходимо сравнивать с синтезированным пептидом для подтверждения интенсивности каждого фрагмента иона. Поскольку затраты на выполнение этого при каждой предполагаемой идентификации неосуществимы, идентификация обычно описывается на основе уверенности, когда более наблюдаемые ионы фрагментов повышают уверенность в идентификации пептидов. В то время как на рисунке 2A,B изображены два нейропептида, которые были идентифицированы со 100% охватом последовательностей и погрешностью низкой массы, как определено максимальным пределом 0,02 Да, плохое покрытие фрагментации (только от трех ионов), наблюдаемое только для нейропептида на рисунке 2B, снижает уверенность в идентификации конкретной изоформы. На рисунке 2C изображены извлеченные ионные хроматограммы (XICs), которые представляют собой график, содержащий интенсивность сигнала выбранного значения m/z в зависимости от времени удержания нейропептида, обнаруженного в двух образцах, используемых для LFQ. Время удержания нейропептида незначительно отличается, поскольку он был идентифицирован в двух отдельных и последовательных прогонах; однако разница находится в пределах надежного порогового значения в 1 мин. Таким образом, соотношение между программно рассчитанной площадью под кривой от XIC используется для LFQ этого нейропептида.

Для количественного определения диметил-меченых нейропептидов спектр MS1 должен содержать пик при теоретическом значении нейропептида m/z и пик при значении m/z со сдвигом массы, который коррелирует с разницей масс между используемыми изотопными реагентами для маркировки. На рисунке 2D массовый сдвиг этого 2-плексного диметилового меченого образца составляет 4,025 Да. Площадь под кривой иона-предшественника из его XICs затем вычисляется программным обеспечением и используется для расчета относительных коэффициентов изобилия. Упрощенная версия таблицы экспорта программного обеспечения протеомики, содержащая идентифицированные нейропептиды и их соотношения LFQ, приведена в таблице 1. Аналогичные результаты получены для изотопно меченых нейропептидов.

Программные алгоритмы позволяют de novo секвенировать спектры для обнаружения новых предполагаемых нейропептидов. При утверждении об обнаружении предполагаемых новых нейропептидов, идентификация с высокой степенью достоверности является идеальным случаем, когда все аминокислоты идентифицируются и локализуются однозначно, основываясь на наблюдении фрагментов ионов. На фиг.3 изображен спектр секвенированного пептида de novo , содержащего мотив -RYamide на С-конце, сохраненный мотив последовательности, разделяемый известными нейропептидами семейства ракообразных RYamide22. Пептид был сопоставлен из базы данных со 100% покрытием последовательности, все аминокислотообразующие фрагменты ионов наблюдались, погрешность низкой массы ионов фрагмента, определяемая максимальным пределом 0,02 Да, и содержали профиль элюирования Гаусса. Эти результаты свидетельствуют о том, что наблюдался эндогенный пептид, принадлежащий к семейству ракообразных -RYamide нейропептидов.

Точечные измерения MALDI-MS могут обеспечить идентификацию нейропептидов, которые дополняют идентификацию LC-ESI-MS, а также обеспечивают более высокую пропускную способность. После того, как гомогенат сырой ткани экстрагируется для нейропептидов, обессоливается и маркируется (при желании), образец может быть смешан с матрицей и обнаружен на пластине-мишени из нержавеющей стали MALDI, как показано на рисунке 4A. Успешное пипетирование однородных пятен образцов приводит к четко разрешенным пикам, особенно в пределах калибровочного спектра (рисунок 4B). При использовании прибора MALDI-TOF прибор должен быть откалиброван в начале каждого эксперимента. Любые аналиты с известными массами могут быть использованы для калибровки прибора, если он находится в пределах желаемого диапазона масс образца. Здесь красный фосфор используется для калибровки положительной ионной массы прибора. Он имеет преимущества перед использованием пептидных калибровочных смесей из-за его стабильности при комнатной температуре, дешевой стоимости, обильных пиков из-за его полимеризации, высокого отношения сигнал-шум, и он не требует матрицы для ионизации.

Для визуализации нейропептидов MALDI-MS используемый прибор MALDI TOF/TOF требует ручной калибровки изображения слайда с покрытием ITO (шаг 3.1.10) для корреляции оптического изображения с образцом. Диаграмма на рисунке 5 показывает правильное размещение перекрестия отбеливания, которое будет использоваться в качестве обучающих точек, чтобы позволить инструменту соотнести отсканированное оптическое изображение с фактической пластиной образца. Он также иллюстрирует области слайда с покрытием ITO, которые следует избегать пользователю (т.е. не содержат образца или матрицы). При калибровке по массе размещение пятна калибровочного образца относительно образца ткани на слайде, покрытом ITO, напрямую влияет на погрешность массы из-за присущего анализаторам массы времени пролета, хотя величина этой проблемы зависит от обилия целевых аналитов. Решение этой проблемы заключается в ручной проверке пиков из спектров MS1 из разных участков ткани на наличие доказательств смещения пиков. Если есть смещение пика, рассмотрите возможность добавления дополнительных калибровочных пятен массы на слайд с покрытием ITO прямо рядом с каждым участком ткани. Оттуда пользователь может усреднить спектры калибровочных пятен вместе или выполнить визуализацию РС на одном участке ткани за раз, используя только калибровочное пятно, ближайшее к участку ткани. После того, как образец собран, убедитесь, что сигнал от значений m/z , соответствующих нейропептидам, локализован только в области ткани (рисунок 6), прежде чем назначать предполагаемую идентификацию нейропептидов.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс подготовки образца нейропептида для масс-спектрометрического анализа. Для анализа тканевого экстракта сырая ткань гомогенат обессоливается, маркируется стабильными изотопными метками, снова обессоливается и анализируется MS. Для визуализационного анализа неповрежденная ткань внедряется, криосекционируется, наносится с матрицей и анализируется MALDI-MSI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Идентификация и количественная оценка, выполняемые с помощью программного обеспечения протеомики. Нейропептиды обнаруживаются с помощью спектров ранжированного качества с (A) хорошим или (B) плохим покрытием фрагментации MS2. Ошибка сопоставления массы ионов фрагмента показана под спектрами. (C) Формы профиля XIC и время удержания (RT) могут быть вручную проверены на наличие нейропептидов, количественно определенных с помощью LFQ. (D) Спектры MS1 используются для обнаружения и количественной оценки нейропептидов, меченных диметилом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Секвенирование De novo для обнаружения новых нейропептидов. (A) Спектр MS2 предполагаемого нового RYamide демонстрирует хороший охват фрагментацией с погрешностью низкой массы для каждого фрагмента. (B) Идентифицированные фрагменты ионов перечислены для ручного контроля. (C) XIC нового нейропептида вручную проверяется на форму пика Гаусса. Сокращения: RT = время хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Пятна MALDI-MS и калибровочный спектр. (A) Качество спектров MS зависит от равномерного матрично-пептидного распределения в целевой скважине MALDI из нержавеющей стали. Левые три пятна являются примерами хороших пятен, которые касаются краев гравировки колодца, а правые три пятна являются примерами плохих пятен. Оба пятна содержат матрицу α-циан-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA) и стандартную пептидную смесь. (B) Калибровочный спектр с использованием красных фосфорных кластеров от 500 до 3200 м/z. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Изображение стеклянного слайда с покрытием ITO. (A) Схема с отмеченными важными областями: места для размещения участков ткани (светло-синие прямоугольники), автоматические места обучения точек, которых следует избегать (красные прямоугольники), примеры мест, где обучающие точки могут быть нарисованы (белые перекрестия), и где винты прикрепляются к пластине адаптера и их следует избегать (темно-синие овалы). (B) Фотография стеклянного слайда, содержащего два участка ткани, пятно, содержащее калибровочную смесь, и следы перекрестия. Расположение сечения ткани и калибровочных пятен очерчено на другой стороне стеклянного слайда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: MS изображения C. sapidus синусовых желез. Показаны изображения распределения ионов нейропептида [M+H]+ (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844.48), (B) Аллатостатина A-типа NPYAFGLamide или GGPYAFGLamide (m/z 780.40), (C) Аллатостатина A-типа GQYAFGLamide (m/z 754.39) и (D) RFamide GRNFLRFamide (m/z 908.52). Изображения генерируются с использованием окна ± 50 ppm от теоретического значения m/z . Цветовая шкала указывает диапазон интенсивности сигнала от 0 до 100%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Поиск по базе данных и результаты LFQ. Нейропептиды идентифицированы и количественно определены с помощью программного обеспечения LC-MS и протеомики. Идентифицированные ПТМ перечислены вместе с интенсивностью обнаруженных пептидов в обоих образцах для LFQ, а также результирующим соотношением LFQ. Перечислены средние массы и описания наблюдаемых нейропептидов из файла FASTA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Точная идентификация, количественная оценка и локализация нейропептидов и эндогенных пептидов, обнаруженных в нервной системе, имеют решающее значение для понимания их функции23,24. Масс-спектрометрия является мощным методом, который может позволить достичь всего этого, даже в организмах без полностью секвенированного генома. Показана способность этого протокола обнаруживать, количественно оценивать и локализовать нейропептиды из ткани, собранной из C. sapidus, посредством комбинации LC-ESI- и MALDI-MS.

Во время подготовки образца к анализу LC-ESI-MS необходимо учитывать. В то время как РС является чувствительным методом, низкая концентрация пептидов в нейронной ткани (вплоть до фемтомолярного диапазона25) представляет собой серьезное ограничение. Тщательная подготовка образцов необходима не только для удаления более обильных и мешающих компонентов матрицы, таких как белки и липиды, но и для минимизации потери нейропептидов на каждом этапе26,27. Например, потери образцов могут быть уменьшены с помощью микроцентрифужных трубок, которые сопротивляются адсорбции пептидов. В зависимости от состава интересующей ткани для разделения биомолекул с различными размерами и химическими свойствами может быть использовано использование различных растворителей (для экстракции или осаждения) или твердофазных экстракционных материалов. Чтобы обеспечить присутствие гидрофильных или гидрофобных пептидов в экстракте нейропептида, для нацеливания на нейропептиды с различными физико-химическими свойствами может быть дополнительно использовано несколько экстракционных растворителей. Их, наряду с использованием ингибиторов протеазы, возможно, потребуется модифицировать для оптимизации очистки для улучшения восстановления нейропептидов28. Недостатки использования нескольких систем экстракции заключаются в том, что несколько нейронных тканей должны быть объединены для удовлетворения общей потребности в более высоком содержании пептидов, а также снижения пропускной способности. Многие этапы, такие как обессоливание, изотопная маркировка и инъекция РС, рекомендуют определенные начальные количества пептидов. Для характеристики драгоценных образцов, таких как нейропептиды, обычно избегают пептидных анализов, чтобы предотвратить потребление посторонних пептидов. Кроме того, были разработаны пептидные анализы для определения точной концентрации пептидов из белковых переварителей, которые имеют другие химические свойства, чем эндогенные пептиды. Чтобы преодолеть осложнения от неизвестной концентрации нейропептидов, начальный пептидный анализ может быть выполнен с использованием объединенных экстрактов нейрональной ткани, где результаты используются в качестве оценки для всех последующих анализов, хотя необходимо иметь в виду, что все пептиды в растворе измеряются, и не все из них являются нейропептидами29. Другие ограничения этого метода включают потенциальные смещения к неполярным и гидрофобным нейропептидам и отсутствие сохранения нативной структуры. Модификации композиций растворителей и материалов, такие как использование растворов, которые являются более гидрофобными или исключают использование органических растворителей, могут быть выполнены для решения этой проблемы.

Измерения MALDI-MS основаны на тщательных этапах подготовки образцов для получения последовательных результатов и могут иметь другие соображения по выборке, чем для измерений LC-ESI-MS. Такие шаги, как хранение экстракта нейропептида на льду до анализа РС, все еще применяются. Дополнительные методы предотвращения деградации нейропептидов включают хранение стеклянных слайдов, содержащих оттаивающие участки ткани, в осушительной коробке после рассечения, чтобы предотвратить накопление конденсата30, хотя оставление образца ткани в осушителе после его высыхания может также привести к деградации образца. Предлагается размещение тканевых слайдов в вакуумном осушителе (конечное давление: 1x10-4 Torr при комнатной температуре) за 5-10 мин непосредственно перед нанесением матрицы. После того, как матрица нанесена на тканевую горку, ее можно хранить в холодильнике или морозильной камере на ночь и сушить в вакуумном осушителе перед измерением MALDI-MS. Для точечных измерений MALDI матрично-пептидная кристаллическая структура неравномерно распределена по всей цели MALDI, даже если это выглядит так. Существуют способы смягчения вариаций масс-спектров от технических реплик благодаря этому процессу. Во-первых, получите средний спектр из каждой скважины, используя несколько лазерных снимков (обычно от сотен до тысяч), где лазер случайным образом растрируется по всей скважине (т. Е. Выбор ДВИЖЕНИЯ НОСИТЕЛЯ SMART или Random в параметрах прибора). Приобретите не менее пяти технических реплик для каждого типа выборки и выберите три технические реплики, где изменение интенсивности сигнала для желаемых пиков является самым низким. Компромиссом здесь является экспериментальная пропускная способность. Необходимо поддерживать такие параметры, как количество лазерных снимков, диаметр лазера и другие настройки прибора, согласованными для всех полученных спектров. В идеале все технические реплики и биологические реплики анализируются одновременно с использованием одного и того же матричного раствора и калибровки прибора. Идентификация нейропептидов может быть выполнена путем точного сопоставления массы с пиковым списком, содержащим теоретические [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+ и другие солевые аддукты, дающие однозначно заряженные значения ионов m/z . Нормализация данных имеет решающее значение для минимизации систематических артефактов из экспериментов MALDI-MS. Оценка воспроизводимости особенно важна, когда точечные измерения MALDI-MS используются для количественной оценки нейропептидов путем маркировки стабильных изотопов (SIL). Качество пробоподготовки и сбора данных можно оценить, взяв пептидный стандартный или нейропептидный экстракт, разделив его на две равные аликвоты, дифференциально маркировав каждый образец SIL и проанализировав образец для обеспечения относительной интенсивности парных пиков 1:1. Изменения, полученные из этих соотношений, могут быть использованы для оценки уровня дисперсии в общем эксперименте, приписываемого ошибке пользователя.

Важно отметить, что MALDI-MS также способен предоставлять последовательность и количественную информацию; однако одиночно заряженные ионы, обычно получаемые при обнаружении фрагментов пептида MALDI, ограничивают обнаружение пептидных фрагментов, что затрудняет получение полной последовательности и ингибирует методы количественного определения, обсуждаемые для LC-ESI-MS. Несмотря на это, MALDI-MS является привлекательным методом из-за его способности к высокой пропускной способности, а также более высокой толерантности к солям и примесям в образце12,31. Кроме того, визуализация MALDI-MS имеет преимущества перед другими традиционными методами визуализации, которые требуют антител. В большинстве модальностей РС снижение массового разрешения повысит чувствительность, что позволит улучшить обнаружение нейропептидов с низким содержанием. Эта стратегия может быть более практичной для приборов MALDI-TOF/TOF, чем для приборов LC-ESI-MS, из-за простоты калибровки инструмента MALDI для каждого эксперимента. Еще один способ, которым MALDI может быть выгодным для нейропептидомики, заключается в усреднении спектров. Как правило, усреднение спектров из измерений LC-ESI-MS не используется, поскольку оно сводит на нет преимущества разделения LC; поэтому программное обеспечение биоинформатики в значительной степени полагается на идентификацию нейропептидов, и идентификация проверяется вручную. Тем не менее, существует меньше последствий для усреднения спектров из измерений MALDI-MS, поскольку не было первоначального разделения; таким образом, необработанные данные меньше и пользователю легче вручную прочесывать. Простота управления данными важна, поскольку она изменяет порядок, в котором пользователь может подходить к стратегиям идентификации и проверки нейропептидов. В то время как уверенность в идентификации нейропептидов из LC-ESI-MS может выиграть от повышения уровня пороговой жесткости в программном обеспечении для анализа данных, эта стратегия с меньшей вероятностью принесет пользу идентификации MALDI-MS. В примере с нейропептидами ракообразных тот факт, что существует менее 1000 записей из лабораторной базы данных (т. Е. Максимум <1000 спектральных пиков или изображений РС для ручного сканирования), позволяет сначала фильтровать данные MALDI-MS с большим порогом ошибки массы, а затем вручную проверять эти идентификации, исследуя изотопные оболочки на уровне MS1, а также другие методы проверки, обсуждаемые в разделе «Репрезентативные результаты». Популярное программное обеспечение для анализа данных визуализации РС может выполнять точное сопоставление массы с базой данных массы нейропептидов и извлекать соответствующие изображения РС. Для клинических исследовательских вопросов, таких как открытие биомаркеров, это программное обеспечение способно извлекать значения m/z, уникальные для интересующей области ткани (обычно называемой анализом области интереса (ROI)32, и выполнять статистические тесты для количественной оценки того, насколько различны две области ткани. Также стоит отметить, что существует меньше вариантов программного обеспечения для анализа данных для визуализации MS, чем для LC-ESI-MS.

Выполнение поиска в базе данных LC-ESI-MS для нейропептидов обычно влечет за собой использование программных алгоритмов, построенных для анализа переваренных пептидов. Таким образом, существуют ограничения на то, что программное обеспечение может выполнять поиск по неспецифическим базам данных ферментов или количество времени, необходимое для завершения поиска. В настоящее время эндогенные пептидные поиски выполняются с максимальным количеством пропущенных расщеплений, но это число по-прежнему ограничено, что приводит к потенциально пропущенным идентификациям. Когда геном вида не полностью секвенирован, как в случае с C. sapidus, секвенирование de novo может быть выполнено для идентификации неизвестных / новых нейропептидов с помощью известных сохраненных мотивов последовательности нейропептидов, хотя этот метод не может идентифицировать нейропептиды, которые имеют неизвестные мотивы или не содержат мотивов, используемых в качестве идентификаторов семейства нейропептидов19. Например, WSSMRGAWamide является мотивом для семейства нейропептидов аллатостатина B-типа19. В этом заключается значение добычи транскриптома для прогнозируемых нейропептидных последовательностей для видов без полностью декодированной последовательности генома33. Затем идентификация нейропептидов подтверждается синтезом предполагаемой пептидной последовательности и сравнением спектров MS/MS из синтетического пептида и биологической ткани34. Даже после того, как последовательность проверена, иногда неизвестно, является ли она полной нейропептидной последовательностью или продуктом деградации. Следует отметить, что различия между источниками ионизации MALDI и ESI-MS (ESI является более мягким методом ионизации, чем MALDI) могут привести к различным скоростям искусственной деградации (т.е. фрагментации в источнике). Чтобы отличить усеченную версию пептида от искусственно индуцированного (т.е. не in vivo) продукта деградации, необходимо знать путь обработки предпрогормона для этого нейропептида. Поскольку это часто не так, синтетическая форма пептида должна использоваться в физиологических анализах и проверяться на биологическую активность.

В целом, рабочий процесс, приведенный здесь для анализа нейропептидов, может принести пользу различным областям. Он заполняет технический пробел в среднем анализе пептидов РС, поскольку он оптимизирован для эндогенных пептидов, которые меньше, чем белки, обычно анализируемые анализами РС снизу вверх или сверху вниз. Таким образом, методы пробоподготовки, используемые нейропептидомикой, должны быть в значительной степени трансформируемыми на другие биологически активные эндогенные пептиды, такие как те, на которые нацелены медицинские химики для антибактериальных свойств35. Преимущество этого протокола заключается в том, что он использует общие инструменты от популярных поставщиков, предлагая дополнительную степень переводимости. Таким образом, рабочий процесс может использоваться в академических и коммерческих условиях, таких как скрининг кандидатов на фармацевтические препараты или мишеней лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальным научным фондом (CHE-1710140 и CHE-2108223) и Национальными институтами здравоохранения (NIH) через грант R01DK071801. A.P. был частично поддержан грантом NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. был частично поддержан Национальными институтами здравоохранения в рамках Премии Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы от Национального института сердца легких и крови в Центр сердечно-сосудистых исследований Университета Висконсина-Мэдисона (T32 HL007936). L.L. хотел бы отметить гранты NIH R56 MH110215, S10RR029531 и S10OD025084, а также финансовую поддержку от профессора выдающихся достижений Виласа и профессора Чарльза Мельбурна Джонсона с финансированием, предоставленным Исследовательским фондом выпускников Висконсина и Школой фармации Университета Висконсина-Мэдисона.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde - D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) - Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

Tags

Химия выпуск 183 нейропептид масс-спектрометрия очистка пептидов изотопная маркировка секвенирование de novo количественное определение LC MALDI масс-спектрометрическая визуализация поиск в базе данных анализ транскриптома
Многогранное масс-спектрометрическое исследование нейропептидов в <em>Callinectes sapidus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L.… More

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter