Summary
La caratterizzazione spettrometrica di massa dei neuropeptidi fornisce informazioni di sequenza, quantificazione e localizzazione. Questo flusso di lavoro ottimizzato non è utile solo per gli studi sui neuropeptidi, ma anche per altri peptidi endogeni. I protocolli forniti qui descrivono la preparazione del campione, l'acquisizione della SM, l'analisi della SM e la generazione di neuropeptidi nel database utilizzando LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting e MALDI-MS imaging.
Abstract
I neuropeptidi sono molecole di segnalazione che regolano quasi tutti i processi fisiologici e comportamentali, come lo sviluppo, la riproduzione, l'assunzione di cibo e la risposta a fattori di stress esterni. Tuttavia, i meccanismi biochimici e il pieno complemento dei neuropeptidi e i loro ruoli funzionali rimangono poco compresi. La caratterizzazione di questi peptidi endogeni è ostacolata dall'immensa diversità all'interno di questa classe di molecole di segnalazione. Inoltre, i neuropeptidi sono bioattivi a concentrazioni 100x - 1000x inferiori a quelle dei neurotrasmettitori e sono soggetti a degradazione enzimatica dopo il rilascio sinaptico. La spettrometria di massa (MS) è uno strumento analitico altamente sensibile in grado di identificare, quantificare e localizzare analiti senza una conoscenza a priori completa. È adatto per profilare globalmente i neuropeptidi e aiutare nella scoperta di nuovi peptidi. A causa della bassa abbondanza e dell'elevata diversità chimica di questa classe di peptidi, diversi metodi di preparazione del campione, parametri di acquisizione della SM e strategie di analisi dei dati sono stati adattati dalle tecniche di proteomica per consentire una caratterizzazione ottimale dei neuropeptidi. Qui, vengono descritti metodi per isolare i neuropeptidi da tessuti biologici complessi per la caratterizzazione, la quantificazione e la localizzazione della sequenza utilizzando la cromatografia liquida (LC)-MS e il desorbimento / ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI)-MS. È incluso un protocollo per la preparazione di un database di neuropeptidi dal granchio blu, Callinectes sapidus, un organismo senza informazioni genomiche complete. Questi flussi di lavoro possono essere adattati per studiare altre classi di peptidi endogeni in diverse specie utilizzando una varietà di strumenti.
Introduction
Il sistema nervoso è complesso e richiede una rete di neuroni per trasmettere segnali in tutto l'organismo. Il sistema nervoso coordina le informazioni sensoriali e la risposta biologica. Le interazioni intricate e contorte coinvolte nella trasmissione del segnale richiedono molte molecole di segnalazione diverse come neurotrasmettitori, steroidi e neuropeptidi. Poiché i neuropeptidi sono le molecole di segnalazione più diverse e potenti che svolgono un ruolo chiave nell'attivazione delle risposte fisiologiche allo stress e ad altri stimoli, è interessante determinare il loro ruolo specifico in questi processi fisiologici. La funzione neuropeptidica è correlata alla loro struttura aminoacidica, che determina la mobilità, l'interazione del recettore e l'affinità1. Tecniche come l'istochimica, che è importante perché i neuropeptidi possono essere sintetizzati, immagazzinati e rilasciati in diverse regioni del tessuto, e l'elettrofisiologia sono state impiegate per studiare la struttura e la funzionedei neuropeptidi 2,3,4, ma questi metodi sono limitati dal throughput e dalla specificità per risolvere la vasta diversità di sequenze dei neuropeptidi.
La spettrometria di massa (MS) consente l'analisi ad alto rendimento della struttura e dell'abbondanza dei neuropeptidi. Questo può essere eseguito attraverso diverse tecniche di SM, più comunemente cromatografia liquida-ionizzazione elettrospray MS (LC-ESI-MS)5 e desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice MS (MALDI-MS)6. Utilizzando misurazioni di massa ad alta precisione e frammentazione della SM, MS fornisce la possibilità di assegnare la sequenza di amminoacidi e lo stato di modificazione post-traduzionale (PTM) ai neuropeptidi da miscele complesse senza conoscenza a priori per aiutare ad accertare la loro funzione 7,8. Oltre alle informazioni qualitative, la SM consente l'informazione quantitativa dei neuropeptidi attraverso la quantificazione senza etichetta (LFQ) o metodi basati su etichette come l'etichettatura isotopica o isobarica9. I principali vantaggi di LFQ includono la sua semplicità, il basso costo di analisi e la riduzione delle fasi di preparazione del campione che possono ridurre al minimo la perdita di campioni. Tuttavia, gli svantaggi di LFQ includono l'aumento dei costi di tempo dello strumento in quanto richiede più repliche tecniche per affrontare l'errore quantitativo dovuto alla variabilità run-to-run. Ciò porta anche a una diminuzione della capacità di quantificare con precisione piccole variazioni. I metodi basati su etichette sono soggetti a variazioni meno sistematiche in quanto più campioni possono essere etichettati in modo differenziale utilizzando una varietà di isotopi stabili, combinati in un unico campione e analizzati simultaneamente attraverso la spettrometria di massa. Ciò aumenta anche la produttività, sebbene le etichette isotopiche possano richiedere molto tempo e denaro da sintetizzare o acquistare. Anche la complessità spettrale degli spettri di massa a scansione completa (MS1) aumenta con l'aumentare del multiplexing, il che diminuisce il numero di neuropeptidi unici in grado di essere frammentati e, quindi, identificati. Al contrario, l'etichettatura isobarica non aumenta la complessità spettrale a livello MS1, sebbene introduca sfide per gli analiti a bassa abbondanza come i neuropeptidi. Poiché la quantificazione isobarica viene eseguita a livello degli spettri di massa ionica del frammento (MS2), i neuropeptidi a bassa abbondanza potrebbero non essere in grado di essere quantificati poiché componenti della matrice più abbondanti possono essere selezionati per la frammentazione e quelli selezionati potrebbero non avere un'abbondanza abbastanza elevata da essere quantificati. Con l'etichettatura isotopica, la quantificazione può essere eseguita su ogni peptide identificato.
Oltre all'identificazione e alla quantificazione, le informazioni di localizzazione possono essere ottenute dagli SM tramite l'imaging MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Rasterizzando un laser su una superficie campione, gli spettri MS possono essere compilati in un'immagine della mappa di calore per ogni valore m/z . La mappatura dell'intensità del segnale neuropeptidico transitorio in diverse regioni attraverso le condizioni può fornire informazioni preziose per la determinazione della funzione11. La localizzazione dei neuropeptidi è particolarmente importante perché la funzione del neuropeptide può differire a seconda della posizione12.
I neuropeptidi si trovano in una minore abbondanza in vivo rispetto ad altre molecole di segnalazione, come i neurotrasmettitori, e quindi richiedono metodi sensibili per il rilevamento13. Ciò può essere ottenuto attraverso la rimozione di componenti della matrice a maggiore abbondanza, come i lipidi11,14. Ulteriori considerazioni per l'analisi dei neuropeptidi devono essere fatte rispetto ai comuni flussi di lavoro di proteomica, principalmente perché la maggior parte delle analisi neuropeptidomiche omettono la digestione enzimatica. Ciò limita le opzioni software per l'analisi dei dati neuropeptidici poiché la maggior parte sono stati costruiti con algoritmi basati su dati proteomici e corrispondenze proteiche informate dal rilevamento di peptidi. Tuttavia, molti software come PEAKS15 sono più adatti all'analisi dei neuropeptidi grazie alle loro capacità di sequenziamento de novo. Diversi fattori devono essere considerati per l'analisi dei neuropeptidi a partire dal metodo di estrazione all'analisi dei dati della SM.
I protocolli qui descritti includono metodi per la preparazione del campione e l'etichettatura isotopica del dimetilico, l'acquisizione dei dati e l'analisi dei dati dei neuropeptidi da parte di LC-ESI-MS, MALDI-MS e MALDI-MSI. Attraverso i risultati rappresentativi di diversi esperimenti, viene dimostrata l'utilità e la capacità di questi metodi di identificare, quantificare e localizzare i neuropeptidi dei granchi blu, Callinectes sapidus. Per comprendere meglio il sistema nervoso, i sistemi modello sono comunemente usati. Molti organismi non hanno un genoma completamente sequenziato disponibile, il che impedisce la scoperta completa di neuropeptidi a livello peptidico. Al fine di mitigare questa sfida, è incluso un protocollo per l'identificazione di nuovi neuropeptidi e l'estrazione di trascrittomi per generare database per organismi senza informazioni complete sul genoma. Tutti i protocolli qui presentati possono essere ottimizzati per campioni di neuropeptidi di qualsiasi specie, nonché applicati per l'analisi di qualsiasi peptide endogeno.
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Protocol
Tutti i prelievi di tessuto descritti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Università del Wisconsin-Madison.
1. Analisi LC-ESI-MS dei neuropeptidi
- Estrazione e dissalazione di neuropeptidi
- Prima dell'acquisizione dei tessuti, preparare metanolo acidificato (acMeOH) (90:9:1 MeOH:acqua:acido acetico) come descritto in16.
- Raccogliere il tessuto cerebrale dal crostaceo17 e utilizzare una pinza per posizionare immediatamente un tessuto ciascuno in un tubo da 0,6 ml contenente 20 μL di acMeOH.
NOTA: i protocolli di dissezione dei tessuti variano notevolmente per diversi animali e diversi tipi di tessuto. Il lettore fa riferimento al protocollo17 per una descrizione dettagliata su come sezionare il tessuto cerebrale e più altri tipi di tessuto dal crostaceo. I campioni possono essere conservati a -80 °C fino all'uso (idealmente entro 6 mesi). I volumi descritti sono utilizzati per un singolo cervello da Callinectes sapidus. I volumi devono essere ridimensionati in base alle dimensioni del tessuto. Il tessuto può essere congelato immediatamente senza solvente, anche se questo non è raccomandato in quanto gli enzimi proteolitici endogeni non saranno inibiti e rimarranno attivi, anche se a un ritmo più lento quando sono freddi. - Aggiungere 150 μL di acMeOH al campione. Impostare il tempo totale di sonicazione a 24 s, il tempo di impulso a 8 s, il tempo di pausa a 15 s e l'ampiezza al 50% su un omogeneizzatore ad ultrasuoni e omogeneizzare i campioni su ghiaccio.
NOTA: Sono disponibili diversi sistemi di omogeneizzazione. Regolare le impostazioni e le condizioni in base al tipo di campione e all'attrezzatura. - Centrifugare il campione a 4 °C a 20.000 x g per 20 min. Con una pipetta, trasferire il surnatante in un tubo e asciugarlo in un concentratore a vuoto (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a circa 35 °C.
NOTA: I campioni essiccati possono essere conservati a -80 °C fino all'uso (idealmente entro 6 mesi). Il riscaldamento del concentratore di vuoto deve essere eseguito con cautela. Mentre il calore riduce il tempo di asciugatura, il campione deve essere rimosso dal concentratore immediatamente dopo che tutto il liquido è evaporato per ridurre al minimo la degradazione del peptide. Per evitare ciò, il riscaldamento può essere omesso da questo e da tutti i passaggi successivi. - Per la desalinizzazione, ricostituire il campione di tessuto estratto in 20 μL di acido formico allo 0,1% (FA), vortice bene e sonicare a bagnomaria a temperatura ambiente per 1 minuto.
NOTA: Sono disponibili diversi materiali di desalinizzazione. Regolare le soluzioni e i volumi in base all'identità della resina e alla quantità di neuropeptide. La quantità totale di peptidi può essere stimata utilizzando un saggio di quantificazione peptidica commerciale (vedere Tabella dei materiali). - Applicare 0,5 μL di campione su una striscia di pH per confermare che il pH < 4. Se il pH è più alto, aggiungere aliquote di 1 μL del 10% FA fino a quando il pH < 4.
- Seguire il protocollo del produttore per la desalinizzazione18. Preparare una soluzione bagnante contenente 100 μL di acetonitrile al 50% (ACN), una soluzione di equilibratura contenente 100 μL di 0,1% FA, una soluzione di lavaggio contenente 100 μL di 0,1% FA e soluzioni di eluizione contenenti 20 μL di 25% ACN/0,1% FA, 20 μL di 50% ACN/0,1% FA e 20 μL di 75% ACN/0,1% FA.
- Ottenere una punta di desalinizzazione da 10 μL con resina C18 (vedere Tabella dei materiali).
- Posizionare la punta di dissalazione su una pipetta da 20 μL impostata su 15 μL. Una volta che la punta di dissalazione è bagnata, evitare il passaggio dell'aria mantenendo la pipetta depressa quando è fuori soluzione fino a quando non verrà scartata.
- Aspirare la punta 3x con soluzione bagnante e 3x con soluzione di equilibratura. Aspirare nel campione 10x seguito da lavare 3x in soluzione di lavaggio, scartando ogni lavaggio. Eluire aspirando 10 volte in ciascuna delle soluzioni di eluizione in ordine di aumento ACN.
NOTA: Le frazioni di eluizione possono essere tenute separate o combinate per ulteriori analisi. - Scartare la punta di dissalazione utilizzata e asciugare i neuropeptidi eluiti in un concentratore sotto vuoto (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a circa 35 °C.
NOTA: Questo può essere conservato a -80 °C fino all'uso (idealmente entro 6 mesi).
- Marcatura isotopica dei neuropeptidi nell'estratto tissutale
NOTA: questo passaggio è facoltativo e viene utilizzato solo quando si desidera la quantificazione.- Preparare la soluzione isotopica di etichettatura dimetilica 2-plex in una cappa aspirante: 1% CH2 OH 2 (13,5 μL di stock 37 percentuale peso/peso (wt. %) in soluzione acquosa in 486,5 μL di acqua), 1% CH2OD2 (25 μL di stock 20 wt. % soluzione in 475 μL di acqua) e 0,03 M di piridina borano (3,75 μL di soluzione stock 8 M in 996,25 μL di acqua).
ATTENZIONE: La formaldeide è tossica, quindi tutte le soluzioni devono essere conservate in un cappuccio ventilato. Indossare guanti, un cappotto da laboratorio, protezione per gli occhi e calzature impermeabili. Le lenti a contatto non devono essere indossate quando si lavora con questo materiale.
NOTA: Esistono diversi reagenti isotopici; selezionare quelli appropriati in base al tipo di campione e al numero di canali di etichettatura desiderati. - Sciogliere l'estratto di neuropeptide grezzo in 10 μL di acqua e sonicare per 10 min.
- Aggiungere 10 μL di una diversa soluzione isotopica di formaldeide (ad esempio, CH2OH2, CH2OD2, ecc.) a ciascuna diversa condizione sperimentale da misurare quantitativamente. Vortice per mescolare bene e centrifugare brevemente ogni campione a 2.000 x g.
- Aggiungere 10 μL di 0,03 M di borano piridina a ciascuna provetta campione. Vortice per mescolare bene e centrifugare brevemente ogni campione a 2.000 x g.
- Incubare i campioni per 15 minuti a 37 °C a bagnomaria.
- Rimuovere i campioni dal bagno d'acqua e aggiungere 10 μL di bicarbonato di ammonio da 100 mM. Vortice per mescolare bene e centrifugare brevemente ogni campione a 2.000 x g.
- Combinare i campioni etichettati per un campione 2-plex e asciugare i neuropeptidi in un concentratore sotto vuoto (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a circa 35 °C.
- Dissalare i neuropeptidi etichettati rieperformando i passaggi 1.1.5 - 1.1.10 e conservarli fino a quando non sono pronti per l'acquisizione dei dati.
- Preparare la soluzione isotopica di etichettatura dimetilica 2-plex in una cappa aspirante: 1% CH2 OH 2 (13,5 μL di stock 37 percentuale peso/peso (wt. %) in soluzione acquosa in 486,5 μL di acqua), 1% CH2OD2 (25 μL di stock 20 wt. % soluzione in 475 μL di acqua) e 0,03 M di piridina borano (3,75 μL di soluzione stock 8 M in 996,25 μL di acqua).
- Acquisizione dati
- Ricostituire i neuropeptidi essiccati dissalati in 12 μL di 3% ACN/0,1% FA, vortice bene, sonicare a bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e centrifugare brevemente a 2.000 x g. Trasferire ogni campione in flaconcini autocampionatori.
NOTA: Regolare il volume del campione in base alla quantità di neuropeptide a una concentrazione di ~ 1 μg di peptide per μL. La quantità totale di peptide può essere stimata utilizzando un saggio di quantificazione peptidico commerciale (vedere Tabella dei materiali). - Utilizzare un autocampionatore per iniettare 1 μL di campione in uno strumento nano-LC-MS/MS ad alta risoluzione (vedere Tabella dei materiali).
- Utilizzare una colonna C18 a fase inversa (RP) lunga circa 15 cm (vedere Tabella dei materiali) per eseguire il campione con lo 0,1% di FA in acqua come fase mobile A e lo 0,1% di FA in ACN come fase B mobile. Eseguire i campioni con un gradiente del 3% - 95% di B ad una velocità di 300 nL / min per oltre 11 minuti.
- Per lo strumento MS qui utilizzato, utilizzare condizioni MS comuni di 2,00 kV per la tensione di spruzzo e 275 °C per la temperatura capillare.
- Acquisisci spettri MS nell'intervallo da 200 a 2.000 m/z con una risoluzione di 60.000, target AGC (Automatic Gain Control) di 1 x 106 e tempo massimo di iniezione ionica (IT) di 150 ms.
- Selezionare i 15 ioni più intensi (intensità minima di 3,2 x 104) per la frammentazione della dissociazione di collisione (HCD) ad alta energia utilizzando un'energia di collisione normalizzata di 30, una finestra di isolamento di 2,0 m/z, una risoluzione di 15.000, un target AGC di 2 x 105 e un IT massimo di 250 ms.
- Impostare una finestra di esclusione dinamica di 30 s. Escludere gli ioni con una carica di 1 o ≥ 8 e gli ioni con stati di carica non riconosciuti.
- Ricostituire i neuropeptidi essiccati dissalati in 12 μL di 3% ACN/0,1% FA, vortice bene, sonicare a bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e centrifugare brevemente a 2.000 x g. Trasferire ogni campione in flaconcini autocampionatori.
- Identificazione e quantificazione dei neuropeptidi
NOTA: Sono disponibili molti software per la ricerca di database e la quantificazione dei peptidi (sia open source che commerciali). Qui verrà utilizzato PEAKS Studio (software di proteomica)15 .- Eseguire la ricerca nel database utilizzando i passaggi descritti in 1.4.2 - 1.4.6.
- Creare un nuovo progetto e aggiungere i dati LC-MS selezionando Nessuno per l'enzima, Orbitrap per lo strumento, HCD per il frammento e acquisizione dipendente dai dati (DDA) per l'acquisizione.
NOTA: selezionare i parametri appropriati in base ai parametri di acquisizione dati. - Selezionare Identificazioni e selezionare Precursore corretto [DDA] e Solo massa.
- Selezionare Ricerca database e impostare una tolleranza di errore di 20,0 ppm utilizzando la massa monoisotopica per la massa del precursore e 0,02 Da per la massa dello ione del frammento, Nessuno per il tipo di enzima, Non specifico per la modalità digest, 100 per le scissioni massime mancate e le seguenti PTM variabili variabili con la variabile massima consentita PTM per peptide di 3: Amidation, Ossidazione (M), Pyro-glu da E, e Pyro-glu di Q.
- Selezionare il database Neuropeptide, stimare il tasso di falsa scoperta (FDR) con decoy-fusion.
NOTA: l'errore di tolleranza di massa deve essere regolato in modo che corrisponda ai dati raccolti. Utilizzare il database appropriato per il tipo di esempio. Quando non viene selezionato alcun enzima, il parametro max mancate scissioni non influisce sulla ricerca. Tuttavia, è necessario un gran numero di scissioni mancate se il software non ha la modalità digest non specificata come opzione. - Se si desidera una quantificazione senza etichetta, selezionare Quantificazione, selezionare Senza etichetta e impostare una tolleranza di errore di 20,0 ppm e una tolleranza del tempo di ritenzione di 1,0 minuti.
- Eseguire la quantificazione degli ioni precursori se è stato eseguito il passaggio 1.2 per l'etichettatura isotopica.
- Selezionare Quantificazione, selezionare Quantificazione ionica precursore, utilizzare un intervallo di tempo di ritenzione di 1,0 minuti e utilizzare una soglia FDR dell'1%.
- Selezionate un metodo di quantificazione preimpostato o personalizzato dal menu a discesa Seleziona metodo .
- Per creare un nuovo metodo personalizzato, fare clic su Finestra > configurazione > Etichetta metodo Q > Nuovo. Assegnare un nome al nuovo metodo e selezionare Quantificazione ionica precursore per Tipo di metodo. Selezionate Aggiungi riga (Add Row ) e modifica (Modification) dall'elenco Opzioni PTM (PTM Options).
- Aggiungere i dati LC-MS e selezionare Condizione di riferimento per essere la modifica sui neuropeptidi dalla condizione di controllo dell'esperimento.
- Valutare i risultati della ricerca come descritto nei passaggi 1.4.9 - 1.4.11.
- Filtra i risultati attraverso la scheda di riepilogo per peptidi e proteine con -10lgP ≥ 20, seleziona ≥ 1 peptide univoco e seleziona la casella etichettata Con peptidi significativi.
- Valutare i risultati della ricerca nel database in cui Protein.csv rappresenta le identificazioni dei neuropeptidi e Peptide.csv rappresenta le identificazioni dei frammenti di neuropeptide.
- Ispeziona la ricerca del database per i punteggi di proteine e peptidi, l'accuratezza della massa e la copertura della sequenza.
NOTA: ogni software di ricerca di database utilizza algoritmi di punteggio univoci e potrebbe essere necessario valutare di conseguenza. Le identificazioni possono essere valutate ispezionando manualmente gli spettri osservati per i peptidi identificati contenenti la serie completa di ioni frammento.
2. Analisi di spotting MALDI-MS dei neuropeptidi
- Preparazione del campione
- Seguire i passaggi 1.1 o 1.1 - 1.2 se si desidera la quantificazione, escluso il passaggio 1.2.8 (la desalinizzazione dopo l'etichettatura isotopica non è richiesta prima dell'analisi MALDI-MS).
- Ricostituire i neuropeptidi essiccati dissalati in 5 μL di FA allo 0,1%, vortice bene, sonicare a bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e centrifugare brevemente a 2.000 x g.
- Per l'individuazione di neuropeptidi nei tessuti dei crostacei, preparare 150 mg/mL di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) in metanolo al 50% (MeOH)/0,1% FA (v/v) come matrice.
- Pipettare una goccia di campione da 3 μL su un film idrofobo (vedi Tabella dei materiali) e pipettare 3 μL della matrice direttamente sulla goccia del campione. Pipetta su e giù per mescolare.
- Pipetta 1 μL del campione 1:1: miscela a matrice in un pozzo della piastra target in acciaio inossidabile MALDI. Utilizzare la punta della pipetta per distribuire bene ogni miscela ai bordi del campione. Il campione deve toccare i bordi dell'incisione del pozzo per facilitare una distribuzione uniforme (Figura 4A).
- Spot 1 μL di miscela calibrante:matrice 1:1 (miscela di calibrazione commerciale o personalizzata, materiali polimerici (ad esempio, fosforo rosso disciolto in MeOH) o ioni cluster di matrice comuni)12 in un pozzo vicino al campione.
NOTA: il fosforo rosso non ha bisogno di essere miscelato con la matrice prima di individuare.
- Acquisizione dati
- Inserire la piastra bersaglio contenente punti campione essiccati nello strumento MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (vedere Tabella dei materiali).
- Per la matrice DHB, impostare la potenza del laser su 95%, selezionare Guadagno rilevatore ottimale automatico e Smart - Modalità di movimento del portatore del campione completo. Acquisisci spettri MS nell'intervallo da 200 a 3200 m/z e aggiungi più spettri da ogni punto insieme per aumentare il rapporto segnale-rumore neuropeptide.
NOTA: ottimizzare la percentuale di potenza del laser, il guadagno del rilevatore e selezionare la modalità di movimento del vettore del campione appropriata in modo che ogni acquisizione copra all'incirca l'intero punto e le acquisizioni successive non vadano alle posizioni precedenti. - Calibrare lo strumento.
NOTA: Regolare l'intervallo di massa per includere l'intervallo di neuropeptidi desiderato.
- Analisi dei dati
- Aprire il file MALDI-MS nel software di analisi dei dati (vedere Tabella dei materiali) e fare clic su Sottrazione di base per il software utilizzato qui.
- Eseguire il prelievo dei picchi facendo clic su Trova elenco di massa. Se ci sono troppo pochi picchi, modifica manualmente l'elenco di massa selezionando Modifica elenco di massa e fai clic sui picchi nello spettro per aggiungerli all'elenco di massa.
- Eseguire una corrispondenza di massa accurata confrontando l'elenco di massa con il database di neuropeptidi contenente valori [M + H] + m / z (± errore di 200 ppm).
NOTA: anche gli addotti di sale comuni, come [M + K] +, [M + Na] + e [M + NH4] + - dovrebbero essere inclusi nell'elenco di destinazione di corrispondenza di massa accurata. - Per verificare i picchi identificati, generare un elenco di m/z di interesse ed eseguire esperimenti MS/MS.
3. Analisi di imaging MALDI-MS di neuropeptidi
- Preparazione del campione
NOTA: le fasi di incorporamento e sezionamento non sono necessarie per i tessuti troppo sottili per essere sezionati.- Riempire mezza tazza di criostato con gelatina (37 °C, 100 mg/mL in acqua deionizzata) e lasciarla solidificare a temperatura ambiente. Tenere al caldo la gelatina liquida avanzata a bagnomaria a 37 °C.
- Raccogliere il tessuto neuronale desiderato dall'animale e utilizzare una pinza per immergere immediatamente il tessuto in un tubo da 0,6 ml contenente acqua deionizzata per 1 s.
NOTA: Fare riferimento al Passo 1.1.2 NOTA per la dissezione del tessuto neuronale. - Posizionare il tessuto sopra la gelatina solida e riempire il resto della tazza di criostato con gelatina liquida. Utilizzare una pinza per posizionare il tessuto.
- Posizionare la tazza criostato su una superficie piana e congelare con ghiaccio secco.
NOTA: Conservare i campioni a -80 °C fino all'uso (idealmente entro 6 mesi). - Per la preparazione del sezionamento, separare il campione incorporato nella gelatina dallo stampo criostato tagliando via lo stampo.
- Montare il tessuto incorporato su un mandrino criostato pipettando una goccia da 1 mL di acqua deionizzata sul mandrino e premendo immediatamente il tessuto incorporato sulla goccia.
- Una volta congelato, pipettare più acqua deionizzata intorno al tessuto per fissarlo ulteriormente al mandrino. Eseguire questi passaggi all'interno della scatola criostata (vedi Tabella dei materiali) impostata a -20 °C.
- Sezionare il tessuto a uno spessore approssimativo di una cella (8-20 μm a seconda del tipo di campione) e scongelare montare ogni sezione su un vetrino rivestito di ossido di indio stagno (ITO) posizionando un lato del vetrino vicino alla sezione e posizionando un dito sull'altro lato del vetrino per riscaldare lentamente il vetro e consentire alla sezione di aderire al vetrino.
NOTA: le sezioni di tessuto possono anche essere montate sul disgelo raccogliendo un bordo della gelatina con una pinzetta (refrigerata a -20 °C), posizionandola sul vetrino rivestito in ITO e posizionando un dito sull'altro lato del vetrino per riscaldare lentamente il vetro e consentire alla sezione di aderire al vetrino. - Individuare il campione da utilizzare come calibrante (vedere il punto 2.1.6 per le opzioni di calibro) disegnando un piccolo cerchio vicino alla sezione del tessuto usando una penna idrofobica e individuando il calibrante all'interno del cerchio.
- Contrassegnare ogni angolo della diapositiva con una penna whiteout con una piccola forma contenente spigoli vivi (ad esempio, x) da utilizzare come punti di insegnamento.
- Posizionare il vetrino nella piastra adattatore per diapositive MALDI ed eseguire una scansione ottica dell'immagine ad alta risoluzione (≥2400 DPI) utilizzando uno scanner.
- Matrice di spruzzatura sulla sezione del tessuto utilizzando uno spruzzatore automatico (vedere Tabella dei materiali per i dettagli e le istruzioni dello spruzzatore).
- Per l'MSI dei neuropeptidi nei tessuti dei crostacei utilizzare 40 mg/mL DHB in 50% metanolo/0,1% FA (v/v) come matrice, impostare la temperatura dell'ugello a 80 °C, la velocità a 1.250 mm/min, la portata a 0,1 ml/min, il numero di passaggi a 12 e 30 s tra ogni passaggio per lo spruzzatore automatico.
- Acquisizione dati
- Inserire la piastra bersaglio completamente essiccata contenente sezioni di tessuto montate sul disgelo che sono state spruzzate con la matrice.
- Impostare i parametri del file di acquisizione dell'imaging MS in modo che il diametro del laser sia inferiore alla dimensione del gradino raster.
- Caricare l'immagine ottica scansionata e calibrare la piastra campione utilizzando i punti di insegnamento x. Definire le aree tissutali di interesse da misurare leggermente più grandi della sezione tissutale effettiva per includere anche le aree contenenti solo matrice.
- Calibrare lo strumento e acquisire spettri nell'intervallo 200 - 3200 m/z. Regolare l'intervallo di massa per includere l'intervallo di neuropeptidi desiderato.
- Analisi dei dati
- Per elaborare i dati, importare il set di dati di imaging MS nel software desiderato, selezionare un algoritmo di rimozione di base e normalizzare i dati utilizzando il conteggio totale degli ioni.
NOTA: la selezione di diversi algoritmi di normalizzazione, ad esempio la mediana, il valore RMS (Root Mean Square) o l'intensità di un valore m/z di riferimento, probabilmente modificherà la distribuzione spaziale di molti valori m/z . Scegli l'algoritmo di normalizzazione più adatto per gli analiti desiderati. - Per generare un'immagine per ogni valore m/z da un elenco di picchi teorici, carica un file csv (comma-separated values) contenente neuropeptide [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, ecc. Per ottenere i valori m/z , fare clic su File > Importa > elenco di picchi. Assegna un nome all'elenco dei picchi.
- Per stimare la soglia di errore ppm appropriata, identificare manualmente un picco neuropeptide nello spettro MS e confrontarlo con la massa teorica del neuropeptide. Calcolare l'errore ppm e fare clic su Proprietà file > file > larghezza intervallo e input ppm errore.
- Selezionare l'elenco dei picchi dal menu a discesa e fare clic su Crea immagini m/z per ogni intervallo dell'elenco dei picchi.
- Salva ogni immagine m/z facendo clic su Salva screenshot di ogni immagine m/z.
NOTA: L'identificazione putativa del neuropeptide può essere eseguita identificando immagini m/z in cui il segnale analita è localizzato solo all'interno del tessuto e non nella matrice circostante. - Per verificare l'identità del picco, generare un elenco di m/z di interesse ed eseguire esperimenti MS/MS.
- Per elaborare i dati, importare il set di dati di imaging MS nel software desiderato, selezionare un algoritmo di rimozione di base e normalizzare i dati utilizzando il conteggio totale degli ioni.
4. Scoprire nuovi neuropeptidi putativi usando il sequenziamento de novo
- Eseguire i passaggi da 1.4.2 a 1.4.5.
- Esporta de novo solo peptidi.csv dal software PEAKS con un punteggio medio di fiducia locale (ALC) di ≥ 75.
NOTA: Ci sono molti software disponibili per eseguire il sequenziamento de novo , ognuno con i propri algoritmi di punteggio e dovrebbe essere valutato di conseguenza. - Cerca nell'elenco dei peptidi motivi di sequenza noti indicativi di neuropeptidi appartenenti a specifiche famiglie di neuropeptidi19.
NOTA: Mentre i motivi sono comunemente ben conservati tra le specie, i motivi cercati dovrebbero essere selezionati tenendo conto dell'organismo campione.
5. Estrazione del trascrittoma per sequenze neuropeptidiche previste
NOTA: questo passaggio è facoltativo e viene utilizzato solo per aggiungere a un database neuropeptide esistente o creare un nuovo database neuropeptide.
- Scegli una sequenza di aminoacidi preproormone nota di interesse e usa tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
_LOC=blasthome) per cercare la sequenza preproormone di query su database tra cui nr/nt, Refseq_genomes, EST e TSA.
NOTA: per eseguire ricerche nelle sequenze di query nel database delle proteine, utilizzare BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).- Selezionare l'organismo di destinazione (codice fiscale) e modificare i parametri dell'algoritmo Expect Threshold su 1000 per includere allineamenti a punteggio basso.
- Esegui il programma BLAST e quindi controlla i risultati per punteggi di omologia elevati tra sequenze di query e soggetti che producono allineamenti significativi. Salvare il file FASTA contenente la sequenza nucleotidica.
NOTA: Se ci sono diverse sequenze di soggetti con punteggi di omologia simili, eseguire un allineamento MAFFT per restringere le sequenze putative20,21.
- Tradurre la sequenza nucleotidica preproormone in sequenze peptidiche preproormone utilizzando lo strumento Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Per C. sapidus, selezionare Mitocondriale invertebrato per il codice genetico.
- Verificare la presenza della sequenza peptidica del segnale e dei siti di scissione del proormone nelle sequenze peptidiche utilizzando SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
NOTA: l'omologia agli schemi di elaborazione preproormone noti può anche essere utilizzata per identificare i siti di scissione del proormone. Possibili modifiche post-traduzionali per i peptidi di segnale possono essere previste se lo si desidera. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) può essere utilizzato per prevedere lo stato di solfatazione dei residui di tirosina. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) può essere utilizzato per prevedere la connettività del legame disolfuro.
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Representative Results
Il flusso di lavoro per la preparazione dei campioni e l'analisi ms è illustrato nella Figura 1. Dopo la dissezione del tessuto neuronale, vengono eseguite l'omogeneizzazione, l'estrazione e la desalinizzazione per purificare i campioni di neuropeptide. Se si desidera una quantificazione isotopica basata sull'etichetta, i campioni vengono nuovamente etichettati e dissalati. Il campione risultante viene analizzato attraverso LC-MS/MS per l'identificazione e la quantificazione dei neuropeptidi.
I neuropeptidi identificati attraverso il software di proteomica dovrebbero avere una buona copertura della sequenza di frammentazione peptidica, tuttavia, questo non è globalmente definito o standardizzato. Per l'identificazione assoluta, ogni amminoacido dovrebbe produrre uno ione frammento che fornisca un'identificazione e una localizzazione inequivocabili. Questo deve anche essere confrontato con un peptide sintetizzato per confermare l'intensità di ogni frammento di ione. Poiché il costo per eseguire questo su ogni presunta identificazione non è fattibile, l'identificazione è comunemente descritta in base alla fiducia in cui più ioni frammento osservati aumentano la fiducia nell'identificazione peptidica. Mentre la Figura 2A,B raffigura due neuropeptidi che sono stati entrambi identificati con una copertura di sequenza del 100% e un errore di massa basso come definito dal limite massimo di 0,02 Da, la scarsa copertura di frammentazione (da soli tre ioni) osservata solo per il neuropeptide nella Figura 2B diminuisce la fiducia nell'identificazione di un'isoforma specifica. La Figura 2C illustra i cromatogrammi ionici (XIC) estratti, che è un grafico contenente l'intensità del segnale di un valore m/z selezionato in funzione del tempo di ritenzione, di un neuropeptide rilevato in due campioni utilizzati per LFQ. I tempi di ritenzione per il neuropeptide differiscono leggermente perché è stato identificato in due cicli separati e consecutivi; tuttavia, la differenza è all'interno del valore soglia affidabile di 1 min. Pertanto, il rapporto tra l'area calcolata dal software sotto la curva dall'XIC viene utilizzato per l'LFQ di questo neuropeptide.
Per la quantificazione dei neuropeptidi marcati con dimetile, lo spettro MS1 dovrebbe contenere un picco al valore teorico del neuropeptide m/z e un picco al valore m/z con uno spostamento di massa correlato alla differenza di massa tra i reagenti di marcatura isotopica utilizzati. Nella Figura 2D, lo spostamento di massa di questo campione marcato con dimetile 2-plex è 4,025 Da. L'area sotto la curva dello ione precursore dei suoi XIC viene quindi calcolata dal software e utilizzata per calcolare i rapporti di abbondanza relativa. Una versione semplificata della tabella di esportazione del software di proteomica contenente neuropeptidi identificati e i loro rapporti LFQ è mostrata nella Tabella 1. Risultati simili si ottengono per i neuropeptidi marcati isotopicamente.
Gli algoritmi software consentono il sequenziamento de novo degli spettri per rilevare nuovi neuropeptidi putativi. Quando si afferma la rilevazione di nuovi neuropeptidi putativi, le identificazioni ad alta confidenza sono casi ideali in cui tutti gli amminoacidi sono identificati e localizzati in modo inequivocabile, sulla base dell'osservazione degli ioni frammento. La Figura 3 raffigura lo spettro di un peptide sequenziato de novo contenente il motivo -RYamide al C-terminale, un motivo di sequenza conservato condiviso da neuropeptidi noti della famiglia dei crostacei RYamide22. Un peptide è stato abbinato dal database con una copertura di sequenza del 100%, tutti gli ioni di frammento di formazione di amminoacidi osservati, un errore di massa ionica a basso frammento come definito dal limite massimo di 0,02 Da e conteneva un profilo di eluizione gaussiana. Questi risultati indicano che è stato osservato un peptide endogeno appartenente alla famiglia dei neuropeptidi crostacei -RYamide.
Le misurazioni spot MALDI-MS possono fornire identificazioni neuropeptidiche complementari all'identificazione LC-ESI-MS, oltre a offrire capacità di throughput più elevate. Dopo che l'omogeneizzato di tessuto grezzo viene estratto per i neuropeptidi, dissalato ed etichettato (se lo si desidera), il campione può essere miscelato con matrice e individuato sulla piastra target in acciaio inossidabile MALDI, come mostrato nella Figura 4A. Il pipettaggio riuscito di punti campione omogenei produce picchi chiaramente risolti, specialmente all'interno dello spettro di calibrazione (Figura 4B). Quando si utilizza uno strumento MALDI-TOF, lo strumento deve essere calibrato all'inizio di ogni esperimento. Qualsiasi analite con masse note può essere utilizzato per calibrare lo strumento se si trova all'interno dell'intervallo di massa desiderato del campione. Qui, il fosforo rosso viene utilizzato per la calibrazione della massa ionica positiva dello strumento. Ha vantaggi rispetto all'utilizzo di miscele di calibrazione peptidica grazie alla sua stabilità a temperatura ambiente, al costo economico, ai picchi abbondanti grazie alla sua polimerizzazione, all'elevato rapporto segnale-rumore e non richiede una matrice per la ionizzazione.
Per l'imaging MALDI-MS dei neuropeptidi, lo strumento MALDI TOF/TOF utilizzato richiede la calibrazione manuale dell'immagine del vetrino rivestito ITO (passaggio 3.1.10) per correlare l'immagine ottica con il campione. Il diagramma nella Figura 5 mostra il corretto posizionamento del mirino whiteout da utilizzare come punti di insegnamento per consentire allo strumento di correlare l'immagine ottica scansionata con la piastra campione effettiva. Illustra anche le aree della diapositiva rivestita con ITO che dovrebbero essere evitate dall'utente (cioè, non contengono campione o matrice). Per la calibrazione di massa, il posizionamento del punto del campione di calibrazione rispetto al campione di tessuto sul vetrino rivestito con ITO influisce direttamente sull'errore di massa dovuto alla natura intrinseca degli analizzatori di massa a tempo di volo, sebbene l'entità di questo problema dipenda dall'abbondanza degli analiti bersaglio. Una soluzione a questo problema consiste nel controllare manualmente i picchi dagli spettri MS1 da diverse sezioni di tessuto per la prova dello spostamento dei picchi. Se c'è uno spostamento del picco, considera l'aggiunta di ulteriori punti di calibrazione della massa sulla diapositiva rivestita con ITO proprio accanto a ciascuna sezione di tessuto. Da lì, l'utente può calcolare la media degli spettri dai punti di calibrazione insieme o eseguire l'imaging MS su una sezione di tessuto alla volta utilizzando solo il punto di calibrazione più vicino alla sezione del tessuto. Dopo aver raccolto il campione, verificare che il segnale proveniente dai valori m/z corrispondenti ai neuropeptidi sia localizzato solo all'interno della regione tissutale (Figura 6) prima di assegnare una presunta identificazione neuropeptidica.
Figura 1: Flusso di lavoro di preparazione del campione neuropeptidico per l'analisi della spettrometria di massa. Per l'analisi dell'estratto tissutale l'omogeneizzato di tessuto grezzo viene dissalato, etichettato con etichette isotopiche stabili, dissalato di nuovo e analizzato dalla SM. Per l'analisi di imaging il tessuto intatto viene incorporato, criosezionato, applicato con matrice e analizzato da MALDI-MSI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione e quantificazione effettuata attraverso il software di proteomica. I neuropeptidi vengono rilevati attraverso spettri di qualità variabile con (A) buona o (B) scarsa copertura di frammentazione MS2. L'errore di corrispondenza della massa ionica del frammento è mostrato sotto gli spettri. (C) Le forme del profilo XIC e il tempo di ritenzione (RT) possono essere ispezionati manualmente per i neuropeptidi quantificati tramite LFQ. (D) Gli spettri MS1 sono utilizzati per rilevare e quantificare i neuropeptidi marcati con dimetile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sequenziamento de novo per la rilevazione di nuovi neuropeptidi. (A) Lo spettro MS2 di un presunto nuovo RYamide dimostra una buona copertura della frammentazione con un basso errore di massa per ciascun frammento. (B) Gli ioni frammento identificati sono elencati per l'ispezione manuale. (C) L'XIC del nuovo neuropeptide viene ispezionato manualmente per la forma del picco gaussiano. Abbreviazioni: RT = tempo di conservazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spot MALDI-MS e spettro di calibrazione. (A) La qualità degli spettri MS si basa sulla distribuzione uniforme matrice-peptide nel pozzo bersaglio in acciaio inossidabile MALDI. I tre punti di sinistra sono esempi di punti buoni che toccano i bordi dell'incisione del pozzo e i tre punti di destra sono esempi di punti cattivi. Entrambi gli spot contengono α matrice di acido ciano-4-idrossicinnamico (CHCA) e una miscela standard di peptidi. (B) Spettro di taratura mediante ammassi di fosforo rosso da 500 a 3200 m/z. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rappresentazione di vetrini rivestiti con ITO. (A) Schema con aree importanti annotate: posizioni per posizionare sezioni di tessuto (rettangoli blu chiaro), posizioni automatiche dei punti di insegnamento che dovrebbero essere evitate (rettangoli rossi), posizioni di esempio in cui possono essere disegnati i punti di insegnamento (mirino bianco) e dove le viti si attaccano alla piastra dell'adattatore e dovrebbero essere evitate (ovali blu scuro). (B) Foto di vetrino contenente due sezioni di tessuto, una macchia contenente una miscela di calibrazione e segni di mirino. La posizione della sezione tissutale e i punti di calibrazione sono delineati sull'altro lato del vetrino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini MS delle ghiandole sinusali di C. sapidus . Vengono mostrate immagini di distribuzione ionica Neuropeptide [M+H]+ di (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844.48), (B) Allatostatina di tipo A NPYAFGLamide o GGPYAFGLamide (m/z 780.40), (C) Allatostatina di tipo A GQYAFGLamide (m/z 754.39) e (D) RFamide GRNFLRFamide (m/z 908.52). Le immagini vengono generate utilizzando una finestra ± 50 ppm dal valore teorico m/z . La barra di colore indica l'intervallo di intensità del segnale da 0 a 100%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Ricerca nel database e risultati LFQ. Neuropeptidi identificati e quantificati attraverso software LC-MS e proteomica. I PTM identificati sono elencati insieme alle intensità dei peptidi rilevati in entrambi i campioni per LFQ, insieme al rapporto LFQ risultante. Sono elencate le masse medie e le descrizioni dei neuropeptidi osservate dal file FASTA. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
L'identificazione accurata, la quantificazione e la localizzazione di neuropeptidi e peptidi endogeni presenti nel sistema nervoso sono cruciali per comprendere la loro funzione23,24. La spettrometria di massa è una tecnica potente che può consentire di realizzare tutto questo, anche in organismi senza un genoma completamente sequenziato. Viene dimostrata la capacità di questo protocollo di rilevare, quantificare e localizzare neuropeptidi da tessuti raccolti da C. sapidus attraverso una combinazione di LC-ESI- e MALDI- MS.
Durante la preparazione del campione per l'analisi LC-ESI-MS, è necessario fare delle considerazioni. Mentre la SM è una tecnica sensibile, la bassa concentrazione peptidica del tessuto neuronale (fino all'intervallo femtomolare25) pone una grave limitazione. È necessaria un'attenta preparazione del campione non solo per rimuovere componenti della matrice più abbondanti e interferenti, come proteine e lipidi, ma anche per ridurre al minimo la perdita di neuropeptidi in ogni fase26,27. Ad esempio, la perdita di campione può essere ridotta utilizzando tubi microcentrifuga che resistono all'adsorbimento peptidico. A seconda della composizione del tessuto di interesse, l'uso di vari solventi (per estrazione o precipitazione) o materiali di estrazione in fase solida può essere utilizzato per separare biomolecole con diverse dimensioni e proprietà chimiche. Per garantire che i peptidi idrofili o idrofobici siano presenti nell'estratto di neuropeptide, più sistemi di solventi da estrazione possono essere facoltativamente utilizzati per colpire neuropeptidi con diverse proprietà fisico-chimiche. Questi, insieme all'uso di inibitori della proteasi, potrebbero dover essere modificati per una purificazione ottimizzata per migliorare il recupero dei neuropeptidi28. Gli svantaggi dell'utilizzo di più sistemi di estrazione sono che diversi tessuti neuronali devono essere raggruppati per soddisfare un requisito complessivo di contenuto peptidico più elevato, nonché una diminuzione della produttività. Molti passaggi come la desalinizzazione, l'etichettatura isotopica e l'iniezione di SM raccomandano determinate quantità di peptidi iniziali. Per la caratterizzazione di campioni preziosi, come i neuropeptidi, vengono generalmente evitati saggi peptidici per prevenire il consumo di peptidi estranei. Inoltre, sono stati sviluppati saggi peptidici per determinare un'accurata concentrazione di peptidi da digest proteici, che hanno proprietà chimiche diverse rispetto ai peptidi endogeni. Per superare le complicazioni derivanti da una concentrazione sconosciuta di neuropeptide, è possibile eseguire un test peptidico iniziale utilizzando estratti di tessuto neuronale raggruppati, in cui i risultati vengono utilizzati come stima per tutte le analisi successive, anche se si deve tenere presente che tutti i peptidi in soluzione sono misurati e non tutti questi sono neuropeptidi29. Altre limitazioni di questo metodo includono potenziali pregiudizi verso neuropeptidi non polari e idrofobici e la mancanza di conservazione della struttura nativa. Per risolvere questo problema, possono essere eseguite modifiche alle composizioni e ai materiali dei solventi, come l'uso di soluzioni più idrofobiche o l'omissione dell'uso di solventi organici.
Le misurazioni MALDI-MS si basano su un'attenta fase di preparazione del campione per risultati coerenti e possono avere considerazioni di campionamento diverse rispetto alle misurazioni LC-ESI-MS. Passi come mantenere l'estratto di neuropeptide sul ghiaccio prima dell'analisi della SM sono ancora applicati. Ulteriori metodi per prevenire la degradazione dei neuropeptidi includono la conservazione di vetrini contenenti sezioni di tessuto montate sul disgelo in una scatola essiccante dopo la dissezione per evitare che la condensa si accumuli30, anche se lasciare il campione di tessuto nell'essiccatore dopo che si è asciugato può causare anche la degradazione del campione. Si consiglia di posizionare i vetrini di tessuto in un essiccatore sottovuoto (pressione finale: 1x10-4 Torr a temperatura ambiente) per 5-10 minuti immediatamente prima dell'applicazione della matrice. Dopo che la matrice è stata depositata sul vetrino, può essere conservata in frigorifero o congelatore durante la notte e asciugata nell'essiccatore sottovuoto prima della misurazione dell'imaging MALDI-MS. Per le misurazioni spot MALDI, la struttura cristallina matrice-peptide non è equamente distribuita in tutto il bersaglio MALDI anche se sembra così. Esistono modi per mitigare le variazioni degli spettri di massa dalle repliche tecniche dovute a questo processo. In primo luogo, acquisire uno spettro medio da ciascun pozzo utilizzando più colpi laser (in genere da centinaia a migliaia) in cui il laser viene rasterizzato casualmente attraverso il pozzo (ad esempio, selezionando il movimento SMART o Random del vettore del campione nei parametri dello strumento). Acquisire almeno cinque repliche tecniche per ogni tipo di campione e selezionare tre repliche tecniche in cui la variazione dell'intensità del segnale per i picchi desiderati è la più bassa. Il compromesso qui è il throughput sperimentale. È necessario mantenere parametri come il numero di colpi laser, il diametro del laser e altre impostazioni dello strumento coerenti per tutti gli spettri acquisiti. Idealmente, tutte le repliche tecniche e le repliche biologiche vengono analizzate contemporaneamente utilizzando la stessa soluzione matriciale e la calibrazione dello strumento. L'identificazione dei neuropeptidi può essere eseguita mediante un'accurata corrispondenza di massa a un elenco di picco contenente [M + H] + teorici,[M + Na] +, [M + NH4] +, [M + K] + e altri addotti salini che producono valori m / z ionici singolarmente carichi. La normalizzazione dei dati è fondamentale per ridurre al minimo gli artefatti sistematici degli esperimenti MALDI-MS. La valutazione della riproducibilità è particolarmente importante quando le misurazioni spot MALDI-MS sono utilizzate per la quantificazione dei neuropeptidi mediante marcatura isotopica stabile (SIL). La qualità della preparazione del campione e dell'acquisizione dei dati può essere valutata prendendo uno standard peptidico o un estratto di neuropeptide, dividendolo in due aliquote uguali, etichettando differenzialmente ciascun campione tramite SIL e analizzando il campione per garantire che l'intensità relativa dei picchi accoppiati sia 1: 1. La variazione riportata da tali rapporti può essere utilizzata per stimare il livello di varianza nell'esperimento complessivo attribuito all'errore dell'utente.
È importante notare che MALDI-MS è anche in grado di fornire informazioni di sequenza e quantitative; tuttavia, gli ioni caricati singolarmente tipicamente prodotti da MALDI limitano il rilevamento di frammenti peptidici, rendendo più difficile ottenere la sequenza completa e inibendo i metodi di quantificazione discussi per LC-ESI-MS. Indipendentemente da ciò, MALDI-MS è una modalità interessante grazie alla sua capacità di elevata produttività, nonché a una maggiore tolleranza per sali e impurità all'interno del campione12,31. Inoltre, l'imaging MALDI-MS presenta vantaggi rispetto ad altre tecniche di imaging convenzionali che richiedono anticorpi. Nella maggior parte delle modalità MS, l'abbassamento della risoluzione di massa aumenterà la sensibilità, consentendo una migliore rilevazione di neuropeptidi a bassa abbondanza. Questa strategia può essere più pratica per gli strumenti MALDI-TOF/TOF rispetto agli strumenti LC-ESI-MS a causa della facilità di calibrazione dello strumento MALDI per ogni esperimento. Un altro modo in cui MALDI può essere vantaggioso per i neuropeptidomici è attraverso la media degli spettri. Tipicamente, la media degli spettri delle misurazioni LC-ESI-MS non viene utilizzata perché annulla i benefici della separazione LC; pertanto, il software di bioinformatica è fortemente invocato per identificare i neuropeptidi e le identificazioni sono verificate manualmente. Tuttavia, ci sono meno conseguenze per la media degli spettri dalle misurazioni MALDI-MS perché non c'è stata alcuna separazione iniziale; pertanto, i dati grezzi sono più piccoli e più facili da pettinare manualmente per un utente. La facilità di gestione dei dati è importante in quanto cambia l'ordine in cui l'utente può avvicinarsi alle strategie di identificazione e verifica dei neuropeptidi. Mentre la fiducia nelle identificazioni di neuropeptidi da LC-ESI-MS potrebbe trarre beneficio dall'aumento del livello di rigore di soglia all'interno del software di analisi dei dati, questa strategia ha meno probabilità di avvantaggiare le identificazioni MALDI-MS. Nell'esempio dei neuropeptidi dei crostacei, il fatto che ci siano meno di 1000 voci dal database costruito in laboratorio (cioè un massimo di <1000 picchi spettrali o immagini MS da scansionare manualmente), consente di filtrare prima i dati MALDI-MS con una generosa soglia di errore di massa, e quindi verificare manualmente tali identificazioni esaminando gli involucri isotopici a livello MS1, così come altri metodi di verifica discussi nella sezione Risultati rappresentativi. Il popolare software di analisi dei dati di imaging MS può eseguire un'accurata corrispondenza di massa a un database di massa neuropeptidico ed estrarre le immagini MS corrispondenti. Per le domande di ricerca cliniche, come la scoperta di biomarcatori, questi software sono in grado di estrarre valori m / z unici per una regione tissutale di interesse (in genere chiamata analisi della regione di interesse (ROI)32 ed eseguire test statistici per quantificare quanto siano diverse due regioni tissutali. Vale anche la pena notare che ci sono anche meno opzioni software di analisi dei dati per l'imaging MS rispetto a LC-ESI-MS.
L'esecuzione di ricerche nel database LC-ESI-MS per i neuropeptidi comporta comunemente l'uso di algoritmi software costruiti per l'analisi dei peptidi digeriti. Pertanto, ci sono limitazioni al fatto che il software sia in grado di eseguire ricerche non specifiche nel database enzimatico o la quantità di tempo necessaria per completare la ricerca. Attualmente, le ricerche peptidiche endogene vengono eseguite con il numero massimo di scissioni mancate, ma questo numero è ancora limitato, portando a identificazioni potenzialmente mancate. Quando il genoma di una specie non è completamente sequenziato, come con C. sapidus, il sequenziamento de novo può essere eseguito per identificare neuropeptidi sconosciuti / nuovi attraverso motivi di sequenza neuropeptidici conservati noti, sebbene questo metodo non riesca a identificare neuropeptidi che hanno motivi sconosciuti o non contengono i motivi usati come identificatori della famiglia dei neuropeptidi19. Ad esempio, WSSMRGAWamide è un motivo per la famiglia di neuropeptidi di tipo B dell'allatostatina19. Qui sta il significato dell'estrazione del trascrittoma per le sequenze neuropeptidiche previste per le specie senza una sequenza di genoma completamente decodificata33. Le identificazioni neuropeptidiche sono quindi confermate sintetizzando la presunta sequenza peptidica e confrontando gli spettri MS/MS dal peptide sintetico e dal tessuto biologico34. Anche dopo che una sequenza è stata verificata, a volte non è noto se si tratti della sequenza completa di neuropeptide o di un prodotto di degradazione. Vale la pena notare che le differenze tra le fonti di ionizzazione MALDI ed ESI-MS (ESI è un metodo di ionizzazione più morbido rispetto a MALDI) possono comportare diversi tassi di degradazione artificiale (cioè frammentazione in-source). Per distinguere tra una versione troncata di un peptide da un prodotto di degradazione indotto artificialmente (cioè non in vivo), deve essere nota la via di elaborazione preproormone per quel neuropeptide. Poiché questo spesso non è il caso, una forma sintetica del peptide dovrebbe essere utilizzata in saggi fisiologici e verificata per l'attività biologica.
Nel complesso, il flusso di lavoro esemplificato qui per l'analisi dei neuropeptidi può avvantaggiare una varietà di campi diversi. Colma una lacuna tecnica all'interno dell'analisi della SM medio-basso dei peptidi perché è ottimizzata per peptidi endogeni che sono più piccoli delle proteine tipicamente analizzate da analisi MS bottom-up o top-down. Pertanto, i metodi di preparazione del campione utilizzati dalla neuropeptidomica dovrebbero essere in gran parte traducibili in altri peptidi endogeni bioattivi, come quelli presi di mira dai chimici medicinali per le proprietà antibatteriche35. Un vantaggio di questo protocollo è che utilizza strumenti comuni di fornitori popolari che offrono anche un ulteriore grado di traducibilità. In questo modo, il flusso di lavoro può essere utilizzato in contesti accademici e commerciali, come lo screening per farmaci candidati o bersagli farmacologici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation (CHE-1710140 e CHE-2108223) e dal National Institutes of Health (NIH) attraverso la sovvenzione R01DK071801. A.P. è stato supportato in parte dal NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health, nell'ambito del Ruth L. Kirschstein National Research Service Award dal National Heart Lung and Blood Institute all'Università del Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. desidera riconoscere le sovvenzioni NIH R56 MH110215, S10RR029531 e S10OD025084, nonché il sostegno finanziario di una Vilas Distinguished Achievement Professorship e Charles Melbourne Johnson Professorship con finanziamenti forniti dalla Wisconsin Alumni Research Foundation e dalla University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
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