Summary
Die massenspektrometrische Charakterisierung von Neuropeptiden liefert Sequenz-, Quantifizierungs- und Lokalisierungsinformationen. Dieser optimierte Workflow ist nicht nur für Neuropeptidstudien nützlich, sondern auch für andere endogene Peptide. Die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben die Probenvorbereitung, die MS-Akquisition, die MS-Analyse und die Datenbankgenerierung von Neuropeptiden unter Verwendung von LC-ESI-MS, MALDI-MS-Spotting und MALDI-MS-Bildgebung.
Abstract
Neuropeptide sind Signalmoleküle, die fast alle physiologischen und Verhaltensprozesse wie Entwicklung, Fortpflanzung, Nahrungsaufnahme und Reaktion auf externe Stressoren regulieren. Dennoch sind die biochemischen Mechanismen und die vollständige Ergänzung der Neuropeptide und ihre funktionellen Rollen noch wenig verstanden. Die Charakterisierung dieser endogenen Peptide wird durch die immense Vielfalt innerhalb dieser Klasse von Signalmolekülen behindert. Darüber hinaus sind Neuropeptide in Konzentrationen von 100x - 1000x niedriger als die von Neurotransmittern bioaktiv und neigen nach der synaptischen Freisetzung zum enzymatischen Abbau. Die Massenspektrometrie (MS) ist ein hochempfindliches Analysewerkzeug, das Analyten ohne umfassende A-priori-Kenntnisse identifizieren, quantifizieren und lokalisieren kann. Es eignet sich gut für die globale Profilierung von Neuropeptiden und die Unterstützung bei der Entdeckung neuartiger Peptide. Aufgrund der geringen Häufigkeit und hohen chemischen Vielfalt dieser Peptidklasse wurden mehrere Probenvorbereitungsmethoden, MS-Akquisitionsparameter und Datenanalysestrategien aus Proteomiktechniken angepasst, um eine optimale Neuropeptidcharakterisierung zu ermöglichen. Hier werden Methoden zur Isolierung von Neuropeptiden aus komplexen biologischen Geweben zur Sequenzcharakterisierung, -quantifizierung und -lokalisierung mittels Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS und matrixgestützter Laserdesorption/-ionisation (MALDI)-MS beschrieben. Ein Protokoll zur Erstellung einer Neuropeptid-Datenbank aus der blauen Krabbe, Callinectes sapidus, einem Organismus ohne umfassende genomische Informationen, ist enthalten. Diese Arbeitsabläufe können angepasst werden, um andere Klassen von endogenen Peptiden in verschiedenen Spezies mit einer Vielzahl von Instrumenten zu untersuchen.
Introduction
Das Nervensystem ist komplex und benötigt ein Netzwerk von Neuronen, um Signale durch einen Organismus zu übertragen. Das Nervensystem koordiniert sensorische Informationen und biologische Reaktionen. Die komplizierten und komplizierten Wechselwirkungen, die an der Signalübertragung beteiligt sind, erfordern viele verschiedene Signalmoleküle wie Neurotransmitter, Steroide und Neuropeptide. Da Neuropeptide die vielfältigsten und stärksten Signalmoleküle sind, die eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung physiologischer Reaktionen auf Stress und andere Reize spielen, ist es von Interesse, ihre spezifische Rolle in diesen physiologischen Prozessen zu bestimmen. Die Funktion von Neuropeptiden hängt mit ihrer Aminosäurestruktur zusammen, die die Mobilität, die Rezeptorinteraktion und die Affinitätbestimmt 1. Techniken wie die Histochemie, die wichtig ist, weil Neuropeptide in verschiedenen Regionen des Gewebes synthetisiert, gespeichert und freigesetzt werden können, und die Elektrophysiologie wurden eingesetzt, um die Struktur und Funktion von Neuropeptiden zu untersuchen 2,3,4, aber diese Methoden sind durch Durchsatz und Spezifität begrenzt, um die enorme Sequenzvielfalt von Neuropeptiden aufzulösen.
Die Massenspektrometrie (MS) ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der Neuropeptidstruktur und -häufigkeit. Dies kann durch verschiedene MS-Techniken durchgeführt werden, am häufigsten durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisation MS (LC-ESI-MS)5 und matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation MS (MALDI-MS)6. Durch hochgenaue Massenmessungen und MS-Fragmentierung bietet MS die Möglichkeit, Neuropeptiden aus komplexen Mischungen ohne A-priori-Kenntnisse den Status einer Aminosäuresequenz und posttranslationalen Modifikation (PTM) zuzuweisen, um ihre Funktion zu bestimmen 7,8. Neben qualitativen Informationen ermöglicht MS die quantitative Information von Neuropeptiden durch markierungsfreie Quantifizierung (LFQ) oder markierungsbasierte Methoden wie isotopische oder isobare Markierung9. Zu den Hauptvorteilen von LFQ gehören die Einfachheit, die niedrigen Analysekosten und die Verringerung der Probenvorbereitungsschritte, wodurch der Probenverlust minimiert werden kann. Zu den Nachteilen von LFQ gehören jedoch erhöhte Gerätezeitkosten, da mehrere technische Replikate erforderlich sind, um quantitative Fehler aufgrund von Run-to-Run-Variabilität zu beheben. Dies führt auch zu einer verminderten Fähigkeit, kleine Variationen genau zu quantifizieren. Markierungsbasierte Methoden unterliegen weniger systematischen Variationen, da mehrere Proben mit einer Vielzahl stabiler Isotope differenziell markiert, zu einer Probe kombiniert und gleichzeitig durch Massenspektrometrie analysiert werden können. Dies erhöht auch den Durchsatz, obwohl die Synthese oder der Kauf von Isotopenmarkierungen zeitaufwändig und kostspielig sein kann. Die spektrale Komplexität der Full Scan-Massenspektren (MS1) nimmt mit zunehmendem Multiplexing ebenfalls zu, was die Anzahl der einzigartigen Neuropeptide verringert, die fragmentiert und daher identifiziert werden können. Umgekehrt erhöht die isobare Markierung die spektrale Komplexität auf MS1-Ebene nicht, obwohl sie Herausforderungen für Analyten mit geringer Häufigkeit wie Neuropeptide mit sich bringt. Da die isobare Quantifizierung auf der Ebene der Fragmentionen-Massenspektren (MS2) durchgeführt wird, können Neuropeptide mit geringer Häufigkeit möglicherweise nicht quantifiziert werden, da reichlichere Matrixkomponenten für die Fragmentierung ausgewählt werden können und die ausgewählten möglicherweise nicht hoch genug sind, um quantifiziert zu werden. Mit der Isotopenmarkierung kann die Quantifizierung an jedem identifizierten Peptid durchgeführt werden.
Zusätzlich zur Identifizierung und Quantifizierung können Lokalisierungsinformationen von MS durch MALDI-MS-Bildgebung (MALDI-MSI)10 erhalten werden. Durch Rasten eines Lasers über eine Probenoberfläche können MS-Spektren zu einem Heatmap-Bild für jeden m/z-Wert kompiliert werden. Die Kartierung der transienten Neuropeptidsignalintensität in verschiedenen Regionen über Bedingungen hinweg kann wertvolle Informationen für die Funktionsbestimmungliefern 11. Die Lokalisation von Neuropeptiden ist besonders wichtig, da die Neuropeptidfunktion je nach Standort12 unterschiedlich sein kann.
Neuropeptide kommen in vivo in geringerer Häufigkeit vor als andere Signalmoleküle wie Neurotransmitter und erfordern daher empfindliche Methoden zum Nachweis13. Dies kann durch die Entfernung von Matrixkomponenten mit höherer Häufigkeit, wie z.B. Lipiden11,14, erreicht werden. Zusätzliche Überlegungen für die Analyse von Neuropeptiden müssen im Vergleich zu herkömmlichen Proteomik-Workflows angestellt werden, vor allem, weil die meisten neuropeptidomischen Analysen die enzymatische Verdauung auslassen. Dies schränkt die Softwareoptionen für die Neuropeptid-Datenanalyse ein, da die meisten mit Algorithmen erstellt wurden, die auf Proteomik-Daten und Proteinübereinstimmungen basieren, die durch Peptiddetektion informiert sind. Viele Software wie PEAKS15 eignet sich jedoch aufgrund ihrer De-novo-Sequenzierungsfunktionen besser für die Neuropeptidanalyse. Für die Analyse von Neuropeptiden müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden, angefangen von der Extraktionsmethode bis zur MS-Datenanalyse.
Die hier beschriebenen Protokolle umfassen Methoden zur Probenvorbereitung und Dimethylisotopenmarkierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Neuropeptiden durch LC-ESI-MS, MALDI-MS und MALDI-MSI. Durch repräsentative Ergebnisse aus mehreren Experimenten wird der Nutzen und die Fähigkeit dieser Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Lokalisierung von Neuropeptiden aus blauen Krabben, Callinectes sapidus, demonstriert. Um das Nervensystem besser zu verstehen, werden häufig Modellsysteme verwendet. Vielen Organismen steht kein vollständig sequenziertes Genom zur Verfügung, was eine umfassende Entdeckung von Neuropeptiden auf Peptidebene verhindert. Um diese Herausforderung zu mildern, ist ein Protokoll zur Identifizierung neuartiger Neuropeptide und zum Transkriptom-Mining zur Generierung von Datenbanken für Organismen ohne vollständige Genominformationen enthalten. Alle hier vorgestellten Protokolle können für Neuropeptidproben aus beliebigen Spezies optimiert sowie für die Analyse beliebiger endogener Peptide angewendet werden.
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Protocol
Alle beschriebenen Gewebeproben wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Wisconsin-Madison durchgeführt.
1. LC-ESI-MS-Analyse von Neuropeptiden
- Neuropeptidextraktion und Entsalzung
- Vor der Gewebeentnahme ist angesäuertes Methanol (acMeOH) (90:9:1 MeOH:Wasser:Essigsäure) wie in16 beschrieben herzustellen.
- Sammeln Sie Hirngewebe aus dem Krustentier17 und verwenden Sie eine Pinzette, um sofort jeweils ein Gewebe in eine 0,6-ml-Röhre mit 20 μL acMeOH zu legen.
HINWEIS: Die Protokolle zur Gewebedissektion variieren stark für verschiedene Tiere und Gewebetypen. Der Leser wird auf Protokoll17 verwiesen, um eine detaillierte Beschreibung der Sezierung von Hirngewebe und mehreren anderen Gewebetypen aus dem Krebstier zu erhalten. Die Proben können bis zur Verwendung (idealerweise innerhalb von 6 Monaten) bei -80 °C gelagert werden. Die beschriebenen Volumina werden für ein einzelnes Gehirn von Callinectes sapidus verwendet. Volumina sollten für die Gewebegröße skaliert werden. Gewebe kann sofort ohne Lösungsmittel schockgefroren werden, obwohl dies nicht empfohlen wird, da endogene proteolytische Enzyme nicht gehemmt werden und aktiv bleiben, wenn auch langsamer, wenn sie kalt sind. - 150 μL acMeOH in die Probe geben. Stellen Sie die Gesamtbeschallungszeit auf 24 s, die Pulszeit auf 8 s, die Pausenzeit auf 15 s und die Amplitude auf 50% auf einem Ultraschallhomogenisator ein und homogenisieren Sie die Proben auf Eis.
HINWEIS: Es stehen verschiedene Homogenisierungssysteme zur Verfügung. Passen Sie die Einstellungen und Bedingungen je nach Probentyp und Ausrüstung an. - Zentrifugieren Sie die Probe bei 4 °C bei 20.000 x g für 20 min. Mit einer Pipette den Überstand in ein Rohr geben und in einem Vakuumkonzentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bei ca. 35 °C trocknen.
HINWEIS: Die getrockneten Proben können bis zur Verwendung (idealerweise innerhalb von 6 Monaten) bei -80 °C gelagert werden. Die Erwärmung des Vakuumkonzentrators muss mit Vorsicht erfolgen. Während Hitze die Trocknungszeit verkürzt, muss die Probe sofort nach dem Verdampfen der gesamten Flüssigkeit aus dem Konzentrator entfernt werden, um den Peptidabbau zu minimieren. Um dies zu vermeiden, kann auf die Heizung bei diesem und allen nachfolgenden Schritten verzichtet werden. - Zum Entsalzen die extrahierte Gewebeprobe in 20 μL 0,1% Ameisensäure (FA), Wirbelgut rekonstituieren und in einem Wasserbad bei Raumtemperatur für 1 min beschallen.
HINWEIS: Es stehen verschiedene Entsalzungsmaterialien zur Verfügung. Passen Sie die Lösungen und Volumina entsprechend der Harzidentität und der Neuropeptidmenge an. Die Gesamtpeptidmenge kann unter Verwendung eines kommerziellen Peptidquantifizierungstests geschätzt werden (siehe Materialtabelle). - Tragen Sie 0,5 μL Probe auf einen pH-Streifen auf, um zu bestätigen, dass der pH-Wert 4 <. Wenn der pH-Wert höher ist, fügen Sie 1 μL Aliquots von 10% FA hinzu, bis der pH-Wert 4 <.
- Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers zum Entsalzen18. Es ist eine Benetzungslösung mit 100 μL 50 % Acetonitril (ACN), einer Gleichgewichtslösung mit 100 μL 0,1 % FA, einer Waschlösung mit 100 μL 0,1 % FA und Elutionslösungen mit 20 μL 25 % ACN/0,1 % FA, 20 μL 50 % ACN/0,1 % FA und 20 μL 75 % ACN/0,1 % FA herzustellen.
- Erhalten Sie eine 10 μL Entsalzungsspitze mit C18-Harz (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie die Entsalzungsspitze auf eine 20-μL-Pipette, die auf 15 μL eingestellt ist. Sobald die Entsalzungsspitze nass ist, verhindern Sie, dass Luft durchdringt, indem Sie die Pipette gedrückt halten, wenn sie keine Lösung mehr hat, bis sie entsorgt wird.
- Saugen Sie die Spitze 3x mit Benetzungslösung und 3x mit Gleichgewichtslösung ab. 10x in der Probe abpumpen, gefolgt von 3x Waschen in Waschlösung, wobei jede Wäsche verworfen wird. Eluieren Sie, indem Sie 10x in jeder der Elutionslösungen in der Reihenfolge der Erhöhung von ACN absaugen.
HINWEIS: Elutionfraktionen können für weitere Analysen getrennt oder kombiniert werden. - Die verwendete Entsalzungsspitze entsorgen und die eluierten Neuropeptide in einem Vakuumkonzentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bei ca. 35 °C trocknen.
HINWEIS: Dieser kann bis zum Gebrauch (idealerweise innerhalb von 6 Monaten) bei -80 °C gelagert werden.
- Isotopenmarkierung von Neuropeptiden im Gewebeextrakt
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und wird nur verwendet, wenn eine Quantifizierung gewünscht wird.- Es wird die 2-Plex-Isotopen-Dimethyl-Markierungslösung in einem Abzug hergestellt: 1%CH2OH2(13,5 μL Stamm 37 Gewichts-/Gewichtsprozentsatz (Gew.-%) in Wasserlösung in 486,5 μL Wasser), 1% CH2OD2 (25 μL Stammlösung mit 20 Gew.-% in 475 μl Wasser) und 0,03 M Boranpyridin (3,75 μL Stammlösung 8 M in 996,25 μL Wasser).
ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig, daher sollten alle Lösungen in einer belüfteten Haube aufbewahrt werden. Tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel, Augenschutz und undurchlässiges Schuhwerk. Kontaktlinsen sollten bei der Arbeit mit diesem Material nicht getragen werden.
HINWEIS: Es gibt verschiedene Isotopenreagenzien; Wählen Sie die entsprechenden basierend auf dem Probentyp und der Anzahl der gewünschten Etikettierkanäle aus. - Roher Neuropeptidextrakt in 10 μL Wasser und Ultraschall für 10 min auflösen.
- 10 μL einer anderen Isotopen-Formaldehydlösung (d. h. CH2OH2, CH2OD2 usw.) zu jeder anderen experimentellen Bedingung hinzufügen,die quantitativ gemessen werden soll. Vortex, um gut zu mischen und jede Probe kurz bei 2.000 x g zentrifugieren.
- 10 μL 0,03 M Boranpyridin in jedes Probenröhrchen geben. Vortex, um gut zu mischen und jede Probe kurz bei 2.000 x g zentrifugieren.
- Die Proben 15 min bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.
- Entfernen Sie die Proben aus dem Wasserbad und fügen Sie 10 μL 100 mM Ammoniumbicarbonat hinzu. Vortex, um gut zu mischen und jede Probe kurz bei 2.000 x g zentrifugieren.
- Kombinieren Sie die markierten Proben zu einer 2-Plex-Probe und trocknen Sie die Neuropeptide in einem Vakuumkonzentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bei ca. 35 °C.
- Entsalzen Sie die markierten Neuropeptide, indem Sie die Schritte 1.1.5 - 1.1.10 wiederholen und lagern Sie sie, bis sie für die Datenerfassung bereit sind.
- Es wird die 2-Plex-Isotopen-Dimethyl-Markierungslösung in einem Abzug hergestellt: 1%CH2OH2(13,5 μL Stamm 37 Gewichts-/Gewichtsprozentsatz (Gew.-%) in Wasserlösung in 486,5 μL Wasser), 1% CH2OD2 (25 μL Stammlösung mit 20 Gew.-% in 475 μl Wasser) und 0,03 M Boranpyridin (3,75 μL Stammlösung 8 M in 996,25 μL Wasser).
- Datenerfassung
- Rekonstituieren Sie die getrockneten entsalzten Neuropeptide in 12 μL von 3% ACN / 0,1% FA, wirbeln Sie gut, beschallen Sie in 37 ° C Wasserbad für 1 min und zentrifugieren Sie kurz bei 2.000 x g. Übertragen Sie jede Probe in Autosampler-Fläschchen.
HINWEIS: Stellen Sie das Probenvolumen entsprechend der Neuropeptidmenge auf eine Konzentration von ~ 1 μg Peptid pro μL ein. Die Gesamtpeptidmenge kann unter Verwendung eines kommerziellen Peptidquantifizierungstests geschätzt werden (siehe Materialtabelle). - Verwenden Sie einen Autosampler, um 1 μL Probe in ein hochauflösendes Nano-LC-MS/MS-Gerät zu injizieren (siehe Materialtabelle).
- Verwenden Sie eine ca. 15 cm lange C18-Säule mit umgekehrter Phase (RP) (siehe Materialtabelle), um die Probe mit 0,1% FA in Wasser als mobile Phase A und 0,1% FA in ACN als mobile Phase B auszuführen. Führen Sie die Proben mit einem Gradienten von 3% - 95% von B mit einer Rate von 300 nL/min für mehr als 11 min aus.
- Verwenden Sie für das hier verwendete MS-Gerät die üblichen MS-Bedingungen von 2,00 kV für die Sprühspannung und 275 °C für die Kapillartemperatur.
- Erfassen Sie MS-Spektren im Bereich von 200 - 2.000 m/z mit einer Auflösung von 60.000, einem Automatic Gain Control (AGC)-Target von 1 x 106 und einer maximalen Ioneninjektionszeit (IT) von 150 ms.
- Wählen Sie die 15 intensivsten Ionen (Mindestintensität von 3,2 x 104) für eine HCD-Fragmentierung (Collision Dissociation) mit höherer Energie unter Verwendung einer normalisierten Kollisionsenergie von 30, eines Isolationsfensters von 2,0 m/z, einer Auflösung von 15.000, eines AGC-Ziels von 2 x 105 und einer maximalen IT von 250 ms.
- Legen Sie ein dynamisches Ausschlussfenster von 30 s fest. Schließen Sie Ionen mit einer Ladung von 1 oder ≥ 8 und Ionen mit nicht erkannten Ladungszuständen aus.
- Rekonstituieren Sie die getrockneten entsalzten Neuropeptide in 12 μL von 3% ACN / 0,1% FA, wirbeln Sie gut, beschallen Sie in 37 ° C Wasserbad für 1 min und zentrifugieren Sie kurz bei 2.000 x g. Übertragen Sie jede Probe in Autosampler-Fläschchen.
- Identifizierung und Quantifizierung von Neuropeptiden
HINWEIS: Viele Software für die Datenbanksuche und Peptidquantifizierung (sowohl Open-Source als auch kommerziell) ist verfügbar. Hier kommt PEAKS Studio (Proteomik-Software)15 zum Einsatz.- Führen Sie die Datenbanksuche mit den in 1.4.2 - 1.4.6 beschriebenen Schritten durch.
- Erstellen Sie ein neues Projekt und fügen Sie die LC-MS-Daten hinzu, indem Sie Keine für das Enzym, Orbitrap für das Instrument, HCD für das Fragment und datenabhängige Erfassung (DDA) für die Erfassung auswählen.
HINWEIS: Wählen Sie die entsprechenden Parameter basierend auf den Datenerfassungsparametern aus. - Wählen Sie Identifikationen und dann Korrekter Vorläufer [DDA] und Nur Masse aus.
- Wählen Sie Datenbanksuche und legen Sie eine Fehlertoleranz von 20,0 ppm fest, wobei die Monoisotopenmasse für die Vorläufermasse und 0,02 Da für die Fragmentionenmasse, Keine für den Enzymtyp, Unspezifisch für den Aufschlussmodus, 100 für die maximal verpassten Spaltungen und die folgenden variablen PTMs mit der maximal zulässigen Variablen PTM pro Peptid von 3 verwendet werden: Amidation, Oxidation (M), Pyro-Glu von E, und Pyro-glu von Q.
- Wählen Sie die Neuropeptid-Datenbank, schätzen Sie die False-Discovery-Rate (FDR) mit Lockvogel-Fusion.
HINWEIS: Der Massentoleranzfehler sollte an die erfassten Daten angepasst werden. Verwenden Sie die entsprechende Datenbank für den Beispieltyp. Wenn kein Enzym ausgewählt ist, hat der Parameter max missed cleavages keinen Einfluss auf die Suche. Eine große Anzahl von verpassten Spaltungen ist jedoch erforderlich, wenn die Software nicht über den nicht spezifizierten Digest-Modus als Option verfügt. - Wenn eine kennzeichnungsfreie Quantifizierung gewünscht ist, wählen Sie Quantifizierung, wählen Sie Etikettenfrei und legen Sie eine Fehlertoleranz von 20,0 ppm und eine Verweilzeittoleranz von 1,0 min fest.
- Führen Sie eine Vorläuferionenquantifizierung durch, wenn Schritt 1.2 für die Isotopenmarkierung durchgeführt wurde.
- Wählen Sie Quantifizierung, wählen Sie Vorläufer-Ionenquantifizierung, verwenden Sie einen Aufbewahrungszeitbereich von 1,0 min und verwenden Sie einen FDR-Schwellenwert von 1 %.
- Wählen Sie im Dropdown-Menü Methode auswählen eine voreingestellte oder benutzerdefinierte Quantifizierungsmethode aus.
- Um eine neue benutzerdefinierte Methode zu erstellen, klicken Sie auf Fenster > Konfiguration > Label Q-Methode > Neu. Benennen Sie die neue Methode, und wählen Sie Vorläufer-Ionenquantifizierung für Methodentyp aus. Wählen Sie Zeile hinzufügen und dann Änderung aus der Liste PTM-Optionen aus.
- Fügen Sie die LC-MS-Daten hinzu und wählen Sie Referenzbedingung, um die Modifikation von Neuropeptiden aus der Kontrollbedingung des Experiments zu sein.
- Werten Sie die Suchergebnisse wie in den Schritten 1.4.9 - 1.4.11 beschrieben aus.
- Filtern Sie die Ergebnisse über die Registerkarte Zusammenfassung für Peptide und Proteine mit -10lgP ≥ 20, wählen Sie ≥ 1 einzigartiges Peptid aus und wählen Sie das Feld mit der Bezeichnung Mit signifikanten Peptiden aus.
- Bewerten Sie die Suchergebnisse der Datenbank, wobei Protein.csv für Neuropeptididentifikationen und Peptid.csv für Neuropeptidfragmentidentifikationen steht.
- Überprüfen Sie die Datenbanksuche auf Protein- und Peptidwerte, Massengenauigkeit und Sequenzabdeckung.
HINWEIS: Jede Datenbanksuchsoftware verwendet eindeutige Bewertungsalgorithmen und muss möglicherweise entsprechend bewertet werden. Die Identifizierungen können durch manuelle Inspektion der beobachteten Spektren auf identifizierte Peptide, die die vollständige Fragmentionenreihe enthalten, ausgewertet werden.
2. MALDI-MS-Spotting-Analyse von Neuropeptiden
- Probenvorbereitung
- Befolgen Sie Schritt 1.1 oder die Schritte 1.1 - 1.2, wenn eine Quantifizierung gewünscht ist, mit Ausnahme von Schritt 1.2.8 (eine Entsalzung nach der Isotopenmarkierung ist vor der MALDI-MS-Analyse nicht erforderlich).
- Rekonstituieren Sie die getrockneten entsalzten Neuropeptide in 5 μL von 0,1% FA, wirbeln Sie gut, beschallen Sie in einem 37 ° C Wasserbad für 1 min und zentrifugieren Sie kurz bei 2.000 x g.
- Zur Schmierblutung von Neuropeptiden in Krebstiergeweben werden 150 mg/ml 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) in 50% Methanol (MeOH)/0,1% FA (v/v) als Matrix hergestellt.
- Pipettieren Sie einen 3 μL-Tropfen der Probe auf einen hydrophoben Film (siehe Materialtabelle) und pipettieren Sie 3 μL der Matrix direkt auf den Probentropfen. Pipette auf und ab zum Mischen.
- Pipette 1 μL der 1:1 Probe: Matrixmischung in eine Vertiefung der MALDI Edelstahl-Zielplatte. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um jede Mischung an den Rändern der Probe gut zu verteilen. Die Probe muss die Kanten der Bohrlochgravur berühren, um eine gleichmäßige Verteilung zu ermöglichen (Abbildung 4A).
- Spot 1 μL 1:1 Kalibrat:Matrix-Gemisch (kommerzielle oder kundenspezifische Kalibriermischung, Polymermaterialien (d. h. roter Phosphor, der in MeOH gelöst ist) oder übliche Matrix-Cluster-Ionen)12 in eine Vertiefung in der Nähe der Probe.
HINWEIS: Roter Phosphor muss vor dem Spotten nicht mit Matrix gemischt werden.
- Datenerfassung
- Setzen Sie die Zielplatte mit getrockneten Probenflecken in das MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF)-Instrument ein (siehe Materialverzeichnis).
- Stellen Sie für die DHB-Matrix die Laserleistung auf 95 % ein, wählen Sie den Bewegungsmodus "Automatic Optimal Detector Gain" und "Smart - Complete Sample Carrier". Erfassen Sie MS-Spektren im Bereich von 200 - 3200 m/z und addieren Sie mehrere Spektren von jedem Punkt zusammen, um das Signal-Rausch-Verhältnis von Neuropeptiden zu erhöhen.
HINWEIS: Optimieren Sie die prozentuale Laserleistung, die Detektorverstärkung und wählen Sie den geeigneten Probenträgerbewegungsmodus, damit jede Aufnahme ungefähr den gesamten Punkt abdeckt und nachfolgende Erfassungen nicht an die vorherigen Positionen gehen. - Kalibrieren Sie das Instrument.
HINWEIS: Passen Sie den Massenbereich so an, dass er den gewünschten Neuropeptidbereich umfasst.
- Datenanalyse
- Öffnen Sie die Datei MALDI-MS in der Datenanalysesoftware (siehe Materialverzeichnis) und klicken Sie auf Baseline Subtraction für die hier verwendete Software.
- Führen Sie die Spitzenauswahl durch, indem Sie auf Massenliste suchen klicken. Wenn es zu wenige Spitzen gibt, bearbeiten Sie die Massenliste manuell, indem Sie Massenliste bearbeiten auswählen und auf Spitzen im Spektrum klicken, um sie der Massenliste hinzuzufügen.
- Führen Sie einen genauen Massenabgleich durch, indem Sie die Massenliste mit der Neuropeptiddatenbank vergleichen, die [M + H] + m / z-Werte enthält (± 200 ppm Fehler).
HINWEIS: Gewöhnliche Salzaddukte wie [M+K]+, [M+Na]+ und [M+NH4]+, sollten ebenfalls in die Liste der genauen Massenanpassungsziele aufgenommen werden. - Um die identifizierten Spitzen zu überprüfen, generieren Sie eine Liste von m/z von Interesse und führen Sie MS/MS-Experimente durch.
3. MALDI-MS bildgebende Analyse von Neuropeptiden
- Probenvorbereitung
HINWEIS: Einbettungs- und Schnittschritte sind für Gewebe, die zu dünn sind, um geschnitten zu werden, nicht erforderlich.- Füllen Sie einen halben Kryostatenbecher mit Gelatine (37 °C, 100 mg/ml in entionisiertem Wasser) und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur erstarren. Übrig gebliebene flüssige Gelatine in einem 37 °C warmen Wasserbad aufbewahren.
- Sammeln Sie das gewünschte neuronale Gewebe vom Tier und verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe sofort in eine 0,6 ml Röhre mit deionisiertem Wasser für 1 s zu tauchen.
HINWEIS: Siehe Schritt 1.1.2 HINWEIS für die Dissektion von neuronalem Gewebe. - Legen Sie das Gewebe auf die feste Gelatine und füllen Sie den Rest des Kryostatbechers mit flüssiger Gelatine. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zu positionieren.
- Den Kryostatenbecher auf eine ebene Fläche stellen und mit Trockeneis einfrieren.
HINWEIS: Lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung (idealerweise innerhalb von 6 Monaten). - Für die Schnittvorbereitung trennen Sie die in Gelatine eingebettete Probe von der Kryostatform, indem Sie die Form wegschneiden.
- Montieren Sie das eingebettete Gewebe auf ein Kryostat-Futter, indem Sie ein 1 ml Tröpfchen deionisiertes Wasser auf das Futter pipettieren und das eingebettete Gewebe sofort auf das Tröpfchen drücken.
- Nach dem Einfrieren pipettieren Sie mehr deionisiertes Wasser um das Gewebe, um es weiter am Spannfutter zu befestigen. Führen Sie diese Schritte in der Kryostatenbox (siehe Materialtabelle) aus, die auf -20 °C eingestellt ist.
- Schneiden Sie das Gewebe mit einer ungefähren Dicke von einer Zelle (8-20 μm je nach Probentyp) und montieren Sie jeden Abschnitt auf einem mit Indiumzinnoxid (ITO) beschichteten Glasobjektträger, indem Sie eine Seite des Objektträgers in der Nähe des Abschnitts platzieren und einen Finger auf die andere Seite des Objektträgers legen, um das Glas langsam zu erwärmen und den Abschnitt am Objektträger haften zu lassen.
HINWEIS: Gewebeschnitte können auch aufgetaut werden, indem eine Kante der Gelatine mit einer Pinzette (gekühlt auf -20 ° C) aufgenommen wird, sie auf den ITO-beschichteten Glasträger gelegt und ein Finger auf die andere Seite des Objektträgers gelegt wird, um das Glas langsam zu erwärmen und den Abschnitt am Objektträger haften zu lassen. - Erkennen Sie die Probe, die als Kalibrant verwendet werden soll (siehe Schritt 2.1.6 für Kalibrantoptionen), indem Sie mit einem hydrophoben Pen einen kleinen Kreis in der Nähe des Gewebeabschnitts zeichnen und das Kalibrant innerhalb des Kreises erkennen.
- Markieren Sie jede Ecke der Folie mit einem Whiteout-Stift mit einer kleinen Form, die scharfe Kanten (z. B. x) enthält, die als Teach-Punkte verwendet werden sollen.
- Legen Sie das Glasdia in die MALDI Diaadapterplatte und machen Sie einen hochauflösenden (≥2400 DPI) optischen Bildscan mit einem Scanner.
- Sprühmatrix auf den Gewebeschnitt mit einem automatisierten Sprühgerät (siehe Materialtabelle für Sprühdetails und Anweisungen).
- Für MSI von Neuropeptiden in Krebstiergeweben verwenden Sie 40 mg / ml DHB in 50% Methanol / 0,1% FA (v / v) als Matrix, stellen Sie die Düsentemperatur auf 80 ° C, die Geschwindigkeit auf 1.250 mm / min, die Durchflussrate auf 0,1 ml / min, die Anzahl der Durchgänge auf 12 und 30 s zwischen jedem Durchgang für das automatische Sprühgerät ein.
- Datenerfassung
- Setzen Sie die vollständig getrocknete Zielplatte ein, die aufgetaute Gewebeabschnitte enthält, die mit der Matrix besprüht wurden.
- Richten Sie die Parameter der MS-Bildaufnahmedatei so ein, dass der Laserdurchmesser kleiner als die Rasterschrittgröße ist.
- Laden Sie das gescannte optische Bild und kalibrieren Sie die Probenplatte mit den x Teach-Punkten. Definieren Sie die interessierenden Gewebebereiche, die etwas größer als der tatsächliche Gewebeabschnitt gemessen werden sollen, um auch Bereiche einzubeziehen, die nur Matrix enthalten.
- Kalibrieren Sie das Gerät und erfassen Sie Spektren im Bereich von 200 - 3200 m/z. Passen Sie den Massenbereich so an, dass er den gewünschten Neuropeptidbereich umfasst.
- Datenanalyse
- Um Daten zu verarbeiten, importieren Sie den MS-Imaging-Datensatz in die gewünschte Software, wählen Sie einen Algorithmus zum Entfernen der Baseline aus und normalisieren Sie die Daten mithilfe der Gesamtzahl der Ionen.
HINWEIS: Die Auswahl verschiedener Normalisierungsalgorithmen, wie z. B. Median, RMS-Wert (Root Mean Square) oder die Intensität eines m/z-Referenzwerts, wird wahrscheinlich die räumliche Verteilung vieler m/z-Werte verändern. Wählen Sie den Normalisierungsalgorithmus, der für die gewünschten Analyten am besten geeignet ist. - Um ein Bild für jeden m/z-Wert aus einer theoretischen Peakliste zu generieren, laden Sie eine CSV-Datei (Comma-Separated Values) hoch, die Neuropeptide [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+ usw. enthält. Rufen Sie m/z-Werte ab, indem Sie auf Datei > > Spitzenliste importieren klicken. Nennen Sie die Peak-Liste.
- Um die geeignete ppm-Fehlerschwelle abzuschätzen, identifizieren Sie zunächst manuell einen Neuropeptid-Peak im MS-Spektrum und vergleichen Sie ihn mit der theoretischen Masse des Neuropeptids. Berechnen Sie den ppm-Fehler, und klicken Sie auf Datei- > Dateieigenschaften > Intervallbreite und ppm-Eingabefehler.
- Wählen Sie die Peak-Liste aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf m/z-Bilder für jedes Intervall der Peak-Liste erstellen.
- Speichern Sie jedes m/z-Bild, indem Sie auf Screenshot jedes m/z-Bildes speichern klicken.
HINWEIS: Die mutmaßliche Identifizierung von Neuropeptiden kann durchgeführt werden, indem m / z-Bilder identifiziert werden, bei denen das Analytsignal nur innerhalb des Gewebes und nicht in der umgebenden Matrix lokalisiert ist. - Um die Spitzenidentität zu überprüfen, generieren Sie eine Liste interessanter m/z und führen Sie MS/MS-Experimente durch.
- Um Daten zu verarbeiten, importieren Sie den MS-Imaging-Datensatz in die gewünschte Software, wählen Sie einen Algorithmus zum Entfernen der Baseline aus und normalisieren Sie die Daten mithilfe der Gesamtzahl der Ionen.
4. Entdeckung neuartiger mutmaßlicher Neuropeptide mittels De-novo-Sequenzierung
- Führen Sie die Schritte 1.4.2 - 1.4.5 aus.
- Exportieren Sie de novo only Peptide.csv aus der PEAKS-Software mit einem durchschnittlichen ALC-Score (Local Confidence) von ≥ 75.
HINWEIS: Es gibt viele Software, um De-novo-Sequenzierung durchzuführen, jede mit ihren eigenen Scoring-Algorithmen und sollte entsprechend bewertet werden. - Durchsuchen Sie die Peptidliste nach bekannten Sequenzmotiven, die auf Neuropeptide hinweisen, die zu bestimmten Neuropeptidfamilien gehören19.
HINWEIS: Während Motive in der Regel artübergreifend gut konserviert sind, sollten die gesuchten Motive unter Berücksichtigung des Probenorganismus ausgewählt werden.
5. Transkriptom-Mining für vorhergesagte Neuropeptidsequenzen
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und wird nur verwendet, um eine vorhandene Neuropeptiddatenbank hinzuzufügen oder eine neue Neuropeptiddatenbank zu erstellen.
- Wählen Sie eine bekannte Preprohormon-Aminosäuresequenz von Interesse und verwenden Sie tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
_LOC=blasthome), um die Präprohormonsequenz der Abfrage anhand von Datenbanken wie nr/nt, Refseq_genomes, EST und TSA zu durchsuchen.
HINWEIS: Um Abfragesequenzen anhand der Proteindatenbank zu durchsuchen, verwenden Sie BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).- Wählen Sie den Zielorganismus (Steuer-ID) aus und ändern Sie die Parameter des Algorithmus "Schwellenwert erwarten" in 1000, um Low-Score-Ausrichtungen einzubeziehen.
- Führen Sie das BLAST-Programm aus, und überprüfen Sie dann die Ergebnisse auf hohe Homologiewerte zwischen Abfrage- und Subjektsequenzen, die zu signifikanten Ausrichtungen führen. Speichern Sie die FASTA-Datei mit der Nukleotidsequenz.
HINWEIS: Wenn es mehrere Subjektsequenzen mit ähnlichen Homologiewerten gibt, führen Sie eine MAFT-Ausrichtung durch, um die mutmaßlichen Sequenzen20,21 einzugrenzen.
- Übersetzen Sie die Präprohormon-Nukleotidsequenz in Präprohormon-Peptidsequenzen mit dem Expasy Translate-Tool (https://web.expasy.org/translate/). Für C. sapidus wählen Sie Invertebrate Mitochondrial für genetischen Code.
- Überprüfen Sie die Signalpeptidsequenz und die Prohormonspaltungsstellen in den Peptidsequenzen mit SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
HINWEIS: Die Homologie zu bekannten Präprohormon-Verarbeitungsschemata kann auch verwendet werden, um Prohormon-Spaltungsstellen zu identifizieren. Mögliche posttranslationale Modifikationen für Signalpeptide können auf Wunsch vorhergesagt werden. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) kann verwendet werden, um den Sulfatierungszustand von Tyrosinresten vorherzusagen. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) kann verwendet werden, um die Konnektivität von Disulfidbindungen vorherzusagen.
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Representative Results
Der Workflow für die Probenvorbereitung und MS-Analyse ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Dissektion von neuronalem Gewebe werden Homogenisierung, Extraktion und Entsalzung durchgeführt, um Neuropeptidproben zu reinigen. Ist eine isotopenmarkierungsbasierte Quantifizierung gewünscht, werden die Proben markiert und erneut entsalzt. Die resultierende Probe wird mittels LC-MS/MS zur Identifizierung und Quantifizierung von Neuropeptiden analysiert.
Neuropeptide, die durch die Proteomik-Software identifiziert wurden, sollten eine gute Peptidfragmentierungssequenzabdeckung aufweisen, die jedoch nicht global definiert oder standardisiert ist. Zur absoluten Identifizierung sollte jede Aminosäure ein Fragment erzeugen, das eine eindeutige Identifizierung und Lokalisierung ermöglicht. Dies muss auch mit einem synthetisierten Peptid verglichen werden, um die Intensität jedes Fragments zu bestätigen. Da die Kosten für die Durchführung bei jeder mutmaßlichen Identifizierung nicht machbar sind, wird die Identifizierung häufig auf der Grundlage des Vertrauens beschrieben, wobei mehr beobachtete Fragmentionen das Vertrauen in die Peptididentifizierung erhöhen. Während Abbildung 2A,B zwei Neuropeptide zeigt, die beide mit einer 100%igen Sequenzabdeckung und einem niedrigen Massenfehler identifiziert wurden, wie durch die maximale Grenze von 0,02 Da definiert, verringert die schlechte Fragmentierungsabdeckung (von nur drei Ionen), die nur für das Neuropeptid in Abbildung 2B beobachtet wurde, das Vertrauen in die Identifizierung einer spezifischen Isoform. Abbildung 2C zeigt die extrahierten Ionenchromatogramme (XICs), bei denen es sich um ein Diagramm handelt, das die Signalintensität eines ausgewählten m/z-Wertes als Funktion der Retentionszeit eines Neuropeptids enthält, das in zwei für LFQ verwendeten Proben nachgewiesen wurde. Die Retentionszeiten für das Neuropeptid unterscheiden sich geringfügig, da es in zwei getrennten und aufeinanderfolgenden Durchläufen identifiziert wurde; Die Differenz liegt jedoch innerhalb des zuverlässigen Schwellenwerts von 1 min. Somit wird das Verhältnis zwischen der softwareberechneten Fläche unter der Kurve aus dem XIC für den LFQ dieses Neuropeptids verwendet.
Für die Quantifizierung von dimethylmarkierten Neuropeptiden sollte das MS1-Spektrum einen Peak am theoretischen Neuropeptid-m/z-Wert und einen Peak am m/z-Wert mit einer Massenverschiebung enthalten, die mit der Massendifferenz zwischen den verwendeten Isotopenmarkierungsreagenzien korreliert. In Abbildung 2D beträgt die Massenverschiebung dieser 2-Plex-Dimethyl-markierten Probe 4,025 Da. Die Fläche unter der Kurve des Vorläuferions aus seinen XICs wird dann von der Software berechnet und zur Berechnung relativer Abundanzverhältnisse verwendet. Eine vereinfachte Version der Exporttabelle der Proteomik-Software, die identifizierte Neuropeptide und ihre LFQ-Verhältnisse enthält, ist in Tabelle 1 dargestellt. Ähnliche Ergebnisse werden für isotopenmarkierte Neuropeptide erzielt.
Softwarealgorithmen ermöglichen die De-novo-Sequenzierung von Spektren zum Nachweis neuartiger mutmaßlicher Neuropeptide. Wenn man den Nachweis von mutmaßlich neuartigen Neuropeptiden behauptet, sind Identifizierungen mit hoher Konfidenzsicherheit ideale Fälle, in denen alle Aminosäuren eindeutig identifiziert und lokalisiert werden, basierend auf der Fragmentbeobachtung. Abbildung 3 zeigt das Spektrum eines De-novo-sequenzierten Peptids , das das -RYamid-Motiv am C-Terminal enthält, ein konserviertes Sequenzmotiv, das von bekannten Neuropeptiden der Krebstier-RYamid-Familiegeteilt wird 22. Ein Peptid wurde aus der Datenbank mit 100% Sequenzabdeckung abgeglichen, alle aminosäurebildenden Fragmentionen beobachtet, geringer Fragmentionenmassenfehler gemäß der maximalen Grenze von 0,02 Da und enthielt ein Gaußsches Elutionsprofil. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein endogenes Peptid der Krebstier-RYamid-Neuropeptidfamilie beobachtet wurde.
MALDI-MS-Spotmessungen können Neuropeptididentifikationen liefern, die die LC-ESI-MS-Identifizierung ergänzen und höhere Durchsatzfähigkeiten bieten. Nachdem Rohgewebehomogenat für Neuropeptide extrahiert, entsalzt und markiert wurde (falls gewünscht), kann die Probe mit Matrix gemischt und auf der MALDI-Edelstahl-Zielplatte gefleckt werden, wie in Abbildung 4A gezeigt. Das erfolgreiche Pipettieren homogener Probenspots erzeugt eindeutig aufgelöste Peaks, insbesondere innerhalb des Kalibrierspektrums (Abbildung 4B). Bei Verwendung eines MALDI-TOF-Instruments muss das Gerät zu Beginn jedes Experiments kalibriert werden. Alle Analyten mit bekannten Massen können verwendet werden, um das Gerät zu kalibrieren, wenn es sich innerhalb des gewünschten Massenbereichs der Probe befindet. Hier wird roter Phosphor für die positive Ionenmassenkalibrierung des Instruments verwendet. Es hat Vorteile gegenüber der Verwendung von Peptidkalibriermischungen aufgrund seiner Stabilität bei Raumtemperatur, billigen Kosten, reichlich Peaks aufgrund seiner Polymerisation, hohes Signal-Rausch-Verhältnis und es benötigt keine Matrix für die Ionisation.
Für die MALDI-MS-Bildgebung von Neuropeptiden erfordert das verwendete MALDI TOF/TOF-Gerät eine manuelle Bildkalibrierung des ITO-beschichteten Objektträgers (Schritt 3.1.10), um das optische Bild mit der Probe zu korrelieren. Das Diagramm in Abbildung 5 zeigt die richtige Platzierung der Whiteout-Fadenkreuze, die als Teach-Punkte verwendet werden sollen, damit das Gerät das gescannte optische Bild mit der tatsächlichen Probenplatte korrelieren kann. Es veranschaulicht auch Bereiche des ITO-beschichteten Objektträgers, die vom Benutzer vermieden werden sollten (dh keine Probe oder Matrix enthalten). Bei der Massenkalibrierung wirkt sich die Platzierung des Kalibrierprobenflecks relativ zur Gewebeprobe auf dem ITO-beschichteten Objektträger aufgrund der inhärenten Natur von Time-of-Flight-Massenanalysatoren direkt auf den Massenfehler aus, obwohl das Ausmaß dieses Problems von der Häufigkeit der Zielanalyten abhängt. Eine Lösung für dieses Problem besteht darin, Peaks aus den MS1-Spektren aus verschiedenen Gewebeabschnitten manuell auf Hinweise auf eine Peakverschiebung zu überprüfen. Wenn es zu einer Spitzenverschiebung kommt, sollten Sie zusätzliche Massenkalibrierungspunkte auf dem ITO-beschichteten Objektträger direkt neben jedem Gewebeabschnitt hinzufügen. Von dort aus kann der Benutzer die Spektren der Kalibrierungspunkte zusammen mitteln oder MS-Bildgebung an jeweils einem Gewebeabschnitt durchführen, wobei nur der Kalibrierungspunkt verwendet wird, der dem Gewebeabschnitt am nächsten ist. Nachdem die Probe entnommen wurde, überprüfen Sie, ob das Signal von m / z-Werten , die Neuropeptiden entsprechen, nur innerhalb der Geweberegion lokalisiert ist (Abbildung 6), bevor Sie eine mutmaßliche Neuropeptididentifizierung zuweisen.
Abbildung 1: Arbeitsablauf zur Vorbereitung von Neuropeptidproben für die Massenspektrometrie-Analyse. Für die Gewebeextraktanalyse wird Rohgewebehomogenat entsalzt, mit stabilen Isotopenmarkierungen markiert, erneut entsalzt und mittels MS analysiert. Für die bildgebende Analyse wird intaktes Gewebe eingebettet, kryosektiert, mit Matrix aufgetragen und von MALDI-MSI analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Identifizierung und Quantifizierung durch die Proteomik-Software. Neuropeptide werden durch Spektren von Bereichsqualität mit (A) guter oder (B) schlechter MS2-Fragmentierungsabdeckung nachgewiesen. Der Fehler bei der Übereinstimmung der Fragmentmasse ist unterhalb der Spektren dargestellt. (C) XIC-Profilformen und Retentionszeit (RT) können manuell auf Neuropeptide untersucht werden, die durch LFQ quantifiziert werden. (D) MS1-Spektren werden verwendet, um dimethylmarkierte Neuropeptide nachzuweisen und zu quantifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: De-novo-Sequenzierung für den neuartigen Nachweis von Neuropeptiden . (A) Das MS2-Spektrum eines mutmaßlichen neuartigen RYamids zeigt eine gute Fragmentierungsabdeckung mit geringem Massenfehler für jedes Fragment. (B) Die identifizierten Fragmente werden für die manuelle Inspektion aufgelistet. (C) Der XIC des neuartigen Neuropeptids wird manuell auf Gaußsche Peakform untersucht. Abkürzungen: RT = Verweilzeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: MALDI-MS-Spots und Kalibrierspektrum. (A) Die MS-Spektrenqualität beruht auf einer gleichmäßigen Matrix-Peptid-Verteilung im MALDI-Edelstahl-Zielbohrloch. Die linken drei Flecken sind Beispiele für gute Stellen, die die Kanten der Brunnengravur berühren, und die rechten drei Flecken sind Beispiele für schlechte Stellen. Beide Spots enthalten α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) -Matrix und eine Peptid-Standardmischung. (B) Kalibrierspektrum mit roten Phosphorclustern von 500 - 3200 m/z. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Darstellung des ITO-beschichteten Objektträgers. (A) Schematische Darstellung mit wichtigen Bereichen: Positionen zum Platzieren von Gewebeschnitten (hellblaue Rechtecke), automatische Teach-Point-Positionen, die vermieden werden sollten (rote Rechtecke), Beispielstellen, an denen Teach-Punkte gezeichnet werden können (weißes Fadenkreuz) und wo Schrauben an der Adapterplatte befestigt und vermieden werden sollten (dunkelblaue Ovale). (B) Foto eines Glasobjektträgers mit zwei Gewebeabschnitten, einer Stelle mit einer Kalibriermischung und Fadenkreuzspuren. Die Lage des Gewebeschnitts und der Kalibrierungspunkte sind auf der anderen Seite des Glasobjektträgers umrissen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: MS-Bilder von C. sapidus sinus drüsen. Neuropeptid [M+H]+ Ionenverteilungsbilder von (A) HL/IGSL/IYRamid (m/z 844.48), (B) Allatostatin A-Typ NPYAFGLamid oder GGPYAFGLamid (m/z 780.40), (C) Allatostatin A-Typ GQYAFGLamid (m/z 754.39) und (D) RFamid GRNFLRFamid (m/z 908.52) sind gezeigt. Bilder werden unter Verwendung eines ± 50-S./Min.-Fensters aus dem theoretischen m/z-Wert generiert. Der Farbbalken zeigt den Bereich der Signalintensität von 0 bis 100% an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Datenbanksuche und LFQ-Ergebnisse Neuropeptide, die durch LC-MS und Proteomik-Software identifiziert und quantifiziert wurden. Identifizierte PTMs werden zusammen mit den Intensitäten der nachgewiesenen Peptide in beiden Proben für LFQ zusammen mit dem resultierenden LFQ-Verhältnis aufgeführt. Die durchschnittlichen Massen und beobachteten Neuropeptidbeschreibungen aus der FASTA-Datei werden aufgelistet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die genaue Identifizierung, Quantifizierung und Lokalisierung von Neuropeptiden und endogenen Peptiden im Nervensystem sind entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion23,24. Die Massenspektrometrie ist eine leistungsstarke Technik, mit der all dies auch in Organismen ohne vollständig sequenziertes Genom erreicht werden kann. Die Fähigkeit dieses Protokolls, Neuropeptide aus Gewebe, das von C. sapidus durch eine Kombination von LC-ESI- und MALDI-MS gesammelt wurde, nachzuweisen, zu quantifizieren und zu lokalisieren, wird nachgewiesen.
Bei der Probenvorbereitung für die LC-ESI-MS-Analyse müssen Überlegungen angestellt werden. Während MS eine empfindliche Technik ist, stellt die niedrige Peptidkonzentration des neuronalen Gewebes (bis in den femtomolaren Bereich25) eine ernsthafte Einschränkung dar. Eine sorgfältige Probenvorbereitung ist erforderlich, um nicht nur häufiger vorkommende und störende Matrixkomponenten wie Proteine und Lipide zu entfernen, sondern auch den Verlust von Neuropeptiden in jedem Schritt zu minimieren26,27. Zum Beispiel kann der Probenverlust durch die Verwendung von Mikrozentrifugenröhrchen, die der Peptidadsorption widerstehen, reduziert werden. Abhängig von der Zusammensetzung des interessierenden Gewebes kann die Verwendung verschiedener Lösungsmittel (zur Extraktion oder Fällung) oder Festphasenextraktionsmaterialien zur Trennung von Biomolekülen unterschiedlicher Größe und chemischer Eigenschaften verwendet werden. Um sicherzustellen, dass hydrophile oder hydrophobe Peptide im Neuropeptidextrakt vorhanden sind, können optional mehrere Extraktionslösungsmittelsysteme verwendet werden, um Neuropeptide mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften anzugreifen. Diese, zusammen mit der Verwendung von Proteasehemmern, müssen möglicherweise für eine optimierte Reinigung modifiziert werden, um die Neuropeptid-Regeneration zu verbessern28. Die Nachteile der Verwendung mehrerer Extraktionssysteme bestehen darin, dass mehrere neuronale Gewebe gepoolt werden müssen, um eine insgesamt höhere Peptidgehaltsanforderung sowie einen verringerten Durchsatz zu erfüllen. Viele Schritte wie Entsalzen, Isotopenmarkierung und MS-Injektion empfehlen bestimmte Anfangspeptidmengen. Für die Charakterisierung wertvoller Proben, wie z.B. Neuropeptide, werden Peptid-Assays im Allgemeinen vermieden, um den Verbrauch von Fremdpeptiden zu verhindern. Darüber hinaus wurden Peptidassays entwickelt, um die genaue Peptidkonzentration aus Proteinverdauungen zu bestimmen, die andere chemische Eigenschaften als endogene Peptide aufweisen. Um Komplikationen durch unbekannte Neuropeptidkonzentration zu überwinden, kann ein erster Peptidassay mit gepoolten neuronalen Gewebeextrakten durchgeführt werden, wobei die Ergebnisse als Schätzung für alle nachfolgenden Analysen verwendet werden, obwohl zu beachten ist, dass alle Peptide in Lösung gemessen werden, und nicht alle davon sind Neuropeptide29. Weitere Einschränkungen dieser Methode sind mögliche Verzerrungen zu unpolaren und hydrophoben Neuropeptiden und der Mangel an nativer Strukturerhaltung. Modifikationen an Lösungsmittelzusammensetzungen und -materialien, wie z. B. die Verwendung von Lösungen, die hydrophober sind, oder das Weglassen der Verwendung organischer Lösungsmittel, können durchgeführt werden, um dies zu beheben.
MALDI-MS-Messungen beruhen auf sorgfältigen Probenvorbereitungsschritten für konsistente Ergebnisse und können andere Probenüberlegungen aufweisen als bei LC-ESI-MS-Messungen. Schritte wie das Aufbewahren von Neuropeptidextrakt auf Eis vor der MS-Analyse werden weiterhin angewendet. Zusätzliche Methoden zur Verhinderung des Neuropeptidabbaus umfassen das Aufbewahren von Glasobjektträgern mit aufgetauten Gewebeschnitten in einer Trockenmittelbox nach der Dissektion, um zu verhindern, dasssich Kondensation 30 ansammelt, obwohl das Verbleiben der Gewebeprobe im Exsikkator nach dem Trocknen ebenfalls zum Abbau der Probe führen kann. Es wird empfohlen, die Gewebeobjektträger in einen Vakuum-Exsikkator (Enddruck: 1x10-4 Torr bei Raumtemperatur) für 5-10 min unmittelbar vor dem Matrixauftrag zu legen. Nachdem die Matrix auf dem Objektträger abgeschieden wurde, kann sie über Nacht im Kühlschrank oder Gefrierschrank aufbewahrt und vor der MALDI-MS-Bildgebungsmessung im Vakuum-Exsikkator getrocknet werden. Für MALDI-Spotmessungen ist die Matrix-Peptid-Kristallstruktur nicht gleichmäßig über das MALDI-Ziel verteilt, selbst wenn sie so aussieht. Es gibt Möglichkeiten, Massenspektrenvariationen von technischen Replikaten aufgrund dieses Prozesses zu mildern. Erfassen Sie zunächst ein durchschnittliches Spektrum aus jedem Bohrloch mit mehreren Laseraufnahmen (typischerweise Hunderte bis Tausende), bei denen der Laser zufällig über das Bohrloch gerastert wird (d. h. die Auswahl der SMART- oder Random-Sample-Carrier-Bewegung in den Instrumentenparametern). Erfassen Sie mindestens fünf technische Replikate für jeden Probentyp und wählen Sie drei technische Replikate aus, bei denen die Variation der Signalintensität für die gewünschten Spitzen am geringsten ist. Der Kompromiss hier ist der experimentelle Durchsatz. Es ist notwendig, Parameter wie die Anzahl der Laserschüsse, den Laserdurchmesser und andere Instrumenteneinstellungen für alle erfassten Spektren konsistent zu halten. Im Idealfall werden alle technischen Replikate und biologischen Replikate gleichzeitig mit der gleichen Matrixlösung und Instrumentenkalibrierung analysiert. Die Identifizierung von Neuropeptiden kann durch genaue Massenanpassung an eine Peakliste durchgeführt werden, die theoretische [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+ und andere Salzaddukte enthält, die einfach geladene Ionen-M/Z-Werte erzeugen. Die Normalisierung von Daten ist entscheidend für die Minimierung systematischer Artefakte aus MALDI-MS-Experimenten. Die Bewertung der Reproduzierbarkeit ist besonders wichtig, wenn MALDI-MS-Spotmessungen zur Neuropeptidquantifizierung durch stabile Isotopenmarkierung (SIL) verwendet werden. Die Qualität der Probenvorbereitung und Datenerfassung kann bewertet werden, indem ein Peptidstandard- oder Neuropeptidextrakt entnommen, in zwei gleiche Aliquots aufgeteilt, jede Probe durch SIL differenziell markiert und die Probe analysiert wird, um sicherzustellen, dass die relative Intensität der gepaarten Peaks 1: 1 beträgt. Die aus diesen Verhältnissen gemeldete Variation kann verwendet werden, um den Grad der Varianz im Gesamtexperiment zu schätzen, der auf Benutzerfehler zurückzuführen ist.
Es ist wichtig zu beachten, dass MALDI-MS auch in der Lage ist, sequenzielle und quantitative Informationen bereitzustellen; Die einfach geladenen Ionen, die typischerweise durch MALDI erzeugt werden, begrenzen jedoch den Nachweis von Peptidfragmenten, was es schwieriger macht, die vollständige Sequenz zu erhalten und die für LC-ESI-MS diskutierten Quantifizierungsmethoden zu hemmen. Unabhängig davon ist MALDI-MS eine attraktive Modalität aufgrund seiner Fähigkeit für hohen Durchsatz sowie einer höheren Toleranz für Salze und Verunreinigungen in der Probe12,31. Darüber hinaus hat die MALDI-MS-Bildgebung Vorteile gegenüber anderen herkömmlichen bildgebenden Verfahren, die Antikörper erfordern. Bei den meisten MS-Modalitäten erhöht die Senkung der Massenauflösung die Empfindlichkeit und ermöglicht einen verbesserten Nachweis von Neuropeptiden mit geringer Häufigkeit. Diese Strategie kann für MALDI-TOF/TOF-Geräte praktischer sein als für LC-ESI-MS-Geräte, da das MALDI-Gerät für jedes Experiment einfach zu kalibrieren ist. Eine weitere Möglichkeit, wie MALDI für die Neuropeptidomik von Vorteil sein kann, ist die Spektrenmittelung. Typischerweise werden Mittelungsspektren aus LC-ESI-MS-Messungen nicht verwendet, da sie die Vorteile der LC-Trennung zunichte machen. Daher wird bei der Identifizierung von Neuropeptiden stark auf Bioinformatik-Software zurückgegriffen, und die Identifizierungen werden manuell überprüft. Es gibt jedoch weniger Konsequenzen für die Mittelung von Spektren aus MALDI-MS-Messungen, da es keine anfängliche Trennung gab; Daher sind die Rohdaten kleiner und für einen Benutzer einfacher manuell zu durchforsten. Die einfache Datenverwaltung ist wichtig, da sie die Reihenfolge ändert, in der sich der Benutzer den Strategien zur Identifizierung und Verifizierung von Neuropeptiden nähern kann. Während das Vertrauen in Neuropeptid-Identifikationen durch LC-ESI-MS von der Erhöhung der Schwellenwertstringenz innerhalb von Datenanalysesoftware profitieren könnte, ist diese Strategie weniger wahrscheinlich, dass MALDI-MS-Identifikationen zugute kommen. Im Beispiel der Krebstier-Neuropeptide ermöglicht die Tatsache, dass es weniger als 1000 Einträge aus der im Labor erstellten Datenbank gibt (d.h. maximal <1000 Spektralpeaks oder MS-Bilder, die manuell durchgescannt werden müssen), die Möglichkeit, zuerst die MALDI-MS-Daten mit einer großzügigen Massenfehlerschwelle zu filtern und diese Identifizierungen dann manuell zu überprüfen, indem die Isotopenhüllen auf MS1-Ebene untersucht werden. sowie andere Verifizierungsmethoden, die im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" erörtert werden. Beliebte MS-Bildgebungs-Datenanalysesoftware kann einen genauen Massenabgleich mit einer Neuropeptid-Massendatenbank durchführen und die entsprechenden MS-Bilder extrahieren. Für klinisch basierte Forschungsfragen, wie z. B. die Entdeckung von Biomarkern, ist diese Software in der Lage, m / z-Werte zu extrahieren, die für eine Geweberegion von Interesse von Interesse sind (typischerweise als Region of Interest (ROI) -Analyse bezeichnet)32 und statistische Tests durchzuführen, um zu quantifizieren, wie unterschiedlich zwei Geweberegionen sind. Es ist auch erwähnenswert, dass es auch weniger Datenanalyse-Softwareoptionen für MS-Bildgebung als für LC-ESI-MS gibt.
Die Durchführung von LC-ESI-MS-Datenbanksuchen nach Neuropeptiden erfordert üblicherweise die Verwendung von Softwarealgorithmen, die für die Analyse von verdauten Peptiden entwickelt wurden. Daher gibt es Einschränkungen für Software, die unspezifische Enzymdatenbanksuchen durchführen kann, oder die Zeit, die benötigt wird, um die Suche abzuschließen. Derzeit werden endogene Peptidsuchen mit der maximalen Anzahl von verpassten Spaltungen durchgeführt, aber diese Anzahl ist immer noch begrenzt, was zu potenziell verpassten Identifikationen führt. Wenn das Genom für eine Spezies nicht vollständig sequenziert ist, wie bei C. sapidus, kann eine De-novo-Sequenzierung durchgeführt werden, um unbekannte / neuartige Neuropeptide durch bekannte konservierte Neuropeptidsequenzmotive zu identifizieren, obwohl diese Methode keine Neuropeptide identifiziert, die unbekannte Motive haben oder nicht die Motive enthalten, die als Neuropeptid-Familienidentifikatoren verwendet werden19. Zum Beispiel ist WSSMRGAWamid ein Motiv für die Allatostatin-B-Typ-Neuropeptidfamilie19. Hierin liegt die Bedeutung des Transkriptom-Mining für vorhergesagte Neuropeptidsequenzen für Spezies ohne vollständig entschlüsselte Genomsequenz33. Die Identifizierung von Neuropeptiden wird dann bestätigt, indem die mutmaßliche Peptidsequenz synthetisiert und die MS / MS-Spektren aus synthetischem Peptid und biologischem Gewebe verglichenwerden 34. Selbst nachdem eine Sequenz verifiziert wurde, ist manchmal unbekannt, ob es sich um die vollständige Neuropeptidsequenz oder ein Abbauprodukt handelt. Es ist erwähnenswert, dass Unterschiede zwischen MALDI- und ESI-MS-Ionisationsquellen (ESI ist eine weichere Ionisationsmethode als MALDI) zu unterschiedlichen Raten des künstlichen Abbaus (d. H. In-Source-Fragmentierung) führen können. Um zwischen einer abgeschnittenen Version eines Peptids und einem künstlich induzierten (d.h. nicht in vivo) Abbauprodukt zu unterscheiden, muss der Präprohormon-Verarbeitungsweg für dieses Neuropeptid bekannt sein. Da dies oft nicht der Fall ist, sollte eine synthetische Form des Peptids in physiologischen Assays verwendet und auf biologische Aktivität überprüft werden.
Insgesamt kann der hier veranschaulichte Workflow für die Neuropeptidanalyse einer Vielzahl unterschiedlicher Bereiche zugute kommen. Es füllt eine technische Lücke in der mittleren MS-Analyse von Peptiden, da es für endogene Peptide optimiert ist, die kleiner sind als Proteine, die typischerweise durch Bottom-up- oder Top-down-MS-Analysen analysiert werden. Daher sollten die von der Neuropeptidomik verwendeten Probenvorbereitungsmethoden weitgehend auf andere bioaktive endogene Peptide übertragbar sein, wie sie von medizinischen Chemikern auf antibakterielle Eigenschaften abzielen35. Ein Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es gängige Instrumente von beliebten Anbietern verwendet, die auch ein zusätzliches Maß an Übersetzbarkeit bieten. Auf diese Weise kann der Workflow in akademischen und kommerziellen Umgebungen eingesetzt werden, z. B. beim Screening auf pharmazeutische Arzneimittelkandidaten oder Arzneimittelziele.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der National Science Foundation (CHE-1710140 und CHE-2108223) und den National Institutes of Health (NIH) durch den Zuschuss R01DK071801 unterstützt. A.P. wurde zum Teil durch den NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505) unterstützt. N.V.Q. wurde zum Teil von den National Institutes of Health im Rahmen des Ruth L. Kirschstein National Research Service Award des National Heart Lung and Blood Institute an das University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936) unterstützt. L.L. möchte die NIH-Zuschüsse R56 MH110215, S10RR029531 und S10OD025084 sowie die finanzielle Unterstützung durch eine Vilas Distinguished Achievement Professorship und eine Charles Melbourne Johnson Professorship mit Mitteln der Wisconsin Alumni Research Foundation und der University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy anerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al.
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P.
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
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