Summary
Massaspectrometrische karakterisering van neuropeptiden biedt sequentie-, kwantificerings- en lokalisatie-informatie. Deze geoptimaliseerde workflow is niet alleen nuttig voor neuropeptidestudies, maar ook voor andere endogene peptiden. De protocollen die hier worden verstrekt, beschrijven monstervoorbereiding, MS-acquisitie, MS-analyse en databasegeneratie van neuropeptiden met behulp van LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting en MALDI-MS-beeldvorming.
Abstract
Neuropeptiden zijn signaalmoleculen die bijna alle fysiologische en gedragsprocessen reguleren, zoals ontwikkeling, reproductie, voedselinname en reactie op externe stressoren. Toch blijven de biochemische mechanismen en volledige aanvulling van neuropeptiden en hun functionele rollen slecht begrepen. De karakterisering van deze endogene peptiden wordt belemmerd door de immense diversiteit binnen deze klasse van signaalmoleculen. Bovendien zijn neuropeptiden bioactief bij concentraties die 100x - 1000x lager zijn dan die van neurotransmitters en zijn ze vatbaar voor enzymatische afbraak na synaptische afgifte. Massaspectrometrie (MS) is een zeer gevoelig analytisch hulpmiddel dat analyten kan identificeren, kwantificeren en lokaliseren zonder uitgebreide a priori kennis. Het is zeer geschikt voor het wereldwijd profileren van neuropeptiden en het helpen bij de ontdekking van nieuwe peptiden. Vanwege de lage abundantie en hoge chemische diversiteit van deze klasse van peptiden, zijn verschillende monstervoorbereidingsmethoden, MS-acquisitieparameters en data-analysestrategieën aangepast van proteomics-technieken om optimale neuropeptidekarakterisering mogelijk te maken. Hier worden methoden beschreven voor het isoleren van neuropeptiden uit complexe biologische weefsels voor sequentiekarakterisering, kwantificering en lokalisatie met behulp van vloeistofchromatografie (LC) -MS en matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) - MS. Een protocol voor het voorbereiden van een neuropeptide database van de blauwe krab, Callinectes sapidus, een organisme zonder uitgebreide genomische informatie, is opgenomen. Deze workflows kunnen worden aangepast om andere klassen van endogene peptiden in verschillende soorten te bestuderen met behulp van een verscheidenheid aan instrumenten.
Introduction
Het zenuwstelsel is complex en vereist een netwerk van neuronen om signalen door een organisme te verzenden. Het zenuwstelsel coördineert sensorische informatie en biologische respons. De ingewikkelde en ingewikkelde interacties die betrokken zijn bij signaaloverdracht vereisen veel verschillende signaalmoleculen zoals neurotransmitters, steroïden en neuropeptiden. Omdat neuropeptiden de meest diverse en krachtige signaalmoleculen zijn die een sleutelrol spelen bij het activeren van fysiologische reacties op stress en andere stimuli, is het van belang om hun specifieke rol in deze fysiologische processen te bepalen. Neuropeptidefunctie is gerelateerd aan hun aminozuurstructuur, die mobiliteit, receptorinteractie en affiniteit bepaalt1. Technieken zoals histochemie, wat belangrijk is omdat neuropeptiden kunnen worden gesynthetiseerd, opgeslagen en vrijgegeven in verschillende regio's van het weefsel, en elektrofysiologie zijn gebruikt om neuropeptidestructuur en -functie 2,3,4 te onderzoeken, maar deze methoden worden beperkt door doorvoer en specificiteit om de enorme sequentiediversiteit van neuropeptiden op te lossen.
Massaspectrometrie (MS) maakt de high throughput analyse van neuropeptide structuur en abundantie mogelijk. Dit kan worden uitgevoerd door middel van verschillende MS-technieken, meestal vloeistofchromatografie-elektrospray-ionisatie MS (LC-ESI-MS)5 en matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie MS (MALDI-MS)6. Met behulp van zeer nauwkeurige massametingen en MS-fragmentatie biedt MS de mogelijkheid om aminozuursequentie en posttranslationele modificatie (PTM) status toe te wijzen aan neuropeptiden uit complexe mengsels zonder a priori kennis om te helpen bij het vaststellen van hun functie 7,8. Naast kwalitatieve informatie maakt MS kwantitatieve informatie van neuropeptiden mogelijk door middel van labelvrije kwantificering (LFQ) of labelgebaseerde methoden zoals isotopische of isobare etikettering9. De belangrijkste voordelen van LFQ zijn de eenvoud, lage analysekosten en verminderde monstervoorbereidingsstappen die monsterverlies kunnen minimaliseren. De nadelen van LFQ omvatten echter hogere instrumenttijdkosten, omdat het meerdere technische replicaties vereist om kwantitatieve fouten van run-to-run variabiliteit aan te pakken. Dit leidt ook tot een verminderd vermogen om kleine variaties nauwkeurig te kwantificeren. Labelgebaseerde methoden worden onderworpen aan minder systematische variatie omdat meerdere monsters differentieel kunnen worden gelabeld met behulp van een verscheidenheid aan stabiele isotopen, gecombineerd in één monster en tegelijkertijd geanalyseerd door massaspectrometrie. Dit verhoogt ook de doorvoer, hoewel isotopische etiketten tijdrovend en kostbaar kunnen zijn om te synthetiseren of te kopen. De spectrale complexiteit van full scan mass spectra (MS1) neemt ook toe naarmate multiplexing toeneemt, waardoor het aantal unieke neuropeptiden dat kan worden gefragmenteerd en daarom kan worden geïdentificeerd, afneemt. Omgekeerd verhoogt isobare etikettering de spectrale complexiteit op MS1-niveau niet, hoewel het uitdagingen introduceert voor analyten met een lage abundantie, zoals neuropeptiden. Aangezien isobare kwantificering wordt uitgevoerd op het niveau van fragmentionenmassaspectra (MS2), kunnen neuropeptiden met een lage abundantie mogelijk niet worden gekwantificeerd omdat meer overvloedige matrixcomponenten kunnen worden geselecteerd voor fragmentatie en de geselecteerde mogelijk niet hoog genoeg abundantie hebben om te worden gekwantificeerd. Met isotopische etikettering kan kwantificering worden uitgevoerd op elk geïdentificeerd peptide.
Naast identificatie en kwantificering kan lokalisatie-informatie door MS worden verkregen via MALDI-MS imaging (MALDI-MSI)10. Door een laser over een monsteroppervlak te rasteren, kunnen MS-spectra worden gecompileerd tot een heatmapbeeld voor elke m/z-waarde . Het in kaart brengen van de intensiteit van het transiënte neuropeptidesignaal in verschillende regio's in verschillende omstandigheden kan waardevolle informatie opleveren voor functiebepaling11. Lokalisatie van neuropeptiden is vooral belangrijk omdat de neuropeptidefunctie kan verschillen afhankelijk van locatie12.
Neuropeptiden worden in vivo in een lagere abundantie aangetroffen dan andere signaalmoleculen, zoals neurotransmitters, en vereisen dus gevoelige methoden voor detectie13. Dit kan worden bereikt door het verwijderen van matrixcomponenten met een hogere abundantie, zoals lipiden11,14. Aanvullende overwegingen voor de analyse van neuropeptiden moeten worden gemaakt in vergelijking met gewone proteomics-workflows, vooral omdat de meeste neuropeptidomische analyses enzymatische spijsvertering weglaten. Dit beperkt software-opties voor neuropeptidegegevensanalyse, omdat de meeste zijn gebouwd met algoritmen op basis van proteomics-gegevens en eiwitmatches op basis van peptidedetectie. Veel software zoals PEAKS15 is echter meer geschikt voor neuropeptide-analyse vanwege hun de novo sequencing-mogelijkheden. Verschillende factoren moeten worden overwogen voor de analyse van neuropeptiden, beginnend bij extractiemethode tot MS-gegevensanalyse.
De hier beschreven protocollen omvatten methoden voor monstervoorbereiding en dimethylisotopische etikettering, gegevensverzameling en gegevensanalyse van neuropeptiden door LC-ESI-MS, MALDI-MS en MALDI-MSI. Door middel van representatieve resultaten van verschillende experimenten wordt het nut en het vermogen van deze methoden om neuropeptiden van blauwe krabben, Callinectes sapidus, te identificeren, kwantificeren en lokaliseren, aangetoond. Om het zenuwstelsel beter te begrijpen, worden vaak modelsystemen gebruikt. Veel organismen hebben geen volledig gesequenced genoom beschikbaar, wat uitgebreide neuropeptide-ontdekking op peptideniveau voorkomt. Om deze uitdaging te verminderen, is een protocol opgenomen voor het identificeren van nieuwe neuropeptiden en transcriptoommining om databases voor organismen te genereren zonder volledige genoominformatie. Alle protocollen die hier worden gepresenteerd, kunnen worden geoptimaliseerd voor neuropeptidemonsters van elke soort, evenals worden toegepast voor de analyse van endogene peptiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven weefselmonsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Wisconsin-Madison.
1. LC-ESI-MS analyse van neuropeptiden
- Neuropeptide extractie en ontzouting
- Bereid voorafgaand aan weefselverwerving aangezuurde methanol (acMeOH) (90:9:1 MeOH:water:azijnzuur) voor zoals beschreven in16.
- Verzamel hersenweefsel van het schaaldier17 en gebruik een tang om onmiddellijk één weefsel elk in een buis van 0,6 ml met 20 μL acMeOH te plaatsen.
OPMERKING: Weefseldissectieprotocollen variëren sterk voor verschillende dieren en verschillende weefseltypen. De lezer wordt verwezen naar protocol17 voor een gedetailleerde beschrijving van het ontleden van hersenweefsel en meerdere andere weefseltypen van het schaaldier. Monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C tot gebruik (idealiter binnen 6 maanden). De beschreven volumes worden gebruikt voor een enkel brein van Callinectes sapidus. Volumes moeten worden geschaald voor weefselgrootte. Weefsel kan onmiddellijk worden ingevroren zonder oplosmiddel, hoewel dit niet wordt aanbevolen omdat endogene proteolytische enzymen niet worden geremd en actief blijven, hoewel in een langzamer tempo wanneer het koud is. - Voeg 150 μL acMeOH toe aan het monster. Stel de totale ultrasoonapparaattijd in op 24 s, pulstijd op 8 s, pauzetijd op 15 s en amplitude op 50% op een ultrasone homogenisator en homogeniseer de monsters op ijs.
OPMERKING: Er zijn verschillende homogenisatiesystemen beschikbaar. Pas de instellingen en omstandigheden aan op basis van het type monster en de apparatuur. - Centrifugeer het monster bij 4 °C bij 20.000 x g gedurende 20 minuten. Pipetteer met een pipet het supernatant in een buis en droog het in een vacuümconcentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bij ongeveer 35 °C.
OPMERKING: De gedroogde monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C tot gebruik (idealiter binnen 6 maanden). Het verwarmen van de vacuümconcentrator moet met de nodige voorzichtigheid worden uitgevoerd. Hoewel hitte de droogtijd verkort, moet het monster onmiddellijk uit de concentrator worden verwijderd nadat alle vloeistof is verdampt om de afbraak van peptiden te minimaliseren. Om dit te voorkomen, kan verwarming worden weggelaten uit deze en alle volgende stappen. - Reconstitueer voor ontzouting het geëxtraheerde weefselmonster in 20 μL van 0,1% mierenzuur (FA), vortexput en soniceer gedurende 1 minuut in een waterbad bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Er zijn verschillende ontzoutingsmaterialen beschikbaar. Pas de oplossingen en volumes aan op basis van de harsidentiteit en de hoeveelheid neuropeptiden. De totale hoeveelheid peptide kan worden geschat met behulp van een commerciële kwantificeringstest voor peptiden (zie Tabel met materialen). - Breng 0,5 μL monster aan op een pH-strip om te bevestigen dat de pH < 4. Als de pH hoger is, voegt u 1 μL aliquots van 10% FA toe totdat de pH < 4.
- Volg het protocol van de fabrikant voor het ontzouten van18. Bereid een bevochtigingsoplossing met 100 μL 50% acetonitril (ACN), equilibratieoplossing met 100 μL 0,1% FA, wasoplossing met 100 μL 0,1% FA en elutieoplossingen met 20 μL 25% ACN/0,1% FA, 20 μL 50% ACN/0,1% FA en 20 μL 75% ACN/0,1% FA.
- Verkrijg een ontzoutingstip van 10 μL met C18-hars (zie Tabel met materialen).
- Plaats de ontzoutingstip op een pipet van 20 μL die is ingesteld op 15 μL. Zodra de ontzoutingstip nat is, voorkomt u dat er lucht doorheen gaat door de pipet ingedrukt te houden wanneer deze uit de oplossing is totdat deze wordt weggegooid.
- Zuig de tip 3x aan met bevochtigingsoplossing en 3x met equilibratie-oplossing. Zuig 10x in het monster op, gevolgd door 3x wassen in wasoplossing, waarbij elke wasbeurt wordt weggegooid. Eluteer door 10x in elk van de elutie-oplossingen te zuigen om de ACN te verhogen.
OPMERKING: Elutiefracties kunnen gescheiden of gecombineerd worden voor verdere analyses. - Gooi de gebruikte ontzoutingstip weg en droog de geëlueerde neuropeptiden in een vacuümconcentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bij ongeveer 35 °C.
OPMERKING: Dit kan worden bewaard bij -80 °C tot gebruik (idealiter binnen 6 maanden).
- Isotopische etikettering van neuropeptiden in weefselextract
OPMERKING: Deze stap is optioneel en wordt alleen gebruikt wanneer kwantificering gewenst is.- Bereid de 2-plex isotopische dimethyletiketteringsoplossing in een zuurkast: 1% CH2OH2 (13,5 μL bouillon 37 gewichts-/gewichtspercentage (wt. %) in wateroplossing in 486,5 μL water), 1% CH2OD2 (25 μL bouillon 20 wt. % oplossing in 475 μL water) en 0,03 M borane pyridine (3,75 μL voorraad 8 M oplossing in 996,25 μL water).
LET OP: Formaldehyde is giftig, dus alle oplossingen moeten in een geventileerde kap worden bewaard. Draag handschoenen, een laboratoriumjas, oogbescherming en ondoordringbaar schoeisel. Contactlenzen mogen niet worden gedragen bij het werken met dit materiaal.
OPMERKING: Er zijn verschillende isotopische reagentia; selecteer de juiste op basis van het voorbeeldtype en het aantal gewenste etiketteringskanalen. - Los ruw neuropeptide-extract op in 10 μL water en soniceer gedurende 10 minuten.
- Voeg 10 μL van een andere isotopische formaldehyde-oplossing (d.w.z. CH2OH2, CH2OD2, enz.) toe aan elke verschillende experimentele toestand die kwantitatief moet worden gemeten. Vortex om goed te mengen en centrifugeer elk monster kort op 2.000 x g.
- Voeg 10 μL 0,03 M boraanpyridine toe aan elke monsterbuis. Vortex om goed te mengen en centrifugeer elk monster kort op 2.000 x g.
- Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 37 °C in een waterbad.
- Verwijder de monsters uit het waterbad en voeg 10 μL ammoniumbicarbonaat van 100 mM toe. Vortex om goed te mengen en centrifugeer elk monster kort op 2.000 x g.
- Combineer de gelabelde monsters voor één 2-plex monster en droog de neuropeptiden in een vacuümconcentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bij ongeveer 35 °C.
- Desalt de gelabelde neuropeptiden door stappen 1.1.5 - 1.1.10 opnieuw uit te voeren en bewaar ze totdat ze klaar zijn voor gegevensverzameling.
- Bereid de 2-plex isotopische dimethyletiketteringsoplossing in een zuurkast: 1% CH2OH2 (13,5 μL bouillon 37 gewichts-/gewichtspercentage (wt. %) in wateroplossing in 486,5 μL water), 1% CH2OD2 (25 μL bouillon 20 wt. % oplossing in 475 μL water) en 0,03 M borane pyridine (3,75 μL voorraad 8 M oplossing in 996,25 μL water).
- Data-acquisitie
- Reconstitueer de gedroogde ontzoute neuropeptiden in 12 μL van 3% ACN/0,1% FA, vortexput, soniceer in 37 °C waterbad gedurende 1 minuut en centrifugeer kort bij 2.000 x g. Breng elk monster over in injectieflacons met automatische monsters.
OPMERKING: Pas het monstervolume aan op basis van de neuropeptidehoeveelheid tot een concentratie van ~ 1 μg peptide per μL. De totale hoeveelheid peptide kan worden geschat met behulp van een commerciële kwantificeringstest voor peptiden (zie Tabel met materialen). - Gebruik een autosampler om 1 μL monster in een nano-LC-MS/MS-instrument met hoge resolutie te injecteren (zie Materiaaltabel).
- Gebruik een ongeveer 15 cm lange omgekeerde fase (RP) C18-kolom (zie Materiaaltabel) voor het uitvoeren van het monster met 0,1% FA in water als mobiele fase A en 0,1% FA in ACN als mobiele fase B. Voer de monsters uit met een gradiënt van 3% - 95% van B met een snelheid van 300 nL / min gedurende meer dan 11 minuten.
- Gebruik voor het MS-instrument dat hier wordt gebruikt, algemene MS-omstandigheden van 2,00 kV voor sproeispanning en 275 °C voor capillaire temperatuur.
- Verkrijg MS-spectra in het bereik van 200 - 2.000 m / z met een resolutie van 60.000, automatische versterkingsregeling (AGC) van 1 x 106 en maximale ioninjectietijd (IT) van 150 ms.
- Selecteer de 15 meest intense ionen (minimale intensiteit van 3,2 x 104) voor hcd-fragmentatie (higher-energy collision dissociation) met een genormaliseerde botsingsenergie van 30, isolatievenster van 2,0 m/z, resolutie van 15.000, een AGC-doel van 2 x 105 en een maximale IT van 250 ms.
- Stel een dynamisch uitsluitingsvenster van 30 s in. Sluit ionen met een lading van 1 of ≥ 8 en ionen met niet-herkende ladingstoestanden uit.
- Reconstitueer de gedroogde ontzoute neuropeptiden in 12 μL van 3% ACN/0,1% FA, vortexput, soniceer in 37 °C waterbad gedurende 1 minuut en centrifugeer kort bij 2.000 x g. Breng elk monster over in injectieflacons met automatische monsters.
- Neuropeptide identificatie en kwantificering
OPMERKING: Veel software voor het zoeken naar databases en kwantificering van peptiden (zowel open-source als commercieel) zijn beschikbaar. Hier wordt gebruik gemaakt van PEAKS Studio (proteomics software)15 .- Voer databasezoekopdrachten uit met behulp van de stappen die worden beschreven in 1.4.2 - 1.4.6.
- Maak een nieuw project en voeg de LC-MS-gegevens toe door Geen te selecteren voor het enzym, Orbitrap voor het instrument, HCD voor het fragment en gegevensafhankelijke acquisitie (DDA) voor acquisitie.
OPMERKING: Selecteer de juiste parameters op basis van parameters voor gegevensverzameling. - Selecteer Identificaties en selecteer Correct Precursor [DDA] en Alleen massa.
- Selecteer Database Search en stel een fouttolerantie in van 20,0 ppm met behulp van mono-isotopische massa voor precursormassa en 0,02 Da voor fragmentionenmassa, Geen voor enzymtype, Niet-specifiek voor verteermodus, 100 voor maximale gemiste splitsingen en de volgende variabele PTM's met de maximaal toegestane variabele PTM per peptide van 3: Amidatie, Oxidatie (M), Pyro-glu van E, en Pyro-glu van Q.
- Selecteer de Neuropeptide Database, schat false discovery rate (FDR) met decoy-fusion.
OPMERKING: De massatolerantiefout moet worden aangepast aan de verzamelde gegevens. Gebruik de juiste database voor het voorbeeldtype. Wanneer er geen enzym is geselecteerd, heeft de parameter max missed cleavages geen invloed op de zoekopdracht. Een groot aantal gemiste splitsingen is echter vereist als de software de niet-gespecificeerde digest-modus niet als optie heeft. - Als labelvrije kwantificering gewenst is, selecteert u Kwantificering, selecteert u Labelvrij en stelt u een fouttolerantie van 20,0 ppm en een retentietijdtolerantie van 1,0 minuten in.
- Voer precursorionkwantificering uit als stap 1.2 voor isotopische etikettering is uitgevoerd.
- Selecteer Kwantificering, selecteer Precursor Ion Quantification, gebruik een retentietijdbereik van 1,0 min en gebruik een FDR-drempel van 1%.
- Selecteer een vooraf ingestelde of aangepaste kwantificeringsmethode in het vervolgkeuzemenu Methode selecteren .
- Als u een nieuwe aangepaste methode wilt maken, klikt u op > Configuratie > Methode Label Q > Nieuw. Geef de nieuwe methode een naam en selecteer Precursor Ion Quantification voor Methodetype. Selecteer Rij toevoegen en selecteer wijziging in de lijst PTM-opties.
- Voeg de LC-MS-gegevens toe en selecteer Referentieconditie om de modificatie op neuropeptiden te zijn van de controleconditie van het experiment.
- Evalueer de zoekresultaten zoals beschreven in stappen 1.4.9 - 1.4.11.
- Filter de resultaten door het overzichtstabblad voor peptiden en eiwitten met -10lgP ≥ 20, selecteer ≥ 1 uniek peptide en selecteer het vakje met het label Met significante peptiden.
- Evalueer de zoekresultaten van de database waarbij Protein.csv neuropeptide-identificaties vertegenwoordigt en Peptide.csv neuropeptidefragmentidentificaties vertegenwoordigt.
- Inspecteer de databasezoekopdracht op eiwit- en peptidescores, massanauwkeurigheid en sequentiedekking.
OPMERKING: Elke databasezoeksoftware maakt gebruik van unieke scoringsalgoritmen en moet mogelijk dienovereenkomstig worden geëvalueerd. Identificaties kunnen worden geëvalueerd door de waargenomen spectra handmatig te inspecteren op geïdentificeerde peptiden die de volledige fragmentionenreeks bevatten.
2. MALDI-MS spotting analyse van neuropeptiden
- Monstervoorbereiding
- Volg stap 1.1 of stap 1.1 - 1.2 als kwantificering gewenst is, met uitzondering van stap 1.2.8 (ontzouting na isotopische etikettering is niet vereist voorafgaand aan MALDI-MS-analyse).
- Reconstitueer de gedroogde ontzoute neuropeptiden in 5 μL van 0,1% FA, vortexput, soniceer gedurende 1 minuut in een waterbad van 37 °C en centrifugeer kort bij 2.000 x g.
- Voor het spotten van neuropeptiden in schaaldierweefsels, bereid 150 mg / ml 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) in 50% methanol (MeOH) / 0,1% FA (v / v) als de matrix.
- Pipetteer een monsterdruppel van 3 μL op een hydrofobe film (zie Materiaaltabel) en pipetteer 3 μL van de matrix rechtstreeks op de monsterdruppel. Pipetteer op en neer om te mengen.
- Pipet 1 μL van het 1:1 monster: matrixmengsel in een put van de MALDI roestvrijstalen doelplaat. Gebruik de pipetpunt om elk mengsel goed uit te spreiden over de randen van het monster. Het monster moet de randen van de putgravure raken om een gelijkmatige verdeling te vergemakkelijken (figuur 4A).
- Spot 1 μL van 1:1 kalibrant:matrixmengsel (commerciële of aangepaste kalibratiemix, polymeermaterialen (d.w.z. rode fosfor opgelost in MeOH) of gemeenschappelijke matrixclusterionen)12 in een put in de buurt van het monster.
OPMERKING: Rode fosfor hoeft niet te worden gemengd met matrix voordat het wordt opgemerkt.
- Data-acquisitie
- Plaats de doelplaat met gedroogde monstervlekken in het MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF)-instrument (zie Materiaaltabel).
- Stel voor dhb-matrix het laservermogen in op 95%, selecteer automatische optimale detectorversterking en smart - complete sample sample carrier bewegingsmodus. Verkrijg MS-spectra in het bereik van 200 - 3200 m / z en voeg meerdere spectra van elke plek samen om de neuropeptide signaal-ruisverhouding te verhogen.
OPMERKING: Optimaliseer het percentage laservermogen, detectorversterking en selecteer de juiste bewegingsmodus voor monsterdragers, zodat elke acquisitie ongeveer de hele plek bestrijkt en volgende acquisities niet naar de vorige posities gaan. - Kalibreer het instrument.
OPMERKING: Pas het massabereik aan om het gewenste neuropeptidebereik te omvatten.
- Data-analyse
- Open het MALDI-MS-bestand in data-analysesoftware (zie Tabel met materialen) en klik op Baseline Subtracction voor de software die hier wordt gebruikt.
- Voer piekselectie uit door op Massalijst zoeken te klikken. Als er te weinig pieken zijn, bewerkt u de massalijst handmatig door Massalijst bewerken te selecteren en klikt u op pieken in het spectrum om ze aan de massalijst toe te voegen.
- Voer nauwkeurige massamatching uit door de massalijst te vergelijken met de neuropeptidedatabase met [M + H] + m / z-waarden (± fout van 200 ppm).
OPMERKING: Gemeenschappelijke zoutadducten, zoals [M + K]+, [M +Na] + en [M + NH4]+, moeten ook worden opgenomen in de nauwkeurige lijst met doelen voor massamatching. - Om de geïdentificeerde pieken te verifiëren, genereert u een lijst met m/z van belang en voert u MS/MS-experimenten uit.
3. MALDI-MS beeldvormingsanalyse van neuropeptiden
- Monstervoorbereiding
OPMERKING: Insluit- en sectiestappen zijn niet nodig voor weefsels die te dun zijn om te worden gesneden.- Vul een halve cryostaatbeker met gelatine (37 °C, 100 mg/ml in gedeïoniseerd water) en laat het stollen bij kamertemperatuur. Houd overgebleven vloeibare gelatine warm in een waterbad van 37 °C.
- Verzamel het gewenste neuronale weefsel van het dier en gebruik een tang om het weefsel onmiddellijk gedurende 1 s in een buis van 0,6 ml met gedeïoniseerd water te dopen.
OPMERKING: Raadpleeg stap 1.1.2 OPMERKING voor neuronale weefseldissectie. - Leg het weefsel op de vaste gelatine en vul de rest van de cryostaatbeker met vloeibare gelatine. Gebruik een tang om het weefsel te positioneren.
- Plaats de cryostaatbeker op een plat oppervlak en vries in met droogijs.
OPMERKING: Bewaar monsters bij -80 °C tot gebruik (idealiter binnen 6 maanden). - Voor de sectiebereiding scheidt u het met gelatine ingebedde monster van de cryostaatvorm door de vorm weg te snijden.
- Monteer het ingebedde weefsel op een cryostaat-klauwplaat door een druppel gedeïoniseerd water van 1 ml op de klauwplaat te pipetteren en het ingebedde weefsel onmiddellijk op de druppel te drukken.
- Eenmaal bevroren, pipetteer meer gedeïoniseerd water rond het weefsel om het verder aan de klauwplaat vast te zetten. Voer deze stappen uit in de cryostaatbox (zie Materialentabel) die is ingesteld op -20 °C.
- Snijd het weefsel op een geschatte dikte van één cel (8-20 μm afhankelijk van het monstertype) en ontdooi monteer elke sectie op een met indiumtinoxide (ITO) gecoate glasplaat door een kant van de dia in de buurt van de sectie te plaatsen en een vinger aan de andere kant van de dia te plaatsen om het glas langzaam te verwarmen en de sectie aan de dia te laten kleven.
OPMERKING: Weefselsecties kunnen ook worden ontdooid door een rand van de gelatine op te pakken met een pincet (gekoeld tot -20 °C), deze op de ito-gecoate glasplaat te plaatsen en een vinger aan de andere kant van de dia te plaatsen om het glas langzaam op te warmen en het gedeelte aan de dia te laten kleven. - Zoek het monster dat als kalibrant moet worden gebruikt (zie stap 2.1.6 voor kalibrantopties) door met een hydrofobe pen een kleine cirkel in de buurt van het weefselgedeelte te tekenen en de kalibrant binnen de cirkel te spotten.
- Markeer elke hoek van de dia met een white-outpen met een kleine vorm met scherpe randen (d.w.z. x) die als leerpunten moet worden gebruikt.
- Plaats de glasplaat in de MALDI-diaadapterplaat en maak een optische beeldscan met hoge resolutie (≥2400 DPI) met behulp van een scanner.
- Spuitmatrix op het weefselgedeelte met behulp van een geautomatiseerde sproeier (zie Tabel met materialen voor details en instructies van de sproeier).
- Gebruik voor MSI van neuropeptiden in schaaldierweefsels 40 mg / ml DHB in 50% methanol / 0,1% FA (v / v) als matrix, stel de mondstuktemperatuur in op 80 ° C, snelheid op 1.250 mm / min, stroomsnelheid op 0,1 ml / min, aantal passages op 12 en 30 s tussen elke pas voor de automatische sproeier.
- Data-acquisitie
- Plaats de volledig gedroogde doelplaat met op ontdooi gemonteerde weefselsecties die met de matrix zijn besproeid.
- Stel de parameters van het MS-beeldvormingsacquisitiebestand zo in dat de laserdiameter kleiner is dan de rasterstapgrootte.
- Laad de gescande optische afbeelding en kalibreer de monsterplaat met behulp van de x teach-punten. Definieer de weefselgebieden van belang die iets groter moeten worden gemeten dan de werkelijke weefselsectie om ook gebieden op te nemen die alleen matrix bevatten.
- Kalibreer het instrument en verkrijg spectra in het bereik van 200 - 3200 m/z. Pas het massabereik aan om het gewenste neuropeptidebereik te omvatten.
- Data-analyse
- Als u gegevens wilt verwerken, importeert u de MS-beeldvormingsdataset in de gewenste software, selecteert u een basislijnverwijderingsalgoritme en normaliseert u gegevens met behulp van het totale aantal ionen.
OPMERKING: Selectie van verschillende normalisatie-algoritmen, zoals mediaan, RMS-waarde (root mean square) of de intensiteit van een referentie m/z-waarde , zal waarschijnlijk de ruimtelijke verdeling van veel m/z-waarden veranderen. Kies het normalisatiealgoritme dat het meest geschikt is voor gewenste analyten. - Om een afbeelding te genereren voor elke m/z-waarde uit een theoretische pieklijst, uploadt u een csv-bestand (comma-separated values) met neuropeptide [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, enz. Verkrijg m/z-waarden door op Bestand te klikken > > pieklijst importeren. Geef de pieklijst een naam.
- Om de juiste ppm-foutdrempel te schatten, identificeert u eerst handmatig een neuropeptidepiek in het MS-spectrum en vergelijkt u deze met de theoretische massa van het neuropeptide. Bereken de ppm-fout en klik op Bestand > Bestandseigenschappen > intervalbreedte en invoer ppm-fout.
- Selecteer de pieklijst in het vervolgkeuzemenu en klik op M/z-afbeeldingen maken voor elk interval van de pieklijst.
- Sla elke m/z-afbeelding op door op Screenshot van elke m/z-afbeelding opslaan te klikken.
OPMERKING: Vermeende neuropeptide-identificatie kan worden uitgevoerd door m / z-afbeeldingen te identificeren waarbij het analytsignaal alleen in het weefsel is gelokaliseerd en niet in de omringende matrix. - Om de piekidentiteit te verifiëren, genereert u een lijst met interessante m/z's en voert u MS/MS-experimenten uit.
- Als u gegevens wilt verwerken, importeert u de MS-beeldvormingsdataset in de gewenste software, selecteert u een basislijnverwijderingsalgoritme en normaliseert u gegevens met behulp van het totale aantal ionen.
4. Het ontdekken van nieuwe vermeende neuropeptiden met behulp van de novo sequencing
- Voer stappen 1.4.2 - 1.4.5 uit.
- Exporteer de novo alleen peptiden.csv uit PEAKS-software met een gemiddelde lokale betrouwbaarheid (ALC) score van ≥ 75.
OPMERKING: Er is veel software beschikbaar om de novo sequencing uit te voeren, elk met zijn eigen scoringsalgoritmen en moet dienovereenkomstig worden geëvalueerd. - Zoek in de peptidelijst naar bekende sequentiemotieven die wijzen op neuropeptiden die behoren tot specifieke neuropeptidefamilies19.
OPMERKING: Hoewel motieven over het algemeen goed bewaard blijven tussen soorten, moeten de gezochte motieven worden geselecteerd met inachtneming van het monsterorganisme.
5. Transcriptoommijnbouw voor voorspelde neuropeptidesequenties
OPMERKING: Deze stap is optioneel en wordt alleen gebruikt om toe te voegen aan een bestaande neuropeptidedatabase of een nieuwe neuropeptidedatabase te bouwen.
- Kies een bekende preprohormoon aminozuursequentie van belang en gebruik tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
_LOC=blasthome) om de preprohormone volgorde van zoekopdrachten te doorzoeken op databases zoals nr/nt, Refseq_genomes, EST en TSA.
OPMERKING: Als u querysequenties wilt zoeken tegen eiwitdatabase, gebruikt u BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).- Selecteer het doelorganisme (belasting-id) en wijzig de parameters van het algoritme Drempel verwachten in 1000 om uitlijningen met een lage score op te nemen.
- Voer het BLAST-programma uit en controleer vervolgens de resultaten op hoge homologiescores tussen query- en onderwerpsequenties die significante uitlijningen produceren. Sla fasta-bestand met nucleotidesequentie op.
OPMERKING: Als er meerdere subjectsequenties zijn met vergelijkbare homologiescores, voer dan een MAFFT-uitlijning uit om putatieve sequenties20,21 te verkleinen.
- Vertaal preprohormoon nucleotide sequentie in preprohormoon peptide sequenties met behulp van Expasy Translate tool (https://web.expasy.org/translate/). Selecteer voor C. sapidus Invertebrate Mitochondrial voor genetische code.
- Controleer op signaalpeptidesequentie en prohormoonsplitsingsplaatsen in de peptidesequenties met behulp van SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
OPMERKING: Homologie aan bekende preprohormoonverwerkingsschema's kan ook worden gebruikt om prohormoonsplitsingsplaatsen te identificeren. Mogelijke posttranslationele modificaties voor signaalpeptiden kunnen indien gewenst worden voorspeld. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) kan worden gebruikt om de sulfateringstoestand van tyrosineresiduen te voorspellen. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) kan worden gebruikt om disulfidebindingsconnectiviteit te voorspellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De workflow voor monstervoorbereiding en MS-analyse is weergegeven in figuur 1. Na de dissectie van neuronaal weefsel worden homogenisatie, extractie en ontzouting uitgevoerd om neuropeptidemonsters te zuiveren. Als isotopische labelgebaseerde kwantificering gewenst is, worden monsters vervolgens gelabeld en opnieuw ontzout. Het resulterende monster wordt geanalyseerd door middel van LC-MS / MS voor neuropeptide-identificatie en kwantificering.
Neuropeptiden geïdentificeerd via de proteomics-software zouden een goede peptidefragmentatiesequentiedekking moeten hebben, maar dit is niet wereldwijd gedefinieerd of gestandaardiseerd. Voor absolute identificatie moet elk aminozuur een fragmention produceren dat een ondubbelzinnige identificatie en lokalisatie biedt. Dit moet ook worden vergeleken met een gesynthetiseerd peptide voor bevestiging van de intensiteit van elk fragmention. Omdat de kosten voor het uitvoeren van dit op elke vermeende identificatie niet haalbaar zijn, wordt identificatie gewoonlijk beschreven op basis van betrouwbaarheid waarbij meer waargenomen fragmentionen de peptide-identificatiezekerheid verhogen. Terwijl figuur 2A,B twee neuropeptiden weergeeft die beide werden geïdentificeerd met 100% sequentiedekking en een lage massafout zoals gedefinieerd door de maximale limiet van 0,02 Da, vermindert de slechte fragmentatiedekking (van slechts drie ionen) die alleen voor het neuropeptide in figuur 2B wordt waargenomen, de betrouwbaarheid van identificatie van een specifieke isovorm. Figuur 2C toont de geëxtraheerde ionchromatogrammen (XICs), een plot met de signaalintensiteit van een geselecteerde m/z-waarde als functie van de retentietijd, van een neuropeptide gedetecteerd in twee monsters die worden gebruikt voor LFQ. De retentietijden voor het neuropeptide verschillen enigszins omdat het werd geïdentificeerd in twee afzonderlijke en opeenvolgende runs; het verschil ligt echter binnen de betrouwbare drempelwaarde van 1 min. Zo wordt de verhouding tussen het door software berekende gebied onder de curve van de XIC gebruikt voor de LFQ van dit neuropeptide.
Voor de kwantificering van dimethyl gelabelde neuropeptiden moet het MS1-spectrum een piek bevatten bij de theoretische neuropeptide m/z-waarde en een piek bij de m/z-waarde met een massaverschuiving die correleert met het massaverschil tussen de gebruikte isotopische etiketteringsreagentia. In figuur 2D is de massaverschuiving van dit 2-plex dimethyl gelabelde monster 4,025 Da. De oppervlakte onder de curve van het voorloperion van zijn XICs wordt vervolgens berekend door de software en gebruikt om relatieve abundantieverhoudingen te berekenen. Een vereenvoudigde versie van de proteomics software export tabel met geïdentificeerde neuropeptiden en hun LFQ ratio's wordt getoond in Tabel 1. Vergelijkbare resultaten worden verkregen voor isotopisch gelabelde neuropeptiden.
Software-algoritmen maken de de novo sequencing van spectra mogelijk om nieuwe vermeende neuropeptiden te detecteren. Bij het claimen van de detectie van vermeende nieuwe neuropeptiden, zijn identificaties met een hoge betrouwbaarheid ideale gevallen waarin alle aminozuren ondubbelzinnig worden geïdentificeerd en gelokaliseerd, op basis van fragmentionobservatie. Figuur 3 toont het spectrum van een de novo gesequenced peptide met het -RYamide-motief op de C-terminal, een geconserveerd sequentiemotief gedeeld door bekende neuropeptiden van de schaaldier RYamide-familie22. Een peptide werd gematcht uit de database met 100% sequentiedekking, alle aminozuurvormende fragmentionen waargenomen, lage fragmentionenmassafout zoals gedefinieerd door de maximale limiet van 0,02 Da en bevatte een gaussisch elutieprofiel. Deze resultaten geven aan dat een endogene peptide die behoort tot de Crustacean -RYamide neuropeptide familie werd waargenomen.
MALDI-MS-spotmetingen kunnen neuropeptide-identificaties bieden die complementair zijn aan LC-ESI-MS-identificatie, en bieden hogere doorvoermogelijkheden. Nadat ruw weefselhomogenaat is geëxtraheerd voor neuropeptiden, ontzout en gelabeld (indien gewenst), kan het monster worden gemengd met matrix en worden gespot op de MALDI roestvrijstalen doelplaat, zoals weergegeven in figuur 4A. Succesvol pipetteren van homogene monstervlekken produceert duidelijk opgeloste pieken, vooral binnen het kalibratiespectrum (figuur 4B). Bij gebruik van een MALDI-TOF-instrument moet het instrument aan het begin van elk experiment worden gekalibreerd. Alle analyten met bekende massa's kunnen worden gebruikt om het instrument te kalibreren als het zich binnen het gewenste massabereik van het monster bevindt. Hier wordt rode fosfor gebruikt voor de positieve ionenmassakalibratie van het instrument. Het heeft voordelen ten opzichte van het gebruik van peptidekalibratiemengsels vanwege de stabiliteit bij kamertemperatuur, goedkope kosten, overvloedige pieken vanwege de polymerisatie, hoge signaal-ruisverhouding en het vereist geen matrix voor ionisatie.
Voor MALDI-MS-beeldvorming van neuropeptiden vereist het gebruikte MALDI TOF/TOF-instrument handmatige beeldkalibratie van de ITO-gecoate dia (stap 3.1.10) om het optische beeld met het monster te correleren. Het diagram in figuur 5 toont de juiste plaatsing van het whiteout-vizier dat als leerpunten moet worden gebruikt om het instrument in staat te stellen het gescande optische beeld te correleren met de werkelijke monsterplaat. Het illustreert ook gebieden van de ITO-gecoate dia die door de gebruiker moeten worden vermeden (d.w.z. geen monster of matrix bevatten). Voor massakalibratie heeft de plaatsing van de kalibratiemonstervlek ten opzichte van het weefselmonster op de ITO-gecoate dia rechtstreeks invloed op de massafout vanwege de inherente aard van time-of-flight massaanalysatoren, hoewel de omvang van dit probleem afhankelijk is van de abundantie van de doelanalyten. Een oplossing voor dit probleem is om pieken uit de MS1-spectra van verschillende weefselsecties handmatig te controleren op bewijs van piekverschuiving. Als er piekverschuiving is, overweeg dan om extra massakalibratieplekken toe te voegen aan de ITO-gecoate dia direct naast elk weefselgedeelte. Van daaruit kan de gebruiker de spectra van de kalibratievlekken samen gemiddelden of MS-beeldvorming op één weefselsectie tegelijk uitvoeren met alleen de kalibratievlek die zich het dichtst bij de weefselsectie bevindt. Nadat het monster is verzameld, controleert u of het signaal van m / z-waarden die overeenkomen met neuropeptiden alleen is gelokaliseerd in het weefselgebied (figuur 6) voordat een vermeende neuropeptide-identificatie wordt toegewezen.
Figuur 1: Neuropeptide sample preparation workflow voor massaspectrometrie analyse. Voor weefselextractanalyse wordt ruw weefselhomogenaat ontzout, gelabeld met stabiele isotopische labels, opnieuw ontzout en geanalyseerd door MS. Voor beeldvormende analyse wordt intact weefsel ingebed, gecryopgericht, aangebracht met matrix en geanalyseerd door MALDI-MSI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Identificatie en kwantificering uitgevoerd via de proteomics software. Neuropeptiden worden gedetecteerd door spectra van bereikkwaliteit met (A) goede of (B) slechte MS2-fragmentatiedekking. Fragment ion mass matching error wordt weergegeven onder de spectra. (C) XIC-profielvormen en retentietijd (RT) kunnen handmatig worden geïnspecteerd op neuropeptiden gekwantificeerd via LFQ. (D) MS1-spectra worden gebruikt om dimethyl gelabelde neuropeptiden te detecteren en te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De novo sequencing voor nieuwe neuropeptidedetectie. (A) Het MS2-spectrum van een vermeende roman RYamide vertoont een goede fragmentatiedekking met een lage massafout voor elk fragment. B) De geïdentificeerde fragmenten worden voor handmatige inspectie vermeld. (C) De XIC van het nieuwe neuropeptide wordt handmatig geïnspecteerd op Gaussische piekvorm. Afkortingen: RT = bewaartijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: MALDI-MS spots en kalibratiespectrum. (A) Ms-spectrakwaliteit is afhankelijk van een uniforme matrix-peptideverdeling in de MALDI roestvrijstalen doelput. De linker drie vlekken zijn voorbeelden van goede vlekken die de randen van de putgravure raken en de rechter drie vlekken zijn voorbeelden van slechte plekken. Beide plekken bevatten α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) matrix en een peptide standaard mix. (B) Kalibratiespectrum met behulp van rode fosforclusters van 500 - 3200 m/z. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Afbeelding van ito-gecoat glasplaat. (A) Schema met belangrijke gebieden genoteerd: locaties om weefselsecties te plaatsen (lichtblauwe rechthoeken), automatische leerpunten locaties die moeten worden vermeden (rode rechthoeken), voorbeeldlocaties van waar leerpunten kunnen worden getrokken (wit vizier) en waar schroeven aan de adapterplaat worden bevestigd en moeten worden vermeden (donkerblauwe ovalen). (B) Foto van een glasplaat met twee weefselsecties, een vlek met een kalibratiemengsel en kruishaarmarkeringen. De locatie van het weefselgedeelte en de kalibratievlekken zijn aan de andere kant van de glasplaat aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: MS-beelden van C. sapidus sinusklieren. Neuropeptide [M+H]+ ionenverdelingsbeelden van (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844.48), (B) Allatostatine A-type NPYAFGLamide of GGPYAFGLamide (m/z 780.40), (C) Allatostatine A-type GQYAFGLamide (m/z 754.39) en (D) RFamide GRNFLRFamide (m/z 908.52) worden getoond. Afbeeldingen worden gegenereerd met behulp van een ± venster van 50 ppm van de theoretische m/z-waarde . Kleurenbalk geeft het bereik van de signaalintensiteit aan van 0 tot 100%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Database zoeken en LFQ resultaten. Neuropeptiden geïdentificeerd en gekwantificeerd door middel van LC-MS en proteomics software. Geïdentificeerde PTM's worden vermeld samen met de intensiteiten van gedetecteerde peptiden in beide monsters voor LFQ, samen met de resulterende LFQ-ratio. De gemiddelde massa's en waargenomen neuropeptidebeschrijvingen uit het FASTA-bestand worden vermeld. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De nauwkeurige identificatie, kwantificering en lokalisatie van neuropeptiden en endogene peptiden in het zenuwstelsel zijn cruciaal voor het begrijpen van hun functie23,24. Massaspectrometrie is een krachtige techniek waarmee dit alles kan worden bereikt, zelfs in organismen zonder een volledig gesequenced genoom. Het vermogen van dit protocol om neuropeptiden te detecteren, kwantificeren en lokaliseren uit weefsel verzameld van C. sapidus door een combinatie van LC-ESI- en MALDI-MS is aangetoond.
Tijdens de monstervoorbereiding voor LC-ESI-MS-analyse moeten overwegingen worden gemaakt. Hoewel MS een gevoelige techniek is, vormt de lage peptideconcentratie van neuronaal weefsel (tot in het femtomolaire bereik25) een ernstige beperking. Zorgvuldige monstervoorbereiding is vereist om niet alleen meer overvloedige en storende matrixcomponenten, zoals eiwitten en lipiden, te verwijderen, maar ook het verlies van neuropeptiden in elke stapte minimaliseren 26,27. Monsterverlies kan bijvoorbeeld worden verminderd door microcentrifugebuizen te gebruiken die bestand zijn tegen peptide-adsorptie. Afhankelijk van de samenstelling van het weefsel van belang, kan het gebruik van verschillende oplosmiddelen (voor extractie of precipitatie) of vaste fase extractiematerialen worden gebruikt voor het scheiden van biomoleculen met verschillende groottes en chemische eigenschappen. Om ervoor te zorgen dat hydrofiele of hydrofobe peptiden aanwezig zijn in het neuropeptide-extract, kunnen meerdere extractieoplosmiddelsystemen optioneel worden gebruikt om neuropeptiden met verschillende fysisch-chemische eigenschappen te targeten. Deze, samen met het gebruik van proteaseremmers, moeten mogelijk worden aangepast voor geoptimaliseerde zuivering om het herstel van neuropeptiden te verbeteren28. De nadelen van het gebruik van meerdere extractiesystemen zijn dat verschillende neuronale weefsels moeten worden samengevoegd om te voldoen aan een algemene hogere peptide-inhoudsvereiste, evenals een verminderde doorvoer. Veel stappen zoals ontzouting, isotopische etikettering en MS-injectie bevelen bepaalde beginnende hoeveelheden peptiden aan. Voor de karakterisering van kostbare monsters, zoals neuropeptiden, worden peptide-assays over het algemeen vermeden om externe peptideconsumptie te voorkomen. Bovendien werden peptide-assays ontwikkeld om de nauwkeurige peptideconcentratie te bepalen uit eiwitvertellingen, die andere chemische eigenschappen hebben dan endogene peptiden. Om complicaties van onbekende neuropeptideconcentratie te overwinnen, kan een eerste peptidetest worden uitgevoerd met behulp van gepoolde neuronale weefselextracten, waarbij de resultaten worden gebruikt als schatting voor alle daaropvolgende analyses, hoewel in gedachten moet worden gehouden dat alle peptiden in oplossing worden gemeten, en niet al deze zijn neuropeptiden29. Andere beperkingen van deze methode zijn mogelijke vooroordelen over niet-polaire en hydrofobe neuropeptiden en het gebrek aan behoud van de inheemse structuur. Aanpassingen in oplosmiddelsamenstellingen en materialen, zoals het gebruik van oplossingen die meer hydrofoob zijn of het weglaten van het gebruik van organische oplosmiddelen, kunnen worden uitgevoerd om dit aan te pakken.
MALDI-MS-metingen zijn gebaseerd op zorgvuldige monstervoorbereidingsstappen voor consistente resultaten en kunnen andere monsteroverwegingen hebben dan voor LC-ESI-MS-metingen. Stappen zoals het houden van neuropeptide-extract op ijs voorafgaand aan MS-analyse worden nog steeds toegepast. Aanvullende methoden om neuropeptidedegradatie te voorkomen, omvatten het bewaren van glazen dia's met op dooi gemonteerde weefselsecties in een droogmiddeldoos na dissectie om te voorkomen dat condensatiezich ophoopt 30, hoewel het achterlaten van het weefselmonster in de exsiccator nadat het is opgedroogd ook kan leiden tot monsterafbraak. Het plaatsen van de weefselglijden in een vacuümsiccator (einddruk: 1x10-4 Torr bij kamertemperatuur) gedurende 5-10 minuten onmiddellijk voorafgaand aan het aanbrengen van de matrix wordt voorgesteld. Nadat de matrix op de weefselglaas is afgezet, kan deze een nacht in de koelkast of vriezer worden bewaard en voorafgaand aan de MALDI-MS-beeldvormingsmeting in de vacuümsiccator worden gedroogd. Voor MALDI-spotmetingen is de matrix-peptidekristalstructuur niet goed verdeeld over het MALDI-doelwit, zelfs als dit zo lijkt. Er zijn manieren om massaspectravariaties van technische replicaties als gevolg van dit proces te verminderen. Verwerf eerst een gemiddeld spectrum van elke put met behulp van meerdere laserschoten (meestal honderden tot duizenden) waarbij de laser willekeurig over de put wordt gerasterd (d.w.z. SMART of Random sample carrier-beweging in instrumentparameters selecteren). Verkrijg ten minste vijf technische replicaties voor elk monstertype en selecteer drie technische replicaties waarbij de variatie in signaalintensiteit voor gewenste pieken het laagst is. De afweging hier is experimentele doorvoer. Het is noodzakelijk om parameters zoals het aantal laserschoten, laserdiameter en andere instrumentinstellingen consistent te houden voor alle verworven spectra. Idealiter worden alle technische replicaties en biologische replicaties tegelijkertijd geanalyseerd met behulp van dezelfde matrixoplossing en instrumentkalibratie. Neuropeptide-identificatie kan worden uitgevoerd door nauwkeurige massamatching met een pieklijst met theoretische [M + H]+, [M + Na]+, [M + NH4]+, [M + K] +, en andere zoutadducten die afzonderlijk geladen ion m / z-waarden produceren. Normalisatie van gegevens is van cruciaal belang voor het minimaliseren van systematische artefacten uit MALDI-MS-experimenten. Evaluatie van de reproduceerbaarheid is vooral belangrijk wanneer MALDI-MS-spotmetingen worden gebruikt voor neuropeptidekwantificering door stabiele isotoopetikettering (SIL). De kwaliteit van monstervoorbereiding en gegevensverzameling kan worden geëvalueerd door een peptidestandaard of neuropeptide-extract te nemen, het in twee gelijke aliquots te splitsen, elk monster differentieel te labelen met SIL en het monster te analyseren om ervoor te zorgen dat de relatieve intensiteit van gepaarde pieken 1: 1 is. De gerapporteerde variatie van die verhoudingen kan worden gebruikt om het variantieniveau in het totale experiment te schatten dat wordt toegeschreven aan gebruikersfouten.
Het is belangrijk op te merken dat MALDI-MS ook in staat is om sequentie- en kwantitatieve informatie te verstrekken; de afzonderlijk geladen ionen die doorgaans door MALDI worden geproduceerd, beperken echter de detectie van peptidefragmenten, waardoor het moeilijker wordt om de volledige sequentie te verkrijgen en de kwantificeringsmethoden die voor LC-ESI-MS worden besproken, worden geremd. Hoe dan ook, MALDI-MS is een aantrekkelijke modaliteit vanwege zijn vermogen voor hoge doorvoer, evenals een hogere tolerantie voor zouten en onzuiverheden in het monster12,31. Bovendien heeft MALDI-MS beeldvorming voordelen ten opzichte van andere conventionele beeldvormingstechnieken waarvoor antilichamen nodig zijn. In de meeste MS-modaliteiten zal het verlagen van de massaresolutie de gevoeligheid verhogen, waardoor een betere detectie van neuropeptiden met een lage abundantie mogelijk wordt. Deze strategie kan praktischer zijn voor MALDI-TOF/TOF-instrumenten dan LC-ESI-MS-instrumenten vanwege het gemak waarmee het MALDI-instrument voor elk experiment kan worden gekalibreerd. Een andere manier waarop MALDI voordelig kan zijn voor neuropeptidomics is door middel van spectragemiddelde. Doorgaans worden gemiddelde spectra van LC-ESI-MS-metingen niet gebruikt omdat dit de voordelen van LC-scheiding tenietdoet; daarom wordt er sterk vertrouwd op bioinformatica-software om neuropeptiden te identificeren en worden de identificaties handmatig geverifieerd. Er zijn echter minder gevolgen voor de gemiddelde spectra van MALDI-MS-metingen omdat er geen initiële scheiding was; daarom zijn de onbewerkte gegevens kleiner en gemakkelijker voor een gebruiker om handmatig door te kammen. Gemak van gegevensbeheer is belangrijk omdat het de volgorde verandert waarin de gebruiker neuropeptide-identificatie- en verificatiestrategieën kan benaderen. Hoewel het vertrouwen in neuropeptide-identificaties van LC-ESI-MS zou kunnen profiteren van het verhogen van het niveau van drempelse strengheid binnen data-analysesoftware, zal deze strategie minder waarschijnlijk ten goede komen aan MALDI-MS-identificaties. In het voorbeeld van schaaldierneurpeptiden maakt het feit dat er minder dan 1000 vermeldingen uit de in het laboratorium gebouwde database zijn (d.w.z. maximaal <1000 spectrale pieken of MS-beelden om handmatig doorheen te scannen), het mogelijk om eerst de MALDI-MS-gegevens te filteren met een royale massafoutdrempel en vervolgens handmatig die identificaties te verifiëren door de isotopische enveloppen op MS1-niveau te onderzoeken, evenals andere verificatiemethoden die worden besproken in de sectie Representatieve resultaten. Populaire MS imaging data-analyse software kan nauwkeurige massa matching uitvoeren met een neuropeptide massa database en de bijbehorende MS beelden extraheren. Voor klinische onderzoeksvragen, zoals biomarkerontdekking, kan deze software m/z-waarden extraheren die uniek zijn voor een weefselgebied van belang (meestal Region of Interest (ROI) -analyse genoemd)32 en statistische tests uitvoeren om te kwantificeren hoe verschillend twee weefselregio's zijn. Het is ook vermeldenswaard dat er ook minder software-opties voor gegevensanalyse zijn voor MS-beeldvorming dan voor LC-ESI-MS.
Het uitvoeren van LC-ESI-MS database zoekopdrachten naar neuropeptiden omvat vaak het gebruik van software-algoritmen gebouwd voor de analyse van verteerde peptiden. Als zodanig zijn er beperkingen aan software die niet-specifieke enzymdatabase-zoekopdrachten kan uitvoeren of de hoeveelheid tijd die nodig is om de zoekopdracht te voltooien. Momenteel worden endogene peptidezoekopdrachten uitgevoerd met het maximale aantal gemiste splitsingen, maar dit aantal is nog steeds beperkt, wat leidt tot mogelijk gemiste identificaties. Wanneer het genoom voor een soort niet volledig is gesequenced, zoals bij C. sapidus, kan de novo sequencing worden uitgevoerd om onbekende / nieuwe neuropeptiden te identificeren door middel van bekende geconserveerde neuropeptidesequentiemotieven, hoewel deze methode er niet in slaagt neuropeptiden te identificeren die onbekende motieven hebben of niet de motieven bevatten die worden gebruikt als neuropeptidefamilie-id's19. WSSMRGAWamide is bijvoorbeeld een motief voor de allatostatine B-type neuropeptide familie19. Hierin ligt de betekenis van transcriptoommijnbouw voor voorspelde neuropeptidesequenties voor soorten zonder een volledig gedecodeerde genoomsequentie33. Neuropeptide-identificaties worden vervolgens bevestigd door de vermeende peptidesequentie te synthetiseren en de MS / MS-spectra van synthetisch peptide en biologisch weefselte vergelijken 34. Zelfs nadat een sequentie is geverifieerd, is het soms onbekend of het de volledige neuropeptidesequentie of een afbraakproduct is. Het is vermeldenswaard dat verschillen tussen MALDI- en ESI-MS-ionisatiebronnen (ESI is een zachtere ionisatiemethode dan MALDI) kunnen leiden tot verschillende snelheden van kunstmatige afbraak (d.w.z. in-source fragmentatie). Om onderscheid te maken tussen een afgeknotte versie van een peptide en een kunstmatig geïnduceerd (d.w.z. niet in vivo) afbraakproduct, moet de preprohormoonverwerkingsroute voor dat neuropeptide bekend zijn. Omdat dit vaak niet het geval is, moet een synthetische vorm van het peptide worden gebruikt in fysiologische testen en worden geverifieerd op biologische activiteit.
Over het algemeen kan de workflow die hier wordt geïllustreerd voor neuropeptide-analyse een verscheidenheid aan verschillende velden ten goede komen. Het vult een technische leemte binnen de middle-down MS-analyse van peptiden omdat het is geoptimaliseerd voor endogene peptiden die kleiner zijn dan eiwitten die doorgaans worden geanalyseerd door bottom-up of top-down MS-analyses. Daarom moeten de monstervoorbereidingsmethoden die door neuropeptidomics worden gebruikt, grotendeels vertaalbaar zijn naar andere bioactieve endogene peptiden, zoals die waarop medicinale chemici zich richten op antibacteriële eigenschappen35. Een voordeel van dit protocol is dat het gebruik maakt van veelgebruikte instrumenten van populaire leveranciers die ook een extra mate van vertaalbaarheid bieden. Op deze manier kan de workflow worden gebruikt in academische en commerciële omgevingen, zoals screening op farmaceutische kandidaat-geneesmiddelen of medicijndoelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation (CHE-1710140 en CHE-2108223) en de National Institutes of Health (NIH) door middel van subsidie R01DK071801. A.P. werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health, onder de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award van het National Heart Lung and Blood Institute aan het University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. wil graag nih-subsidies R56 MH110215, S10RR029531 en S10OD025084 erkennen, evenals financieringssteun van een Vilas Distinguished Achievement Professorship en Charles Melbourne Johnson Professorship met financiering verstrekt door de Wisconsin Alumni Research Foundation en university of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al.
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P.
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S.
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
