Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן

Published: April 8, 2022 doi: 10.3791/63338
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Laboratory of Neurochemistry, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Laboratory of Neuroenergetics and Inborn Errors of Metabolism, Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Laboratory of Neurochemistry and Cell Biology, Institute of Life Sciences, Universidade Federal da Bahia

Summary

הדמיית סידן תאים היא מתודולוגיה רב-תכליתית לחקר איתות דינמי של תאים בודדים, על אוכלוסיות מעורבות בתרבית או אפילו על בעלי חיים מתעוררים, המבוססת על הביטוי של ערוצים / קולטנים חדירים לסידן המעניקים חתימות פונקציונליות ייחודיות.

Abstract

כאן, אנו מדווחים על מודלים סלקטיביים במבחנה של מעגלים המבוססים על גליה (אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ומיקרוגליה) ו / או נוירונים מציוד היקפי (גרעיני שורש הגב) ורקמות מרכזיות (קליפת המוח, אזור תת-חדרי, אורגנויד) הנחקרים באופן דינמי במונחים של שינויי סידן. המודל שנבחר כדי להמחיש את התוצאות הוא הרשתית, רקמה פשוטה עם אינטראקציות תאיות מורכבות. סידן הוא שליח אוניברסלי המעורב ברוב התפקידים התאיים החשובים. אנו מסבירים בפרוטוקול שלב אחר שלב כיצד תאי נוירון-גליה ברשתית בתרבית יכולים להיות מוכנים ומוערך, לדמיין שינויי סידן. במודל זה, אנו מבדילים נוירונים מגליה בהתבסס על התגובה הסלקטיבית שלהם ל- KCl ו- ATP. קולטנים חדירים סידן וערוצים באים לידי ביטוי באופן סלקטיבי בתאים שונים. כדי לנתח תגובות סידן, אנו משתמשים במתים פלואורסצנטיים יחסיים כגון Fura-2. בדיקה זו מכמתת ריכוז Ca2+ חופשי המבוסס על צורות Ca2+ ללא Ca2 + ו- Ca2 + מאוגדות, ומציגה שתי פסגות שונות, המבוססות על עוצמת הפלואורסצנטיות הנתפסת בשני אורכי גל.

Introduction

בשל התכונות האוניברסליות של סידן כשליח שני, יון זה מעורב במספר עצום של פעילויות איתות: שעתוק גנים, לידה ומוות, התפשטות, הגירה ובידול, שידור סינפטי ופלסטיות. לפיכך, שיטה המסוגלת לעקוב אחר דינמיקת הפעלת הסידן בנאמנות וזריזות תספק דרך להתבונן בתגובות מרחביות-זמניות ייחודיות. שיטה כזו היא טכניקת הדמיית הסידן התאית, אשר מתאמת סידן מעביר נתונים פונקציונליים עם פנוטיפים ספציפיים של התא בהתבסס על התגובות הייחודיות שלהם.

בדיקות Ca2+ פותחו לראשונה בשנות השמונים, עם שיפורים מאוחרים יותר המאפשרים שימוש במולקולות אלה בבדיקות תאים חיים1. כאינדיקטור כימי, Fura-2 נחשב לסטנדרט למדידות כמותיות [Ca2+]i. אסתר האצטוקסימתיל (AM) של מחוון זה (כלומר, Fura-2 AM) מחלחלת בקלות לקרום התא ויכולה להגיע לריכוזים תאיים גדולים פי 20 מדילול הדגירה (למשל, [5 μM]o/[100 μM]i). יתרון נוסף של Fura-2 הוא שיש לו התנגדות טובה להלבנה פוטו; לפיכך, הדמיית אינדיקטור זה לפרקי זמן ארוכים יותר לא תשפיע רבות על יכולות הפלואורסצנטיות שלה. לבסוף, Fura-2 רגיש למגוון רחב של רמות סידן, מ ~ 100 nM כדי ~ 100 מיקרומטר, ויש לו Kd של ~ 145 nM, אשר דומה למנוחה [Ca2 +]i2. מאוחר יותר, הדמיית סידן התא פותחה עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים טובים יותר ושיטות חישוב, יחד עם בדיקות יחס שאינן מושפעות מטעינת צבע.

כל תא מבטא התקני סידן שונים (משאבות, מובילים, קולטנים וערוצים) התורמים לתגובה הסופית כחתימה מסוימת. הטיפ החשוב הוא למצוא תגובות סלקטיביות של סוגים שונים של תאים בקורלציה עם הביטוי הפנוטיפי שלהם. בהתאם לכך, ישנם לפחות שני קולטנים שונים הפועלים באמצעות משמרות סידן: קולטנים יונוטרופיים המחלחלים Ca2 + במצב מהיר וקולטנים מטבוטרופיים איטיים בשילוב מסלולי איתות ומלאי תאיים המשחררים Ca2 + מופעל על ידי שליחים שניים, כגון אינוזיטול טריפוספט ו ADP-ריבוז מחזורי3.

לדוגמה, תאי אב מבטאים nestin ברשתית לא בוגרת ולהראות קולטני GABAA depolarized על ידי גאבא (או muscimol)4. זה קורה בשל שיפוע Cl- אלקטרוכימי עם רמות Cl − תאיות גבוהות; כמו הרקמה מתפתחת, מובילי KCC2 לעבור עירור על אבות לעיכוב על נוירונים GABAergic בוגר5. מצד שני, תאי גזע המבטאים sox-2 באזור תת-חדרי לא בוגר (SVZ) של מכרסמים לאחר הלידה מציגים גם קולטני H1 מטבוטרופיים המופעלים על ידי היסטמין הגדלת Ca2 + בצורה איטית6. קולטן מטבוטרופי שני ממשפחת קולטן-1 המופעלת על ידי פרוטאז (PAR-1), המופעל על ידי תרומבין ובמורד הזרם ל- G(q/11) ופוספוליפאז C (PLC), נותן משמרות Ca2 + איטיות באוליגודנדרוציטים (המבטאים O4 ו- PLP) הנוצרים מתאי עצב גזע SVZ מרובים7.

באופן כללי, נוירונים מבטאים ערוצי סידן תלויי מתח, כמו גם קולטני נוירוטרנסמיטר עיקריים חדיר Ca2 +, כמו גלוטמטרגי (אמפא, NMDA, kainate) וקולטנים היקפיים ומרכזיים nicotinic. אשלגן כלורי משמש בדרך כלל כסוכן depolarizing להפעלת נוירונים היקפיים, כמו נוירונים גנגליון שורש הגב8 או נוירונים מרכזיים, כמו מאזור subventricular9 או רשתית10. מצד שני, ATP מוכר כמו gliotransmitter העיקרי (בנוסף D-serine), אשר מפעיל חברי Ca2 + חדירים סלקטיביים P2X, כמו P2X7 ו P2X4. שני הקולטנים מציגים זרמי Ca2+ מקבילים, בדומה לאלה המוצגים על ידי קולטני NMDA המוכרים כזרמי Ca2 + הגדולים ביותר המופעלים על ידי משדרים11. קולטני P2X7 באים לידי ביטוי מאוד על מיקרוגליה, אבל בצפיפות נמוכה יותר על אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים, שיש להם תפקיד בשחרור של ציטוקינים פרו-דליקים12. קולטני P2X7 באים לידי ביטוי גם על תאי Schwann13 ו Müller גליה ברשתית14,15.

הרשתית ידועה להראות כמעט את כל המשדרים שנראו במוח. לדוגמה, הציר האנכי (קולטני אור, תאי גנגליון דו קוטביים ורשתית) הוא בעיקר גלוטמטרגי, עם קולטני אמפא חדירים לסידן או kainate המתבטאים בתאים OFF-דו-קוטביים ו- mgluR6 המתבטאים בתאים דו-קוטביים 16. באופן מוזר, כל שלושת הקולטנים נמצאים גם מולר גליה, אשר מצמידים סידן ואינוזיטול טריפוספט מסלולים17,18. ציר מעכב אופקי, שנעשו על ידי תאים אופקיים amacrine, להפריש לא רק גאבא, אלא גם דופמין, אצטילכולין, נוירוטרנסמיטורים קלאסיים אחרים. תאי Amacrine הם הסוגים העיקריים של תאים שנמצאו בתרביות רשתית העופות, מראה מספר סוגים של ערוצים המופעלים על ידי סידן, כמו glutamatergic, purinergic, ניקוטיני ומתח תלוי סידן תעלות סידן. מסיבה זו, זהו מודל מצוין להערכת תכונות שונות של סידן משתנה בין נוירונים גליה.

לכן, השילוב של קולטנים וערוצים שונים הסתכם סמנים פנוטיפיים סלקטיביים במהלך הפיתוח עם דפוסי תגובה אגוניסטיים ברורים מאפשר חתימות ייחודיות גזע, אב, נוירון, אסטרוציט, אוליגודנדרוציטים, ומיקרוגליה הפועלים באמצעות התקני איתות סלקטיביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים אושרו ובוצעו על ידי ובוצעו בעקבות ההנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, בעקבות "עקרונות הטיפול בבעלי חיים במעבדה" (NIH, Bethesda, ארה"ב); מספר היתר IBCCF-035 עבור ביצי עוף לגהורן לבן מופרות.

1. הכנת פתרונות

  1. הכן פתרון קרבס: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.4 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 6 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 373 mOsm).
  2. הכן מאגר מלוחים (Ca2+ ו Mg2 + פתרון חינם - CMF): 76.55 גרם / L NaCl, 3.05 גרם / L KCl, 1.65 גרם / L Na2HPO4, 0.610 g / L KH2PO4, 21.95 גרם / ליטר גלוקוז, ו 7.90 גרם / L NaHCO3.
  3. הכן פתרון דגירה (עם Fura-2 בפתרון קרבס:) 5 μM Fura-2-acetoxymethyl אסתר (Fura-2), 0.1% אלבומין סרום בקר ללא חומצות שומן (BSA), ו 0.02% פולוקסמר 407.
  4. לאוכלוסייה מעורבת או לתרבות גליה, הכינו DMEM/F12 עם 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו-40 מ"ג/ליטר גנטמיצין כאמצעי.
  5. עבור תרבות מועשרת נוירונים, להכין DMEM / F12 עם 1% FCS, תוספת תרבית התא העצבי, 40 מ"ג / L וגנטמיצין כמו המדיום.

2. כריתת רשתית והכנה תרבית תאים

  1. פתחו את ביצת העובר בן ה-8 ימים (E8) שבה נמצא תא האוויר.
  2. מוציאים את תכולת הביצית לצלחת פטרי וממשיכים עם המתת החסד העוברית על ידי עריפת ראש עם זוג פינצטה.
  3. מביאים את הראש לצלחת פטרי נקייה ויוצקים קצת תמיסה נטולת סידן ומגנזיום (CMF) כדי לשטוף אותה.
  4. הסר את העיניים, הקפדה לא לפגוע בו בתהליך.
    הערה: נסו להימנע מחיתוך או גריסה של שכבות העין לפני הסרתן מחלל העין.
  5. הביאו את העיניים לצלחת פטרי נקייה המכילה CMF.
  6. התחל את ניתוח העין על ידי הסרת העדשה.
  7. בצע 3 או 4 חתכים אורך בעין, החל על ידי החור שנותר על ידי העדשה. לעשות חתכים על ידי משיכת פינצטה, מחזיק את סקלרה העין בכיוונים מנוגדים.
  8. הסר את הגוף הזגוגי השקוף בזהירות, לוודא כי הרשתית אינה קשורה אליו.
  9. לנתק את הרשתית מן האפיתל פיגמנטי ולהסיר כל רקמה שנותרה.
  10. חותכים את הרשתית הברורה לחתיכות קטנות.
  11. העבר את הרשתית לנמען אחר וצנטריפוגה לזמן קצר (~ 1,800 x g למשך דקה אחת) כדי להסיר את ה- CMF.
  12. באופן אנזימטי לנתק את הרשתית עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, על ידי דגירה זה ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
  13. עצור את התגובה על ידי הוספת 1 מ"ל של בינוני המכיל 10% FCS.
  14. לשטוף את הרשתית 2 או 3 פעמים עם בינוני. הכביסה מורכבת ממחזורים של הוספת בינוני והסרתו על ידי צנטריפוגה (~ 1,800 x גרם במשך דקה אחת).
  15. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום מלא לכל רשתית ומנתקים בעדינות את הרשתית באופן מכני על ידי הזרמתה למעלה ולמטה.
    הערה: כאן, חוקרים יכולים לבחור איזה סוג של תרבות יהיה מוכן. לתרבות עצבית מועשרת, יש להשתמש ב-DMEM-F12 + תוסף עצבי + 1% FCS + אנטיביוטיקה. לאוכלוסייה מעורבת או גליה מטוהרת, יש להשתמש ב-DMEM-F12 + 10% FCS + אנטיביוטיקה.
  16. לספור את התאים ולדלל אותם לצפיפות הרצויה.
    הערה: באופן אידיאלי, זה צריך להיות תרבות בצפיפות נמוכה עם ~ 2 x 106 תאים או פחות.
  17. הוסף 50 μL של השעיית התא לכל כיסוי כיסוי.
  18. טיפול בכיסוי
    1. דגירה מכסה לפחות 1 שעות (באופן אידיאלי לילה) ב 1 מ"ל של 10-50 מיקרוגרם / מ"ל פולי-L-ליזין במים מטוהרים מעוקרים ב 37 °C (37 °F).
    2. הסר את תמיסת פולי-L-ליזין ולשטוף כיסויים עם מים מטוהרים מעוקרים 2-3 פעמים.
    3. אפשר לכסותים להתייבש בארון בטיחות עם אורות UV דולקים. בשלב זה, לאחסן אותם במיכל אטום ב 4 °C (65 °F) עד חודש אחד.
    4. שלב אופציונלי: עבור תרביות מועשרות נוירונים, להוסיף 50 μL של 10-20 ng /mL למינין ב- PBS או בינוני לכל כיסוי עבור 2 שעות ב 37 °C (37 °F). לאחר הדגירה, להסיר למינין פתרון עודף ואת כיסוי מוכן לשימוש.
  19. תאי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 עד שהם מתחברים לזכוכית. זה צריך לקחת בערך 1-2 שעות.
  20. מוסיפים 1 מ"ל של מדיום מלא לכל באר ומחזירים את הצלחת לאינקובטור עד יום הניסוי. במידת הצורך, לשנות את המדיום כל 2-3 ימים.

3. טעינת תאים עם פורה-2 AM

  1. לשחזר בקבוקון 50 מיקרוגרם של פורה-2 AM עם 50 μL של DMSO.
  2. כדי להכין פתרון פורה-2 AM עובד, להוסיף 3 μL של 10% Poloxamer 407, 7.5 μL של Fura-2 AM ב DMSO ו Krebs פתרון q.s.p. ל 1.5 מ"ל.
  3. Sonicate התערובת במשך 7 דקות באמבט מים.
  4. לשטוף את כיסוי עם תרבית התא 3x עם פתרון קרבס לפני הדגירה אותו Fura-2.
  5. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות.
  6. לאחר הדגירה, לשטוף אותו 3x שוב ולהעביר אותו לנמען אחר המכיל קרבס ומוגן מפני האור.
    הערה: פתרון Fura-2 AM עובד נשאר יציב במשך 24 שעות אם מוגן מפני האור.

4. הדמיית סידן של תאים

  1. לפני כל ריצה, הוסיפו סיליקון לתמיכה ולתמיכת כיסוי כדי למנוע דליפה במהלך הניסוי.
  2. לשטוף את החלק התחתון של כיסוי עם מים מזוקקים כדי למנוע התגבשות מלח על עדשת המיקרוסקופ.
  3. שים את כיסוי על התמיכה, בעדינות לחיצה על הגבולות.
  4. חבר את התמיכה והתא למיקרוסקופ ולהתחיל לתזקף תאים עם פתרון קרבס.
    הערה: זלוף תאים במהלך ניסויים הדמיית סידן תא יחיד מכויל לקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה, וזה לוקח 8-10 s עבור פתרון הפלטפורמה להיות מוחלף באופן מלא.
  5. הבט בתאים ובחר שדה ראייה מתאים.
  6. בחר ידנית את גופי התא בהתבסס על המורפולוגיה הייחודית שלהם.
  7. לפני החלת כל גירוי, לחכות ייצוב בסיסי. כל גירוי צריך לקחת בערך 30 שניות.
    הערה: הכינו את כל הפתרונות מיד לפני כל ניסוי.
  8. הערך את הווריאציות ב- [Ca2+]i על-ידי כימות היחס בין הפלואורסצנטיות הנפלטת ב- 510 ננומטר לאחר עירור חלופי (750 אלפיות השניה) ב- 340 ו- 380 ננומטר.
  9. עבד ערכים שנרכשו באמצעות תוכנת ניתוח פלואורסצנטיות.
  10. תוצאות ניסיוניות מפורשות בטבלה שבה כל שורה מייצגת תא בודד, וכל שורה היא נקודת זמן.

5. עיבוד נתונים

  1. באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני, להתוות את הווריאציה של Fura-2 ערכי יחס פלואורסצנטיות של תאים יחידים בנפרד או של כולם בו זמנית.
  2. כדי לכמת את מספר התאים תגובתיים לגירוי שנקבע, הגדר ניתוק של 30% עלייה ברמות הבסיס של הסידן

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, השתמשנו בתאי רשתית בתרבית מגוזלי היום העוברי 8 כדי לחקור כיצד נוירונים וגליה מאותתים במונחים של משמרות סידן. תרביות הוכנו למעשה כפי שתואר 15,19 כתאי נוירון-גליה מעורבים (בצפיפות של ≥ 1 x 106 תא / צלחת) בשלב של 7 ימים במבחנה (איור 1A). לחלופין, תאים עצביים מועשרים המועשרים המוכנים בצפיפות נמוכה (5 x 105 תאים/צלחת), שנזרעים על פולי-L-ליזין מטופל (10 מיקרוגרם/מ"ל) מכסים בשלב של 3 ימים במבחנה (איור 1B). בנוסף, Müller גליה מטוהר נשמרו במשך 10 ימים ב- DMEM המכיל 10% FCS, כאשר נוירונים הוסרו. על מנת לכמת באופן פונקציונלי את התגובות של נוירונים גליה, תאים היו מגורה עם 50 mM KCl או 1 mM ATP. כפי שמוצג (איור 1A), מתוך 302 תאים, 50% הגיבו ל- KCl בעוד 53% אותתו ל- ATP. במובן זה, בתרבית תאים עצביים מועשרים היו 89% מתגובות הסידן ל- KCl לעומת 17% שהגיבו ל- ATP (איור 1B). ואכן, תרבות מולר גליה מטוהרת, שבה נוירונים מוסרים לאחר 10 ימים בתרבות, הופעלה אך ורק על ידי ATP (איור 1C).

Figure 1
איור 1. תאי רשתית שהוכנו כתרביות מעורבות, מועשרות עצביות או מטוהרות גליה מראות דפוסי תגובה שונים על דימות סידן. (A) שדות בהירים ופלואורסצנטיים של תאי רשתית עוברית מעורבים בתרבית. אותו שדה מיקרוסקופ המוצג תחת 5 מיקרומטר fura-2 AM פלואורסצנטיות. 50 mM KCl מפעיל מחצית מהתאים (פנוטיפ עצבי), בעוד 1 mM ATP מפעיל את החצי השני (פנוטיפ גליה), עם יחסי F340/380 גבוהים המתאימים לעלייה ברמות הסידן התאיים ([Ca2+]i). (B) תרבית התא העצבי המועשר הייתה תגובה של 89% סידן ל- KCl לעומת 17% שהגיבו ל- ATP. (ג) מצד שני, תרבות מולר גליה מטוהרת, שבה נוירונים מוסרים לאחר 10 ימים בתרבות, הופעלה אך ורק על ידי ATP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השתמשנו ברקמת הרשתית כדי להראות שתגובות הסידן בתיווך KCl או ATP ממודרות בבירור לתגובות עצביות וגליות, בהתאמה (איור 1). למרות כמה נתונים בספרות לרמוז כי קולטני P2X7 באים לידי ביטוי נוירונים, אשר לווסת את הפעילות העצבית ואת שחרור נוירוטרנסמיטר סינפטי 20, מחברים אחרים מטילים ספק בקיומם של קולטני P2X7 עצביים. ואכן, התוצאות הנוכחיות מקיימות את הרעיון שקולטני P2X7 גליה ראשוניים מתווכים השפעות עצביות שהסתכמו בריכוזי ATP חוץ תאיים גבוהים שנמצאו ברקמות לא בריאות21.

קישרנו בעבר את ההבחנה התפקודית של תאי הרשתית עם התצוגה הפנוטיפית שלהם, באופן ששינויים של [Ca2+]i משתנים המופעלים על ידי KCl או AMPA (אגוניסט גלוטמט) מבטאים חלבון הקשור למיקרוטובולה (MAP-2), סמן של נוירון בוגר1. לחלופין, תאים המופעלים על ידי ATP אקספרס גלוטמין סינתטאז, סמן גליה מולר טיפוסי.

השתמשנו בסוגים שונים של תרביות תאים כפי שמוצג כאן (תאי גליה מעורבים, עצביים מועשרים או מטוהרים), בנוסף לנוירוספירות הנגזרות4 כדי לענות על שאלות רבות הקשורות למערכות נוירוכימיות שונות כמו גלוטמטרגי222, דופאמין19, GABAergic23, קנבינואידים9,10, purinergic14,24, serotoninergic25 בין היתר כדי להבין את התקשורת הנוירו-גלית ברשתית., Müller גליה להביע מספר רב של קולטני נוירוטרנסמיטר26 ולהפריש gliotransmitters כמו D-serine, ATP וגלוטמט, אשר עשוי להשתחרר שלפוחית, Ca2 + תלוי באופן27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מענקים, נותני חסות ומקורות מימון: MH מקבל מלגת CNPq לדוקטורט. HRF מקבל מלגת פוסט-דוקטורט הנתמכת על ידי CNPq (מספר מענק HRF 152071/2020-2). RAMR נתמך על ידי CNPq ו- FAPERJ (מספרי מענק E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 ו-312157/2016-9 ו-INCT-INNT (המכון הלאומי למדעי המוח התרגומיים).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mm coverslip Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 111550 Cell suport
510 nm long-pass filter Carl Zeiss
ATP Sigma A1852
B-27 Supplement Gibco 17504044 Suplement
CaCl2 Sigma-Aldrich C8106
CoolSNAP digital camera Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose Neon 1466
DMEM/ F-12 Gibco 12400-24 Cell culture medium
Excel Software Microsoft
Fetal Calf Serum Sigma-Aldrich F9665 Suplement
Fluorescence Microscope Axiovert 200; Carl Zeiss B 40-080
Fura-2 AM Molecular Probes F1221 Ratiometric Ca2+ indicator
Gentamicin Sulfate Calbiochem 1405-41-0 antibiotics
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Lambda DG-4 apparatus Sutter Instrument, Novato, CA DG-4PLUS/OF30
Laminin Gibco 23017-015 Help cell adhesion
Metafluor software Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2 Sigma M4880
Na2HPO4 Vetec 129
NaCl Isofar 310
NaHCO3 Vetec 306
PH3 platform Warner Intruments, Hamden, CT 64-0286
Pluronic F-127 Molecular Probes P6866 nonionic, surfactant
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920 Help cell adhesion
Trypsin-EDTA 0.25% Gibco 25200056 Dissociation enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
  2. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  3. Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
  4. De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
  5. Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
  6. Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
  7. Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
  8. Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
  9. Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
  10. Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
  11. Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
  12. Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
  13. Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
  14. Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
  15. Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
  16. Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
  17. Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
  18. López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
  19. Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
  20. Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
  21. Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
  22. Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
  23. Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neuroscience. 281, 208-215 (2014).
  24. Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
  25. Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
  26. de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
  27. Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).

Tags

מדעי המוח בעיה 182 דימות סידן גל סידן מעגלי נוירון-גליה ATP גלוטמט רשתית DRG גליוטרנסמיטר
הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tempone, M. H., Freitas, H. R.,… More

Tempone, M. H., Freitas, H. R., Schitine, C. S., de Melo Reis, R. A. Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique. J. Vis. Exp. (182), e63338, doi:10.3791/63338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter