Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تصور التحولات على دائرة الخلايا العصبية الدبقية باستخدام تقنية تصوير الكالسيوم

Published: April 8, 2022 doi: 10.3791/63338
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Laboratory of Neurochemistry, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Laboratory of Neuroenergetics and Inborn Errors of Metabolism, Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Laboratory of Neurochemistry and Cell Biology, Institute of Life Sciences, Universidade Federal da Bahia

Summary

تصوير الكالسيوم الخلوي هو منهجية متعددة الاستخدامات لدراسة الإشارات الديناميكية للخلايا الفردية ، على مجموعات مختلطة في الثقافة أو حتى على الحيوانات المستيقظة ، استنادا إلى التعبير عن القنوات / المستقبلات النفاذة للكالسيوم التي تعطي توقيعات وظيفية فريدة من نوعها.

Abstract

هنا ، نقدم تقريرا عن نماذج انتقائية في المختبر للدوائر القائمة على الخلايا الدبقية (الخلايا النجمية ، الخلايا قليلة التغصن ، والخلايا الدبقية الصغيرة) و / أو الخلايا العصبية من الأطراف الطرفية (العقد الجذرية الظهرية) والأنسجة المركزية (القشرة ، المنطقة تحت البطينية ، العضوية) التي تتم دراستها ديناميكيا من حيث تحولات الكالسيوم. النموذج الذي تم اختياره لتوضيح النتائج هو شبكية العين، وهي نسيج بسيط مع تفاعلات خلوية معقدة. الكالسيوم هو رسول عالمي يشارك في معظم الأدوار الخلوية الهامة. نوضح في بروتوكول خطوة بخطوة كيف يمكن إعداد وتقييم الخلايا العصبية الدبقية الشبكية في الثقافة ، مع تصور تحولات الكالسيوم. في هذا النموذج ، نفرق بين الخلايا العصبية والدبقية بناء على استجابتها الانتقائية ل KCl و ATP. يتم التعبير عن المستقبلات والقنوات النفاذة للكالسيوم بشكل انتقائي في مقصورات مختلفة. لتحليل استجابات الكالسيوم، نستخدم قوالب الفلورسنت النسبية مثل Fura-2. يحدد هذا المسبار تركيز Ca2+ الحر استنادا إلى الأشكال المرتبطة ب Ca2 + و Ca2 + ، مما يعرض قمتين مختلفتين ، مبنيتين على شدة التألق المدركة على طولين موجيين.

Introduction

نظرا للخصائص العالمية للكالسيوم كرسول ثان ، يشارك هذا الأيون في عدد كبير من أنشطة الإشارة: النسخ الجيني ، والولادة والموت ، والانتشار ، والهجرة والتمايز ، والانتقال المشبكي ، واللدونة. وبالتالي ، فإن الطريقة القادرة على تتبع ديناميكيات تنشيط الكالسيوم بدقة وخفة الحركة ستوفر طريقة لمراقبة الاستجابات المكانية والزمانية الفريدة. هذه الطريقة هي تقنية تصوير الكالسيوم الخلوية ، والتي تربط بين البيانات الوظيفية لتحولات الكالسيوم مع أنماط ظاهرية خلية محددة بناء على استجاباتها المتميزة.

تم تطوير مجسات Ca2+ لأول مرة في عام 1980 ، مع تحسينات لاحقة تسمح باستخدام هذه الجزيئات في فحوصات الخلايا الحية 1. كمؤشر كيميائي ، يعتبر Fura-2 هو المعيار للقياسات الكمية [Ca2 +]i. يتخلل استر الأسيتوكسي ميثيل (AM) لهذا المؤشر (أي Fura-2 AM) غشاء الخلية بسهولة ويمكن أن يصل إلى تركيزات داخل الخلايا أكبر ب 20 ضعفا من تخفيف الحضانة (على سبيل المثال ، [5 μM] o / [100 μM]i). ميزة أخرى ل Fura-2 هي أن لديها مقاومة جيدة للتبييض الضوئي. وبالتالي ، فإن تصوير هذا المؤشر لفترات أطول من الزمن لن يؤثر بشكل كبير على قدراته الفلورية. أخيرا ، Fura-2 حساس لمجموعة واسعة من مستويات الكالسيوم ، من ~ 100 نانومتر إلى ~ 100 ميكرومتر ، ولديه دينار كويتي من ~ 145 نانومتر ، وهو ما يمكن مقارنته بالراحة [Ca2 +] i2. في وقت لاحق ، تم تطوير تصوير الكالسيوم الخلوي باستخدام مجاهر فلورسنت أفضل وطرق حسابية ، إلى جانب تحقيقات قياس النسبة التي لا تتأثر بتحميل الصبغة.

تعبر كل خلية عن أجهزة الكالسيوم المختلفة (المضخات والناقلات والمستقبلات والقنوات) التي تساهم في الاستجابة النهائية كتوقيع معين. النصيحة المهمة هي العثور على استجابات انتقائية لأنواع مختلفة من الخلايا المرتبطة بتعبيرها الظاهري. وبناء على ذلك، هناك مستقبلان مختلفان على الأقل يعملان من خلال تحولات الكالسيوم: المستقبلات الأيونية التي تتخلل Ca2+ في وضع سريع ومستقبلات التمثيل الغذائي البطيئة إلى جانب مسارات الإشارات والمخزونات داخل الخلايا التي تطلق Ca2+ التي يتم تنشيطها بواسطة رسل ثانية، مثل الإينوزيتول ثلاثي الفوسفات وADP-ribose3 الدوري.

على سبيل المثال، تعبر الخلايا السلفية عن العشين في شبكية العين غير الناضجة وتظهر مستقبلات GABAA غير المستقطبة بواسطة GABA (أو muscimol)4. يحدث هذا بسبب التدرج الكهروكيميائي Cl مع مستويات Cl− عالية داخل الخلايا. مع تطور الأنسجة ، يتحول الناقلون KCC2 من الإثارة على السلف إلى تثبيط الخلايا العصبية GABAergic الناضجة5. من ناحية أخرى ، فإن الخلايا الجذعية التي تعبر عن sox-2 في المنطقة تحت البطينية غير الناضجة (SVZ) للقوارض بعد الولادة تقدم أيضا مستقبلات H1 الأيضية التي يتم تنشيطها بواسطة الهيستامين الذي يزيد من Ca2 + بطريقة بطيئة 6. وهناك مستقبل استقلابي ثان من عائلة المستقبلات المنشطة بالبروتياز-1 (PAR-1)، يتم تنشيطه بواسطة الثرومبين والمصب إلى G(q/11) وفوسفوليباز C (PLC)، يعطي تحولات بطيئة Ca2+ في الخلايا القليلة التغصن (التي تعبر عن O4 و PLP) المتولدة من الخلايا الجذعية العصبية SVZ متعددة القدرات7.

بشكل عام ، تعبر الخلايا العصبية عن قنوات الكالسيوم المعتمدة على الجهد بالإضافة إلى مستقبلات الناقل العصبي الرئيسية النفاذة إلى Ca2 + ، مثل الغلوتاماتيرجيك (AMPA ، NMDA ، kainate) ومستقبلات النيكوتين الطرفية والمركزية. عادة ما يستخدم كلوريد البوتاسيوم كعامل إزالة الاستقطاب لتنشيط الخلايا العصبية الطرفية، مثل الخلايا العصبية العقدة الجذرية الظهرية8 أو الخلايا العصبية المركزية، اعتبارا من المنطقة تحت البطينية9 أو شبكية العين10. من ناحية أخرى ، يتم التعرف على ATP باعتباره جهاز الإرسال الدبقي الرئيسي (بالإضافة إلى D-serine) ، والذي ينشط أعضاء P2X الانتقائيين المؤثرين في Ca2 + ، مثل P2X7 و P2X4. يقدم كلا المستقبلين تيارات Ca2+ مكافئة ، على غرار تلك التي أظهرتها مستقبلات NMDA المعترف بها كأكبر تيارات Ca2 + التي يتم تنشيطها بواسطة أجهزة الإرسال 11. يتم التعبير عن مستقبلات P2X7 بشكل كبير على الخلايا الدبقية الصغيرة ، ولكن بكثافة أقل على الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن ، ولها دور في إطلاق السيتوكينات المسببة للالتهابات 12. يتم التعبير عن مستقبلات P2X7 أيضا على خلايا Schwann13 ودبقية مولر في شبكية العين14,15.

من المعروف أن شبكية العين تظهر تقريبا جميع أجهزة الإرسال التي شوهدت في الدماغ. على سبيل المثال ، المحور الرأسي (المستقبلات الضوئية ، الخلايا العقدية ثنائية القطب والشبكية) هو أساسا غلوتاماتيرجي ، مع مستقبلات AMPA أو kainate النفاذة للكالسيوم المعبر عنها في الخلايا ثنائية القطب OFF-polar و mgluR6 المعبر عنها في الخلايا ثنائية القطب ON-bipolar16. ومن الغريب أن جميع المستقبلات الثلاثة موجودة أيضا في دبقية مولر ، والتي تقترن بمسارات الكالسيوم والإينوزيتول ثلاثي الفوسفات17،18. المحور المثبط الأفقي ، الذي تصنعه الخلايا الأفقية والأماكرين ، لا يفرز فقط GABA ، ولكن أيضا الدوبامين والأسيتيل كولين وغيرها من الناقلات العصبية الكلاسيكية. خلايا أماكرين هي الأنواع الرئيسية من الخلايا الموجودة في مزارع شبكية العين للطيور ، والتي تظهر عدة أنواع من القنوات التي تعمل بالكالسيوم ، مثل قنوات الكالسيوم الغلوتاماتية والبيورينية والنيكوتينية والجهد الكهربائي. لهذا السبب ، يعد هذا نموذجا ممتازا لتقييم الخصائص المختلفة لتحولات الكالسيوم بين الخلايا العصبية والدبقية.

لذلك ، فإن الجمع بين المستقبلات والقنوات المختلفة التي تم تلخيصها في علامات النمط الظاهري الانتقائي أثناء التطوير مع أنماط استجابة ناهضة متميزة يسمح بتوقيعات فريدة في الجذع ، السلف ، الخلايا العصبية ، الخلايا النجمية ، oligodendrocyte ، و microglia التي تعمل من خلال أجهزة إشارات انتقائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب التي شملت الحيوانات وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، وفقا ل مبادئ رعاية المختبر (المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ رقم التصريح IBCCF-035 لبيض الدجاج الأبيض المخصب Leghorn.

1. إعداد الحلول

  1. تحضير محلول كريبس: (132 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 4 ملليمتر KCl ، 1.4 ملم MgCl2 ، 2.5 ملم CaCl2 ، 6 ملليمتر جلوكوز ، 10 ملم HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 373 mOsm).
  2. تحضير المخزن المؤقت الملحي (Ca2+ و Mg2+ الحل الحر - CMF): 76.55 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 3.05 جم / لتر KCl ، 1.65 جم / لتر Na2HPO4 ، 0.610 جم / لتر KH2PO4 ، 21.95 جم / لتر جلوكوز ، و 7.90 جم / لتر NaHCO3.
  3. تحضير محلول الحضانة (مع حل Fura-2 في Krebs:) 5 ميكرومتر فورا-2-أسيتوكسي ميثيل استر (فورا-2)، 0.1٪ ألبومين مصل البقر الخالي من الأحماض الدهنية (BSA)، و 0.02٪ بولوكسامير 407.
  4. بالنسبة للسكان المختلطين أو ثقافة الدبقية ، قم بإعداد DMEM / F12 مع مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS) و 40 مجم / لتر من الجنتاميسين كوسيط.
  5. للثقافة الغنية بالخلايا العصبية ، قم بإعداد DMEM / F12 مع 1٪ FCS ، ملحق زراعة الخلايا العصبية ، 40 مجم / لتر والجنتاميسين كوسيط.

2. تشريح الشبكية وإعداد زراعة الخلايا

  1. افتح بيضة جنين الفرخ (E8) البالغة من العمر 8 أيام حيث توجد خلية الهواء.
  2. قم بإزالة محتويات البيض إلى طبق بتري واستمر في القتل الرحيم للجنين عن طريق قطع الرأس باستخدام زوج من الملقط.
  3. أحضري الرأس إلى طبق بتري نظيف واسكبي بعض المحلول الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (CMF) لغسله.
  4. قم بإزالة العينين ، مع الحرص على عدم إتلافها في هذه العملية.
    ملاحظة: حاول تجنب قطع أو تمزيق طبقات العين قبل إزالتها من تجويف العين.
  5. أحضري العينين إلى طبق بتري نظيف يحتوي على CMF.
  6. ابدأ تشريح العين عن طريق إزالة العدسة.
  7. قم بإجراء 3 أو 4 جروح طولية في العين ، بدءا من الثقب الذي تركته العدسة. قم بإجراء تخفيضات عن طريق سحب الملقط ، مع إمساك الصلبة العينية في اتجاهين متعاكسين.
  8. قم بإزالة الجسم الزجاجي الشفاف بحذر ، مع التأكد من أن شبكية العين ليست مرتبطة به.
  9. افصل شبكية العين عن الظهارة المصطبغة وأزل أي أنسجة متبقية.
  10. قطع شبكية العين واضحة في قطع صغيرة.
  11. انقل شبكية العين إلى مستلم آخر وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (~ 1800 × g لمدة دقيقة واحدة) لإزالة CMF.
  12. قم بفصل شبكية العين إنزيميا مع 1 مل من 0.25٪ من التربسين ، عن طريق احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  13. أوقف التفاعل بإضافة 1 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ FCS.
  14. اغسل شبكية العين 2 أو 3 مرات بمتوسطة. يتكون الغسيل من دورات لإضافة وسيط وإزالته عن طريق الطرد المركزي (~ 1800 × g لمدة دقيقة واحدة).
  15. أضف 2 مل من الوسط الكامل لكل شبكية العين وافصل الشبكية ميكانيكيا بلطف عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: هنا ، يمكن للمحققين اختيار نوع الثقافة التي سيتم إعدادها. للحصول على ثقافة عصبية غنية ، استخدم DMEM-F12 + مكمل عصبي + 1٪ FCS + مضادات حيوية. بالنسبة للسكان المختلطين أو الدبقية النقية ، استخدم DMEM-F12 + 10٪ FCS + المضادات الحيوية.
  16. عد الخلايا وتخفيفها إلى الكثافة المطلوبة.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن تكون هذه ثقافة منخفضة الكثافة مع ~ 2 × 106 خلايا أو أقل.
  17. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل غطاء.
  18. علاج الانزلاق الغطائي
    1. احتضان الأغطية لمدة 1 ساعة على الأقل (من الناحية المثالية بين عشية وضحاها) في 1 مل من 10-50 ميكروغرام / مل بولي ل ليسين في الماء النقي المعقم عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بإزالة محلول poly-L-lysine واغسل أغطية الغطاء بالماء النقي المعقم 2-3 مرات.
    3. اترك الأغطية تجف في خزانة أمان مع تشغيل مصابيح الأشعة فوق البنفسجية. في هذه المرحلة ، قم بتخزينها في حاوية مغلقة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    4. الخطوة الاختيارية: بالنسبة للثقافات الغنية بالخلايا العصبية، أضف 50 ميكرولتر من 10-20 نانوغرام/مل من الصفيحة في PBS أو متوسطة إلى كل غطاء لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول laminin الزائد ويكون الغطاء جاهزا للاستخدام.
  19. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪ حتى تلتصق بالزجاج. هذا يجب أن يستغرق حوالي 1-2 ساعة.
  20. أضف 1 مل من الوسط الكامل إلى كل بئر وأعد اللوحة إلى الحاضنة حتى يوم التجربة. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام.

3. تحميل الخلايا مع Fura-2 AM

  1. إعادة تشكيل قارورة 50 ميكروغرام من Fura-2 AM مع 50 ميكرولتر من DMSO.
  2. لإعداد حل Fura-2 AM العامل ، أضف 3 ميكرولتر من 10٪ Poloxamer 407 ، 7.5 ميكرولتر من Fura-2 AM في DMSO وحل Krebs q.s.p. إلى 1.5 مل.
  3. سونيك الخليط لمدة 7 دقائق في حمام مائي.
  4. اغسل الغطاء بزراعة الخلايا 3x بمحلول كريبس قبل احتضانه في Fura-2.
  5. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
  6. بعد الحضانة ، اغسلها 3x مرة أخرى وانقلها إلى مستلم آخر يحتوي على كريبس ومحمي من الضوء.
    ملاحظة: يظل حل Fura-2 AM العامل مستقرا لمدة 24 ساعة إذا كان محميا من الضوء.

4. تصوير الكالسيوم للخلايا

  1. قبل كل تشغيل ، أضف السيليكون إلى دعامة الغطاء والغرفة لتجنب التسرب أثناء التجربة.
  2. اغسل الجزء السفلي من الغطاء بالماء المقطر لتجنب تبلور الملح على عدسة المجهر.
  3. ضع الغطاء على الدعامة ، واضغط برفق على الحدود.
  4. قم بتوصيل الدعم والغرفة بالمجهر وابدأ في اختراق الخلايا بمحلول Krebs.
    ملاحظة: تتم معايرة تروية الخلايا أثناء تجارب تصوير الكالسيوم أحادية الخلية إلى معدل تدفق يبلغ 0.5 مل / دقيقة ، ويستغرق استبدال حل النظام الأساسي بالكامل من 8 إلى 10 ثوان.
  5. ألق نظرة على الخلايا وحدد مجال رؤية مناسبا.
  6. حدد أجسام الخلايا يدويا بناء على مورفولوجيتها المتميزة.
  7. قبل تطبيق أي حافز ، انتظر استقرار خط الأساس. يجب أن يستغرق كل حافز حوالي 30 ثانية.
    ملاحظة: قم بإعداد جميع الحلول مباشرة قبل كل تجربة.
  8. قم بتقييم الاختلافات في [Ca2+] i عن طريق تحديد نسبة التألق المنبعث عند 510 نانومتر بعد الإثارة البديلة (750 مللي ثانية) عند 340 و 380 نانومتر.
  9. معالجة القيم المكتسبة باستخدام برنامج تحليل التألق.
  10. التعبير عن النتائج التجريبية في جدول يمثل فيه كل صف خلية فردية، وكل سطر نقطة زمنية.

5. معالجة البيانات

  1. باستخدام برنامج جدول بيانات ، ارسم تباين قيم نسبة التألق Fura-2 للخلايا المفردة بشكل منفصل أو جميعها في نفس الوقت.
  2. لتحديد عدد الخلايا التفاعلية لتحديد الحافز ، حدد حدا لزيادة بنسبة 30٪ في مستويات خط الأساس للكالسيوم

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا ، استخدمنا خلايا شبكية العين في الثقافة من فراخ اليوم الجنيني 8 للتحقيق في كيفية إشارة الخلايا العصبية والدبقية من حيث تحولات الكالسيوم. تم تحضير المستنبتات بشكل أساسي كما هو موصوف15,19 كخلايا عصبية دبقية مختلطة (بكثافة ≥ 1 × 106 خلية / طبق) في مرحلة من 7 أيام في المختبر (الشكل 1A). بدلا من ذلك ، الخلايا العصبية المخصبة المحضرة بكثافة منخفضة (5 × 105 خلية / طبق) ، مبذرة على أغطية بولي - إل ليسين المعالجة (10 ميكروغرام / مل) في مرحلة 3 أيام في المختبر (الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك ، تم الحفاظ على دبقية مولر النقية لمدة 10 أيام في DMEM تحتوي على 10٪ FCS ، عندما تمت إزالة الخلايا العصبية. من أجل تحديد استجابات الخلايا العصبية والدبقية وظيفيا ، تم تحفيز الخلايا باستخدام 50 mM KCl أو 1 mM ATP. كما هو موضح (الشكل 1A) ، من أصل 302 خلية ، استجاب 50٪ ل KCl بينما أشار 53٪ إلى ATP. وبهذا المعنى ، كان لزراعة الخلايا العصبية المخصبة 89٪ من استجابات الكالسيوم ل KCl مقارنة ب 17٪ التي استجابت ل ATP (الشكل 1B). في الواقع ، تم تنشيط ثقافة دبقية مولر النقية ، حيث تتم إزالة الخلايا العصبية بعد 10 أيام في الثقافة ، فقط بواسطة ATP (الشكل 1C).

Figure 1
الشكل 1. تظهر خلايا الشبكية المحضرة كثقافات مختلطة أو غنية بالخلايا العصبية أو منقية بدبقية أنماط استجابة مختلفة على تصوير الكالسيوم. (أ) الحقول الساطعة والفلورية لخلايا الشبكية الجنينية المختلطة في الثقافة. نفس حقل المجهر الموضح تحت 5 ميكرومتر فورا-2 AM التألق. 50 mM KCl ينشط نصف الخلايا (النمط الظاهري العصبي) ، في حين أن 1 mM ATP ينشط النصف الآخر (النمط الظاهري الدبقي) ، مع نسب F340/380 عالية المقابلة للزيادات في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ([Ca2 +]i). (ب) كان لمزرعة الخلايا العصبية المخصبة استجابة كالسيوم بنسبة 89٪ ل KCl مقارنة ب 17٪ التي استجابت ل ATP. (ج) من ناحية أخرى ، تم تنشيط ثقافة دبقية مولر النقية ، حيث تتم إزالة الخلايا العصبية بعد 10 أيام في الثقافة ، فقط بواسطة ATP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد استخدمنا أنسجة شبكية العين لإظهار أن استجابات الكالسيوم بوساطة KCl أو ATP مجزأة بوضوح إلى استجابات عصبية ودبقية ، على التوالي (الشكل 1). على الرغم من أن بعض البيانات في الأدبيات تشير إلى أن مستقبلات P2X7 يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية ، التي تنظم النشاط العصبي وإطلاق الناقل العصبي المشبكي 20 ، إلا أن مؤلفين آخرين يشككون في وجود مستقبلات P2X7 العصبية. في الواقع، تدعم النتائج الحالية فكرة أن مستقبلات P2X7 الدبقية الأولية تتوسط في التأثيرات العصبية التي يتم تلخيصها في تركيزات ATP العالية خارج الخلية الموجودة في الأنسجة غير الصحية21.

لقد ربطنا سابقا التمايز الوظيفي لخلايا الشبكية مع عرضها الظاهري ، بطريقة تجعل الاختلافات في [Ca2 +] i التي يتم تنشيطها بواسطة KCl أو AMPA (ناهض الغلوتامات) تعبر عن البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة (MAP-2) ، علامة على الخلايا العصبية الناضجة 1. بدلا من ذلك ، تعبر الخلايا التي يتم تنشيطها بواسطة ATP عن سينثيتاز الجلوتامين ، وهي علامة دبقية نموذجية من مولر.

لقد استخدمنا أنواعا مختلفة من مزارع الخلايا كما هو موضح هنا (الخلايا الدبقية المختلطة أو المخصب بالخلايا العصبية أو النقية) ، بالإضافة إلى الكرات العصبية المشتقة 4 للإجابة على العديد من الأسئلة المتعلقة بالأنظمة الكيميائية العصبية المختلفة مثل glutamatergic22 ، dopaminergic19 ، GABAergic23 ، cannabinoid9,10 ، purinergic14,24 ، serotoninergic25 ، من بين أمور أخرى لفهم التواصل الشبكي العصبي الدبقي. تعبر دبقية مولر عن عدد كبير من مستقبلات الناقل العصبي26 وتفرز أجهزة الإرسال الدبقي مثل D-serine و ATP والغلوتامات ، والتي يمكن إطلاقها بطريقة حويصلة تعتمد على Ca2 + 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

المنح والرعاة ومصادر التمويل: يتلقى MH زمالة CNPq للدكتوراه. تتلقى HRF زمالة ما بعد الدكتوراه بدعم من CNPq (رقم منحة HRF 152071/2020-2). يتم دعم RAMR من قبل CNPq و FAPERJ (أرقام المنح E-26/202.668/2018 و E-26/010.002215/2019 و 426342/2018-6 و 312157/2016-9 و INCT-INNT (المعهد الوطني لعلم الأعصاب الانتقالي).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mm coverslip Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 111550 Cell suport
510 nm long-pass filter Carl Zeiss
ATP Sigma A1852
B-27 Supplement Gibco 17504044 Suplement
CaCl2 Sigma-Aldrich C8106
CoolSNAP digital camera Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose Neon 1466
DMEM/ F-12 Gibco 12400-24 Cell culture medium
Excel Software Microsoft
Fetal Calf Serum Sigma-Aldrich F9665 Suplement
Fluorescence Microscope Axiovert 200; Carl Zeiss B 40-080
Fura-2 AM Molecular Probes F1221 Ratiometric Ca2+ indicator
Gentamicin Sulfate Calbiochem 1405-41-0 antibiotics
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Lambda DG-4 apparatus Sutter Instrument, Novato, CA DG-4PLUS/OF30
Laminin Gibco 23017-015 Help cell adhesion
Metafluor software Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2 Sigma M4880
Na2HPO4 Vetec 129
NaCl Isofar 310
NaHCO3 Vetec 306
PH3 platform Warner Intruments, Hamden, CT 64-0286
Pluronic F-127 Molecular Probes P6866 nonionic, surfactant
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920 Help cell adhesion
Trypsin-EDTA 0.25% Gibco 25200056 Dissociation enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
  2. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  3. Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
  4. De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
  5. Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
  6. Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
  7. Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
  8. Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
  9. Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
  10. Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
  11. Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
  12. Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
  13. Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
  14. Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
  15. Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
  16. Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
  17. Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
  18. López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
  19. Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
  20. Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
  21. Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
  22. Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
  23. Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neuroscience. 281, 208-215 (2014).
  24. Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
  25. Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
  26. de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
  27. Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 182 ، تصوير الكالسيوم ، موجة الكالسيوم ، دوائر الخلايا العصبية الدبقية ، ATP ، الغلوتامات ، شبكية العين ، DRG ، جهاز الإرسال الدبقي
تصور التحولات على دائرة الخلايا العصبية الدبقية باستخدام تقنية تصوير الكالسيوم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tempone, M. H., Freitas, H. R.,… More

Tempone, M. H., Freitas, H. R., Schitine, C. S., de Melo Reis, R. A. Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique. J. Vis. Exp. (182), e63338, doi:10.3791/63338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter