Summary
Die Zellkalziumbildgebung ist eine vielseitige Methodik zur Untersuchung der dynamischen Signalgebung einzelner Zellen, an gemischten Populationen in Kultur oder sogar an erwachten Tieren, basierend auf der Expression von kalziumdurchlässigen Kanälen / Rezeptoren, die einzigartige funktionelle Signaturen ergeben.
Abstract
Hier berichten wir über selektive In-vitro-Modelle von Schaltkreisen, die auf Glia-Schaltkreisen (Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia) und/oder Neuronen aus peripheren (dorsale Wurzelganglien) und zentralen Geweben (Kortex, subventrikuläre Zone, Organoid) basieren, die dynamisch in Bezug auf Kalziumverschiebungen untersucht werden. Das Modell, das zur Veranschaulichung der Ergebnisse gewählt wurde, ist die Netzhaut, ein einfaches Gewebe mit komplexen zellulären Interaktionen. Kalzium ist ein universeller Botenstoff, der an den meisten wichtigen zellulären Rollen beteiligt ist. Wir erklären in einem Schritt-für-Schritt-Protokoll, wie retinale Neuron-Gliazellen in Kultur vorbereitet und ausgewertet werden können, wobei wir uns Kalziumverschiebungen vorstellen. In diesem Modell unterscheiden wir Neuronen von Glia basierend auf ihrer selektiven Reaktion auf KCl und ATP. Kalziumpermeable Rezeptoren und Kanäle werden selektiv in verschiedenen Kompartimenten exprimiert. Um Kalziumreaktionen zu analysieren, verwenden wir ratiometrische fluoreszierende Matrizen wie Fura-2. Diese Sonde quantifiziert die freie Ca2+-Konzentration basierend auf Ca2+-freien und Ca2+-gebundenen Formen und zeigt zwei verschiedene Peaks, die auf der Fluoreszenzintensität basieren, die auf zwei Wellenlängen wahrgenommen wird.
Introduction
Aufgrund der universellen Eigenschaften von Kalzium als zweiter Botenstoff ist dieses Ion an einer Vielzahl von Signalaktivitäten beteiligt: Gentranskription, Geburt und Tod, Proliferation, Migration und Differenzierung, synaptische Übertragung und Plastizität. Daher würde eine Methode, die in der Lage ist, die Dynamik der Kalziumaktivierung mit Genauigkeit und Beweglichkeit zu verfolgen, eine Möglichkeit bieten, einzigartige räumlich-zeitliche Reaktionen zu beobachten. Eine solche Methode ist die zelluläre Kalzium-Bildgebungstechnik, die funktionelle Daten mit spezifischen Zellphänotypen korreliert, basierend auf ihren unterschiedlichen Reaktionen.
Ca2+-Sonden wurden erstmals in den 1980er Jahren entwickelt, mit späteren Verbesserungen, die es ermöglichten, diese Moleküle in Lebendzellassays zu verwenden1. Als chemischer Indikator gilt Fura-2 als Standard für quantitative [Ca2+]i-Messungen. Der Acetoxymethylester (AM) dieses Indikators (d. h. Fura-2 AM) durchdringt leicht die Zellmembran und kann intrazelluläre Konzentrationen erreichen, die 20-fach größer sind als die Inkubationsverdünnung (z. B. [5 μM]o/[100 μM]i). Ein weiterer Vorteil von Fura-2 ist, dass es eine gute Fotobleichbeständigkeit hat; Daher hat die Abbildung dieses Indikators über längere Zeiträume keinen großen Einfluss auf seine Fluoreszenzfähigkeiten. Schließlich ist Fura-2 empfindlich gegenüber einem breiten Bereich von Kalziumspiegeln, von ~ 100 nM bis ~ 100 μM, und hat einen Kd von ~ 145 nM, was mit dem ruhenden [Ca2 + ]i2 vergleichbar ist. Später wurde die Zellkalziumbildgebung mit besseren Fluoreszenzmikroskopen und Berechnungsmethoden entwickelt, zusammen mit ratiometrischen Sonden, die nicht von der Farbstoffbelastung betroffen sind.
Jede Zelle exprimiert verschiedene Kalziumgeräte (Pumpen, Transporter, Rezeptoren und Kanäle), die als besondere Signatur zur endgültigen Reaktion beitragen. Der wichtige Tipp ist, selektive Reaktionen verschiedener Zelltypen zu finden, die mit ihrer phänotypischen Expression korrelieren. Dementsprechend gibt es mindestens zwei verschiedene Rezeptoren, die durch Kalziumverschiebungen arbeiten: ionotrope Rezeptoren, die Ca2+ in einem schnellen Modus durchdringen, und langsame metabotrope Rezeptoren, die an Signalwege gekoppelt sind, und intrazelluläre Bestände, die Ca2+ freisetzen, das durch zweite Botenstoffe wie Inositoltriphosphat und zyklisches ADP-Ribose3 aktiviert wird.
Zum Beispiel exprimieren Vorläuferzellen Nestin in der unreifen Netzhaut und zeigen GABAA-Rezeptoren, die durch GABA (oder Muscimol) depolarisiert sind4. Dies geschieht aufgrund des elektrochemischen Cl-Gradienten mit hohen intrazellulären Cl−-Werten; Wenn sich das Gewebe entwickelt, wechseln KCC2-Transporter von der Anregung an Vorläuferzellen zur Hemmung an reifen GABAergen Neuronen5. Auf der anderen Seite präsentieren Stammzellen, die Sox-2 in der unreifen subventrikulären Zone (SVZ) postnataler Nagetiere exprimieren, auch metabotrope H1-Rezeptoren, die durch Histamin aktiviert werden, das Ca2+ langsam erhöht6. Ein zweiter metabotroper Rezeptor aus der Protease-aktivierten Rezeptor-1 (PAR-1)-Familie, der durch Thrombin aktiviert wird und nach G(q/11) und Phospholipase C (PLC) nachgeschaltet ist, führt zu langsamen Ca2+-Verschiebungen in Oligodendrozyten (die O4 und PLP exprimieren), die aus multipotenten neuronalen SVZ-Stammzellen erzeugt werden7.
Im Allgemeinen exprimieren Neuronen spannungsabhängige Kalziumkanäle sowie wichtige Neurotransmitterrezeptoren, die für Ca2 + durchlässig sind, als glutamaterge (AMPA, NMDA, Kainate) und periphere und zentrale Nikotinrezeptoren. Kaliumchlorid wird normalerweise als Depolarisationsmittel verwendet, um periphere Neuronen zu aktivieren, wie die dorsalen Wurzelganglion-Neuronen8 oder zentrale Neuronen, wie aus der subventrikulären Zone9 oder Retina10. Auf der anderen Seite wird ATP als der wichtigste Gliotransmitter (zusätzlich zu D-Serin) anerkannt, der selektive Ca2 + permeable P2X-Mitglieder als P2X7 und P2X4 aktiviert. Beide Rezeptoren weisen äquivalente Ca2+-Ströme auf, ähnlich denen, die von NMDA-Rezeptoren gezeigt werden, die als die größten Ca2+-Ströme anerkannt sind, die von Transmittern aktiviert werden11. P2X7-Rezeptoren werden auf Mikroglia stark exprimiert, aber in einer geringeren Dichte auf Astrozyten und Oligodendrozyten, die eine Rolle bei der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen spielen12. P2X7-Rezeptoren werden auch auf Schwann-Zellen13 und Müller-Glia in der Netzhaut14,15 exprimiert.
Es ist bekannt, dass die Netzhaut fast alle im Gehirn gesehenen Sender zeigt. Zum Beispiel ist die vertikale Achse (Photorezeptoren, bipolare und retinale Ganglienzellen) hauptsächlich glutamaterg, mit calciumdurchlässigen AMPA- oder Kainatrezeptoren, die in OFF-bipolaren Zellen exprimiert werden, und mgluR6, das in ON-bipolaren Zellen exprimiert wird16. Seltsamerweise finden sich alle drei Rezeptoren auch in Müller-Glia, die an Calcium- und Inositoltriphosphatwege gekoppelt sind17,18. Die horizontale inhibitorische Achse, die aus horizontalen und amakrinen Zellen besteht, sezerniert nicht nur GABA, sondern auch Dopamin, Acetylcholin und andere klassische Neurotransmitter. Amakrinzellen sind die Haupttypen von Zellen, die in den Vogelnetzhautkulturen vorkommen und verschiedene Arten von kalziumbetriebenen Kanälen zeigen, wie glutamaterge, purinerge, nikotinische und spannungsabhängige Kalziumkanäle. Aus diesem Grund ist dies ein hervorragendes Modell, um verschiedene Eigenschaften von Kalziumverschiebungen zwischen Neuronen und Glia zu bewerten.
Daher ermöglicht die Kombination verschiedener Rezeptoren und Kanäle, die während der Entwicklung zu selektiven phänotypischen Markern summiert werden, mit unterschiedlichen Agonisten-Reaktionsmustern einzigartige Signaturen in Stamm, Vorläufer, Neuron, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die durch selektive Signalgeräte arbeiten.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden von den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Federal University of Rio de Janeiro nach den "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH, Bethesda, USA) genehmigt und durchgeführt. Genehmigungsnummer IBCCF-035 für befruchtete Hühnereier aus Weißem Leghorn.
1. Vorbereitung von Lösungen
- Krebslösung vorbereiten: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM Glukose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
- Salzpuffer (Ca2+ und Mg2+ freie Lösung - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L Na2HPO4, 0,610 g/L KH2PO4, 21,95 g/L Glukose und 7,90 g/L NaHCO3.
- Vorbereiten Sie Inkubationslösung (mit Fura-2 in Krebslösung:) 5 μM Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2), 0,1% fettsäurefreies Rinderserumalbumin (BSA) und 0,02% Poloxamer 407.
- Für gemischte Populationen oder Gliakulturen bereiten Sie DMEM/F12 mit 10% fetalem Kälberserum (FCS) und 40 mg/L Gentamicin als Medium vor.
- Für eine mit Neuronen angereicherte Kultur bereiten Sie DMEM / F12 mit 1% FCS, neuronalem Zellkulturpräparat, 40 mg / L und Gentamicin als Medium vor.
2. Netzhautdissektion und Zellkulturpräparation
- Öffnen Sie das 8 Tage alte Kükenembryo (E8) Ei, in dem sich die Luftzelle befindet.
- Entfernen Sie den Eiinhalt in eine Petrischale und fahren Sie mit der Embryo-Euthanasie durch Enthauptung mit einer Pinzette fort.
- Bringen Sie den Kopf in eine saubere Petrischale und gießen Sie etwas kalzium- und magnesiumfreie Lösung (CMF), um sie zu waschen.
- Entfernen Sie die Augen und achten Sie darauf, sie dabei nicht zu beschädigen.
HINWEIS: Versuchen Sie, das Schneiden oder Zerkleinern der Augenschichten zu vermeiden, bevor Sie es aus der Augenhöhle entfernen. - Bringen Sie die Augen zu einer sauberen Petrischale mit CMF.
- Beginnen Sie die Augendissektion, indem Sie die Linse entfernen.
- Machen Sie 3 oder 4 Längsschnitte im Auge, beginnend mit dem Loch, das die Linse hinterlassen hat. Machen Sie Schnitte, indem Sie die Pinzette ziehen und die Augensklere in entgegengesetzte Richtungen halten.
- Entfernen Sie den transparenten Glaskörper mit Vorsicht und achten Sie darauf, dass die Netzhaut nicht daran gebunden ist.
- Lösen Sie die Netzhaut vom pigmentierten Epithel und entfernen Sie das verbleibende Gewebe.
- Schneiden Sie die klare Netzhaut in kleine Stücke.
- Übertragen Sie die Netzhaut auf einen anderen Empfänger und zentrifugieren Sie sie kurz (~ 1.800 x g für 1 min), um die CMF zu entfernen.
- Dissoziieren Sie die Netzhaut enzymatisch mit 1 ml 0,25% Trypsin, indem Sie sie bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 1 ml Medium mit 10% FCS hinzufügen.
- Waschen Sie die Netzhaut 2 oder 3 Mal mit Medium. Die Wäsche besteht aus Zyklen der Zugabe von Medium und dem Entfernen durch Zentrifugation (~ 1.800 x g für 1 min).
- Fügen Sie 2 ml vollständiges Medium pro Netzhaut hinzu und dissoziieren Sie die Netzhaut sanft mechanisch, indem Sie sie auf und ab pipettieren.
HINWEIS: Hier können die Ermittler auswählen, welche Art von Kultur vorbereitet wird. Für eine angereicherte neuronale Kultur verwenden Sie DMEM-F12 + neuronale Ergänzung + 1% FCS + Antibiotika. Für gemischte Bevölkerung oder gereinigte Glia, verwenden Sie DMEM-F12 + 10% FCS + Antibiotika. - Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie auf die gewünschte Dichte.
HINWEIS: Idealerweise sollte dies eine Kultur mit geringer Dichte mit ~ 2 x 106 Zellen oder weniger sein. - Fügen Sie jedem Deckglas 50 μL der Zellsuspension hinzu.
- Deckglasbehandlung
- Inkubieren Sie Deckgläser für mindestens 1 h (idealerweise über Nacht) in 1 ml 10-50 μg/ml Poly-L-Lysin in sterilisiertem gereinigtem Wasser bei 37 °C.
- Entfernen Sie die Poly-L-Lysinlösung und waschen Sie die Deckgläser 2-3 Mal mit sterilisiertem gereinigtem Wasser.
- Lassen Sie die Deckgläser in einer Sicherheitswerkbank mit eingeschaltetem UV-Licht trocknen. Lagern Sie sie an dieser Stelle bis zu 1 Monat in einem versiegelten Behälter bei 4 ° C.
- Optionaler Schritt: Für mit Neuronen angereicherte Kulturen fügen Sie 50 μL 10-20 ng / ml Laminin in PBS oder Medium zu jedem Deckglas für 2 h bei 37 ° C hinzu. Entfernen Sie nach der Inkubation den überschüssigen Lamininlösungsüberschuss und der Deckglas ist gebrauchsfertig.
- Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C bei einer CO2-Atmosphäre von 5%, bis sie sich an das Glas anlagern. Dies sollte ca. 1-2 h dauern.
- Fügen Sie 1 ml vollständiges Medium zu jeder Vertiefung hinzu und bringen Sie die Platte bis zum Tag des Experiments in den Inkubator zurück. Wechseln Sie bei Bedarf alle 2-3 Tage das Medium.
3. Wägezellen mit Fura-2 AM
- Rekonstituieren Sie ein 50 μg Fläschchen Fura-2 AM mit 50 μL DMSO.
- Zur Herstellung einer funktionierenden Fura-2 AM-Lösung fügen Sie 3 μL 10% Poloxamer 407, 7,5 μL Fura-2 AM in DMSO und Krebslösung q.s.p. zu 1,5 ml hinzu.
- Beschallen Sie die Mischung für 7 min in einem Wasserbad.
- Waschen Sie das Deckglas mit der Zellkultur 3x mit Krebslösung, bevor Sie es in Fura-2 inkubieren.
- 30 min bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
- Nach der Inkubation 3x erneut waschen und auf einen anderen Empfänger übertragen, der Krebs enthält und vor dem Licht geschützt ist.
HINWEIS: Die funktionierende Fura-2 AM-Lösung bleibt 24 Stunden lang stabil, wenn sie vor dem Licht geschützt ist.
4. Kalzium-Bildgebung von Zellen
- Fügen Sie vor jedem Durchlauf Silizium zur Deckglashalterung und -kammer hinzu, um ein Auslaufen während des Experiments zu vermeiden.
- Waschen Sie den Boden des Deckglases mit destilliertem Wasser, um eine Salzkristallisation auf der Mikroskoplinse zu vermeiden.
- Legen Sie den Decklack auf die Stütze und drücken Sie vorsichtig auf die Ränder.
- Befestigen Sie die Stütze und die Kammer am Mikroskop und beginnen Sie, Zellen mit Krebslösung zu durchbluten.
HINWEIS: Die Zellperfusion während Einzelzell-Calcium-Bildgebungsexperimenten wird auf eine Durchflussrate von 0,5 ml / min kalibriert, und es dauert 8-10 s, bis die Plattformlösung vollständig ersetzt ist. - Werfen Sie einen Blick auf die Zellen und wählen Sie ein geeignetes Sichtfeld aus.
- Wählen Sie die Zellkörper manuell anhand ihrer unterschiedlichen Morphologie aus.
- Bevor Sie einen Stimulus anwenden, warten Sie auf die Stabilisierung der Basislinie. Jeder Reiz sollte etwa 30 Sekunden dauern.
HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen unmittelbar vor jedem Experiment vor. - Bewerten Sie die Variationen in [Ca2+]i durch Quantifizierung des Verhältnisses der Fluoreszenz, die bei 510 nm nach alternativer Anregung (750 Millisekunden) bei 340 und 380 nm emittiert wird.
- Verarbeiten Sie erfasste Werte mit einer Fluoreszenzanalyse-Software.
- Drücken Sie experimentelle Ergebnisse in einer Tabelle aus, in der jede Zeile eine einzelne Zelle und jede Zeile einen Zeitpunkt darstellt.
5. Datenverarbeitung
- Zeichnen Sie mit einer Tabellenkalkulationssoftware die Variation der Fura-2-Fluoreszenzverhältniswerte einzelner Zellen separat oder von allen gleichzeitig auf.
- Um die Anzahl der reaktiven Zellen für den bestimmten Reiz zu quantifizieren, legen Sie einen Grenzwert von 30% fest, um die Kalzium-Baseline-Spiegel zu erhöhen
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Representative Results
Hier verwendeten wir Netzhautzellen in Kultur ab embryonalen Küken am 8. Tag, um zu untersuchen, wie Neuronen und Glia in Bezug auf Kalziumverschiebungen signalisieren. Kulturen wurden im Wesentlichen wie beschrieben15,19 als gemischte Neuron-Gliazellen (bei einer Dichte von ≥ 1 x 106 Zelle/Schale) in einem Stadium von 7 Tagen in vitro hergestellt (Abbildung 1A). Alternativ können angereicherte neuronale Zellen, die in niedriger Dichte (5 x 105 Zellen/Schale) hergestellt und auf behandelten Poly-L-Lysin-Deckgläsern (10 μg/ml) in einem Stadium von 3 Tagen in vitro ausgesät werden (Abbildung 1B). Darüber hinaus wurden gereinigte Müller-Glia 10 Tage lang in DMEM mit 10% FCS gehalten, wenn Neuronen entfernt wurden. Um die Reaktionen von Neuronen und Glia funktionell zu quantifizieren, wurden die Zellen mit 50 mM KCl oder 1 mM ATP stimuliert. Wie gezeigt (Abbildung 1A), reagierten von 302 Zellen 50% auf KCl, während 53% auf ATP signalisierten. In diesem Sinne hatte die angereicherte neuronale Zellkultur 89% der Kalziumreaktionen auf KCl, verglichen mit 17%, die auf ATP reagierten (Abbildung 1B). Tatsächlich wurde eine gereinigte Müller-Glia-Kultur, bei der Neuronen nach 10 Tagen in Kultur entfernt werden, ausschließlich durch ATP aktiviert (Abbildung 1C).
Abbildung 1. Netzhautzellen, die als gemischte, neuronal angereicherte oder gliagereinigte Kulturen hergestellt werden, zeigen unterschiedliche Reaktionsmuster bei der Kalziumbildgebung. (A) Helle und fluoreszierende Felder gemischter embryonaler Netzhautzellen in Kultur. Das gleiche Mikroskopfeld unter 5 μM Fura-2 AM Fluoreszenz. 50 mM KCl aktiviert die Hälfte der Zellen (neuronaler Phänotyp), während 1 mM ATP die andere Hälfte (Glia-Phänotyp) aktiviert, mit hohen F340/380-Verhältnissen, die dem Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels ([Ca2+]i) entsprechen. (B) Die angereicherte neuronale Zellkultur hatte eine Kalziumreaktion von 89% auf KCl im Vergleich zu 17%, die auf ATP ansprachen. (C) Auf der anderen Seite wurde eine gereinigte Müller-Glia-Kultur, bei der Neuronen nach 10 Tagen in Kultur entfernt werden, ausschließlich durch ATP aktiviert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Wir haben das Netzhautgewebe verwendet, um zu zeigen, dass Kalziumreaktionen, die durch KCl oder ATP vermittelt werden, eindeutig in neuronale bzw. gliale Reaktionen unterteilt sind (Abbildung 1). Obwohl einige Daten in der Literatur darauf hindeuten, dass P2X7-Rezeptoren in Neuronen exprimiert werden, die die neuronale Aktivität und die freisetzung synaptischer Neurotransmitter regulieren20, stellen andere Autoren die Existenz neuronaler P2X7-Rezeptoren in Frage. Tatsächlich stützen die aktuellen Ergebnisse die Idee, dass primäre Glia-P2X7-Rezeptoren neuronale Effekte vermitteln, die zu hohen extrazellulären ATP-Konzentrationen in ungesundem Gewebe summiert werden21.
Wir haben zuvor die funktionelle Differenzierung von Netzhautzellen mit ihrem phänotypischen Display verknüpft, so dass Variationen von [Ca2+]i-Verschiebungen, die durch KCl oder AMPA (ein Glutamatagonist) aktiviert werden, Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP-2), Marker eines reifen Neurons1, exprimieren. Alternativ exprimieren Zellen, die durch ATP aktiviert werden, Glutaminsynthetase, einen typischen Muller-Glia-Marker.
Wir haben verschiedene Arten von Zellkulturen verwendet, wie hier gezeigt (gemischte, neuronal angereicherte oder gereinigte Gliazellen), zusätzlich zu den abgeleiteten Neurosphären4, um viele Fragen im Zusammenhang mit verschiedenen neurochemischen Systemen wie glutamatergic22, dopaminergic19, GABAergic23, cannabinoid9,10, purinergic14,24, serotoninergic25 zu beantworten. , unter anderem, um die neurogliale Netzhautkommunikation zu verstehen. Müller-Gliazellen exprimieren eine große Anzahl von Neurotransmitterrezeptoren26 und sezernieren Gliotransmitter als D-Serin, ATP und Glutamat, die vesikulär, Ca2+-abhängig freigesetzt werden können27.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Zuschüsse, Sponsoren und Finanzierungsquellen: MH erhält ein PhD CNPq-Stipendium. HRF ist Empfänger eines Postdoc-Stipendiums, das von CNPq unterstützt wird (HRF-Fördernummer 152071/2020-2). RAMR wird von CNPq und FAPERJ (Fördernummern E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 und 312157/2016-9 und INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
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