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Neuroscience

कैल्शियम इमेजिंग तकनीक के साथ न्यूरॉन-ग्लिया सर्किट पर शिफ्ट की कल्पना करना

Published: April 8, 2022 doi: 10.3791/63338
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Laboratory of Neurochemistry, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Laboratory of Neuroenergetics and Inborn Errors of Metabolism, Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Laboratory of Neurochemistry and Cell Biology, Institute of Life Sciences, Universidade Federal da Bahia

Summary

सेल कैल्शियम इमेजिंग व्यक्तिगत कोशिकाओं के गतिशील सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी पद्धति है, संस्कृति में मिश्रित आबादी पर या यहां तक कि जागृत जानवरों पर, कैल्शियम-पारगम्य चैनलों / रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के आधार पर जो अद्वितीय कार्यात्मक हस्ताक्षर देता है।

Abstract

यहां, हम ग्लिया (एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेंड्रोसाइट्स, और माइक्रोग्लिया) और / या परिधीय (पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया) और केंद्रीय ऊतकों (कॉर्टेक्स, सबवेंट्रिकुलर ज़ोन, ऑर्गेनोइड) से न्यूरॉन्स के आधार पर सर्किट के चुनिंदा इन विट्रो मॉडल पर रिपोर्ट करते हैं जो कैल्शियम शिफ्ट के संदर्भ में गतिशील रूप से अध्ययन किए जाते हैं। परिणामों को स्पष्ट करने के लिए चुना गया मॉडल रेटिना है, जो जटिल सेलुलर इंटरैक्शन के साथ एक सरल ऊतक है। कैल्शियम एक सार्वभौमिक संदेशवाहक है जो अधिकांश महत्वपूर्ण सेलुलर भूमिकाओं में शामिल है। हम एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल में बताते हैं कि संस्कृति में रेटिना न्यूरॉन-ग्लियाल कोशिकाओं को कैल्शियम बदलाव की कल्पना करते हुए कैसे तैयार और मूल्यांकन किया जा सकता है। इस मॉडल में, हम केसीएल और एटीपी के लिए उनकी चयनात्मक प्रतिक्रिया के आधार पर ग्लिया से न्यूरॉन्स को अलग करते हैं। कैल्शियम पारगम्य रिसेप्टर्स और चैनलों को चुनिंदा रूप से विभिन्न डिब्बों में व्यक्त किया जाता है। कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए, हम रेशियोमेट्रिक फ्लोरोसेंट मर जाता है जैसे कि फुरा -2 का उपयोग करते हैं। यह जांच Ca2 + मुक्त और Ca2 + - बाध्य रूपों के आधार पर मुक्त Ca2 + एकाग्रता को निर्धारित करती है, दो अलग-अलग चोटियों को प्रस्तुत करती है, जो दो तरंग दैर्ध्य पर कथित प्रतिदीप्ति तीव्रता पर स्थापित होती है।

Introduction

एक दूसरे दूत के रूप में कैल्शियम के सार्वभौमिक गुणों के कारण, यह आयन बड़ी संख्या में सिग्नलिंग गतिविधियों में शामिल है: जीन प्रतिलेखन, जन्म और मृत्यु, प्रसार, प्रवासन और भेदभाव, सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और प्लास्टिसिटी। इसलिए, निष्ठा और चपलता के साथ कैल्शियम सक्रियण गतिशीलता को ट्रैक करने में सक्षम एक विधि अद्वितीय स्थानिक-अस्थायी प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने का एक तरीका प्रदान करेगी। इस तरह की एक विधि सेलुलर कैल्शियम इमेजिंग तकनीक है, जो कैल्शियम शिफ्ट कार्यात्मक डेटा को उनकी अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के आधार पर विशिष्ट सेल फेनोटाइप के साथ जोड़ती है।

Ca2+ जांच को पहली बार 1980 के दशक में विकसित किया गया था, बाद में सुधार के साथ इन अणुओं को लाइव सेल assays1 में उपयोग करने की अनुमति दी गई थी। एक रासायनिक संकेतक के रूप में, Fura-2 को मात्रात्मक [Ca2+] i माप के लिए मानक माना जाता है। इस संकेतक का एसिटोक्सिमिथाइल (एएम) एस्टर (यानी, फुरा -2 एएम) आसानी से सेल झिल्ली में प्रवेश करता है और इनक्यूबेशन कमजोर पड़ने की तुलना में 20 गुना अधिक इंट्रासेल्युलर सांद्रता तक पहुंच सकता है (उदाहरण के लिए, [5 μM] o / [100 μM]i)। फुरा -2 का एक और लाभ यह है कि इसमें अच्छा फोटोब्लीचिंग प्रतिरोध है; इस प्रकार, लंबे समय तक इस संकेतक को इमेजिंग करने से इसकी प्रतिदीप्ति क्षमताओं पर बहुत प्रभाव नहीं पड़ेगा। अंत में, Fura-2 कैल्शियम के स्तर की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रति संवेदनशील है, ~ 100 nM से ~ 100 μM तक, और ~ 145 nM का एक KD है, जो आराम करने के लिए तुलनीय है [Ca2+] i2। बाद में, सेल कैल्शियम इमेजिंग को बेहतर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और गणना विधियों के साथ विकसित किया गया था, साथ ही साथ रेशियोमेट्रिक जांच के साथ जो डाई लोडिंग से प्रभावित नहीं होते हैं।

प्रत्येक सेल विभिन्न कैल्शियम उपकरणों (पंप, ट्रांसपोर्टर, रिसेप्टर्स और चैनलों) को व्यक्त करता है जो एक विशेष हस्ताक्षर के रूप में अंतिम प्रतिक्रिया में योगदान करते हैं। महत्वपूर्ण टिप विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की चयनात्मक प्रतिक्रियाओं को ढूंढना है जो उनके फेनोटाइपिक अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध हैं। तदनुसार, कम से कम दो अलग-अलग रिसेप्टर्स हैं जो कैल्शियम शिफ्ट के माध्यम से काम करते हैं: आयनोट्रोपिक रिसेप्टर्स जो Ca2 + को एक तेज मोड में प्रवेश करते हैं और धीमी गति से मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर्स सिग्नलिंग मार्गों और इंट्रासेल्युलर स्टॉक के लिए युग्मित होते हैं जो Ca2 + को दूसरे दूतों द्वारा सक्रिय करते हैं, जैसे कि इनोसिटोल ट्राइफॉस्फेट और चक्रीय एडीपी-राइबोज़ 3।

उदाहरण के लिए, पूर्वज कोशिकाएं अपरिपक्व रेटिना में नेस्टिन व्यक्त करती हैं और गाबा रिसेप्टर्स को गाबा (या म्यूसिमोल) 4 द्वारा विध्रुवीकृत दिखाती हैं। यह उच्च इंट्रासेल्युलर Cl- स्तरों के साथ Cl- इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट के कारण होता है; के रूप में ऊतक विकसित होता है, KCC2 ट्रांसपोर्टरों परिपक्व GABaergic न्यूरॉन्स 5 पर निषेध करने के लिए पूर्वजों पर उत्तेजना से स्विच। दूसरी ओर, स्टेम कोशिकाएं जो प्रसवोत्तर कृन्तकों के अपरिपक्व सबवेंट्रिकुलर ज़ोन (एसवीजेड) पर सोक्स -2 व्यक्त करती हैं, वे हिस्टामाइन द्वारा सक्रिय मेटाबोट्रोपिक एच 1 रिसेप्टर्स को भी धीमी गति से Ca2 + को बढ़ाने वाले मेटाबोट्रोपिक एच 1 रिसेप्टर्स को प्रस्तुत करती हैं। प्रोटीज-सक्रिय रिसेप्टर -1 (PAR-1) परिवार से एक दूसरा मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर, थ्रोम्बिन द्वारा सक्रिय और डाउनस्ट्रीम को G (q / 11) और फॉस्फोलिपिस C (PLC) के लिए सक्रिय किया गया है, ओलिगोडेंड्रोसाइट्स (जो कि O4 और PLP को व्यक्त करता है) में धीमी गति से Ca2 + बदलाव देता है जो बहुशक्तिमान SVZ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होता है।

सामान्य तौर पर, न्यूरॉन्स वोल्टेज-निर्भर कैल्शियम चैनलों के साथ-साथ Ca2+ के लिए पारगम्य प्रमुख न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स को व्यक्त करते हैं, जैसे ग्लूटामेटर्जिक (एएमपीए, एनएमडीए, कैनेट) और परिधीय और केंद्रीय निकोटिनिक रिसेप्टर्स। पोटेशियम क्लोराइड का उपयोग आमतौर पर परिधीय न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए एक विध्रुवीकरण एजेंट के रूप में किया जाता है, पृष्ठीय रूट गैंग्लियन न्यूरॉन्स 8 या केंद्रीय न्यूरॉन्स के रूप में, जैसा कि सबवेंट्रिकुलर ज़ोन 9 या रेटिना 10 से होता है। दूसरी ओर, एटीपी को प्रमुख ग्लियोट्रांसमीटर (डी-सेरीन के अलावा) के रूप में स्वीकार किया जाता है, जो चयनात्मक Ca2 + पारगम्य P2X सदस्यों को P2X7 और P2X4 के रूप में सक्रिय करता है। दोनों रिसेप्टर्स समतुल्य Ca2 + धाराओं को प्रस्तुत करते हैं, जो NMDA रिसेप्टर्स द्वारा दिखाए गए लोगों के समान होते हैं, जिन्हें ट्रांसमीटर11 द्वारा सक्रिय सबसे बड़े Ca2 + धाराओं के रूप में स्वीकार किया जाता है। P2X7 रिसेप्टर्स को माइक्रोग्लिया पर अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, लेकिन एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेंड्रोसाइट्स पर कम घनत्व पर, प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स 12 की रिहाई में भूमिका निभाते हैं। P2X7 रिसेप्टर्स भी श्वान कोशिकाओं 13 और मुलर ग्लिया पर रेटिना 14,15 में व्यक्त किए जाते हैं।

रेटिना मस्तिष्क में देखे जाने वाले लगभग सभी ट्रांसमीटरों को दिखाने के लिए जाना जाता है। उदाहरण के लिए, ऊर्ध्वाधर अक्ष (फोटोरिसेप्टर, द्विध्रुवी और रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं) मुख्य रूप से ग्लूटामेटर्जिक है, जिसमें कैल्शियम-पारगम्य एएमपीए या कैनेट रिसेप्टर्स ऑफ-द्विध्रुवी कोशिकाओं में व्यक्त किए जाते हैं और mgluR6 ऑन-द्विध्रुवी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि सभी तीन रिसेप्टर्स मुलर ग्लिया में भी पाए जाते हैं, जो कैल्शियम और इनोसिटोल ट्राइफॉस्फेट मार्ग17,18 के साथ युग्मित होते हैं। क्षैतिज निरोधात्मक अक्ष, क्षैतिज और amacrine कोशिकाओं द्वारा बनाया गया है, न केवल गाबा, बल्कि डोपामाइन, acetylcholine, और अन्य शास्त्रीय न्यूरोट्रांसमीटर भी स्रावित। एमैक्रिन कोशिकाएं एवियन रेटिना संस्कृतियों में पाई जाने वाली मुख्य प्रकार की कोशिकाएं हैं, जो कई प्रकार के कैल्शियम संचालित चैनलों को दिखाती हैं, जैसे ग्लूटामेटर्जिक, प्यूरिनर्जिक, निकोटिनिक और वोल्टेज निर्भर कैल्शियम चैनल। इस कारण से, यह न्यूरॉन्स और ग्लिया के बीच कैल्शियम शिफ्ट के विभिन्न गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है।

इसलिए, अलग-अलग एगोनिस्ट प्रतिक्रिया पैटर्न के साथ विकास के दौरान चुनिंदा फेनोटाइपिक मार्करों के लिए अभिव्यक्त विभिन्न रिसेप्टर्स और चैनलों का संयोजन स्टेम, पूर्वज, न्यूरॉन, एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेंड्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया में अद्वितीय हस्ताक्षर की अनुमति देता है जो चयनात्मक सिग्नलिंग उपकरणों के माध्यम से काम करते हैं।

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Protocol

जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों को "प्रयोगशाला पशु देखभाल के सिद्धांतों" (एनआईएच, बेथेस्डा, यूएसए) का पालन करते हुए रियो डी जनेरियो के संघीय विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए अनुमोदित और किया गया था; निषेचित सफेद Leghorn चिकन अंडे के लिए अनुमति संख्या IBCCF-035.

1. समाधान की तैयारी

  1. Krebs समाधान तैयार करें: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.4 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 6 mM ग्लूकोज, 10 mM HEPES, pH 7.4, 373 mOsm)।
  2. खारा बफर (Ca2+ और Mg2+ मुक्त समाधान - CMF) तैयार करें: 76.55 g/L NaCl, 3.05 g/L KCl, 1.65 g/L Na2HPO4, 0.610 g/L KH2PO4, 21.95 g/L glucose, और 7.90 g/L NaHCO3।
  3. incubating समाधान तैयार करें (Krebs समाधान में Fura-2 के साथ:) 5 μM Fura-2-acetoxymethyl एस्टर (Fura-2), 0.1% फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA), और 0.02% Poloxamer 407.
  4. मिश्रित आबादी या ग्लिया संस्कृति के लिए, 10% भ्रूण बछड़े सीरम (FCS) और माध्यम के रूप में 40 मिलीग्राम / एल gentamicin के साथ DMEM / F12 तैयार करें।
  5. न्यूरॉन समृद्ध संस्कृति के लिए, 1% FCS, न्यूरोनल सेल संस्कृति पूरक, 40 मिलीग्राम / एल और माध्यम के रूप में gentamicin के साथ DMEM / F12 तैयार करें।

2. रेटिना विच्छेदन और सेल संस्कृति तैयारी

  1. 8-दिवसीय पुराने चिक भ्रूण (E8) अंडे को खोलें जहां वायु कोशिका स्थित है।
  2. एक पेट्री डिश के लिए अंडे की सामग्री को हटा दें और चिमटी की एक जोड़ी के साथ decapitation द्वारा भ्रूण इच्छामृत्यु के साथ आगे बढ़ें।
  3. सिर को एक साफ पेट्री डिश में लाएं और इसे धोने के लिए कुछ कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त समाधान (सीएमएफ) डालें।
  4. आंखों को हटा दें, इस बात का ध्यान रखें कि प्रक्रिया में इसे नुकसान न पहुंचे।
    नोट: आंख गुहा से इसे हटाने से पहले आंखों की परतों को काटने या काटने से बचने का प्रयास करें।
  5. आंखों को सीएमएफ युक्त एक साफ पेट्री डिश पर लाएं।
  6. लेंस को हटाकर आंख विच्छेदन शुरू करें।
  7. आंख में 3 या 4 अनुदैर्ध्य कटौती करें, लेंस द्वारा छोड़े गए छेद से शुरू करें। चिमटी खींचकर, आंखों को विपरीत दिशाओं में पकड़कर कटौती करें।
  8. सावधानी के साथ पारदर्शी विट्रियस शरीर को हटा दें, यह सुनिश्चित करें कि रेटिना इसके लिए बाध्य नहीं है।
  9. रंजक उपकला से रेटिना को अलग करें और किसी भी शेष ऊतक को हटा दें।
  10. साफ रेटिना को छोटे टुकड़ों में काट लें।
  11. रेटिना को किसी अन्य प्राप्तकर्ता को स्थानांतरित करें और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज (~ 1,800 x g 1 मिनट के लिए) इसे CMF को हटाने के लिए।
  12. Enzymatically रेटिना को 0.25% ट्रिप्सिन के 1 मिलीलीटर के साथ अलग करें, इसे 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके।
  13. 10% FCS युक्त माध्यम के 1 mL जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
  14. रेटिना को मध्यम से 2 या 3 बार धोएं। धोने में माध्यम को जोड़ने और इसे सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटाने के चक्र होते हैं (~ 1 मिनट के लिए ~ 1,800 x g)।
  15. रेटिना प्रति पूर्ण माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से यांत्रिक रूप से रेटिना को ऊपर और नीचे पिपेट करके अलग करें।
    नोट: यहां, जांचकर्ता चुन सकते हैं कि किस प्रकार की संस्कृति तैयार की जाएगी। एक समृद्ध न्यूरोनल संस्कृति के लिए, DMEM-F12 + न्यूरोनल पूरक + 1% FCS + एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करें। मिश्रित आबादी या शुद्ध ग्लिया के लिए, DMEM-F12 + 10% FCS + एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करें।
  16. कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें वांछित घनत्व तक पतला करें।
    नोट: आदर्श रूप से, यह ~ 2 x 106 कोशिकाओं या उससे कम के साथ एक कम घनत्व वाली संस्कृति होनी चाहिए।
  17. प्रत्येक coverslip करने के लिए सेल निलंबन के 50 μL जोड़ें।
  18. कवरस्लिप उपचार
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर निष्फल शुद्ध पानी में 10-50 μg / mL पॉली-एल-लाइसिन के 1 मिलीलीटर में कम से कम 1 घंटे (आदर्श रूप से रातभर) के लिए इनक्यूबेट कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें।
    2. पॉली-एल-लाइसिन समाधान निकालें और 2-3 बार निष्फल शुद्ध पानी के साथ कवरलिप्स को धोएं।
    3. यूवी रोशनी चालू होने के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट में कवरलिप्स को सूखने दें। इस बिंदु पर, उन्हें 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सील कंटेनर में स्टोर करें।
    4. वैकल्पिक चरण: न्यूरॉन समृद्ध संस्कृतियों के लिए, पीबीएस में 10-20 एनजी / एमएल लैमिनिन के 50 μL जोड़ें या 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रत्येक कवरस्लिप में मध्यम जोड़ें। इनक्यूबेशन के बाद, लैमिनिन समाधान को अतिरिक्त रूप से हटा दें और कवरस्लिप उपयोग करने के लिए तैयार है।
  19. 5% CO2 वातावरण में 37 °C पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जब तक कि वे ग्लास से संलग्न न हों। इसमें लगभग 1-2 घंटे लगना चाहिए।
  20. प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्ण माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और प्रयोग के दिन तक प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस कर दें। यदि आवश्यक हो, तो हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें।

3. Fura-2 AM के साथ कोशिकाओं लोड हो रहा है

  1. DMSO के 50 μL के साथ Fura-2 AM की एक 50 μg शीशी का पुनर्गठन।
  2. काम Fura-2 AM समाधान तैयार करने के लिए, 10% Poloxamer 407 के 3 μL जोड़ें, DMSO और Krebs समाधान q.s.p. में Fura-2 AM के 7.5 μL 1.5 mL करने के लिए।
  3. एक पानी के स्नान में 7 मिनट के लिए मिश्रण sonicate.
  4. Fura-2 में incubating से पहले क्रेब्स समाधान के साथ सेल संस्कृति 3x के साथ coverslip धोलें।
  5. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, इसे फिर से 3x धो लें और इसे क्रेब्स वाले किसी अन्य प्राप्तकर्ता को स्थानांतरित करें और प्रकाश से संरक्षित करें।
    नोट: काम Fura-2 AM समाधान प्रकाश से सुरक्षित है, तो 24 घंटे के लिए स्थिर रहता है।

4. कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग

  1. प्रत्येक रन से पहले, प्रयोग के दौरान रिसाव से बचने के लिए कवरस्लिप समर्थन और कक्ष में सिलिकॉन जोड़ें।
  2. माइक्रोस्कोप लेंस पर नमक क्रिस्टलीकरण से बचने के लिए आसुत पानी के साथ कवरस्लिप के नीचे धोएं।
  3. समर्थन पर coverslip रखो, धीरे सीमाओं को दबाने.
  4. माइक्रोस्कोप के लिए समर्थन और कक्ष संलग्न करें और Krebs समाधान के साथ कोशिकाओं perfusing शुरू करते हैं।
    नोट: एकल सेल कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के दौरान सेल परफ्यूजन को 0.5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर के लिए कैलिब्रेट किया जाता है, और प्लेटफ़ॉर्म समाधान को पूरी तरह से प्रतिस्थापित करने के लिए 8-10 सेकंड लगते हैं।
  5. कक्षों पर एक नज़र डालें और दृश्य के एक उपयुक्त फ़ील्ड का चयन करें।
  6. मैन्युअल रूप से उनके विशिष्ट आकृति विज्ञान के आधार पर सेल निकायों का चयन करें।
  7. किसी भी उत्तेजना को लागू करने से पहले, बेसलाइन स्थिरीकरण की प्रतीक्षा करें। प्रत्येक उत्तेजना में लगभग 30 सेकंड लगना चाहिए।
    नोट: प्रत्येक प्रयोग से तुरंत पहले सभी समाधान तैयार करें।
  8. 340 और 380 एनएम पर वैकल्पिक उत्तेजना (750 मिलीसेकंड) के बाद 510 एनएम पर उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के अनुपात को परिमाणित करके [Ca2+]i में भिन्नताओं का मूल्यांकन करें।
  9. एक प्रतिदीप्ति विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त मूल्यों की प्रक्रिया.
  10. प्रयोगात्मक परिणामों को एक तालिका में व्यक्त करें जहां प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्तिगत सेल का प्रतिनिधित्व करती है, और प्रत्येक पंक्ति एक समय बिंदु।

5. डेटा प्रसंस्करण

  1. एक स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, एकवचन कोशिकाओं के Fura-2 प्रतिदीप्ति अनुपात मूल्यों की भिन्नता को अलग-अलग या एक ही समय में उन सभी के रूप में प्लॉट करें।
  2. निर्धारित उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं की संख्या को मापने के लिए, कैल्शियम बेसलाइन स्तरों में 30% की वृद्धि की कटऑफ सेट करें

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Representative Results

यहां, हमने भ्रूण दिवस 8 चूजों से संस्कृति में रेटिना कोशिकाओं का उपयोग किया ताकि यह पता लगाया जा सके कि कैल्शियम शिफ्ट के मामले में न्यूरॉन्स और ग्लिया सिग्नल कैसे करते हैं। संस्कृतियों को अनिवार्य रूप से वर्णित 15,19 के रूप में मिश्रित न्यूरॉन-ग्लियाल कोशिकाओं (≥ 1 x 106 सेल / डिश के घनत्व पर) के रूप में विट्रो में 7 दिनों के चरण में तैयार किया गया था (चित्रा 1 ए)। वैकल्पिक रूप से, कम घनत्व (5 x 105 सेल / डिश) में तैयार समृद्ध न्यूरोनल कोशिकाएं, उपचारित पॉली-एल-लाइसिन (10 μg / mL) पर बीजित विट्रो में 3 दिनों के चरण में लिप्स को कवर करती हैं (चित्रा 1 बी)। इसके अलावा, शुद्ध मुलर ग्लिया को 10% एफसीएस युक्त डीएमईएम में 10 दिनों के लिए बनाए रखा गया था, जब न्यूरॉन्स को हटा दिया गया था। न्यूरॉन्स और ग्लिया की प्रतिक्रियाओं को कार्यात्मक रूप से मापने के लिए, कोशिकाओं को 50 एमएम केसीएल या 1 एमएम एटीपी के साथ उत्तेजित किया गया था। जैसा कि दिखाया गया है (चित्रा 1 ए), 302 कोशिकाओं में से, 50% ने केसीएल को जवाब दिया, जबकि 53% ने एटीपी को संकेत दिया। इस अर्थ में, समृद्ध न्यूरोनल सेल संस्कृति में 17% की तुलना में KCl के लिए कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का 89% था, जिसने एटीपी (चित्रा 1 बी) का जवाब दिया था। दरअसल, एक शुद्ध मुलर ग्लिया संस्कृति, जहां न्यूरॉन्स को संस्कृति में 10 दिनों के बाद हटा दिया जाता है, पूरी तरह से एटीपी (चित्रा 1 सी) द्वारा सक्रिय किया गया था।

Figure 1
चित्र 1. मिश्रित, न्यूरोनल-समृद्ध या ग्लिया-शुद्ध संस्कृतियों के रूप में तैयार रेटिना कोशिकाएं कैल्शियम इमेजिंग पर विभिन्न प्रतिक्रिया पैटर्न दिखाती हैं। (ए) संस्कृति में मिश्रित भ्रूण रेटिना कोशिकाओं के उज्ज्वल और प्रतिदीप्ति क्षेत्र। एक ही माइक्रोस्कोप क्षेत्र 5 μM fura-2 AM प्रतिदीप्ति के तहत दिखाया गया है। 50 mM KCl कोशिकाओं के आधे (न्यूरोनल फेनोटाइप) को सक्रिय करता है, जबकि 1 mM एटीपी दूसरे आधे (ग्लियाल फेनोटाइप) को सक्रिय करता है, जिसमें उच्च F340/380 अनुपात इंट्रासेल्युलर कैल्शियम ([Ca2+] i) स्तरों में वृद्धि के अनुरूप होते हैं। (बी) समृद्ध न्यूरोनल सेल संस्कृति में एटीपी के जवाब में 17% की तुलना में केसीएल के लिए 89% कैल्शियम प्रतिक्रिया थी। (सी) दूसरी ओर, एक शुद्ध मुलर ग्लिया संस्कृति, जहां न्यूरॉन्स को संस्कृति में 10 दिनों के बाद हटा दिया जाता है, पूरी तरह से एटीपी द्वारा सक्रिय किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने रेटिना ऊतक का उपयोग यह दिखाने के लिए किया है कि केसीएल या एटीपी द्वारा मध्यस्थता की गई कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट रूप से क्रमशः न्यूरोनल और ग्लियल प्रतिक्रियाओं में विभाजित किया जाता है (चित्रा 1)। यद्यपि साहित्य में कुछ डेटा का अर्थ है कि P2X7 रिसेप्टर्स न्यूरॉन्स में व्यक्त किए जाते हैं, जो न्यूरोनल गतिविधि और सिनैप्टिक न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 20 को विनियमित करते हैं, अन्य लेखकन्यूरोनल P2X7 रिसेप्टर्स के अस्तित्व पर सवाल उठाते हैं। दरअसल, वर्तमान परिणाम इस विचार को बनाए रखते हैं कि प्राथमिक ग्लियाल P2X7 रिसेप्टर्स अस्वास्थ्यकर ऊतकों में पाए जाने वाले उच्च बाह्य कोशिकीय एटीपी सांद्रता के लिए संक्षेप में न्यूरोनल प्रभावों की मध्यस्थता करते हैं21।

हमने पहले रेटिना कोशिकाओं के कार्यात्मक भेदभाव को उनके फेनोटाइपिक डिस्प्ले के साथ जोड़ा है, एक तरह से कि [Ca2+] i शिफ्ट की विविधताएं जो KCl या AMPA (एक ग्लूटामेट एगोनिस्ट) द्वारा सक्रिय होती हैं, सूक्ष्मनलिकाएं संबद्ध प्रोटीन (MAP-2) को व्यक्त करती हैं, एक परिपक्व न्यूरॉन 1 का मार्कर। वैकल्पिक रूप से, एटीपी द्वारा सक्रिय कोशिकाएं ग्लूटामाइन सिंथेटेज, एक ठेठ मुलर ग्लिया मार्कर को व्यक्त करती हैं।

हम विभिन्न प्रकार की सेल संस्कृतियों का उपयोग कर रहे हैं जैसा कि यहां दिखाया गया है (मिश्रित, न्यूरोनल समृद्ध या शुद्ध ग्लियाल कोशिकाएं), न्यूरोस्फीयर के अलावा 4 के अलावा ग्लूटामेटर्जिक 22, डोपामिनर्जिक 19, GABaergic23, कैनबिनोइड9,10, प्यूरिनर्जिक 14,24, सेरोटोनिनर्जिक 25 के रूप में विभिन्न न्यूरोकेमिकल सिस्टम से संबंधित कई सवालों के जवाब देने के लिए व्युत्पन्न 4 , न्यूरो-ग्लियाल रेटिना संचार को समझने के लिए दूसरों के बीच। मुलर ग्लिया बड़ी संख्या में न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स 26 को व्यक्त करता है और ग्लियोट्रांसमीटर को डी-सेरीन, एटीपी और ग्लूटामेट के रूप में स्रावित करता है, जिसे वेसिकुलर, सीए 2 + निर्भर तरीके से जारी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अनुदान, प्रायोजक, और वित्त पोषण स्रोत: एमएच पीएचडी CNPq फैलोशिप का प्राप्तकर्ता है। HRF CNPq (HRF अनुदान संख्या 152071/2020-2) द्वारा समर्थित एक पोस्टडॉक फैलोशिप का प्राप्तकर्ता है। RAMR CNPq और FAPERJ (अनुदान संख्या E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 और 312157/2016-9 और INCT-INNT (नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर ट्रांसलेशनल न्यूरोसाइंस) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mm coverslip Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 111550 Cell suport
510 nm long-pass filter Carl Zeiss
ATP Sigma A1852
B-27 Supplement Gibco 17504044 Suplement
CaCl2 Sigma-Aldrich C8106
CoolSNAP digital camera Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose Neon 1466
DMEM/ F-12 Gibco 12400-24 Cell culture medium
Excel Software Microsoft
Fetal Calf Serum Sigma-Aldrich F9665 Suplement
Fluorescence Microscope Axiovert 200; Carl Zeiss B 40-080
Fura-2 AM Molecular Probes F1221 Ratiometric Ca2+ indicator
Gentamicin Sulfate Calbiochem 1405-41-0 antibiotics
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Lambda DG-4 apparatus Sutter Instrument, Novato, CA DG-4PLUS/OF30
Laminin Gibco 23017-015 Help cell adhesion
Metafluor software Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2 Sigma M4880
Na2HPO4 Vetec 129
NaCl Isofar 310
NaHCO3 Vetec 306
PH3 platform Warner Intruments, Hamden, CT 64-0286
Pluronic F-127 Molecular Probes P6866 nonionic, surfactant
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920 Help cell adhesion
Trypsin-EDTA 0.25% Gibco 25200056 Dissociation enzyme

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 182 कैल्शियम इमेजिंग कैल्शियम तरंग न्यूरॉन-ग्लिया सर्किट एटीपी ग्लूटामेट रेटिना DRG gliotransmitter
कैल्शियम इमेजिंग तकनीक के साथ न्यूरॉन-ग्लिया सर्किट पर शिफ्ट की कल्पना करना
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Tempone, M. H., Freitas, H. R.,… More

Tempone, M. H., Freitas, H. R., Schitine, C. S., de Melo Reis, R. A. Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique. J. Vis. Exp. (182), e63338, doi:10.3791/63338 (2022).

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