Summary
세포 칼슘 이미징은 독특한 기능적 시그니처를 제공하는 칼슘 투과성 채널 / 수용체의 발현을 기반으로 개별 세포, 배양 또는 각성 동물의 혼합 집단에서 동적 신호 전달을 연구하는 다목적 방법론입니다.
Abstract
여기에서, 우리는 칼슘 이동의 관점에서 동적으로 연구되는 말초 (등쪽 뿌리 신경절) 및 / 또는 중심 조직 (피질, 심실 하부 영역, 오가노이드)의 신경교 (성상 세포, 희소 돌기 세포 및 미세 아교세포) 및 / 또는 뉴런에 기초한 회로의 선택적 시험관 내 모델을보고합니다. 결과를 설명하기 위해 선택된 모델은 망막, 복잡한 세포 상호 작용을 가진 간단한 조직입니다. 칼슘은 대부분의 중요한 세포 역할에 관여하는 보편적 인 메신저입니다. 우리는 배양물에서 망막 신경 신경교 세포를 준비하고 평가할 수있는 방법을 단계별 프로토콜로 설명하고 칼슘 이동을 구상합니다. 이 모델에서, 우리는 KCl 및 ATP에 대한 선택적 반응을 기반으로 신경교와 뉴런을 구별합니다. 칼슘 투과성 수용체 및 채널은 상이한 구획에서 선택적으로 발현된다. 칼슘 반응을 분석하기 위해, 우리는 Fura-2와 같은 비율계량 형광 다이를 사용합니다. 이 프로브는 Ca2+-free 및 Ca2+-bound 형태를 기반으로 자유 Ca2+ 농도를 정량화하여 두 파장에서 감지되는 형광 강도에 기초한 2개의 서로 다른 피크를 제시한다.
Introduction
두 번째 메신저로서의 칼슘의 보편적 인 특성으로 인해이 이온은 유전자 전사, 출생 및 사망, 증식, 이동 및 분화, 시냅스 전달 및 가소성과 같은 수많은 신호 활동에 관여합니다. 따라서 충실도와 민첩성으로 칼슘 활성화 역학을 추적 할 수있는 방법은 고유 한 시공간 - 시간 반응을 관찰하는 방법을 제공 할 것입니다. 이러한 방법은 세포 칼슘 이미징 기술로, 칼슘 시프트 기능 데이터를 뚜렷한 반응을 기반으로 특정 세포 표현형과 상호 연관시킵니다.
Ca2+ 프로브는 1980년대에 처음 개발되었으며, 이후 개선되어 이들 분자를 살아있는 세포 분석에 사용할 수 있게 되었습니다1. 화학 지표로서 Fura-2는 정량적 [Ca2+]i 측정의 표준으로 간주됩니다. 이 지시약의 아세톡시메틸 (AM) 에스테르 (즉, Fura-2 AM)는 세포막에 쉽게 침투하고 인큐베이션 희석액보다 20 배 큰 세포 내 농도 (예 : [5 μM]o / [100 μM]i)에 도달 할 수 있습니다. Fura-2의 또 다른 장점은 우수한 광표백 저항성을 가지고 있다는 것입니다. 따라서이 지표를 더 오랜 시간 동안 이미징해도 형광 기능에 큰 영향을 미치지 않습니다. 마지막으로, Fura-2는 ~100 nM 내지 ~100 μM의 광범위한 칼슘 수준에 민감하며, ~145 nM의 Kd를 가지며, 이는 휴식 [Ca2+]i2에 필적한다. 나중에, 세포 칼슘 이미징은 염료 로딩의 영향을받지 않는 비율계량 프로브와 함께 더 나은 형광 현미경 및 계산 방법으로 개발되었습니다.
모든 세포는 특정 서명으로서 최종 반응에 기여하는 다른 칼슘 장치 (펌프, 운반체, 수용체 및 채널)를 발현합니다. 중요한 팁은 표현형 발현과 상관 관계가 있는 다양한 유형의 세포의 선택적 반응을 찾는 것입니다. 따라서, 칼슘 이동을 통해 작동하는 적어도 두 개의 상이한 수용체가 있다: 빠른 모드에서 Ca2+에 침투하는 이온성 수용체와 신호전달 경로에 결합된 느린 대사성 수용체 및 이노시톨 트리포스페이트 및 순환 ADP-리보스3와 같은 제2 메신저에 의해 활성화된 Ca2+를 방출하는 세포내 스톡.
예를 들어, 전구 세포는 미성숙 망막에서 네스틴을 발현하고 GABA (또는 muscimol)4에 의해 탈분극된 GABAA 수용체를 나타낸다. 이것은 높은 세포 내 Cl-수준을 갖는 Cl-전기화학적 구배로 인해 발생합니다. 조직이 발달함에 따라, KCC2 수송체는 선조에 대한 자극에서 성숙한 GABAergic 뉴런에 대한 억제로 전환합니다5. 한편, 산후 설치류의 미성숙 심실 하부 영역 (SVZ)에서 sox-2를 발현하는 줄기 세포는 또한 히스타민에 의해 활성화 된 대사성 H1 수용체를 느린 방식으로 Ca2 +를 증가시킵니다6. 트롬빈에 의해 활성화되고 하류에서 G(q/11) 및 포스포리파제 C(PLC)로 활성화되는 프로테아제-1(PAR-1) 패밀리로부터의 두 번째 대사성 수용체는 다분화능 SVZ 신경 줄기 세포로부터 생성된 올리고덴드로사이트(O4 및 PLP를 발현하는)에서 느린 Ca2+ 이동을 제공한다7.
일반적으로 뉴런은 전압 의존적 칼슘 채널뿐만 아니라 Ca2+에 투과할 수 있는 주요 신경전달물질 수용체를 글루타마테르그(AMPA, NMDA, 카이네이트) 및 말초 및 중앙 니코틴 수용체로 발현한다. 염화칼륨은 일반적으로 심실 하부 구역9 또는 망막10에서와 같이 등쪽 뿌리 신경절 뉴런8 또는 중앙 뉴런과 같이 말초 뉴런을 활성화시키는 탈분극제로 사용됩니다. 한편, ATP는 P2X7 및 P2X4로서 선택적 Ca2+ 투과성 P2X 멤버를 활성화시키는 주요 교전달물질(D-세린 외에)으로 인정받고 있다. 두 수용체 모두 동등한 Ca2+ 전류를 존재하며, 이는 송신기11에 의해 활성화된 가장 큰 Ca2+ 전류로 인정되는 NMDA 수용체에 의해 보여지는 것과 유사하다. P2X7 수용체는 미세아교세포 상에서 고도로 발현되지만, 성상세포 및 희소돌기아교세포 상에서 더 낮은 밀도로 발현되지만, 전염증성 사이토카인의 방출에 역할을 한다12. P2X7 수용체는 또한 망막14,15에서 슈완 세포13 및 뮐러 글리아교세포 상에서 발현된다.
망막은 뇌에서 볼 수있는 거의 모든 송신기를 보여주는 것으로 알려져 있습니다. 예를 들어, 세로축(광수용체, 양극성 및 망막 신경절 세포)은 주로 글루타마테르겐성이며, 칼슘-투과성 AMPA 또는 카이네이트 수용체는 OFF-양극성 세포에서 발현되고 mgluR6은 ON-양극성 세포16에서 발현된다. 흥미롭게도, 세 수용체 모두 칼슘 및 이노시톨 삼인산염 경로에 결합되는 뮐러 글리아(Müller glia)에서도 발견된다17,18. 수평 및 아마크린 세포에 의해 만들어진 수평 억제 축은 GABA뿐만 아니라 도파민, 아세틸 콜린 및 기타 고전적인 신경 전달 물질도 분비합니다. Amacrine 세포는 조류 망막 배양물에서 발견되는 세포의 주요 유형으로, 글루타마테르겐, 퓨리너기성, 니코틴 및 전압 의존성 칼슘 채널과 같은 여러 유형의 칼슘 작동 채널을 보여줍니다. 이러한 이유로, 이것은 뉴런과 글리아 사이의 칼슘 이동의 다양한 특성을 평가하는 훌륭한 모델입니다.
따라서, 별개의 작용제 반응 패턴을 갖는 개발 동안 선택적 표현형 마커에 합산된 상이한 수용체 및 채널의 조합은 선택적 신호전달 장치를 통해 작동하는 줄기, 선조, 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포에서 독특한 시그니처를 허용한다.
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Protocol
동물과 관련된 모든 실험은 "실험실 동물 관리 원칙"(NIH, Bethesda, USA)에 따라 리우데자네이루 연방 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 수정 된 화이트 레그혼 닭 알에 대한 허가 번호 IBCCF-035.
1. 용액의 제조
- 크렙스 용액을 준비한다: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.4 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 6 mM 글루코스, 10 mM HEPES, pH 7.4, 373 mOsm).
- 식염수 완충액 (Ca2+ 및 Mg2+ 유리 용액 - CMF) 준비 : 76.55 g / L NaCl, 3.05 g / L KCl, 1.65 g / L Na2HPO4, 0.610 g / L KH2PO4, 21.95 g / L 포도당 및 7.90 g / L NaHCO3.
- 인큐베이팅 용액 준비 (크렙스 용액에 Fura-2 사용 :) 5 μM 푸라-2-아세톡시메틸 에스테르 (Fura-2), 0.1% 무지방산 소 혈청 알부민 (BSA), 및 0.02% 폴록사머 407.
- 혼합 집단 또는 글리아 배양을 위해, 배지로서 10% 우태아 송아지 혈청(FCS) 및 40mg/L 젠타미신으로 DMEM/F12를 준비하십시오.
- 뉴런 농축 배양의 경우, DMEM/F12를 1% FCS, 뉴런 세포 배양 보충제, 40mg/L 및 젠타미신을 배지로 준비하십시오.
2. 망막 해부 및 세포 배양 준비
- 공기 세포가있는 8 일 된 병아리 배아 (E8) 난자를 엽니 다.
- 페트리 접시에 달걀 내용물을 제거하고 핀셋 한 쌍으로 탈구하여 배아 안락사를 진행하십시오.
- 머리를 깨끗한 페트리 접시에 가져 와서 칼슘과 마그네슘이없는 용액 (CMF)을 부어 씻으십시오.
- 그 과정에서 눈을 손상시키지 않도록주의하십시오.
참고: 눈의 층을 눈강에서 제거하기 전에 절단하거나 파쇄하지 마십시오. - CMF가 들어있는 깨끗한 페트리 접시에 눈을 가져 오십시오.
- 렌즈를 제거하여 눈 해부를 시작합니다.
- 렌즈가 남긴 구멍부터 시작하여 눈에 3 ~ 4 개의 세로 컷을 만듭니다. 핀셋을 당기고 눈 공막을 반대 방향으로 잡고 잘라냅니다.
- 투명한 유리체 몸체를 조심스럽게 제거하고 망막이 그것에 묶여 있지 않은지 확인하십시오.
- 색소 침착 된 상피에서 망막을 분리하고 남아있는 조직을 제거하십시오.
- 맑은 망막을 작은 조각으로 자르십시오.
- 망막을 다른 수용자에게 옮기고 간단히 원심분리기(1분 동안 ∼1,800 x g)하여 CMF를 제거하였다.
- 망막을 1 mL의 0.25% 트립신과 효소적으로 해리시키고, 이를 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 10% FCS를 함유하는 배지 1 mL를 첨가하여 반응을 중지시킨다.
- 망막을 중간으로 2 ~ 3 번 씻으십시오. 세척은 배지를 추가하고 원심분리 (1 분 동안 ~ 1,800 x g)로 제거하는 사이클로 구성됩니다.
- 망막 당 2 mL의 완전한 배지를 첨가하고 망막을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 기계적으로 해리시킵니다.
참고 : 여기에서 조사관은 어떤 유형의 문화를 준비 할 것인지 선택할 수 있습니다. 풍부한 뉴런 배양을 위해서는 DMEM-F12 + 뉴런 보충제 + 1 % FCS + 항생제를 사용하십시오. 혼합 집단 또는 정제된 신경교의 경우, DMEM-F12 + 10% FCS + 항생제를 사용하십시오. - 세포를 세고 원하는 밀도로 희석하십시오.
참고: 이상적으로는, 이것은 ~2 x 106 세포 이하의 저밀도 배양물이어야 한다. - 50 μL의 세포 현탁액을 각 커버슬립에 첨가한다.
- 커버슬립 처리
- 커버슬립을 37°C에서 멸균된 정제수 중 10-50 μg/mL 폴리-L-라이신 1 mL에서 적어도 1시간(이상적으로 하룻밤) 동안 인큐베이션한다.
- 폴리-L-라이신 용액을 제거하고 커버슬립을 멸균된 정제수로 2-3회 세척한다.
- UV 조명이 켜진 안전 캐비닛에서 커버슬립을 말리십시오. 이 시점에서, 이들을 4°C에서 밀봉된 용기에 최대 1개월 동안 보관한다.
- 선택적인 단계: 뉴런 농축 배양을 위해, PBS 또는 배지에 10-20 ng/mL 라미닌 50 μL를 37°C에서 2시간 동안 각 커버슬립에 첨가한다. 인큐베이션 후, 과량의 라미닌 용액을 제거하고 커버슬립을 사용할 준비가 되었습니다.
- 세포가 유리에 부착될 때까지 5% CO2 분위기에서 37°C에서 배양한다. 이것은 약 1-2 시간이 걸릴 것입니다.
- 각 웰에 완전한 배지 1 mL를 첨가하고, 실험 당일까지 플레이트를 인큐베이터로 복귀시킨다. 필요한 경우 2-3 일마다 배지를 교체하십시오.
3. Fura-2 AM으로 세포를로드하십시오.
- 50 μL의 DMSO로 Fura-2 AM의 50 μg 바이알을 재구성한다.
- 작업 Fura-2 AM 용액을 준비하려면 3 μL의 10% 폴록사머 407, 7.5 μL의 Fura-2 AM을 DMSO 및 Krebs 용액 q.s.p.에 1.5 mL로 첨가한다.
- 수조에서 7 분 동안 혼합물을 초음파 처리하십시오.
- 세포 배양물 3x로 커버슬립을 Fura-2에서 배양하기 전에 크렙스 용액으로 세척한다.
- 37°C 및 5% CO2 에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 인큐베이션 후, 다시 3x 세척하고 크렙스를 함유하는 다른 수용자에게 옮기고 빛으로부터 보호한다.
참고: 작업 Fura-2 AM 솔루션은 빛으로부터 보호되는 경우 24시간 동안 안정적으로 유지됩니다.
4. 세포의 칼슘 이미징
- 각 실행 전에 커버슬립 지지대와 챔버에 실리콘을 추가하여 실험 중에 누출을 방지합니다.
- 커버슬립의 바닥을 증류수로 세척하여 현미경 렌즈에서 소금 결정화를 피하십시오.
- 커버 슬립을 지지대에 올려 놓고 테두리를 부드럽게 누릅니다.
- 지지체와 챔버를 현미경에 부착하고 Krebs 용액으로 세포를 관류하기 시작하십시오.
참고: 단일 세포 칼슘 이미징 실험 중 세포 관류는 0.5 mL/min의 유속으로 교정되며, 플랫폼 용액을 완전히 교체하려면 8-10초가 걸립니다. - 셀을보고 적절한 시야를 선택하십시오.
- 그들의 뚜렷한 형태학에 기초하여 세포체를 수동으로 선택하십시오.
- 자극을 가하기 전에 기준선 안정화를 기다립니다. 각 자극에는 약 30초가 소요된다.
참고: 각 실험 직전에 모든 솔루션을 준비하십시오. - 340 및 380 nm에서 대체 여기(750 밀리초)에 이어 510 nm에서 방출된 형광의 비율을 정량화함으로써 [Ca2+]i 의 변이를 평가한다.
- 형광 분석 소프트웨어를 사용하여 획득한 값을 처리합니다.
- 실험 결과를 각 행이 개별 셀을 나타내고 각 행이 시점을 나타내는 표에서 표현합니다.
5. 데이터 처리
- 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하여 단수 세포의 Fura-2 형광 비율 값의 변화를 개별적으로 또는 동시에 플로팅하십시오.
- 결정된 자극에 대한 반응성 세포의 수를 정량화하려면, 칼슘 기준선 수준의 30% 증가의 컷오프를 설정한다.
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Representative Results
여기에서, 우리는 배아 8 병아리에서 배양에 망막 세포를 사용하여 칼슘 이동의 관점에서 뉴런과 아교 신호가 어떻게 변하는지를 조사했습니다. 배양물은 본질적으로 시험관내 7일의 단계에서 혼합된 뉴런-아교세포 (≥ 1 x 106 세포/접시의 밀도에서)로서 기술된대로 15,19에 기재된 바와 같이 제조되었다 (도 1A). 대안적으로, 저밀도 (5 x 105 세포/접시)로 제조된 농축된 뉴런 세포는 시험관내 3일의 단계에서 처리된 폴리-L-라이신 (10 μg/mL) 커버슬립에 시딩된다(도 1B). 또한, 정제된 뮐러글리아는 뉴런이 제거되었을 때 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 10일 동안 유지되었다. 뉴런 및 글리아교세포의 반응을 기능적으로 정량화하기 위하여, 세포를 50 mM KCl 또는 1 mM ATP로 자극하였다. (도 1A)에 나타난 바와 같이, 302개의 셀 중 50%는 KCl에 응답했고, 53%는 ATP에 신호를 보냈다. 이러한 의미에서, 농축된 뉴런 세포 배양물은 ATP에 반응한 17%에 비해 KCl에 대한 칼슘 반응의 89%를 가졌다(도 1B). 실제로, 배양 10일 후에 뉴런이 제거되는 정제된 뮐러 글리아 배양물은 ATP에 의해서만 활성화되었다(도 1C).
그림 1. 혼합, 뉴런-농축 또는 글리아-정제된 배양물로서 제조된 망막 세포는 칼슘 이미징에서 상이한 반응 패턴을 나타낸다. (a) 배양물에서 혼합된 배아 망막 세포의 밝고 형광 분야. 동일한 현미경 필드를 5 μM fura-2 AM 형광 하에 나타내었다. 50 mM KCl은 세포의 절반 (신경 표현형)을 활성화시키는 반면, 1 mM ATP는 세포 내 칼슘 ([Ca2+]i) 수준의 증가에 상응하는 높은 F340/380 비율로 나머지 절반 (신경교 표현형)을 활성화시킵니다. (B) 농축된 뉴런 세포 배양물은 ATP에 반응한 17%에 비해 KCl에 대해 89%의 칼슘 반응을 보였다. (c) 한편, 배양 10일 후에 뉴런이 제거되는 정제된 뮐러 글리아 배양물은 ATP에 의해서만 활성화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 망막 조직을 사용하여 KCl 또는 ATP에 의해 매개되는 칼슘 반응이 각각 뉴런 및 신경교 반응으로 명확하게 분류된다는 것을 보여주었습니다 (그림 1). 문헌의 일부 데이터는 P2X7 수용체가 뉴런 활성과 시냅스 신경 전달 물질 방출을 조절하는 뉴런에서 발현된다는 것을 암시하지만20, 다른 저자들은 뉴런 P2X7 수용체의 존재에 의문을 제기합니다. 실제로, 현재의 결과는 일차 신경교 P2X7 수용체가 건강에 해로운 조직에서 발견되는 높은 세포외 ATP 농도로 합산된 뉴런 효과를 매개한다는 생각을 지탱한다21.
우리는 이전에 망막 세포의 기능적 분화를 그들의 표현형 디스플레이와 연결시켰는데, 이는 KCl 또는 AMPA (글루타메이트 작용제)에 의해 활성화되는 [Ca2+]i 시프트의 변형이 성숙한 뉴런1의 마커인 미세소관 관련 단백질 (MAP-2)을 발현하는 방식이다. 대안적으로, ATP에 의해 활성화된 세포는 전형적인 뮬러 글리아 마커인 글루타민 합성효소를 발현한다.
우리는 글루타마테르기ic22, 도파민성19, GABAergic23, cannabinoid9,10, purinergic14,24, serotoninergic25와 같은 다른 신경 화학 시스템과 관련된 많은 질문에 대답하기 위해 신경 영역 파생 4 외에도 여기에 표시된 다양한 유형의 세포 배양 (혼합, 신경 세포 농축 또는 정제 된 신경교 세포)을 사용하고 있습니다. , 다른 것들 중에서도 신경 신경교 망막 통신을 이해합니다. 뮐러 글리아는 많은 수의 신경전달물질 수용체26을 발현하고 교전달물질을 D-세린, ATP 및 글루타메이트로서 분비하며, 이는 수포성, Ca2+ 의존적 방식으로 방출될 수 있다27.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
보조금, 스폰서 및 자금 출처 : MH는 PhD CNPq 펠로우십을 수령합니다. HRF는 CNPq (HRF 보조금 번호 152071/2020-2)가 지원하는 postdoc 펠로우십을 수령합니다. RAMR은 CNPq 및 FAPERJ (허가 번호 E-26 / 202.668 / 2018, E-26 / 010.002215 / 2019, 426342 / 2018-6 및 312157 / 2016-9 및 INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience)가 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
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