Summary
Cellecalciumbilleddannelse er en alsidig metode til at studere dynamisk signalering af individuelle celler, på blandede populationer i kultur eller endda på vækkede dyr, baseret på ekspression af calciumgennemtrængelige kanaler / receptorer, der giver unikke funktionelle signaturer.
Abstract
Her rapporterer vi om selektive in vitro-modeller af kredsløb baseret på glia (astrocytter, oligodendrocytter og microglia) og / eller neuroner fra perifere (dorsale rodganglier) og centrale væv (cortex, subventrikulær zone, organoid), der dynamisk studeres med hensyn til calciumskift. Den model, der er valgt til at illustrere resultaterne, er nethinden, et simpelt væv med komplekse cellulære interaktioner. Calcium er en universel budbringer involveret i de fleste af de vigtige cellulære roller. Vi forklarer i en trinvis protokol, hvordan retinale neuron-glialceller i kultur kan forberedes og evalueres, idet vi forestiller os calciumskift. I denne model skelner vi neuroner fra glia baseret på deres selektive respons på KCl og ATP. Calciumgennemtrængelige receptorer og kanaler udtrykkes selektivt i forskellige rum. For at analysere calciumresponser bruger vi ratiometriske fluorescerende matricer som Fura-2. Denne sonde kvantificerer fri Ca2+ koncentration baseret på Ca2+-fri og Ca2+-bundne former, der præsenterer to forskellige toppe, baseret på fluorescensintensiteten opfattet på to bølgelængder.
Introduction
På grund af calciums universelle egenskaber som en anden budbringer er denne ion involveret i et stort antal signalaktiviteter: gentranskription, fødsel og død, proliferation, migration og differentiering, synaptisk transmission og plasticitet. Derfor ville en metode, der er i stand til at spore calciumaktiveringsdynamik med troskab og smidighed, give en måde at observere unikke rumlige-tidsmæssige reaktioner på. En sådan metode er den cellulære calciumbilleddannelsesteknik, som korrelerer calciumforskydninger funktionelle data med specifikke cellefænotyper baseret på deres forskellige reaktioner.
Ca2+-sonder blev først udviklet i 1980'erne, med senere forbedringer, der brugte disse molekyler i levende celleassays1. Som en kemisk indikator anses Fura-2 for at være standarden for kvantitative [Ca2+]i-målinger. Acetoxymethylesteren (AM) i denne indikator (dvs. Fura-2 AM) gennemsyrer let cellemembranen og kan nå intracellulære koncentrationer, der er 20 gange større end inkubationsfortyndingen (f.eks. [5 μM]o/[100 μM]i). En anden fordel ved Fura-2 er, at den har god fotobleaching modstand; således vil billeddannelse af denne indikator i længere perioder ikke i høj grad påvirke dens fluorescensfunktioner. Endelig er Fura-2 følsom over for en bred vifte af calciumniveauer, fra ~ 100 nM til ~ 100 μM, og har en Kd på ~ 145 nM, hvilket kan sammenlignes med resten [Ca2+]i2. Senere blev cellecalciumbilleddannelse udviklet med bedre fluorescerende mikroskoper og beregningsmetoder sammen med ratiometriske sonder, der ikke påvirkes af farvestofbelastning.
Hver celle udtrykker forskellige calciumanordninger (pumper, transportører, receptorer og kanaler), der bidrager til det endelige svar som en bestemt signatur. Det vigtige tip er at finde selektive reaktioner fra forskellige typer celler korreleret med deres fænotypiske ekspression. Følgelig er der mindst to forskellige receptorer, der fungerer gennem calciumskift: ionotrope receptorer, der gennemsyrer Ca2+ i en hurtig tilstand og langsomme metabotrope receptorer koblet til signalveje og intracellulære lagre, der frigiver Ca2+ aktiveret af anden budbringere, såsom inositoltriphosphat og cyklisk ADP-ribose3.
For eksempel udtrykker stamceller nestin i den umodne nethinde og viser GABAA-receptorer depolariseret af GABA (eller muscimol)4. Dette sker på grund af den Cl-elektrokemiske gradient med høje intracellulære Cl-niveauer ; Efterhånden som vævet udvikler sig, skifter KCC2-transportører fra excitation på forfædre til hæmning på modne GABAergiske neuroner5. På den anden side præsenterer stamceller, der udtrykker sox-2 i den umodne subventrikulære zone (SVZ) af postnatale gnavere, også metabotrope H1-receptorer aktiveret af histamin, der øger Ca2+ på en langsom måde6. En anden metabotrop receptor fra den proteaseaktiverede receptor-1 (PAR-1) familie, aktiveret af thrombin og nedstrøms til G(q/11) og phospholipase C (PLC), giver langsomme Ca2+ skift i oligodendrocytter (der udtrykker O4 og PLP) genereret fra multipotente SVZ neurale stamceller7.
Generelt udtrykker neuroner spændingsafhængige calciumkanaler såvel som store neurotransmitterreceptorer, der er gennemtrængelige for Ca2+, som glutamatergiske (AMPA, NMDA, kainat) og perifere og centrale nikotinreceptorer. Kaliumchlorid anvendes normalt som et depolariserende middel til at aktivere perifere neuroner, som de dorsale rodganglionneuroner8 eller centrale neuroner, som fra subventrikulær zone9 eller retina10. På den anden side anerkendes ATP som den største gliotransmitter (ud over D-serin), som aktiverer selektive Ca2+ permeable P2X-medlemmer som P2X7 og P2X4. Begge receptorer præsenterer ækvivalente Ca2+ strømme, svarende til dem, der vises af NMDA-receptorer, der er anerkendt som de største Ca2+ strømme aktiveret af sendere11. P2X7-receptorer udtrykkes stærkt på microglia, men med en lavere densitet på astrocytter og oligodendrocytter, der har en rolle i frigivelsen af proinflammatoriske cytokiner12. P2X7-receptorer udtrykkes også på Schwann-celler13 og Müller glia i nethinden14,15.
Nethinden er kendt for at vise næsten alle sendere, der ses i hjernen. For eksempel er den lodrette akse (fotoreceptorer, bipolære og retinale ganglionceller) hovedsageligt glutamatergisk, med calciumpermeable AMPA- eller kainatreceptorer udtrykt i OFF-bipolære celler og mgluR6 udtrykt i ON-bipolære celler16. Mærkeligt nok findes alle tre receptorer også i Müller glia, som er koblet til calcium- og inositoltrifosfatveje17,18. Den vandrette hæmmende akse, lavet af vandrette og amakrine celler, udskiller ikke kun GABA, men også dopamin, acetylcholin, og andre klassiske neurotransmittere. Amakrine celler er de vigtigste typer celler, der findes i de aviære retinale kulturer, der viser flere typer calciumopererede kanaler, som glutamatergiske, purinerge, nikotin- og spændingsafhængige calciumkanaler. Af denne grund er dette en fremragende model til at evaluere forskellige egenskaber ved calciumskift blandt neuroner og glia.
Derfor tillader kombinationen af forskellige receptorer og kanaler opsummeret til selektive fænotypiske markører under udvikling med forskellige agonistresponsmønstre unikke signaturer i stamme, stamfader, neuron, astrocyt, oligodendrocyt og microglia, der fungerer gennem selektive signalanordninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med dyr blev godkendt af og udført i retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Federal University of Rio de Janeiro i hænde efter "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH, Bethesda, USA); tilladelsesnummer IBCCF-035 til befrugtede hvide leghorn kyllingæg.
1. Fremstilling af opløsninger
- Forbered Krebs-opløsning: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
- Forbered saltvandsbuffer (Ca2+ og Mg2+ fri opløsning - CMF): 76,55 g/l NaCl, 3,05 g/l KCl, 1,65 g/l Na2HPO4, 0,610 g/l KH2PO4, 21,95 g/l glucose og 7,90 g/l NaHCO3.
- Forbered inkubationsopløsning (med Fura-2 i Krebs-opløsning:) 5 μM Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2), 0,1 % fedtsyrefrit bovin serumalbumin (BSA) og 0,02 % Poloxamer 407.
- For blandet population eller gliakultur fremstilles DMEM/F12 med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 40 mg/l gentamicin som medium.
- For neuronberiget kultur, forberede DMEM / F12 med 1% FCS, neuronal cellekultur supplement, 40 mg / L og gentamicin som medium.
2. Retina dissektion og cellekultur forberedelse
- Åbn det 8 dage gamle kyllingembryo (E8) æg, hvor luftcellen er placeret.
- Fjern ægindholdet til en petriskål og fortsæt med embryoets eutanasi ved halshugning med et par pincet.
- Bring hovedet til en ren petriskål og hæld lidt calcium- og magnesiumfri opløsning (CMF) for at vaske det.
- Fjern øjnene, pas på ikke at beskadige det i processen.
BEMÆRK: Prøv at undgå at skære eller makulere øjets lag, før du fjerner det fra øjenhulen. - Bring øjnene til en ren petriskål, der indeholder CMF.
- Start øjendissektionen ved at fjerne linsen.
- Lav 3 eller 4 langsgående snit i øjet, startende med hullet efterladt af linsen. Lav nedskæringer ved at trække pincetten og holde øjet sclera i modsatte retninger.
- Fjern den gennemsigtige glaslegeme med forsigtighed, og sørg for, at nethinden ikke er bundet til den.
- Fjern nethinden fra det pigmenterede epitel og fjern eventuelt resterende væv.
- Skær den klare nethinde i små stykker.
- Overfør nethinden til en anden modtager og centrifuger kort (~ 1.800 x g i 1 min) for at fjerne CMF'en.
- Enzymatisk dissociere nethinden med 1 ml 0,25% trypsin ved at inkubere det ved 37 °C i 10 minutter.
- Stop reaktionen ved at tilsætte 1 ml medium indeholdende 10% FCS.
- Vask nethinden 2 eller 3 gange med medium. Vasken består af cyklusser med tilsætning af medium og fjernelse af det ved centrifugering (~ 1.800 x g i 1 min).
- Tilsæt 2 ml komplet medium pr. nethinde og forsigtigt mekanisk adskille nethinden ved at pipettere den op og ned.
BEMÆRK: Her kan efterforskere vælge, hvilken type kultur der skal udarbejdes. For en beriget neuronal kultur skal du bruge DMEM-F12 + neuronal supplement + 1% FCS + antibiotika. Til blandet befolkning eller renset glia skal du bruge DMEM-F12 + 10% FCS + antibiotika. - Tæl cellerne og fortynd dem til den ønskede tæthed.
BEMÆRK: Ideelt set bør dette være en kultur med lav densitet med ~ 2 x 106 celler eller mindre. - Tilsæt 50 μL af cellesuspensionen til hvert dækslip.
- Coverslip behandling
- Inkuber dæksler i mindst 1 time (ideelt set natten over) i 1 ml 10-50 μg/ml poly-L-lysin i steriliseret renset vand ved 37 °C.
- Fjern poly-L-lysinopløsningen og vask dæksler med steriliseret renset vand 2-3 gange.
- Lad dæksler tørre i et sikkerhedsskab med UV-lys tændt. På dette tidspunkt opbevares de i en forseglet beholder ved 4 °C i op til 1 måned.
- Valgfrit trin: For neuronberigede kulturer tilsættes 50 μL 10-20 ng/ml laminin i PBS eller medium til hvert dækslip i 2 timer ved 37 °C. Efter inkubation fjernes overskydende lamininopløsning, og dækslen er klar til brug.
- Inkuber celler ved 37 °C ved en 5 % CO2-atmosfære , indtil de sætter sig fast på glasset. Dette skal tage ca. 1-2 timer.
- Tilsæt 1 ml komplet medium til hver brønd og returner pladen til inkubatoren indtil eksperimentets dag. Skift om nødvendigt mediet hver 2-3 dage.
3. Ilægning af celler med Fura-2 AM
- Rekonstituer et 50 μg hætteglas med Fura-2 AM med 50 μL DMSO.
- For at forberede fungerende Fura-2 AM-opløsning tilsættes 3 μL 10% Poloxamer 407, 7,5 μL Fura-2 AM i DMSO og Krebs-opløsning q.s.p. til 1,5 ml.
- Sonikere blandingen i 7 minutter i et vandbad.
- Vask dæksedlen med cellekulturen 3x med Krebs-opløsning, inden den inkuberes i Fura-2.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 min.
- Efter inkubation vaskes det 3x igen og overføres til en anden modtager, der indeholder Krebs og beskyttes mod lyset.
BEMÆRK: Fungerende Fura-2 AM-opløsning forbliver stabil i 24 timer, hvis den er beskyttet mod lyset.
4. Calciumbilleddannelse af celler
- Før hver kørsel skal du tilføje silicium til dækslipsstøtten og kammeret for at undgå lækage under eksperimentet.
- Vask bunden af dæksedlen med destilleret vand for at undgå saltkrystallisation på mikroskoplinsen.
- Sæt dækslen på understøtningen, tryk forsigtigt på grænserne.
- Fastgør støtten og kammeret til mikroskopet og begynd at perfusere celler med Krebs-opløsning.
BEMÆRK: Celleperfusion under enkeltcellet calciumbilleddannelseseksperimenter kalibreres til en strømningshastighed på 0,5 ml / min, og det tager 8-10 s, før platformopløsningen udskiftes fuldt ud. - Se på cellerne, og vælg et passende synsfelt.
- Vælg manuelt cellelegemerne baseret på deres særskilte morfologi.
- Før du anvender nogen stimulus, skal du vente på baseline stabilisering. Hver stimulus skal tage ca. 30 sekunder.
BEMÆRK: Forbered alle opløsningerne umiddelbart før hvert eksperiment. - Evaluer variationerne i [Ca2+]i ved at kvantificere forholdet mellem fluorescensen udsendt ved 510 nm efter alternativ excitation (750 millisekunder) ved 340 og 380 nm.
- Proces erhvervede værdier ved hjælp af en fluorescensanalysesoftware.
- Udtryk eksperimentelle resultater i en tabel, hvor hver række repræsenterer en individuel celle, og hver linje et tidspunkt.
5. Databehandling
- Ved hjælp af en regnearkssoftware skal du plotte variationen af Fura-2 fluorescensforholdsværdier for singulære celler separat eller af dem alle på samme tid.
- For at kvantificere antallet af reaktive celler til bestemt stimulus skal du indstille en afskæring på 30% stigning i calciumbaselineniveauer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her brugte vi nethindeceller i kultur fra embryonale dag 8-kyllinger til at undersøge, hvordan neuroner og glia signalerer i form af calciumforskydninger. Kulturer blev i det væsentlige fremstillet som beskrevet15,19 som blandede neuron-glialceller (ved en densitet på ≥ 1 x 106 celle/skål) på et stadium af 7 dage in vitro (figur 1A). Alternativt dækker berigede neuronale celler fremstillet i lav densitet (5 x 105 celle/skål), podet på behandlet poly-L-lysin (10 μg/ml), på et stadium af 3 dage in vitro (figur 1B). Derudover blev renset Müller glia opretholdt i 10 dage i DMEM indeholdende 10% FCS, når neuroner blev fjernet. For funktionelt at kvantificere neuronernes og glias reaktioner blev cellerne stimuleret med 50 mM KCl eller 1 mM ATP. Som vist (figur 1A) reagerede 50% ud af 302 celler på KCl, mens 53% signalerede til ATP. I denne forstand havde beriget neuronal cellekultur en 89% af calciumresponserne på KCl sammenlignet med 17%, der reagerede på ATP (figur 1B). Faktisk blev en oprenset Müller glia-kultur, hvor neuroner fjernes efter 10 dage i kultur, udelukkende aktiveret af ATP (figur 1C).
Figur 1. Retinale celler fremstillet som blandede, neuronal-berigede eller glia-rensede kulturer viser forskellige responsmønstre på calciumbilleddannelse. A) Lyse felter og fluorescensfelter af blandede embryonale retinale celler i kultur. Det samme mikroskopfelt vist under 5 μM fura-2 AM fluorescens. 50 mM KCl aktiverer halvdelen af cellerne (neuronal fænotype), mens 1 mM ATP aktiverer den anden halvdel (glialfænotype) med høje F340/380-forhold svarende til stigninger i intracellulære calciumniveauer ([Ca2+]i). (B) Den berigede neuronale cellekultur havde et 89% calciumrespons på KCl sammenlignet med 17%, der reagerede på ATP. (C) På den anden side blev en oprenset Müller glia-kultur, hvor neuroner fjernes efter 10 dage i kultur, udelukkende aktiveret af ATP. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har brugt nethindevævet til at vise, at calciumresponser medieret af KCl eller ATP er tydeligt opdelt i henholdsvis neuronale og gliale reaktioner (figur 1). Selvom nogle data i litteraturen antyder, at P2X7-receptorer udtrykkes i neuroner, som regulerer neuronal aktivitet og synaptisk neurotransmitterfrigivelse20, sætter andre forfattere spørgsmålstegn ved eksistensen af neuronale P2X7-receptorer. Faktisk opretholder de nuværende resultater ideen om, at primære glial P2X7-receptorer medierer neuronale virkninger opsummeret til høje ekstracellulære ATP-koncentrationer, der findes i usunde væv21.
Vi har tidligere forbundet den funktionelle differentiering af retinale celler med deres fænotypiske display på en måde, så variationer af [Ca2+]i-skift, der aktiveres af KCl eller AMPA (en glutamatagonist), udtrykker mikrotubuli associeret protein (MAP-2), markør for en moden neuron1. Alternativt udtrykker celler aktiveret af ATP glutaminsyntetase, en typisk Muller glia-markør.
Vi har brugt forskellige typer cellekulturer som vist her (blandede, neuronale berigede eller rensede gliaceller) ud over neurosfærer afledt4 til at besvare mange spørgsmål relateret til forskellige neurokemiske systemer som glutamatergic22, dopaminerg19, GABAergic23, cannabinoid9,10, purinergic14,24, serotoninergic25 , blandt andet for at forstå den neuro-glial retinale kommunikation. Müller glia udtrykker et stort antal neurotransmitterreceptorer26 og udskiller gliotransmittere som D-serin, ATP og glutamat, som kan frigives på en vesikulær, Ca2+-afhængig måde27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Stipendier, sponsorer og finansieringskilder: MH er modtager af et ph.d.-CNPq-stipendium. HRF er modtager af et postdoc-stipendium støttet af CNPq (HRF-bevillingsnummer 152071/2020-2). RAMR støttes af CNPq og FAPERJ (tilskudsnummer E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 og 312157/2016-9 og INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
- Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
- De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
- Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
- Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
- Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
- Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
- Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
- Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
- Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
- Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
- Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
- Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
- López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
- Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
- Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
- Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
- Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
- Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neuroscience. 281, 208-215 (2014).
- Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
- Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
- de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).
