Summary
הליך שלאחר קיבוע שונה מגביר את הניגודיות של חלקיקי גליקוגן ברקמה. מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב המתאר כיצד לטפל ברקמה, לבצע את ההדמיה ולהשתמש בשיטות סטרולוגיות כדי להשיג נתונים משוחדים וכמותיים על התפלגות גליקוגן תת-תאי ספציפית לסוג סיבים בשריר השלד.
Abstract
עם השימוש במיקרוסקופיה אלקטרונים שידור, תמונות ברזולוציה גבוהה של דגימות קבועות המכילות סיבי שריר בודדים ניתן להשיג. הדבר מאפשר כימות של היבטים אולטרה-מבניים כגון שברי נפח, יחסי שטח פנים לנפח, מורפומטריה ואתרי מגע פיזיים של מבנים תת-תאיים שונים. בשנות השבעים פותח פרוטוקול להכתמה משופרת של גליקוגן בתאים וסלל את הדרך לשרשרת מחקרים על לוקליזציה תת-תאית של גודל חלקיקי גליקוגן וגליקוגן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. בעוד שרוב הניתוחים מפרשים את הגליקוגן כאילו הוא מופץ בצורה הומוגנית בתוך סיבי השריר, ומספק רק ערך אחד (למשל, ריכוז ממוצע), מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור גילתה כי גליקוגן מאוחסן כחלקיקי גליקוגן נפרדים הממוקמים בתאים תת-תאיים נפרדים. כאן מתואר הפרוטוקול שלב אחר שלב מאיסוף רקמות לקביעה הכמותית של שבר הנפח וקוטר החלקיקים של הגליקוגן בתאים התת-תאיים הייחודיים של סיבי שריר השלד הבודדים. שיקולים כיצד 1) לאסוף ולהכתים דגימות רקמה, 2) לבצע ניתוחי תמונה וטיפול בנתונים, 3) להעריך את הדיוק של הערכות, 4) להפלות בין סוגי סיבי שריר, ו 5) מלכודות מתודולוגיות ומגבלות כלולות.
Introduction
חלקיקי גליקוגן מורכבים מפולימרים מסועפים של גלוקוז וחלבונים נלווים שונים1 ומהווים דלק חשוב במהלך דרישות מטבוליות גבוהות2. למרות שאינם מוכרים באופן נרחב, חלקיקי גליקוגן מהווים גם דלק מקומי, שבו כמה תהליכים תת-תאיים מעדיפים לנצל גליקוגן למרות הזמינות של דלקים אחרים ועמידים יותר כמו גלוקוז פלזמה וחומצות שומן3,4.
החשיבות של אחסון גליקוגן כדלק תת-תאי ספציפי מקומי נידונה במספר ביקורות5,6 בעיקר בהתבסס על כמה מהתיעודים המוקדמים ביותר של ההפצה התת-תאית של גליקוגן על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM)7,8. המחקרים הראשונים השתמשו בפרוטוקולים שונים כדי להגביר את הניגודיות של גליקוגן מטכניקות הכתמה היסטוכימיות לכתמים שליליים וחיוביים9,10. התפתחות מתודולוגית חשובה הייתה פרוטוקול לאחר הקיבעון המעודן עם אוסמיום מופחת אשלגן פרוציאניד11,12,13,14, אשר שיפר באופן משמעותי את הניגודיות של חלקיקי גליקוגן. פרוטוקול מעודן זה לא שימש בחלק מהעבודה החלוצית על דלדול גליקוגן הנגרמת על ידי פעילות גופנית15, אך הוצג מחדש על ידי גרהם ועמיתיו 16,17.
בהתבסס על התמונות הדו-ממדיות, ההתפלגות התת-תאית של הגליקוגן מתוארת לרוב כחלקיקי גליקוגן הממוקמים בשלוש בריכות: תת-קרקעי (ממש מתחת לקרום פני השטח), intermyofibrillar (בין המיופיברילים), או intramyofibrillar (בתוך המיופיברילים). עם זאת, חלקיקי גליקוגן יכולים גם להיות מתוארים כקשורים, למשל, רשת רטיקולמוס סרקופלסמית7 או גרעינים18. בנוסף להפצה התת-תאית, היתרון של תוכן הגליקוגן המוערך על ידי TEM הוא גם כימות יכול להתבצע ברמת הסיבים הבודדים. זה מאפשר חקירה של שונות סיבים לסיבים וניתוחים קורלטיביים עם סוגי סיבים ורכיבים תאיים כמו מיטוכונדריה וטיפות שומנים בדם.
כאן, הפרוטוקול עבור TEM-מוערך סיבים ספציפיים סוג תוכן נפחי של שלוש בריכות תת תאיות נפוצות של גליקוגן (תת-קרקעי, intermyofibrillar, ו intramyofibrillar) בסיבי שריר השלד מתואר. השיטה יושמה על שרירי שלד מבני אדם19, חולדות20, ועכברים21; כמו גם ציפורים ודגים22; וקרדיומיוציטים מחולדות23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי באמצעות דגימות שרירי שלד ביופסיה אנושית אושר על ידי הוועדות האזוריות על אתיקה מחקר בריאות עבור דרום דנמרק (S-20170198). ביופסיות שרירים הושגו באמצעות חתך בעור מהשריר העצום לרוחב באמצעות מחט Bergström עם יניקה לאחר הרדמה מקומית ניתנה תת עורית (1-3 מ"ל של לידוקאין 2% לכל חתך). אם נעשה שימוש בשרירי חולדה שלמים מבודדים, בעלי החיים הוקרבו על ידי פריקת צוואר הרחם לפני שהושגו ביופסיות השרירים, בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בעלי החיים בבית החולים האוניברסיטאי אודנס, דנמרק.
1. קיבעון ראשוני, לאחר קיבעון, הטבעה, חלוקה, חלוקה וניגודיות
- הכן 1.6 מ"ל של פתרון קבוע ראשוני (2.5% glutaraldehyde במאגר 0.1 M נתרן קקודילאט (pH 7.3)) בצינור צנטריפוגה מיקרו 2 מ"ל. יש לאחסן אותו בטמפרטורה של 5 °C (5 °F) למשך 14 ימים לכל היותר.
- מן הביופסיה שריר או שריר שלם, לבודד דגימה קטנה, אשר יש קוטר מקסימלי של 1 מ"מ בכל כיוון והוא קצת יותר ארוך בכיוון סיבים אורך מאשר חתך (למטרות אוריינטציה).
- מניחים את הדגימה בצינור המכיל את פתרון הקיבעון הראשי הקר. לאחסן אותו ב 5 °C (5 °F) במשך 24 שעות.
- לשטוף את הדגימה ארבע פעמים (15 דקות בין כל לשטוף) ב 0.1 M נתרן קקודילאט מאגר (pH 7.3). באמצעות פיפטות העברה, הסר את המאגר המשומש מהצינור והשאיר את הדגימה ללא פגע, ולאחר מכן הוסף את המאגר הטרי.
הערה: לאחר הכביסה הסופית, ניתן לאחסן את הדגימה במאגר 0.1 M נתרן קקודילאט ב 5 °C (5 °F) במשך מספר חודשים11. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. - Postfix עם 1% אוסמיום tetroxide (OsO4) ו 1.5% אשלגן ferrocyanide (K4Fe(CN)6) ב 0.1 M נתרן קקודילאט חוצץ (pH 7.3) במשך 120 דקות ב 4 °C (4 °F ).
הערה: השימוש ב-1.5% אשלגן פרוציאניד (K4Fe(CN)6) חיוני לניגוד אופטימלי של חלקיקי גליקוגן11,12,13. - יש לשטוף פעמיים במים מזוקקים כפולים בטמפרטורת החדר (RT).
- להתייבש על ידי טבילה בסדרה מדורגת של אלכוהול (אתנול) ב RT באמצעות הריכוזים הבאים: 70% (10 דקות), 70% (10 דקות), 95% (10 דקות), 100% (10 דקות), 100% (10 דקות) ו 100% (10 דקות).
הערה: בכל שלב, הדגימה שקועה באתנול, אשר לאחר מכן רק חלקית הוסר כדי למנוע ייבוש של הדגימה. לבסוף, האתנול שנותר מושלך. - לחדור עם תערובות מדורגות של תחמוצת פרופילן ושרף epossidic ב RT באמצעות יחסי נפח הבאים (תחמוצת פרופילן / שרף epossidic): 1/0 (10 דקות), 1/0 (10 דקות), 1/0 (10 דקות), 3/1 (45 דקות), 1/1 (45 דקות), 1/3 (45 דקות), 0/1 (לילה). למחרת, להטמיע דגימות ב 100% שרף epossidic טרי בתבניות פילמור ב 60 °C (60 °F) עבור 48 שעות.
הערה: שיטה מדורגת זו היא לפי הפרוטוקולים הקודמים11,12. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. - חותכים קטעים דקים במיוחד (60-70 ננומטר) של סיבים בעלי אוריינטציה קוויטודינית ואוספים אותם על רשתות נחושת של חור אחד כדלקמן.
- הר בלוק של דגימה על מחזיק ultramicrotome.
- חותכים את הבלוק על פני השטח עם סכין גילוח על מנת להגיע לרמת הרקמה.
- התקן סכין יהלום (ultracut 45) מול המדגם ויישר את משטח הדגימה במקביל לסכין.
- הפק מקטע דק למחצה (1 מיקרומטר) עם סכין היהלום כדי לבדוק את כיוון המדגם. הכתימו את החלק הדק למחצה בכחול טולואידין לתצפית עם מיקרוסקופיה קלה.
- חתוך את הבלוק עוד יותר כדי להפחית את שטח העניין על מנת לקבל מקטעים דקים במיוחד מתאימים.
- חותכים מקטעי אולטרה-דק (60-70 ננומטר) עם סכין יהלום שנייה (אולטרה-חתך 45).
- לאסוף 1-2 חלקים על רשתות נחושת חור אחד באמצעות לולאה מושלמת.
הערה: רשת נחושת חור אחד יש חור אחד באמצע עם קרום תומך Formvar.
- סעיפים מנוגדים עם אורניל אצטט וציטוט עופרת על ידי טבילת הרשתות לעיל בתמיסת אורניל אצטט (0.5% במים מזוקקים כפול) במשך 20 דקות, ולאחר מכן בתמיסת ציטראט עופרת (1% במים מזוקקים כפול) במשך 15 דקות. לשטוף את הרשתות במים מזוקקים כפול בין ואחרי שני כתמים.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. הדמיה
- הפעל את מיקרוסקופ אלקטרוני השידור (המופעל במתח מואץ של 80 kV), מחשב ותוכנת הקלטת תמונה. הקלט תמונות דיגיטליות באמצעות מצלמת CCD דיגיטלית של סריקה איטית של 2 k x 2 k ותוכנת ההדמיה המשויכת.
- הכנס את הרשת עם מקטעים מרובים בשלב המיקרוסקופ.
- סנן את הרשת בתחילה בהגדלה נמוכה (לדוגמה, x100) כדי לקבוע את איכות המקטעים (כלומר, חורים בממברנה התומכת, פסולת וכו ') ובחר את החלקים באיכות הטובה ביותר. בהגדלה נמוכה, לקבוע את הכיוון של סיבי השריר.
- לאחר מכן, הגדל את ההגדלה כאשר הקורה מרוכזת בסיבים היקפיים בחלק. מקד את התמונה בהגדלה מעל 30 k כדי להבטיח פרטים עדינים מספיקים בתמונה, בהנחיית טרנספורמציה מהירה של פורייה בזמן אמת, אם היא זמינה. לבסוף, הקלט תמונות עם זמן חשיפה של 1 שניות בהגדלה הרצויה.
- לרכוש סך של 24 תמונות של סיבים שנבחרו באופן אקראי, כלומר, 12 תמונות של החלל myofibrillar ו 12 תמונות של החלל subsarcolemmal, בהגדלה בין 10 k ו 40 k. ודאו שהתמונות מופצות לאורכם ולרוחבם של הסיבים בסדר אקראי אך שיטתי כדי להשיג תוצאות לא משוחדות (איור 1A).
הערה: ההגדלה האופטימלית תלויה ברזולוציית המצלמה הזמינה ובגודל המיקרוגרפים. המטרה היא להשיג רזולוציה סופית, שבה ניתן למדוד קטרים של חלקיקי גליקוגן בתוך 1 ננומטר צעדים, ולכלול שטח כולל של אזור myofibrillar של לפחות 70 μm2 ואורך כולל של סיבים של לפחות 25 מיקרומטר מופץ לתוך 12 תמונות של החלל myofibrillar ו 12 תמונות של החלל subsarcolemmal לכל סיבים, בהתאמה. 24 התמונות לסיבים יספקו ככל הנראה דיוק (מקדם טעות) של התוכן הנפחי של מאגרי הגליקוגן השונים בין 0.1 ל-0.2 בסיבים בודדים משרירי שלד אנושיים, עכברושים ועכברים20,21,24 (איור 2E). - חזור על שלבים 2.4 ו- 2.5 עד לתמונה הכוללת של 6-10 סיבים. במידת הצורך, גזור מקטעים נוספים (מופרדים על ידי לפחות 150 מיקרומטר כדי למנוע חפיפה של סיבים שכבר צולמו) ולחזור על שלבים 1.9-2.5.
3. ניתוחי תמונה
- יבא תמונות ל- ImageJ על-ידי לחיצה על קובץ > פתח.
- הגדר קנה מידה כללי כך שיתאים לגודל המקורי של התמונה על-ידי לחיצה על נתח > קבע קנה מידה.
- הגדל את התצוגה ב-100% על-ידי לחיצה על תמונה > זום > פנימה.
- מדוד את העובי של דיסק Z אחד לתמונה של מרחב המיופיברילר (12 לסיבים) באמצעות הכלי קו ישר מתפריט כלים (איור 1D). חשב את עובי דיסק Z הממוצע של כל אחד מ- 6-10 הסיבים.
- הגדר 2-3 סיבים עם דיסק Z הממוצע העבה ביותר כסיבים מסוג 1 ו-2-3 סיבים עם דיסק Z הממוצע הדק ביותר כסיבים מסוג 2. התעלמו מסיבי הביניים 2-4 לניתוחים נוספים (איור 1E).
הערה: השלבים הבאים חוזרים על עצמם עבור כל אחד מ-4-6 הסיבים מהדגימה. שברי נפח הגליקוגן מוערכים לפי ספירת נקודות כמתואר במקומות אחרים25,26. גודל הרשתות נבחר כדי לקבל דיוק גבוה משביע רצון של האומדנים. זה מתקבל לעתים קרובות על ידי השגת 250 כניסות, אשר לאחר מכן מכתיב את המספר הכולל של נקודות הדרושות, בתורו, את האזור לנקודה. - השתמשו בכלי קו מקוטע כדי למדוד את אורך המיופיבריל החיצוני ביותר הנראה ממש מתחת לאזור התת-קרקעי (איור 2A).
הערה: אורך זה משמש להבעת גליקוגן תת-קרקעי לכל שטח פנים (כלומר, אורך המיופיבריל החיצוני ביותר המוכפל בעובי המקטע (60 ננומטר); ראה שלב 4.5). לכן, רק האזור התת-קרקעי, המיוצג על ידי אורך זה, נכלל בניתוח. - הוסף רשת על-ידי לחיצה על נתח כלים > > רשת והגדר את שטח לנקודה ב- 32,400 nm2. ספרו את מספר הלהיטים באורך הזמין ב-12 התמונות התת-קרקעיות, שבהן צלב פוגע בגליקוגן התת-קרקעי (איור 2A). פגיעה מוגדרת כחלקיק גליקוגן שנמצא בפינה הימנית העליונה של צלב.
- הוסף רשת על-ידי לחיצה על נתח כלים > > רשת והגדר את שטח לנקודה ב- 160,000 nm2. ספרו את מספר הלהיטים ב-12 התמונות של מיופיברילר, שבהן צלב פוגע בחלל התוך-מיופיברילר (איור 2B).
- הוסף רשת על-ידי לחיצה על נתח כלים > > רשת והגדר שטח לנקודה ב- 3,600 nm2. ספרו את מספר הלהיטים ב-12 התמונות של מיופיברילר, שבהן צלב פוגע בגליקוגן התוך-מיופיברילר (איור 2C).
- הוסף רשת על-ידי לחיצה על ניתוח כלים > > רשת והגדר שטח לנקודה ב- 32,400 nm2. ספרו את מספר הלהיטים ב-12 התמונות של מיופיברילר, שבהן צלב פוגע בגליקוגן אינטרמיופיברילר (איור 2D).
- באמצעות הכלי קו ישר , מדוד את הקוטר של חמישה חלקיקי גליקוגן שנבחרו באקראי של כל מאגר עבור כל אחת מ-12 התמונות כדי להשיג בממוצע 60 חלקיקים לבריכה לכל סיב.
הערה: הממוצע של 60 חלקיקים מכסה במידה רבה את השונות בתוך הסיבים (איור 2F).
4. חישובים
- חשב את שבר השטח הנראה לעין (AA) של הרווח התוך-מיופיברילר לכל רווח מיופיברילר כסכום של כל הלהיטים חלקי סכום כל הנקודות מתוך 12 התמונות (משלב 3.8).
- חשב את החלק השטח הנראה לעין של lycogen intramyofibrillar לכל אזור myofibrillar, אינטרמיופיברילר גליקוגן לכל אזור myofibrillar, ו glycogen subsarcolemmal לכל אזור תמונה כסכום של כל הלהיטים מחולק בסכום של כל הנקודות מתוך 12 תמונות (משלבים 3.7, 3.9, ו 3.10).
- חשב את שבר הנפח (VV) של intramyofibrillar, intermyofibrillar, ו גליקוגן תת-רחמי, בהתאמה, כשבר השטח הנראה לעין (AA) פחות תוצר של צפיפות פני השטח (SV) עם עובי מקטע (t), כאשר צפיפות פני השטח היא הצפיפות המספרית של חלקיקים המוכפלים על ידי משטח החלקיקים הממוצע:
Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
איפה
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · ח)2)) · (t + H))
t = 0.06 מיקרומטר
H = קוטר ממוצע של החלקיקים (מיקרומטר)
הערה: שבר עוצמת הקול קטן יותר מחלק השטח הנראה לעין עקב תרומתם של אותיות רישיות מחלקיקים כשהמרכז שלהן נמצא מחוץ לפרוסה25. - כדי לבטא גליקוגן intramyofibrillar לכל מרחב intramyofibrillar, חלק את החלק השטח של גליקוגן intramyofibrillar (שלב 4.2) על ידי החלק השטח של החלל intramyofibrillar (שלב 4.1). הגליקוגן אינטרמיופיברילר מתבטא לפי מרחב מיופיברילר כפי שחושב בשלב הקודם (שלב 4.3).
- כדי לבטא גליקוגן תת-קרקעי לכל שטח על פני השטח של הסיבים (VS) (מיופיבריל חיצוני), המר את שבר הנפח של הגליקוגן לכמות מוחלטת על-ידי הכפלה בנפח התמונה (תוצר של שטח ועובי מקטע) וחלוקה לפי תוצר של אורך זמין ממוצע (משלב 3.6) עם עובי מקטע (t).
- הערך את תכולת הגליקוגן הכוללת של נפח באמצעות הערכים משלבים 4.1, 4.4 ו- 4.5, כדלקמן:
Myofibrillar glycogen = Intermyofibrillar glycogen + (intramyofibrillar glycogen · אזור שבר של מרחב intramyofibrillar)
על ידי הנחה של רדיוס סיבים ממוצע של 40 מיקרומטר27, יחס נפח לפני השטח הוא 20:1, כך גליקוגן הכולל הוא:
סה"כ גליקוגן (VV) = מיופיברילר גליקוגן + (גליקוגן תת-קרקעי (VS) / 20)
הערה: יחס נפח לפני השטח של 20:1 יכול להשתנות מסיבים לסיבים בהתאם לגודל הסיבים בפועל ולגודל האזור התת-קרקעי. פעולה זו אינה נלקחת בחשבון עם הפרוטוקול הנוכחי. - מכאן, התרומה היחסית מכל מאגר מחושבת כשבריקים של הגליקוגן הכולל:
Intermyofibrillar glycogen / Total glycogen = Intermyofibrillar glycogen / Total glycogen
Intramyofibrillar glycogen / Total glycogen = (Intramyofibrillar glycogen · אזור שבר של מרחב intramyofibrillar) / סה"כ גליקוגן
גליקוגן תת-קרקעי / סה"כ גליקוגן = גליקוגן תת-קרקעי / 20 / סה"כ גליקוגן - עבור כל מאגר גליקוגן, חשב את מקדם השגיאה (CE), המבטא את חוסר הוודאות של הערכת הגליקוגן ברמת הסיבים, בהתבסס על מספר התמונות (n), המספר הכולל של הצלבים בכל תמונה (x) ומספר הצלבים הפוגעים בגליקוגן במאגר הרלוונטי בכל תמונה (y) כדלקמן28:
CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑אי) -2 - 2∑ (xy) · ∑x-1 · ∑y-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה, חלקיקי הגליקוגן נראים שחורים ומובחנים (איורים 1 ואיור 2). הערכים הרגילים של הגליקוגן מתוארים באיור 3. נתונים אלה מבוססים על סך של 362 סיבים מ 41 גברים צעירים בריאים כפי שנאספו במחקרים קודמים שונים19,24,29,30,31. כאן, ניתן לראות כי ערכי גליקוגן intermyofibrillar מופצים קרוב לנורמלי, ואילו הן intramyofibrillar והן גליקוגן תת-קרקעי מראים התפלגות מוטה, שבה לסיבים לפעמים יש כמות מופרזת של גליקוגן. חשוב לציין כי בסיבים שריריים בגודל רגיל (קוטר של 60-80 מיקרומטר), אינטרמיופיברילר גליקוגן הוא הבריכה הגדולה ביותר המהווה כ -80% מתכולת הגליקוגן הכוללת. אינטרמיופיברילר וגליקוגן תת-קרקעי מהווים כל אחד כ-10% מכלל התוכן.
איור 1: הדמיה והקלדת סיבים. (A) כל סיב מצוי בתמונה בסדר שיטתי אקראי. (ב) דוגמה לתמונה מהחלל התת-קרקעי. (ג) דוגמה לתמונה ממרחב המיופיברילר. (D) בכל תמונת myofibrillar, הרוחב של דיסק Z אחד נמדד (קווים אדומים). המדידות של סך של 12 דיסקי Z (אחד לכל תמונה) מעניקות מקדם שגיאה של כ- 0.03. (ה) ההתפלגות האופיינית של רוחב הדיסק Z הסיבים הממוצע ב-6-10 סיבים מכל אחת מ-10 הביופסיות. מכל ביופסיה, 2-3 סיבים מוגדרים כסוגים 1 ו -2 בהתבסס על התפלגות הביופסיה הפנימית. התמונות מקורן בביופסיה של m. vastus lateralis של מרים כוח הכלול במחקר קודם29. m: מיטוכונדריה ו- Z: Z-disc. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוחי גליקוגן. (A) נפח גליקוגן תת-קרקעי לכל שטח פנים מוערך לפי ספירת נקודות באמצעות גודל רשת של 180 ננומטר x 180 ננומטר בתוך אזור המוגדר לפי אורך המיופיבריל החיצוני ביותר והאזור התת-קרקעי המאונך לאורך זה (קווים מנוקדים כחולים). (B) שבר נפח myofibrillar מוערך לפי ספירת נקודות באמצעות גודל רשת של 400 ננומטר x 400 ננומטר. (C) שבר הנפח של הגליקוגן intramyofibrillar מוערך לפי ספירת נקודות באמצעות גודל רשת של 60 ננומטר x 60 ננומטר. (D) שבר הנפח של גליקוגן intermyofibrillar מוערך לפי ספירת נקודות באמצעות גודל רשת של 180 ננומטר x 180 ננומטר. ב- A-D, העיגולים האדומים מצביעים על להיטים (צלב שפוגע בחלקיק גליקוגן). (ה) מקדם השגיאה המשוער עבור הערכת יחס סטרולוגי24 עבור 2 עד 12 תמונות מנותחות. מקדם השגיאה מוערך בהתבסס על מספר הספירה ולכן משתנה בין דגימות בהתבסס על ריכוז הגליקוגן. לעתים קרובות הוא נמוך יחסית כאשר תוכן הגליקוגן גבוה ולהיפך. (F) מקדם וריאציה של קוטר חלקיקי גליקוגן לאחר מדידת 2-99 חלקיקים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ערכים רגילים של שלוש הבריכות התת-תאיות של הגליקוגן בשריר השלד. חלקות הכינור מבוססות על 362 סיבים מ-41 צעירים בריאים (בני 18-39). הסיבים מקורם במחקרים קודמים, שבהם ביופסיות מ m. vastus lateralis במצב מנוחה או בקרה הושגו19,24,24,29,30,31. ערכים מוצגים כהתוויית תיבה עם סמן עבור החציון ותיבת סימון הטווח הבין-שוויוני. הקווים מייצגים ערכים סמוכים עליונים ותחתונים. הקופסאות מכוסות על-ידי חלקות צפיפות ליבה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי של השיטה הוא השימוש של אוסמיום מופחת על ידי אשלגן ferrocyanide במהלך לאחר קיבוע. הסלקטיביות של תיקון שונה זה לגילוי גליקוגן לא ניתן להסביר באופן מלא על ידי כימיה, אבל כולל גם ממצאים ניסיוניים המוכיחים שום זיהוי של חלקיקים כאלה ברקמות ידוע להיות ללא גליקוגן או בחלל חוץ תאי11.
הפרמטרים הקריטיים הם הדיוק של האומדנים וריאציית הסיבים לסיבים. על ידי ביצוע הפרוטוקול הנוכחי להדמיה, מתקבל מקדם שגיאה בין 0.1 ל -0.2 מההערכות של מאגרי הגליקוגן השונים לסיבים. רמת שגיאה זו נמוכה בהרבה מהשונות בין סיבים בודדים (איור 3). מומלץ לדווח על הערכות דיוק כאלה בעת הערכת התוכן הנפחי של גליקוגן. שיטת הקלדת הסיבים המוצגת מאומתת כנגד איזופורם ATPase מיוזין29. ניתן להשתמש גם בעובי דיסק Z ובשבר נפח המיטוכונדריאלי בשילוב כדי לציין את סוג הסיבים, אך לא שבר נפח מיטוכונדריאלי לבד32.
המגבלות העיקריות של השיטה הן חוסר היכולת לזהות את חלקיקי הגליקוגן הקטנים מאוד וכי פרופילים של חלקיקי גליקוגן עשויים לחפוף בתמונה המוקרנת28. המגבלה הראשונה מבטלת מדד אמיתי של גודל החלקיקים הממוצע. זה הופך להיות הטיה חמורה כאשר חלקיקי הגליקוגן מתפרקים במהלך דרישות מטבוליות גבוהות, ואילו ההטיה עשויה להיות חסרת משמעות כאשר חלקיקי הגליקוגן גדלים ממדיים לגודל גדול יותר במהלך סינתזה של גליקוגן או פיצוי-על. אמנם זה עשוי להיות השלכות עצומות על האומדן של גודל חלקיקי גליקוגן ממוצע ברמות גליקוגן נמוכות, ההערכות של ריכוזי גליקוגן נפחי הם חזקים, שכן חלקיקי גליקוגן קטנים, ללא הפרעה לתרום מעט מאוד לקראת התוכן גליקוגן הכולל. המגבלה השנייה מקורה במצב, שבו חלקיקי הגליקוגן קטנים בהרבה מעובי המקטעים. הטיה זו קיימת בעיקר בריכוזי גליקוגן גבוהים מאוד וניתן לחקור אותה על ידי השוואת שברי נפח הגליקוגן של חלקים עם עוביים שונים. אם מקטע עבה יותר אינו מקביל לשבר נפח גליקוגן גבוה, זה חייב להיות בגלל הערכת חסר עקב חלקיקים חופפים יותר בחלק העבה ביותר. במחקרים קודמים, שבר נפח הגליקוגן מתאם עם ריכוז הגליקוגן בטווח שבין 50 ל -600 מ"מ ק"ג dw-1 המציין שאין חפיפה בולטת של חלקיקים. עם זאת, אם ריכוז הגליקוגן עולה מעל רמה זו, אין עלייה בגליקוגן intermyofibrillar המציין חפיפה33. זה יכול להיפתר על ידי אקסטרפולציה את הקשר בין שבר נפח גליקוגן והריכוז בריכוז הגליקוגן התחתון.
בהתבסס על רזולוציית nm שסופקה על ידי TEM, פרוטוקול זה הוא כיום השיטה היחידה להערכת ההתפלגות התת-תאית של גליקוגן. בנוסף, המתודולוגיה מאפשרת גם גישה כמותית רחבת היקף (כמתואר כאן), שבה ניתן להשיג ערכים כמותיים ברמת הסיבים הבודדים. זה בעל חשיבות עצומה בשרירי השלד עם הטרוגניות גבוהה בגיוס סיבים במהלך סוגים שונים של פעילות גופנית2, שם מנגנוני עייפות תלויי גליקוגן מתרחשים רק בחלק מהסיבים. לשיטה יש גם פוטנציאל לרקמות מרגשות אחרות כמו קרדיומיוציטים, שם ידוע כי גליקוגן חיוני לתפקוד לב תקין וקריטי במהלך איסכמיה23,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הוועד האולימפי השבדי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
