Summary
Modifiye edilmiş bir fiksasyon sonrası prosedür, dokudaki glikojen parçacıklarının kontrastını arttırır. Bu yazıda, iskelet kasında lif tipine özgü hücre altı glikojen dağılımı hakkında tarafsız ve nicel veriler elde etmek için dokunun nasıl ele alınacağını, görüntülemenin nasıl yapılacağını ve stereolojik yöntemlerin nasıl kullanılacağını açıklayan adım adım bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
İletim elektron mikroskobu kullanımı ile, bireysel kas lifleri içeren sabit numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edilebilir. Bu, hacim fraksiyonları, yüzey alanı / hacim oranları, morfometri ve farklı hücre altı yapıların fiziksel temas bölgeleri gibi ultrayapısal yönlerin nicelleştirilmesini sağlar. 1970'lerde, hücrelerde glikojen boyamasının arttırılması için bir protokol geliştirildi ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak glikojen ve glikojen parçacık boyutunun hücre altı lokalizasyonu üzerine bir dizi çalışmanın yolunu açtı. Çoğu analiz, glikojen kas lifleri içinde homojen olarak dağılmış gibi yorumlarken, sadece tek bir değer (örneğin, ortalama bir konsantrasyon) sağlarken, iletim elektron mikroskobu, glikojenin farklı hücre altı bölmelerde bulunan ayrık glikojen parçacıkları olarak depolandığını ortaya koymuştur. Burada, doku toplanmasından, bireysel iskelet kası liflerinin farklı hücre altı bölmelerindeki glikojen hacim fraksiyonunun ve parçacık çapının kantitatif olarak belirlenmesine kadar adım adım protokol açıklanmaktadır. 1) Doku örneklerinin nasıl toplanacağı ve boyanacağı, 2) görüntü analizlerinin ve veri işlemenin nasıl yapılacağı, 3) tahminlerin hassasiyetinin nasıl değerlendirileceği, 4) kas lifi tipleri arasında ayrım yapılacağı ve 5) metodolojik tuzakların ve sınırlamaların nasıl yapılacağına ilişkin hususlar yer almaktadır.
Introduction
Glikojen partikülleri, glikozun dallanmış polimerlerinden ve çeşitli ilişkili proteinlerden1 oluşur ve yüksek metabolik talepler sırasında önemli bir yakıt oluşturur2. Yaygın olarak tanınmamasına rağmen, glikojen parçacıkları aynı zamanda bazı hücre altı proseslerin, plazma glikozu ve yağ asitleri gibi diğer ve daha uzun ömürlü yakıtların mevcudiyetine rağmen tercihen glikojen kullandığı yerel bir yakıt oluşturur3,4.
Glikojen depolamanın hücre altı spesifik lokalize bir yakıt olarak depolanmasının önemi, çeşitli derlemelerde tartışılmıştır5,6 esas olarak glikojen iletimi elektron mikroskobu (TEM)7,8 ile glikojen hücre altı dağılımının en eski belgelerinden bazılarına dayanmaktadır. İlk çalışmalarda histokimyasal boyama tekniklerinden negatif ve pozitif boyamalara kadar glikojen kontrastını arttırmak için farklı protokoller kullanılmıştır9,10. Önemli bir metodolojik gelişme, glikojen parçacıklarının kontrastını önemli ölçüde artıran potasyum ferrosiyanürle indirgenmiş osmiyum11,12,13,14 ile rafine edilmiş fiksasyon sonrası protokoldü. Bu rafine protokol, egzersize bağlı glikojen tükenmesi konusundaki öncü çalışmaların bazılarında kullanılmamıştır15, ancak Graham ve meslektaşları tarafından yeniden tanıtılmıştır16,17.
2 boyutlu görüntülere dayanarak, glikojenin hücre altı dağılımı çoğunlukla üç havuzda bulunan glikojen parçacıkları olarak tanımlanır: subsarkolemmal (yüzey zarının hemen altında), intermiyofibriller (miyofibriller arasında) veya intramiyofibriller (miyofibriller içinde). Bununla birlikte, glikojen parçacıkları, örneğin sarkoplazmik retikulum7 veya çekirdekler18 ile ilişkili olarak da tanımlanabilir. Hücre altı dağılıma ek olarak, TEM tarafından tahmin edilen glikojen içeriğinin avantajı, nicelemenin tek lif seviyesinde yapılabilmesidir. Bu, lif-lif değişkenliğinin araştırılmasına ve mitokondri ve lipit damlacıkları olarak lif tipleri ve hücresel bileşenlerle korelasyon analizlerine olanak tanır.
Burada, iskelet kası liflerindeki üç yaygın hücre altı glikojen havuzunun (subsarkolemmal, intermiyofibriller ve intramiyofibriller) TEM tarafından tahmin edilen fiber tipine özgü hacimsel içeriği için protokol açıklanmaktadır. Yöntem, insanlardan iskelet kaslarına uygulanmıştır19, sıçanlar20 ve fareler21; kuşların ve balıkların yanı sıra22; ve sıçanlardan kardiyomiyositler23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan biyopsisi yapılan iskelet kası örneklerini kullanan mevcut protokol, Güney Danimarka için Sağlık Araştırma Etiği Bölge Komiteleri (S-20170198) tarafından onaylanmıştır. Kas biyopsileri, deri altından lokal anestezi verildikten sonra emme ile Bergström iğnesi kullanılarak vastus lateralis kasından derideki bir kesi yoluyla elde edildi (insizyon başına %2 1-3 mL Lidokain). İzole edilmiş bütün sıçan kasları kullanılmışsa, Danimarka'daki Odense Üniversitesi Hastanesi'ndeki hayvan etik komitesinin yönergelerine uygun olarak, kas biyopsileri alınmadan önce hayvanlar servikal çıkık tarafından kurban edildi.
1. Birincil sabitleme, sabitleme sonrası, gömme, bölümleme ve kontrast oluşturma
- 2 mL'lik bir mikro santrifüjleme tüpünde 1.6 mL birincil fiksatif çözelti (0.1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7.3)% 2.5 glutaraldehit) hazırlayın. En fazla 14 gün boyunca 5 ° C'de saklayın.
- Kas biyopsisinden veya tüm kastan, herhangi bir yönde maksimum 1 mm çapına sahip olan ve uzunlamasına lif yönünde kesitsel olarak (oryantasyon amaçlı) biraz daha uzun olan küçük bir örneği izole edin.
- Numuneyi soğuk primer fiksasyon çözeltisini içeren tüpe yerleştirin. 24 saat boyunca 5 °C'de saklayın.
- Numuneyi 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,3) dört kez (her yıkama arasında 15 dakika) yıkayın. Transfer pipetlerini kullanarak, numuneye dokunulmadan kalan kullanılmış tamponu tüpten çıkarın ve ardından taze tamponu ekleyin.
NOT: Son yıkamanın ardından, numune 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda 5 °C'de birkaç ay boyunca saklanabilir11. Protokol burada duraklatılabilir. - 4 °C'de 120 dakika boyunca 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,3) %1 ozmiyum tetroksit (OsO4) ve %1,5 potasyum ferrosiyanür (K4Fe(CN)6) içeren sonek.
NOT: %1,5 potasyum ferrosiyanür (K4Fe(CN)6) kullanımı, glikojen parçacıklarının optimal kontrastı için gereklidir11,12,13. - Oda sıcaklığında (RT) çift damıtılmış suda iki kez durulayın.
- Aşağıdaki konsantrasyonları kullanarak RT'de derecelendirilmiş bir alkol (etanol) serisine batırılarak kurutun: % 70 (10 dakika),% 70 (10 dakika),% 95 (10 dakika),% 100 (10 dakika) ve% 100 (10 dakika).
NOT: Her adımda, numune etanol içine batırılır ve daha sonra numunenin kurumasını önlemek için sadece kısmen çıkarılır. Son olarak, kalan etanol atılır. - Aşağıdaki hacim oranlarını (propilen oksit / epossidik reçine) kullanarak RT'de derecelendirilmiş propilen oksit ve epossidik reçine karışımları ile sızın: 1/0 (10 dakika), 1/0 (10 dakika), 3/1 (45 dakika), 1/1 (45 dakika), 1/3 (45 dakika), 0/1 (geceleme). Ertesi gün, numuneleri kalıplara %100 taze possidik reçineye gömün ve 48 saat boyunca 60 °C'de polimerize edin.
NOT: Bu derecelendirilmiş yöntem, önceki protokollere11,12 uygundur. Protokol burada duraklatılabilir. - Uzunlamasına yönlendirilmiş liflerin ultra ince (60-70 nm) kesitlerini kesin ve bunları aşağıdaki gibi tek delikli bakır ızgaralarda toplayın.
- Bir numunenin bloğunu ultramikrotom tutucuya monte edin.
- Doku seviyesine ulaşmak için yüzeydeki bloğu bir tıraş bıçağı ile kesin.
- Numunenin önüne bir elmas bıçak (ultracut 45) takın ve numune yüzeyini bıçağa paralel olarak hizalayın.
- Numunenin yönünü kontrol etmek için elmas bıçakla yarı ince (1 μm) bir bölüm oluşturun. Işık mikroskobu ile gözlem için yarı ince kesiti toluidin mavisi ile lekeleyin.
- Uygun ultra ince bölümler elde etmek için ilgi alanını azaltmak için bloğu daha da kesin.
- Ultra ince (60-70 nm) bölümleri ikinci bir elmas bıçakla (ultracut 45) kesin.
- Mükemmel Döngü kullanarak tek delikli bakır ızgaralarda 1-2 bölüm toplayın.
NOT: Tek delikli bakır ızgaranın ortasında Formvar destek membranlı tek bir delik vardır.
- Yukarıdaki ızgaraları 20 dakika boyunca uranil asetat çözeltisine (çift damıtılmış suda% 0.5) ve daha sonra 15 dakika boyunca kurşun sitrat çözeltisine (çift damıtılmış suda% 1) batırarak uranil asetat ve kurşun sitrat ile kontrast kesitler. Izgaraları iki leke arasında ve sonrasında çift damıtılmış suda yıkayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
2. Görüntüleme
- İletim elektron mikroskobunu (80 kV'luk hızlandırıcı voltajda çalıştırılır), bilgisayarı ve görüntü kayıt yazılımını açın. Dijital yavaş tarama 2 k x 2 k CCD kamera ve ilgili görüntüleme yazılımı ile dijital görüntüler kaydedin.
- Mikroskop aşamasında birden fazla bölümlü ızgarayı yerleştirin.
- Bölümlerin kalitesini (yani, destek membranındaki delikler, döküntüler vb.) belirlemek için ızgarayı başlangıçta düşük büyütmede (örneğin, x100) tarayın ve en kaliteli bölümleri seçin. Düşük büyütmede, kas liflerinin yönünü belirleyin.
- Daha sonra, bölümdeki çevresel bir fiber üzerinde ortalanmış ışın ile büyütmeyi artırın. Görüntüde yeterli ince ayrıntı sağlamak için görüntüyü 30 k'nın üzerindeki büyütmeye odaklayın ve varsa Gerçek Zamanlı Hızlı Fourier Dönüşümü ile yönlendirilin. Son olarak, istenen büyütmede 1 s pozlama süresine sahip görüntüler kaydedin.
- Rastgele seçilmiş bir lifin toplam 24 görüntüsünü, yani miyofibriller boşluğun 12 görüntüsünü ve subsarkolemmal alanın 12 görüntüsünü, 10 k ile 40 k arasında bir büyütmede elde edin. Tarafsız sonuçlar elde etmek için görüntülerin fiberin uzunluğu ve genişliği boyunca rastgele ancak sistematik bir sırayla dağıtıldığından emin olun (Şekil 1A).
NOT: En uygun büyütme, mevcut kamera çözünürlüğüne ve mikrografların boyutuna bağlıdır. Amaç, glikojen parçacık çaplarının 1 nm adımlarla ölçülebildiği nihai bir çözünürlüğe ulaşmak ve miyofibriller bölgenin toplam alanını en az 70 μm2 ve lifin toplam uzunluğunu en az 25 μm'lik bir miyofibriller boşluğun 12 görüntüsüne ve lif başına subsarkolemmal boşluğun 12 görüntüsüne dağıtmak, sırasıyla. Lif başına 24 görüntü, büyük olasılıkla, insan, sıçan ve fare iskelet kaslarından gelen bireysel liflerde 0.1 ila 0.2 arasındaki farklı glikojen havuzlarının hacimsel içeriğinin hassasiyetini (hata katsayısı) verecektir20,21,24 (Şekil 2E). - Toplam 6-10 fiber görüntülenene kadar 2,4 ve 2,5 numaralı adımları yineleyin. Gerekirse, ek bölümleri kesin (önceden görüntülenen liflerin üst üste binmesini önlemek için en az 150 μm ile ayrılmış) ve 1.9-2.5 adımlarını tekrarlayın.
3. Görüntü analizleri
- Dosya > Aç'a tıklayarak görüntüleri ImageJ'ye aktarın.
- Analiz Et > Ölçeği Ayarla'ya tıklayarak genel ölçeği görüntünün orijinal boyutuyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
- Image > Zoom > In'e tıklayarak %100 yakınlaştırın.
- Araçlar menüsünden Düz Çizgi aracını kullanarak miyofibriller boşluğun görüntüsü başına bir Z-diskinin kalınlığını (fiber başına 12) ölçün (Şekil 1D). 6-10 fiberin her birinin ortalama Z-disk kalınlığını hesaplayın.
- En kalın ortalama Z-diske sahip 2-3 fiberi tip 1 fiberler olarak ve en ince ortalama Z-disc'i tip 2 fiberler olarak tanımlayan 2-3 fiber. Daha ileri analizler için ara 2-4 lifleri göz ardı edin (Şekil 1E).
NOT: Aşağıdaki adımlar, numunedeki 4-6 lifin her biri için tekrarlanır. Glikojen hacim fraksiyonları, başka bir yerde açıklandığı gibi nokta sayımı ile tahmin edilir25,26. Tahminlerin tatmin edici bir yüksek hassasiyetini elde etmek için ızgaraların boyutu seçilir. Bu genellikle 250 isabet elde ederek elde edilir, bu da daha sonra ihtiyaç duyulan toplam puan sayısını ve dolayısıyla puan başına alanı belirler. - Subsarkolemmal bölgenin hemen altında görülebilen en dıştaki miyofibrilin uzunluğunu ölçmek için Segmentli Çizgi aracını kullanın (Şekil 2A).
NOT: Bu uzunluk, yüzey alanı başına subsarkolemmal glikojeni eksprese etmek için kullanılır (yani, en dıştaki miyofibrilin uzunluğu, bölümün kalınlığı ile çarpılır (60 nm); bkz. adım 4.5). Bu nedenle, sadece bu uzunlukla temsil edilen subsarkolemmal bölge analize dahil edilir. - Kılavuz > Araçlarını Analiz Et>e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alan Sayısı'nı 32.400 nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın subsarkolemmal glikojene çarptığı 12 subsarkolemmal görüntüde mevcut uzunluktaki isabet sayısını sayın (Şekil 2A). Bir vuruş, bir haç sağ üst köşesinde bulunan bir glikojen parçacık olarak tanımlanır.
- Kılavuz > Araçlarını Analiz > 'a tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alan Sayısı'nı 160.000 nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın intramiyofibriler boşluğa çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2B).
- Izgara > Araçlarını Analiz Et>e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alan Sayısı'nı 3.600 nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın intramiyofibriler glikojene çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2C).
- Izgara > Araçlarını Analiz Et>e tıklayarak bir ızgara ekleyin ve Nokta Başına Alan Sayısı'nı 32.400 nm2 olarak ayarlayın. Bir çaprazın intermiyofibriller glikojene çarptığı 12 miyofibriller görüntüdeki isabet sayısını sayın (Şekil 2D).
- Düz Çizgi aracını kullanarak, lif başına havuz başına ortalama 60 parçacık elde etmek için 12 görüntünün her biri için her havuzun rastgele seçilmiş beş glikojen parçacığının çapını ölçün.
NOT: 60 parçacığın ortalaması büyük ölçüde elyaf içindeki varyasyonu kapsar (Şekil 2F).
4. Hesaplamalar
- Miyofibriller boşluk başına intramiyofibriller boşluğun görünür alan fraksiyonunu (AA), tüm isabetlerin toplamının, 12 görüntüdeki tüm noktaların toplamına bölünmesiyle (adım 3.8'den itibaren) hesaplayın.
- Miyofibriler alan başına intramiyofibriller glikojenin, miyofibriller alan başına intermiyofibriller glikojen ve görüntü alanı başına subsarkolemmal glikojenin görünür alan fraksiyonunu, tüm isabetlerin toplamının 12 görüntüdeki tüm noktaların toplamına bölünmesiyle hesaplayın (adım 3.7, 3.9 ve 3.10'dan).
- Sırasıyla intramiyofibriller, intermiyofibriller ve subsarkolemmal glikojenin hacim fraksiyonunu (VV), görünür alan fraksiyonu (AA) eksi kesit kalınlığına (t) sahip yüzey yoğunluğu (SV) ürünü olarak hesaplayın, burada yüzey yoğunluğu, parçacıkların ortalama parçacık yüzeyi ile çarpılan sayısal yoğunluğudur:
Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
nerede
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
t = 0,06 μm
H = parçacıkların ortalama çapı (μm)
NOT: Hacim fraksiyonu, merkezleri dilimin dışında olan parçacıklardan gelen kapakların katkısı nedeniyle görünür alan fraksiyonundan daha küçüktür25. - İntramiyofibriller boşluk başına intramiyofibriller glikojeni eksprese etmek için, intramiyofibriller glikojenin alan fraksiyonunu (adım 4.2) intramiyofibriller boşluğun alan fraksiyonuna (adım 4.1) bölün. İntermiyofibriller glikojen bir önceki adımda hesaplandığı gibi miyofibriller boşluk başına eksprese edilir (adım 4.3).
- Elyafın (VS) yüzey alanı başına subsarkolemmal glikojeni eksprese etmek için (en dıştaki miyofibril), glikojenin hacim fraksiyonunu, görüntünün hacmi (alan ve kesit kalınlığının ürünü) ile çarparak ve kesit kalınlığı (t) ile ortalama mevcut uzunluktaki (adım 3.6'dan) ürüne bölünerek mutlak bir miktara dönüştürün.
- Adım 4.1, 4.4 ve 4.5'teki değerleri kullanarak toplam hacimsel glikojen içeriğini aşağıdaki gibi tahmin edin:
Myofibrillar glikojen= İntramiyofibriller glikojen + (intramiyofibriler glikojen · intramiyofibriller boşluğun alan fraksiyonu)
Ortalama lif yarıçapının 40 μm27 olduğunu varsayarsak, hacim-yüzey oranı 20: 1'dir, bu nedenle toplam glikojen şudur:
Toplam glikojen (VV) = Myofibrillar glikojen + (subsarkolemmal glikojen (VS) / 20)
NOT: 20:1'lik hacim-yüzey oranı, gerçek lif boyutuna ve subsarkolemmal bölgenin boyutuna bağlı olarak fiberden elyafa değişebilir. Bu, mevcut protokolle dikkate alınmamaktadır. - Bundan, her havuzdan gelen göreceli katkı, toplam glikojenin fraksiyonları olarak hesaplanır:
İnmiyofibriller glikojen / Toplam glikojen = İnmiyofibriller glikojen / Toplam glikojen
İntramiyofibriller glikojen / Toplam glikojen = (İntramiyofibriller glikojen · intramiyofibriller boşluğun alan fraksiyonu) / Toplam glikojen
Subsarkolemmal glikojen / Toplam glikojen = Subsarkolemmal glikojen / 20 / Toplam glikojen - Her bir glikojen havuzu için, görüntü sayısına (n), her görüntüdeki toplam haç sayısına (x) ve her görüntüde (y) ilgili havuzda glikojen çarpan haç sayısına bağlı olarak bir fiber düzeyinde glikojen tahmininin belirsizliğini ifade eden hata katsayısını (CE) aşağıdaki gibi hesaplayın28:
CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolü kullanarak, glikojen parçacıkları siyah ve farklı görünür (Şekil 1 ve Şekil 2). Glikojen normal değerleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu veriler, önceki farklı çalışmalarda toplanan 41 sağlıklı genç erkekten toplam 362 liflere dayanmaktadır19,24,29,30,31. Burada, intermiyofibriller glikojen değerlerinin normale yakın dağıldığı, oysa hem intramiyofibriller hem de subsarkolemmal glikojenin, liflerin bazen aşırı miktarda glikojene sahip olduğu çarpık bir dağılım gösterdiği görülebilir. Normal büyüklükteki kas lifinde (60-80 μm çapında), intermiyofibriller glikojenin toplam glikojen içeriğinin yaklaşık% 80'ini oluşturan en büyük havuz olduğuna dikkat etmek önemlidir. İntramiyofibriller ve subsarkolemmal glikojenin her biri toplam içeriğin yaklaşık% 10'unu oluşturur.
Şekil 1: Görüntüleme ve fiber tipleme . (A) Her lif randomize sistematik bir sırayla görüntülenir. (B) Subsarkolemmal uzaydan bir görüntü örneği. (C) Miyofibriller uzaydan bir görüntü örneği. (D) Her miyofibriller görüntüde, bir Z-diskinin genişliği ölçülür (kırmızı çizgiler). Toplam 12 Z-diskinin ölçümleri (görüntü başına bir tane) yaklaşık 0,03'lük bir hata katsayısı verir. (E) Ortalama lif Z-disk genişliğinin 10 biyopsiden her birinin 6-10 lifinde tipik dağılımı. Her biyopsiden 2-3 lif, biyopsi içi dağılıma göre tip 1 ve 2 olarak tanımlanır. Görüntüler, önceki bir çalışmada yer alan bir powerlifter'ın m. vastus lateralis biyopsisinden kaynaklanmaktadır29. m: mitokondri ve Z: Z-disk. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Glikojen analizleri. (A) Yüzey alanı başına subsarkolemmal glikojen hacmi, en dıştaki miyofibrilin uzunluğu ve bu uzunluğa dik subsarkolemmal bölge (mavi noktalı çizgiler) ile tanımlanan bir bölge içinde 180 nm x 180 nm'lik bir ızgara boyutu kullanılarak nokta sayımı ile tahmin edilir. (B) Miyofibriller hacim fraksiyonu, 400 nm x 400 nm ızgara boyutu kullanılarak nokta sayımı ile tahmin edilir. (C) İntramiyofibriller glikojenin hacim fraksiyonu, 60 nm x 60 nm ızgara boyutu kullanılarak nokta sayımı ile tahmin edilir. (D) İnamiofibiller glikojenin hacim fraksiyonu, 180 nm x 180 nm ızgara boyutu kullanılarak nokta sayımı ile tahmin edilir. A-D'de, kırmızı daireler isabetleri gösterir (bir glikojen parçacığına çarpan bir haç). (E) 2 ila 12 analiz edilen görüntü için stereolojik oran tahmini24 için tahmini hata katsayısı. Hata katsayısı, sayım sayısına göre tahmin edilir ve bu nedenle glikojen konsantrasyonuna bağlı olarak numuneler arasında değişir. Glikojen içeriği yüksek olduğunda genellikle nispeten düşüktür ve bunun tersi de geçerlidir. (F) 2-99 parçacık ölçüldükten sonra glikojen parçacık çapının değişim katsayısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İskelet kasındaki üç hücre altı glikojen havuzunun normal değerleri. Keman arsaları, 41 sağlıklı genç erkekten (18-39 yaş) 362 elyafa dayanmaktadır. Lifler, dinlenme veya kontrol durumundaki m. vastus lateralis'ten biyopsilerin elde edildiği önceki çalışmalardan kaynaklanmaktadır19,24,29,30,31. Değerler, medyan için bir işaretleyici ve çeyrekler arası aralığı gösteren bir kutu içeren bir kutu grafiği olarak gösterilir. Çizgiler üst ve alt bitişik değerleri temsil eder. Kutular çekirdek yoğunluğu grafikleri ile kaplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yöntemin kritik adımı, fiksasyon sonrası sırasında potasyum ferrosiyanür ile indirgenmiş osmiyum kullanılmasıdır. Glikojen tespiti için bu modifiye fiksatifin seçiciliği kimya ile tam olarak açıklanamaz, ancak aynı zamanda glikojen içermediği bilinen dokularda veya hücre dışı boşlukta bu tür parçacıkların tespit edilmediğini gösteren deneysel bulguları da içerir11.
Kritik parametreler, tahminlerin hassasiyeti ve elyaftan elyafa varyasyondur. Görüntüleme için mevcut protokolü izleyerek, lif başına farklı glikojen havuzlarının tahminlerinin 0.1 ila 0.2'si arasında bir hata katsayısı elde edilir. Bu hata seviyesi, bireysel lifler arasındaki varyasyonun çok altındadır (Şekil 3). Glikojen hacimsel içeriğini tahmin ederken bu tür hassas tahminlerin bildirilmesi teşvik edilir. Sunulan lif tipleme yöntemi miyozin ATPaz izoform29'a karşı doğrulanmıştır. Z-disk kalınlığı ve mitokondriyal hacim fraksiyonu, fiber tipini belirtmek için kombinasyon halinde de kullanılabilir, ancak tek başına mitokondriyal hacim fraksiyonu kullanılamaz32.
Yöntemin başlıca sınırlamaları, çok küçük glikojen parçacıklarının tespit edilememesi ve glikojen parçacıklarının profillerinin öngörülen görüntüde üst üste gelebilmesidir28. İlk sınırlama, ortalama parçacık boyutunun gerçek bir ölçüsünü geçersiz kılar. Bu, yüksek metabolik talepler sırasında glikojen parçacıkları bozulduğunda ciddi bir önyargı haline gelirken, glikojen parçacıkları glikojen resentezi veya süper kompanzasyon sırasında glikojen parçacıkları ortamdan daha büyük bir boyuta büyüdüğünde önyargı önemsiz olabilir. Bunun, düşük glikojen seviyelerinde ortalama glikojen parçacık boyutunun tahmini için büyük etkileri olsa da, hacimsel glikojen konsantrasyonlarının tahminleri sağlamdır, çünkü küçük, gözlenmemiş glikojen parçacıkları toplam glikojen içeriğine çok az katkıda bulunur. İkinci sınırlama, glikojen parçacıklarının bölümlerin kalınlığından çok daha küçük olduğu durumdan kaynaklanmaktadır. Bu önyargı çoğunlukla çok yüksek glikojen konsantrasyonlarında bulunur ve farklı kalınlıklara sahip bölümlerin glikojen hacim fraksiyonları karşılaştırılarak araştırılabilir. Daha kalın bir kesit yüksek glikojen hacimli bir fraksiyon ile paralel değilse, bunun nedeni en kalın kesitteki daha üst üste binen parçacıklar nedeniyle hafife alınması gerekir. Önceki çalışmalarda, glikojen hacim fraksiyonu, parçacıkların belirgin bir şekilde üst üste binmediğini gösteren 50 ila 600 mmol kg dw-1 aralığındaki glikojen konsantrasyonu ile ilişkilidir. Bununla birlikte, glikojen konsantrasyonu bu seviyenin üzerine çıkarsa, örtüşmeyi gösteren intermiyofibriller glikojen artışı olmaz33. Bu, glikojen hacim fraksiyonu ile düşük glikojen konsantrasyonlarındaki konsantrasyon arasındaki ilişkiyi tahmin ederek çözülebilir.
TEM tarafından sağlanan nm çözünürlüğüne dayanarak, bu protokol şu anda glikojenin hücre altı dağılımını tahmin etmek için tek yöntemdir. Ek olarak, metodoloji aynı zamanda nicel değerlerin tek lif seviyesinde elde edilebileceği büyük ölçekli bir nicel yaklaşıma (burada açıklandığı gibi) izin verir. Bu, glikojene bağımlı yorgunluk mekanizmalarının sadece bazı liflerde meydana geldiği çeşitli egzersiz türleri sırasında2 lif alımında yüksek heterojenliğe sahip iskelet kaslarında büyük önem taşımaktadır. Yöntem ayrıca, glikojenin normal kalp fonksiyonu için gerekli olduğu ve iskemi sırasında kritik olduğu bilinen kardiyomiyositler gibi diğer uyarılabilir dokular için de potansiyele sahiptir23,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma İsveç Olimpiyat Komitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
