Summary
修正された固定後手順は、組織中のグリコーゲン粒子のコントラストを増加させる。この論文は、組織を処理し、イメージングを行い、立体学的方法を使用して骨格筋における繊維型特異的な細胞内グリコーゲン分布に関する偏りのない定量的データを得る方法を説明するステップバイステップのプロトコルを提供する。
Abstract
透過型電子顕微鏡を用いることで、個々の筋線維を含む固定試料の高解像度画像を得ることができる。これにより、体積分率、表面積対体積比、モルフォメトリー、および異なる細胞内構造の物理的接触部位などの超構造的側面の定量化が可能になる。1970年代には、細胞内のグリコーゲンの染色を強化するためのプロトコルが開発され、透過型電子顕微鏡を用いたグリコーゲンおよびグリコーゲン粒子径の細胞内局在化に関する一連の研究への道を開いた。ほとんどの分析では、グリコーゲンが筋線維内に均質に分布しているかのように解釈され、単一の値(例えば、平均濃度)しか提供されないが、透過型電子顕微鏡は、グリコーゲンが別個の細胞内区画に位置する個別のグリコーゲン粒子として保存されることが明らかになった。ここでは、組織採取から個々の骨格筋線維の別個の細胞内区画におけるグリコーゲンの体積分率および粒子径の定量的決定までの段階的なプロトコールが記載されている。1)組織標本の収集と染色、2)画像解析とデータ処理の実行、3)推定値の精度の評価、4)筋線維タイプの識別、5)方法論的な落とし穴と限界に関する考慮事項が含まれています。
Introduction
グリコーゲン粒子は、グルコースと様々な関連タンパク質1の分岐ポリマーで構成されており、代謝要求が高い2際に重要な燃料を構成しています。広く認識されていないが、グリコーゲン粒子はまた、血漿グルコースおよび脂肪酸として他のより長期持続性の燃料が利用可能であるにもかかわらず、いくつかの細胞内プロセスがグリコーゲンを優先的に利用する局所燃料を構成する3,4。
グリコーゲンを細胞内特異的局在化燃料として貯蔵することの重要性は、主に透過型電子顕微鏡(TEM)7,8によるグリコーゲンの細胞内分布に関する初期の文書のいくつかに基づいて、いくつかのレビュー5,6で議論されている7,8。最初の研究では、組織化学染色技術から陰性および陽性染色へのグリコーゲンのコントラストを高めるために、異なるプロトコールを使用しました9,10。重要な方法論的発展は、フェロシアン化カリウム還元オスミウム11,12,13,14による精製された固定後プロトコルであり、グリコーゲン粒子のコントラストを有意に改善した。この洗練されたプロトコルは、運動誘発グリコーゲン枯渇に関する先駆的な研究の一部では使用されず15、グラハムと同僚によって再導入されました16,17。
2次元画像に基づいて、グリコーゲンの細胞内分布は、サルコレンマル下(表面膜のすぐ下)、筋原線維間(筋原線維間)、または筋原線維内(筋原線維内)の3つのプールに位置するグリコーゲン粒子として最も頻繁に記述される。しかしながら、グリコーゲン粒子は、例えば筋小胞体7またはnuclei18に関連するものとして記述することもできる。細胞内分布に加えて、TEM推定グリコーゲン含有量の利点は、単繊維レベルで定量を行うことができることである。これにより、繊維間変動性の調査や、ミトコンドリアや脂肪滴などの繊維タイプや細胞成分との相関解析が可能になります。
ここでは、骨格筋線維におけるグリコーゲンの3つの一般的な細胞内プール(筋筋下、筋原線維間、および筋原線維内)のTEM推定線維型特異的体積含量に関するプロトコールが記載されている。この方法は、ヒト19、ラット20、およびマウス21の骨格筋に適用されている。鳥や魚だけでなく22;ラット由来の心筋細胞23。
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Protocol
ヒト生検された骨格筋サンプルを用いた本プロトコールは、デンマーク南部の健康研究倫理に関する地域委員会(S-20170198)によって承認された。筋生検は、局所麻酔が皮下投与された後に吸引されたベルグストローム針を用いて バストゥス側方 筋から皮膚の切開を通して得られた(切開部あたり2%のリドカイン1〜3mL)。単離されたラット全筋肉を使用した場合、デンマークのオーデンセ大学病院の動物倫理委員会のガイドラインに従って、筋肉生検が得られる前に動物を子宮頸部脱臼によって屠殺した。
1. 一次固定、後固定、埋め込み、セクショニング、およびコントラスト
- 1.6 mL の一次固定液 (0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.3) 中の 2.5% グルタルアルデヒド) を 2 mL マイクロ遠心チューブに調製します。5°Cで最大14日間保管してください。
- 筋肉生検または筋肉全体から、任意の方向に最大直径が1mmであり、縦繊維方向が断面的よりも少し長い小さな標本を単離する(配向目的のため)。
- 冷一次固定液を入れたチューブに検体を入れる。5°Cで24時間保管してください。
- 検体を0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.3)で4回(各洗浄の間に15分間)洗浄する。トランスファーピペットを使用して、使用済みの緩衝液をチューブから取り出し、試料をそのままにし、続いて新鮮な緩衝液を加えます。
注:最終洗浄後、検体は0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液に5°Cで数ヶ月間保存することができます11。プロトコルはここで一時停止できます。 - 0.1 M カコジル酸ナトリウムバッファー (pH 7.3) に 1% 四酸化オスミウム (OsO4) および 1.5% フェロシアン化カリウム (K4Fe(CN)6) を 4 °C で 120 分間後置します。
注:1.5%フェロシアン化カリウム(K4Fe(CN)6)の使用は、グリコーゲン粒子の最適なコントラストに不可欠です11,12,13。 - 室温(RT)の二重蒸留水で2回すすいでください。
- 以下の濃度を用いてRTで段階的な一連のアルコール(エタノール)に沈めることによって脱水する:70%(10分)、70%(10分)、95%(10分)、100%(10分)、および100%(10分)。
注:各ステップにおいて、試料はエタノールに浸漬され、その後、試料の乾燥を避けるために部分的にのみ除去される。最後に、残ったエタノールは廃棄される。 - 以下の体積比(プロピレンオキシド/エポシディック樹脂)を用いてRTでプロピレンオキシドとエポシディック樹脂の段階的混合物を浸潤させる:1/0(10分)、1/0(10分)、3/1(45分)、1/1(45分)、0/1(一晩)。翌日、100%新鮮なエポシド樹脂に試験片を型に埋め込み、60°Cで48時間重合させた。
注: この段階的な方法は、以前のプロトコルに従っています11,12。プロトコルはここで一時停止できます。 - 縦方向に配向した繊維の極薄(60-70nm)切片を切断し、以下のように1穴の銅グリッドに集める。
- 試料のブロックをウルトラミクロトームホルダーに取り付けます。
- 組織のレベルに達するために、表面のブロックをカミソリの刃でトリミングします。
- ダイヤモンドナイフ(ウルトラカット45)をサンプルの前に取り付け、サンプル表面をナイフと平行に整列させます。
- ダイヤモンドナイフで半薄(1μm)の断面を作り、サンプルの向きを確認します。半薄切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察する。
- ブロックをさらにトリミングして関心領域を狭め、適切な超薄断面を取得します。
- 2本目のダイヤモンドナイフ(ウルトラカット45)で超薄(60-70 nm)切片を切断します。
- パーフェクトループを使用して、1穴の銅グリッド上の1〜2セクションを収集します。
注:1穴の銅グリッドには、Formvar支持膜を備えた中央に1つの穴があります。
- 上記のグリッドを酢酸ウラニル溶液(二重蒸留水中で0.5%)に20分間浸漬し、次いでクエン酸鉛溶液(二重蒸留水中で1%)に15分間浸漬することによって、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛と切片を対比させる。2つの汚れの間と後に二重蒸留水でグリッドを洗う。
メモ: プロトコルはここで一時停止できます。
2. イメージング
- 透過型電子顕微鏡(加速電圧80kVで動作)、パソコン、画像記録ソフトの電源を入れます。デジタルスロースキャン2 k x 2 k CCDカメラと関連するイメージングソフトウェアでデジタル画像を記録します。
- 顕微鏡ステージに複数の断面を持つグリッドを挿入します。
- 最初にグリッドを低倍率(例:x100)でスクリーニングして、断面の品質(すなわち、支持膜の穴、破片など)を決定し、最高品質の断面を選択する。低倍率で、筋線維の方向を決定する。
- 次に、断面内の周辺繊維を中心とするビームで倍率を上げます。30 k を超える倍率で画像に焦点を合わせ、リアルタイム高速フーリエ変換 (使用可能な場合) によって導かれる画像内の十分な細部を確保します。最後に、所望の倍率で1秒の露光時間で画像を記録する。
- ランダムに選択されたファイバーの合計24枚の画像、すなわち筋原線維空間の12枚の画像とサブサルコレンマル空間の12枚の画像を、10k〜40kの倍率で取得する。画像がファイバの長さと幅にわたってランダム化されながらも体系的な順序で分布し、偏りのない結果が得られるようにします(図1A)。
注:最適な倍率は、利用可能なカメラの解像度と顕微鏡写真のサイズによって異なります。目標は、グリコーゲン粒子径が1nmステップ以内に測定され得る最終分解能を達成し、少なくとも70μm2の筋原線維領域の総面積および少なくとも25μmの線維の全長を、筋原線維空間の12画像および線維当たりの12 画像に分布させることであり、 それぞれ。ファイバーあたり 24 枚の画像は、ヒト、ラット、マウスの骨格筋からの個々のファイバーにおけるグリコーゲンの異なるプールの体積含有量が 0.1 ~ 0.2 の精度 (誤差係数) を示す可能性が最も高いです20、21、24 (図 2E)。 - 手順 2.4 と 2.5 を繰り返して、合計 6 ~ 10 本のファイバーがイメージ化されます。必要に応じて、追加の切片を切断し(すでに画像化された繊維の重なりを避けるために少なくとも150μmずつ分離して)、手順1.9〜2.5を繰り返します。
3. 画像解析
- 画像をImageJにインポートするには、[ ファイル]をクリックして[開く]>します。
- 画像の元のサイズと一致するようにグローバルスケールを設定するには、[ 分析]>[スケールの設定]をクリックします。
- 画像をクリックして100%ズームイン >ズームイン>ます。
- [ツール]メニューの [直線 ]ツールを使用して、筋原線維空間の画像ごとに1枚のZディスク(ファイバあたり12枚)の厚さを測定します(図1D)。6~10本の繊維のそれぞれの平均Zディスク厚みを計算します。
- 最も太い平均 Z ディスクを持つ 2 ~ 3 本の繊維をタイプ 1 の繊維として定義し、最も細い平均 Z ディスクを持つ 2 ~ 3 本の繊維をタイプ 2 の繊維として定義します。中間の2~4本の繊維は、さらなる分析のために無視してください(図1E)。
注: サンプルの 4 ~ 6 本の繊維のそれぞれについて、次の手順を繰り返します。グリコーゲン体積分画は、他の箇所に記載されているように点数カウントによって推定される25、26。グリッドのサイズは、満足のいく高精度の推定値を得るために選択されます。これは多くの場合、250ヒットを達成することによって得られ、必要なポイントの総数と、ポイントあたりの面積が決まります。 - セグメント化線ツールを使用して、サブサルコレム領域のすぐ下に見える最も外側の筋原線維の長さを測定します(図2A)。
注:この長さは、表面積当たりのサブサルコレムグリコーゲンを発現するために使用される(すなわち、最も外側の筋原線維の長さに断面の厚さ(60nm)を掛けた;ステップ4.5を参照されたい)。したがって、この長さで表されるサブサルコレム領域のみが解析に含まれる。 - [> ツールの解析] をクリックしてグリッドを挿入し、[グリッド>し、ポイントあたりの面積を 32,400 nm2 に設定します。十字がサルコレンマル下グリコーゲンに当たる12のサブサルコレンマル画像で利用可能な長さ内のヒット数を数えます(図2A)。ヒットは、クロスの右上隅に存在するグリコーゲン粒子として定義されます。
- [> ツールの解析] をクリックしてグリッドを挿入し、[グリッド>し、ポイントあたりの面積を 160,000 nm2 に設定します。12個の筋原線維画像で、十字が筋原線維内空間に当たるヒット数を数えます(図2B)。
- [> ツールの分析] をクリックしてグリッドを挿入し、[グリッド>し、ポイントあたりの面積を 3,600 nm2 に設定します。12個の筋原線維画像におけるヒット数をカウントし、そこではクロスが筋原線維内グリコーゲンに当たる(図2C)。
- [> ツールの分析] をクリックしてグリッドを挿入し、[グリッド>し、ポイントあたりの面積を 32,400 nm2 に設定します。12個の筋原線維画像において、十字が筋原線維間グリコーゲンに当たるヒット数をカウントする(図2D)。
- [直線]ツールを使用して、12枚の画像のそれぞれについて、各プールのランダムに選択された5つのグリコーゲン粒子の直径を測定し、繊維あたりプールあたり平均60個の粒子を得た。
注: 平均 60 個のパーティクルは、ファイバ内の変動をほぼカバーしています(図 2F)。
4. 計算
- 筋原線維空間当たりの筋原線維内空間の見かけ面積分率(AA)を、全ヒットの総和を12枚の画像から全点の総和で割った値として算出する(ステップ3.8から)。
- 筋原線維領域当たりの筋原線維内グリコーゲンの見かけ面積分率、筋原線維領域当たりの筋原線維間グリコーゲン、および画像領域当たりのサブサルコレムグリコーゲンを、全ヒットの合計として、12枚の画像からの全ての点の合計で割ったものとして計算する(ステップ3.7、3.9、および3.10から)。
- 筋原線維内グリコーゲン、筋原線維間グリコーゲン、およびサルコレンマル下グリコーゲンの体積分率(VV)をそれぞれ計算し、見かけの面積分率(AA)から表面密度(SV)と断面厚さ(t)の積を引いた値として計算します。ここで、表面密度は粒子の数値密度に平均粒子表面を掛けたものです。
Vv = AA - (1 / 4) ·Sv ·t
どこ
Sv(μm-1)=AA/((π·(((1 / 2) ·H)2))·(t + H))
t = 0.06 μm
H = 粒子の平均直径(μm)
注:体積分率は、スライス25の外側に中心を持つ粒子からのキャップの寄与のために、見かけの面積分率よりも小さい。 - 筋原線維内空間当たりに筋原線維内グリコーゲンを発現させるには、筋原線維内グリコーゲンの面積画分を筋原線維内空間の面積画分で除算する(工程4.1)。筋原線維間グリコーゲンは、前の工程で計算された筋原線維空間当たりに発現される(ステップ4.3)。
- 繊維の表面積当たりのサブサルコレンマルグリコーゲン(VS)(最外層筋原線維)を発現させるためには、グリコーゲンの体積分率を画像の体積(面積と断面厚さの積)に乗じ、平均利用可能長さ(ステップ3.6から)の積を断面厚さ(t)で割ることによって絶対量に変換する。
- ステップ 4.1、4.4、および 4.5 の値を使用して、総体積グリコーゲン含有量を次のように推定します。
筋原線維グリコーゲン=筋原体内グリコーゲン+(筋原線維内グリコーゲン・筋原内空間の面積画分)
平均繊維半径を40μm27と仮定すると、体積対表面比は20:1であるため、全グリコーゲンは次のようになります。
全グリコーゲン(VV)=筋原線維グリコーゲン+(サブサルコレンマルグリコーゲン(VS)/20)
注: 体積対表面比 20:1 は、実際のファイバーサイズとサブサルコレム領域のサイズに応じて、ファイバーごとに異なる場合があります。これは、現在のプロトコルでは考慮されません。 - このことから、各プールからの相対寄与は、総グリコーゲンの画分として計算されます。
インターミオフィブリラーグリコーゲン/全グリコーゲン=インターミオフィブリルグリコーゲン/全グリコーゲン
筋原線維内グリコーゲン/全グリコーゲン=(筋原線維内グリコーゲン・筋原体内空間の面積画分)/全グリコーゲン
サブサルコレンマルグリコーゲン/全グリコーゲン=サブサルコレンマルグリコーゲン/20/全グリコーゲン - 各グリコーゲンプールについて、画像数(n)、各画像の総交配数(x)、および各画像内の関連プール内のグリコーゲンに当たる交配数(y)に基づいて、繊維レベルでのグリコーゲン推定値の不確実性を表す誤差係数(CE)を次のように計算します28。
CE = n-1 ·∑x2 ·(∑倍)-2 + ∑y2 ·(∑年)-2 - 2∑(xy) ·∑x-1 ·∑-1
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Representative Results
このプロトコルを使用すると、グリコーゲン粒子は黒くはっきりと見えます(図1および図2)。グリコーゲンの正常値を図3に示します。これらのデータは、異なる先行研究で収集された41人の健康な若い男性からの合計362本の繊維に基づいている19、24、29、30、31。ここで、筋原線維間グリコーゲン値は正常に近い分布を示すのに対し、筋原線維内グリコーゲンおよびサブサルコレンマルグリコーゲンの両方が歪んだ分布を示し、繊維は時々過剰な量のグリコーゲンを有することがわかる。通常サイズの筋線維(直径60〜80μm)では、筋原線維間グリコーゲンが全グリコーゲン含量の約80%を構成する最大のプールであることに注意することが重要です。筋原線維内およびサルコレンマル下グリコーゲンは、それぞれ総含有量の約10%を構成する。
図 1: イメージングとファイバー・タイピング。 (A) 各ファイバーは、ランダム化された体系的な順序でイメージ化されます。(B)サブサルコレンマル空間からの画像の例。(c)筋原線維空間からの画像の例。(d)各筋原線維画像において、1枚のZディスクの幅が測定される(赤線)。合計12枚のZディスク(画像ごとに1枚)の測定では、誤差係数は約0.03になります。(e)10回の生検の各々の6〜10本の繊維における平均繊維Zディスク幅の典型的な分布。各生検から、2〜3本の繊維が、生検内分布に基づいてタイプ1および2として定義される。この画像は、以前の研究で含まれていたパワーリフターの m. vastus lateralis の生検に由来する29。m:ミトコンドリアおよびZ:Zディスク。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:グリコーゲン分析(A)表面積当たりのサブサルコレンマルグリコーゲン体積は、最外層の筋原線維の長さおよびこの長さに垂直なサブサルコレンマル領域(青色の点線)によって定義される領域内の180nm x 180nmのグリッドサイズを使用してポイントカウントによって推定される。(b)筋原線維体積分率は、400nm×400nmのグリッドサイズを用いて点計数によって推定される。(c)筋原線維内グリコーゲンの体積分率は、60nm×60nmのグリッドサイズを用いた点計数によって推定される。(d)筋原線維間グリコーゲンの体積分率は、180nm×180nmのグリッドサイズを用いた点計数によって推定される。A-Dでは、赤い円はヒット(グリコーゲン粒子に当たる十字)を示します。(E) 2~12枚の解析画像に対する立体比推定値24の推定誤差係数。誤差係数はカウント数に基づいて推定されるため、グリコーゲン濃度に基づいてサンプル間で変化します。グリコーゲン含量が高い場合、それはしばしば比較的低く、その逆も同様である。(f)2~99個の粒子を測定した後のグリコーゲン粒子径の変動係数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:骨格筋におけるグリコーゲンの3つの細胞内プールの正常値。バイオリンプロットは、41人の健康な若い男性(18-39歳)からの362本の繊維に基づいています。この繊維は以前の研究に由来し、休息中または対照状態のm. vastus lateralisからの生検が得られた19、24、29、30、31。値は、中央値のマーカーと四分位範囲を示すボックスを含む箱ひげ図として表示されます。線は、上下の隣接する値を表します。ボックスはカーネル密度プロットによってオーバーレイされます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法の重要なステップは、固定後におけるフェロシアン化カリウムによる還元オスミウムの使用である。グリコーゲン検出のためのこの修飾固定液の選択性は、化学によって完全に説明することはできませんが、グリコーゲンを含まないことが知られている組織または細胞外空間においてそのような粒子が検出されないことを実証する実験的知見も含まれています11。
重要なパラメータは、推定値の精度とファイバ間の変動です。画像化のための本プロトコールに従うことによって、繊維当たりのグリコーゲンの異なるプールの推定値の0.1〜0.2の間の誤差係数が得られる。このレベルの誤差は、個々のファイバ間の変動をはるかに下回っています(図3)。グリコーゲンの体積含有量を推定する際には、このような精度の推定値を報告することが推奨される。提示されたファイバータイピング法を、ミオシンATPaseアイソフォーム29に対して検証する。Zディスクの厚さとミトコンドリア体積分率を組み合わせて繊維型を示すこともできますが、ミトコンドリア体積分率のみを示すことはできません32。
この方法の主な制限は、非常に小さなグリコーゲン粒子を検出できないこと、およびグリコーゲン粒子のプロファイルが投影画像内で重複し得ることである28。第1の制限は、平均粒径の真の尺度を無効にする。これは、グリコーゲン粒子が高い代謝要求の間に分解されるときには深刻なバイアスになるが、グリコーゲン再合成または超補償中にグリコーゲン粒子が中程度からより大きなサイズに成長すると、このバイアスは重要ではない可能性がある。これは、低グリコーゲンレベルでの平均グリコーゲン粒径の推定に大きな意味を持つかもしれないが、小さな観察されていないグリコーゲン粒子が総グリコーゲン含有量にほとんど寄与しないため、体積グリコーゲン濃度の推定値は堅牢である。第2の制限は、グリコーゲン粒子がセクションの厚さよりもはるかに小さい条件に由来する。このバイアスは、主に非常に高いグリコーゲン濃度で存在し、異なる厚さの切片のグリコーゲン体積分画を比較することによって調査することができた。より厚い断面が高グリコーゲン体積分率と平行にない場合、それは最も厚い断面においてより重なり合う粒子による過小評価によるものでなければならない。以前の研究では、グリコーゲン体積分画は、粒子の顕著な重複を示さないことを示す50〜600ミリモルkgdw−1 の範囲内のグリコーゲン濃度と相関する。しかし、グリコーゲン濃度がこのレベルを超えて増加した場合、重複を示す筋原線維間グリコーゲンの増加はない33。これは、グリコーゲン体積分率とより低いグリコーゲン濃度での濃度との関係を外挿することによって解決することができる。
TEMによって提供されるnm分解能に基づいて、このプロトコルは、現在のところ、グリコーゲンの細胞内分布を推定する唯一の方法である。さらに、この方法論は、定量的な値を単繊維レベルで得ることができる大規模な定量的アプローチ(ここで説明するように)も可能にする。これは、グリコーゲン依存性の疲労メカニズムが一部の繊維でのみ発生する様々なタイプの運動2中の繊維動員における不均一性が高い骨格筋において非常に重要です。この方法はまた、心筋細胞として他の興奮性組織の可能性を有し、グリコーゲンは正常な心機能に必須であり、虚血中に重要であることが知られている23,34。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
Acknowledgments
この作業はスウェーデンオリンピック委員会の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
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