Summary
Ett modifierat efterfixeringsförfarande ökar kontrasten mellan glykogenpartiklar i vävnad. Detta dokument ger ett steg-för-steg-protokoll som beskriver hur man hanterar vävnaden, utför avbildningen och använder stereoologiska metoder för att erhålla opartiska och kvantitativa data om fibertypspecifik subcellulär glykogenfördelning i skelettmuskeln.
Abstract
Med användning av transmissionselektronmikroskopi kan högupplösta bilder av fasta prover innehållande enskilda muskelfibrer erhållas. Detta möjliggör kvantifieringar av ultrastrukturella aspekter såsom volymfraktioner, förhållandet mellan yta och volym, morfometri och fysiska kontaktställen för olika subcellulära strukturer. På 1970-talet utvecklades ett protokoll för förbättrad färgning av glykogen i celler och banade väg för en rad studier om subcellulär lokalisering av glykogen och glykogenpartikelstorlek med hjälp av transmissionselektronmikroskopi. Medan de flesta analyser tolkar glykogen som om det är homogent fördelat i muskelfibrerna, vilket endast ger ett enda värde (t.ex. en genomsnittlig koncentration), har transmissionselektronmikroskopi avslöjat att glykogen lagras som diskreta glykogenpartiklar belägna i distinkta subcellulära fack. Här beskrivs steg-för-steg-protokollet från vävnadsinsamling till kvantitativ bestämning av volymfraktionen och partikeldiametern för glykogen i de distinkta subcellulära facken i enskilda skelettmuskelfibrer. Överväganden om hur man 1) samlar in och fläckar vävnadsprover, 2) utför bildanalyser och datahantering, 3) utvärderar precisionen i uppskattningar, 4) diskriminerar mellan muskelfibertyper och 5) metodologiska fallgropar och begränsningar ingår.
Introduction
Glykogenpartiklar består av grenade polymerer av glukos och olika associerade proteiner1 och utgör ett viktigt bränsle under höga metaboliska krav2. Även om det inte är allmänt erkänt, utgör glykogenpartiklar också ett lokalt bränsle, där vissa subcellulära processer företrädesvis utnyttjar glykogen trots tillgången på andra och mer långvariga bränslen som plasmaglukos och fettsyror3,4.
Vikten av att lagra glykogen som ett subcellulärt specifikt lokaliserat bränsle har diskuterats i flera översikter5,6 huvudsakligen baserat på några av de tidigaste dokumentationerna av den subcellulära fördelningen av glykogen genom transmissionselektronmikroskopi (TEM)7,8. De första studierna använde olika protokoll för att öka kontrasten mellan glykogen från histokemiska färgningstekniker till negativa och positiva färgningar9,10. En viktig metodologisk utveckling var det raffinerade postfixeringsprotokollet med kaliumferrocyanidreducerat osmium11,12,13,14, vilket signifikant förbättrade kontrasten mellan glykogenpartiklar. Detta förfinade protokoll användes inte i något av det banbrytande arbetet med träningsinducerad glykogenutarmning15 men återinfördes av Graham och kollegor16,17.
Baserat på de 2-dimensionella bilderna beskrivs den subcellulära fördelningen av glykogen oftast som glykogenpartiklar belägna i tre pooler: subsarkolemmal (strax under ytmembranet), intermyofibrillär (mellan myofibrillerna) eller intramyofibrillar (inom myofibrillerna). Glykogenpartiklar kan emellertid också beskrivas som associerade med exempelvis sarkoplasmatisk retikulum7 eller kärnor18. Förutom den subcellulära fördelningen är fördelen med TEM-uppskattat glykogeninnehåll också att kvantifiering kan utföras på enstaka fibernivå. Detta möjliggör undersökning av fiber-till-fiber-variabilitet och korrelativa analyser med fibertyper och cellulära komponenter som mitokondrier och lipiddroppar.
Här beskrivs protokollet för det TEM-uppskattade fibertypspecifika volymetriska innehållet i de tre gemensamma subcellulära poolerna av glykogen (subsarkolemmal, intermyofibrillär och intramyofibrillär) i skelettmuskelfibrer. Metoden har tillämpats på skelettmuskler från människor19, råttor20 och möss21; samt fåglar och fiskar22; och kardiomyocyter från råttor23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det nuvarande protokollet med användning av humana biopsierade skelettmuskelprover godkändes av de regionala kommittéerna för hälsoforskningsetik för södra Danmark (S-20170198). Muskelbiopsier erhölls genom ett snitt i huden från vastus lateralismuskeln med hjälp av en Bergströmnål med sug efter att lokalbedövning gavs subkutant (1-3 ml lidokain 2 % per snitt). Om isolerade hela råttmuskler användes offrades djuren genom cervikal dislokation innan muskelbiopsierna erhölls, i enlighet med riktlinjerna från den djuretiska kommittén vid Odense universitetssjukhus, Danmark.
1. Primär fixering, efterfixering, inbäddning, sektionering och kontrastering
- Förbered 1,6 ml primär fixativ lösning (2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (pH 7,3)) i ett 2 ml mikrocentrifugeringsrör. Förvara den vid 5 °C i högst 14 dagar.
- Från muskelbiopsi eller hel muskel, isolera ett litet prov, som har en maximal diameter på 1 mm i vilken riktning som helst och är lite längre i längdfiberriktningen än tvärsnitt (för orienteringsändamål).
- Placera provet i röret som innehåller den kalla primära fixeringslösningen. Förvara den vid 5 °C i 24 timmar.
- Tvätta provet fyra gånger (15 min mellan varje tvätt) i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (pH 7,3). Använd överföringspipetter, ta bort den använda bufferten från röret och lämna provet orört och tillsätt sedan den färska bufferten.
OBS: Efter den slutliga tvätten kan provexemplaret förvaras i 0,1 M natriumkakodylatbuffert vid 5 °C i flera månader11. Protokollet kan pausas här. - Postfix med 1 % osmiumtetroxid (OsO4) och 1,5 % kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (pH 7,3) i 120 min vid 4 °C.
OBS: Användningen av 1,5 % kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) är avgörande för en optimal kontrast av glykogenpartiklar11,12,13. - Skölj två gånger i dubbeldestillerat vatten vid rumstemperatur (RT).
- Dehydrera genom nedsänkning i en graderad serie alkohol (etanol) vid RT med följande koncentrationer: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) och 100% (10 min).
OBS: I varje steg är provexemplaret nedsänkt i etanol, som därefter endast delvis avlägsnas för att undvika torkning av provet. Slutligen kasseras den kvarvarande etanolen. - Infiltrera med graderade blandningar av propylenoxid och epossidiskt harts vid RT med användning av följande volymförhållanden (propylenoxid/epossidiskt harts): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (över natten). Följande dag, bädda in prover i 100% färskt epossidiskt harts i formar och polymerisera vid 60 ° C i 48 timmar.
OBS: Denna graderade metod är enligt de tidigare protokollen11,12. Protokollet kan pausas här. - Skär ultratunna (60-70 nm) sektioner av längsgående orienterade fibrer och samla dem på kopparnät med ett hål enligt följande.
- Montera blocket av ett prov på ultramikrotomhållaren.
- Trimma blocket på ytan med ett rakblad för att nå vävnadsnivån.
- Montera en diamantkniv (ultraskuren 45) framför provet och rikta in provytan parallellt med kniven.
- Producera en halvtunn (1 μm) sektion med diamantkniven för att kontrollera provets orientering. Fläcka den halvtunna sektionen med toluidinblå för observation med ljusmikroskopi.
- Trimma blocket ytterligare för att minska intresseområdet för att få ordentliga ultratunna sektioner.
- Skär ultratunna (60-70 nm) sektioner med en andra diamantkniv (ultraskuren 45).
- Samla 1-2 sektioner på kopparnät med ett hål med en Perfect Loop.
OBS: Ett hål kopparnät har ett enda hål i mitten med Formvar stödmembran.
- Kontrastsektioner med uranylacetat och blycitrat genom nedsänkning av ovanstående galler i uranylacetatlösning (0,5% i dubbeldestillerat vatten) i 20 minuter och sedan i blycitratlösning (1% i dubbeldestillerat vatten) i 15 min. Tvätta gallren i dubbeldestillerat vatten mellan och efter de två fläckarna.
OBS: Protokollet kan pausas här.
2. Avbildning
- Slå på transmissionselektronmikroskopet (drivs med en accelererande spänning på 80 kV), dator och bildinspelningsprogramvara. Spela in digitala bilder med en digital långsam skanning 2 k x 2 k CCD-kamera och tillhörande bildprogramvara.
- Sätt in rutnätet med flera sektioner i mikroskopsteget.
- Skärma gallret initialt med låg förstoring (t.ex. x100) för att bestämma kvaliteten på sektionerna (dvs. hål i stödmembranet, skräp etc.) och välj sektioner av bästa kvalitet. Vid låg förstoring bestämmer du muskelfibrernas riktning.
- Öka sedan förstoringen med strålen centrerad på en perifer fiber i sektionen. Fokusera bilden vid förstoring över 30 k för att säkerställa tillräckligt med fina detaljer i bilden, styrd av en snabb Fouriertransformation i realtid, om tillgänglig. Slutligen spela in bilder med 1 s exponeringstid vid önskad förstoring.
- Skaffa totalt 24 bilder av en slumpmässigt utvald fiber, dvs 12 bilder av det myofibrillära utrymmet och 12 bilder av det subsarkolemmala utrymmet, vid en förstoring mellan 10 k och 40 k. Se till att bilderna fördelas över fiberns längd och bredd i en randomiserad men systematisk ordning för att få opartiska resultat (Figur 1A).
OBS: Den optimala förstoringen beror på den tillgängliga kameraupplösningen och storleken på mikrograferna. Målet är att uppnå en slutlig upplösning, där glykogenpartikeldiametrar kan mätas inom 1 nm steg, och att inkludera en total yta av myofibrillära regionen på minst 70 μm2 och en total längd av fibern på minst 25 μm fördelad på 12 bilder av myofibrillärt utrymme och 12 bilder av det subsarkolemmala utrymmet per fiber, respektive. De 24 bilderna per fiber kommer sannolikt att ge en precision (felkoefficient) av det volymetriska innehållet i de olika poolerna av glykogen mellan 0,1 och 0,2 i enskilda fibrer från mänskliga, råtta och möss skelettmuskler20,21,24 (Figur 2E). - Upprepa steg 2.4 och 2.5 tills totalt 6-10 fibrer har avbildats. Skär vid behov ytterligare sektioner (åtskilda av minst 150 μm för att undvika överlappning av redan avbildade fibrer) och upprepa steg 1.9-2.5.
3. Bildanalyser
- Importera bilder till ImageJ genom att klicka på Arkiv > Öppna.
- Ange global skala så att den matchar bildens ursprungliga storlek genom att klicka på Analysera > Ange skala.
- Zooma in 100% genom att klicka på Bild > Zooma in > In.
- Mät tjockleken på en Z-skiva per bild av det myofibrillära utrymmet (12 per fiber) med hjälp av verktyget Straight Line från menyn Verktyg (Figur 1D). Beräkna den genomsnittliga Z-skivtjockleken för var och en av de 6-10 fibrerna.
- Definiera 2-3 fibrer med den tjockaste genomsnittliga Z-skivan som typ 1-fibrer och 2-3 fibrer med den tunnaste genomsnittliga Z-skivan som typ 2-fibrer. Bortse från de mellanliggande 2-4 fibrerna för ytterligare analyser (figur 1E).
OBS: Följande steg upprepas för var och en av de 4-6 fibrerna från provet. Glykogenvolymfraktionerna uppskattas genom punkträkning enligt beskrivningen någon annanstans25,26. Storleken på rutnäten väljs för att få en tillfredsställande hög precision i uppskattningarna. Detta erhålls ofta genom att uppnå 250 träffar, vilket sedan dikterar det totala antalet poäng som behövs och i sin tur området per punkt. - Använd verktyget Segmenterad linje för att mäta längden på den yttersta myofibril som syns strax under den subsarkolemmala regionen (figur 2A).
OBS: Denna längd används för att uttrycka subsarkolemmalt glykogen per yta (dvs. längden på den yttersta myofibrilen multiplicerad med sektionens tjocklek (60 nm); se steg 4.5). Därför ingår endast den subsarcolemmala regionen, som representeras av denna längd, i analysen. - Infoga ett rutnät genom att klicka på Analysera > verktyg > rutnät och ställ in Area Per Point på 32 400 nm2. Räkna antalet träffar inom den tillgängliga längden i de 12 subsarcolemmala bilderna, där ett kors träffar subsarcolemmal glykogen (figur 2A). En träff definieras som en glykogenpartikel som finns i det övre högra hörnet av ett kors.
- Infoga ett rutnät genom att klicka på Analysera > verktyg > rutnät och ställ in Area Per Point på 160 000 nm2. Räkna antalet träffar i de 12 myofibrillära bilderna, där ett kors träffar det intramyofibrillära utrymmet (figur 2B).
- Infoga ett rutnät genom att klicka på Analysera > verktyg > rutnät och ställ in Area Per Point på 3 600 nm2. Räkna antalet träffar i de 12 myofibrillära bilderna, där ett kors träffar intramyofibrillärt glykogen (figur 2C).
- Infoga ett rutnät genom att klicka på Analysera > verktyg > rutnät och ställ in Area Per Point på 32 400 nm2. Räkna antalet träffar i de 12 myofibrillära bilderna, där ett kors träffar den intermyofibrillära glykogenen (figur 2D).
- Med hjälp av Straight Line-verktyget mäter du diametern på fem slumpmässigt utvalda glykogenpartiklar i varje pool för var och en av de 12 bilderna för att erhålla i genomsnitt 60 partiklar per pool per fiber.
OBS: Genomsnittet av 60 partiklar täcker till stor del variationen i fibern (Figur 2F).
4. Beräkningar
- Beräkna den skenbara arealfraktionen (AA) för det intramyofibrillära utrymmet per myofibrillärt utrymme som summan av alla träffar dividerat med summan av alla punkter från de 12 bilderna (från steg 3.8).
- Beräkna den skenbara arealfraktionen av intramyofibrillärt glykogen per myofibrillärt område, intermyofibrillärt glykogen per myofibrillärt område och subsarkolemmalt glykogen per bildområde som summan av alla träffar dividerat med summan av alla punkter från de 12 bilderna (från steg 3.7, 3.9 och 3.10).
- Beräkna volymfraktionen (VV) av intramyofibrillär, intermyofibrillär respektive subsarkolemmal glykogen som den skenbara arealfraktionen (AA) minus produkten av ytdensitet (SV) med sektionstjocklek (t), där ytdensitet är den numeriska densiteten hos partiklar multiplicerad med den genomsnittliga partikelytan:
Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
var
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
t = 0,06 μm
H = partiklarnas medeldiameter (μm)
OBS: Volymfraktionen är mindre än den skenbara arealfraktionen på grund av bidraget från lock från partiklar med deras centrum utanför skivan25. - För att uttrycka intramyofibrillärt glykogen per intramyofibrillärt utrymme, dela arealfraktionen av intramyofibrillärt glykogen (steg 4.2) med arealfraktionen av det intramyofibrillära utrymmet (steg 4.1). Det intermyofibrillära glykogenet uttrycks per myofibrillärt utrymme beräknat i föregående steg (steg 4.3).
- För att uttrycka subsarkolemmalt glykogen per yta av fibern (VS) (yttersta myofibril), omvandla volymfraktionen av glykogen till en absolut mängd genom att multiplicera med bildens volym (produkt av areal och sektionstjocklek) och dividera med produkten med medelhalt tillgänglig längd (från steg 3.6) med sektionstjocklek (t).
- Uppskatta det totala volymetriska glykogeninnehållet med hjälp av värdena i steg 4.1, 4.4 och 4.5 enligt följande:
Myofibrillärt glykogen = Intermyofibrillärt glykogen + (intramyofibrillärt glykogen · områdesfraktion av intramyofibrillärt utrymme)
Genom att anta en genomsnittlig fiberradie på 40 μm27 är förhållandet mellan volym och yta 20:1, så totalt glykogen är:
Totalt glykogen (VV) = Myofibrillärt glykogen + (subsarkolemmal glykogen (VS) / 20)
OBS: Volym-ytförhållandet på 20: 1 kan variera från fiber till fiber beroende på den faktiska fiberstorleken och storleken på den subsarkolemmala regionen. Detta beaktas inte i detta protokoll. - Från detta beräknas det relativa bidraget från varje pool som fraktioner av totalt glykogen:
Intermyofibrillärt glykogen / Totalt glykogen = Intermyofibrillärt glykogen / Totalt glykogen
Intramyofibrillärt glykogen / Totalt glykogen = (Intramyofibrillärt glykogen · arealfraktion av intramyofibrillärt utrymme) / Totalt glykogen
Subsarcolemmal glykogen / Totalt glykogen = Subsarcolemmal glykogen / 20 / Totalt glykogen - För varje glykogenpool beräknar du felkoefficienten (CE), som uttrycker osäkerheten i glykogenuppskattningen på fibernivå, baserat på antalet bilder (n), det totala antalet kors i varje bild (x) och antalet kors som träffar glykogen i den relevanta poolen i varje bild (y) enligt följande28:
CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑ (xy) · ∑x-1 · ∑y-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll verkar glykogenpartiklar svarta och distinkta (figur 1 och figur 2). De normala värdena för glykogen visas i figur 3. Dessa data är baserade på totalt 362 fibrer från 41 friska unga män som samlats in i olika tidigare studier19,24,29,30,31. Här kan man se att intermyofibrillära glykogenvärden fördelas nära det normala, medan både intramyofibrillärt och subsarkolemmalt glykogen visar en skev fördelning, där fibrer ibland har en överdriven mängd glykogen. Det är viktigt att notera att i normalstor muskelfiber (diameter på 60-80 μm) är intermyofibrillärt glykogen den största poolen som utgör cirka 80% av det totala glykogeninnehållet. Intramyofibrillärt och subsarkolemmalt glykogen utgör vardera cirka 10% av det totala innehållet.
Figur 1: Avbildning och fibertypning. (A) Varje fiber avbildas i en randomiserad systematisk ordning. (B) Exempel på en bild från det subsarcolemmala utrymmet. (C) Exempel på en bild från det myofibrillära utrymmet. (D) I varje myofibrillär bild mäts bredden på en Z-skiva (röda linjer). Mätningarna av totalt 12 Z-skivor (en per bild) ger en felkoefficient på cirka 0,03. (E) Den typiska fördelningen av den genomsnittliga fiber Z-skivbredden i 6-10 fibrer av var och en av de 10 biopsierna. Från varje biopsi definieras 2-3 fibrer som typ 1 och 2 baserat på inom-biopsifördelningen. Bilderna härstammar från en biopsi av m. vastus lateralis av en styrkelyftare som ingick i en tidigare studie29. m: mitokondrier och Z: Z-skiva. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Glykogenanalyser. (A) Subsarkolemmal glykogenvolym per yta uppskattas genom punkträkning med hjälp av en rutnätsstorlek på 180 nm x 180 nm inom ett område som definieras av längden på den yttersta myofibrilen och den subsarkolemmala regionen vinkelrätt mot denna längd (blå prickade linjer). (B) Den myofibrillära volymfraktionen uppskattas genom punkträkning med användning av en rutnätsstorlek på 400 nm x 400 nm. (C) Volymfraktionen av intramyofibrillärt glykogen uppskattas genom punkträkning med användning av en rutnätsstorlek på 60 nm x 60 nm. (D) Volymfraktionen av intermyofibrillärt glykogen uppskattas genom punkträkning med användning av en rutnätsstorlek på 180 nm x 180 nm. I A-D indikerar de röda cirklarna träffar (ett kors som träffar en glykogenpartikel). (E) Den uppskattade felkoefficienten för en uppskattning av stereologiskt förhållande24 för 2 till 12 analyserade bilder. Felkoefficienten uppskattas baserat på antalet räkningar och varierar därför mellan proverna baserat på glykogenkoncentrationen. Det är ofta relativt lågt när glykogenhalten är hög och vice versa. (F) Variationskoefficienten för glykogenpartikeldiametern efter mätning av 2-99 partiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Normala värden för de tre subcellulära poolerna av glykogen i skelettmuskeln. Fiolplotterna är baserade på 362 fibrer från 41 friska unga män (18-39 år). Fibrerna härstammar från tidigare studier, där biopsier från m. vastus lateralis i vilo- eller kontrolltillstånd erhölls19,24,29,30,31. Värden visas som ett rutdiagram med en markör för medianen och en ruta som anger interkvartilintervallet. Linjerna representerar övre och nedre intilliggande värden. Lådorna är överlagrade av kärndensitetsplotter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det kritiska steget i metoden är användningen av reducerat osmium med kaliumferrocyanid under postfixering. Selektiviteten hos detta modifierade fixeringsmedel för glykogendetektion kan inte helt förklaras av kemi, utan innefattar även experimentella fynd som visar att sådana partiklar inte kan detektioneras i vävnader som är kända för att vara fria från glykogen eller i det extracellulära utrymmet11.
Kritiska parametrar är precisionen i uppskattningarna och fiber-till-fiber-variationen. Genom att följa det nuvarande protokollet för avbildning erhålls en felkoefficient mellan 0,1 och 0,2 av uppskattningarna av de olika poolerna av glykogen per fiber. Denna felnivå ligger långt under variationen mellan enskilda fibrer (figur 3). Det uppmuntras att rapportera sådana precisionsuppskattningar vid uppskattning av det volymetriska innehållet av glykogen. Den presenterade fibertypningsmetoden valideras mot myosin ATPasisoform29. Z-skivans tjocklek och mitokondriella volymfraktion kan också användas i kombination för att indikera fibertyp, men inte enbart mitokondriell volymfraktion32.
Metodens största begränsningar är oförmågan att detektera de mycket små glykogenpartiklarna och att profiler av glykogenpartiklar kan överlappa varandra i den projicerade bilden28. Den första begränsningen ogiltigförklarar ett verkligt mått på den genomsnittliga partikelstorleken. Detta blir en allvarlig bias när glykogenpartiklarna bryts ned under höga metaboliska krav, medan bias kan vara obetydlig när glykogenpartiklarna växer från medium till större storlek under glykogenresyntes eller superkompensation. Även om detta kan ha stora konsekvenser för uppskattningen av den genomsnittliga glykogenpartikelstorleken vid låga glykogennivåer, är uppskattningarna av volymetriska glykogenkoncentrationer robusta, eftersom små, oobserverade glykogenpartiklar bidrar mycket lite till det totala glykogeninnehållet. Den andra begränsningen härrör från tillståndet, där glykogenpartiklarna är mycket mindre än sektionernas tjocklek. Denna bias är mestadels närvarande vid mycket höga glykogenkoncentrationer och kan undersökas genom att jämföra glykogenvolymfraktionerna av sektioner med olika tjocklekar. Om en tjockare sektion inte är parallell med en hög glykogenvolymfraktion måste det bero på en underskattning på grund av mer överlappande partiklar i den tjockaste sektionen. I tidigare studier korrelerar glykogenvolymfraktionen med glykogenkoncentrationen inom intervallet från 50 till 600 mmol kg dw-1 vilket indikerar ingen uttalad överlappning av partiklar. Om glykogenkoncentrationen ökar över denna nivå finns det emellertid ingen ökning av intermyofibrillärt glykogen som indikerar överlappning33. Detta kan lösas genom att extrapolera förhållandet mellan glykogenvolymfraktionen och koncentrationen vid de lägre glykogenkoncentrationerna.
Baserat på nm-upplösningen från TEM är detta protokoll för närvarande den enda metoden för att uppskatta den subcellulära fördelningen av glykogen. Dessutom tillåter metoden också ett storskaligt kvantitativt tillvägagångssätt (som beskrivs här), där kvantitativa värden kan erhållas på enstaka fibernivå. Detta är av enorm betydelse i skelettmuskler med hög heterogenitet vid fiberrekrytering under olika typer av träning2, där glykogenberoende utmattningsmekanismer endast förekommer i vissa fibrer. Metoden har också potential för andra exciterade vävnader som kardiomyocyter, där glykogen är känt för att vara väsentligt för normal hjärtfunktion och kritiskt under ischemi23,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Sveriges Olympiska Kommitté.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
