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Biochemistry

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कंकाल मांसपेशी तंतुओं में उपकोशिकीय ग्लाइकोजन वितरण का परिमाणीकरण

Published: February 7, 2022 doi: 10.3791/63347
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2
1Research center for applied health science, University College South Denmark, 2Department of Sports Science and Clinical Biomechanics, University of Southern Denmark, 3Department of Biomedical Sciences, Core Facility for Integrated Microscopy, University of Copenhagen

Summary

एक संशोधित पोस्ट-फिक्सेशन प्रक्रिया ऊतक में ग्लाइकोजन कणों के विपरीत को बढ़ाती है। यह पेपर एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है जिसमें बताया गया है कि ऊतक को कैसे संभालना है, इमेजिंग का संचालन करना है, और कंकाल की मांसपेशियों में फाइबर प्रकार-विशिष्ट उपकोशिकीय ग्लाइकोजन वितरण पर निष्पक्ष और मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए स्टीरियोलॉजिकल विधियों का उपयोग करना है।

Abstract

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ, व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर युक्त निश्चित नमूनों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त किया जा सकता है। यह अल्ट्रास्ट्रक्चरल पहलुओं जैसे कि वॉल्यूम अंशों, सतह क्षेत्र से वॉल्यूम अनुपात, मॉर्फोमेट्री और विभिन्न उपकोशिकीय संरचनाओं के भौतिक संपर्क स्थलों के परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है। 1970 के दशक में, कोशिकाओं में ग्लाइकोजन के बढ़े हुए दाग के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ग्लाइकोजन और ग्लाइकोजन कण आकार के उपकोशिकीय स्थानीयकरण पर अध्ययन की एक स्ट्रिंग के लिए मार्ग प्रशस्त किया गया था। जबकि अधिकांश विश्लेषण ग्लाइकोजन की व्याख्या करते हैं जैसे कि यह मांसपेशियों के तंतुओं के भीतर सजातीय रूप से वितरित किया जाता है, केवल एक ही मूल्य (उदाहरण के लिए, एक औसत एकाग्रता) प्रदान करता है, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि ग्लाइकोजन को अलग-अलग उपकोशिकीय डिब्बों में स्थित असतत ग्लाइकोजन कणों के रूप में संग्रहीत किया जाता है। यहां, ऊतक संग्रह से चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल से व्यक्तिगत कंकाल मांसपेशी तंतुओं के अलग-अलग उपकोशिकीय डिब्बों में ग्लाइकोजन की मात्रा अंश और कण व्यास के मात्रात्मक निर्धारण का वर्णन किया गया है। 1) ऊतक नमूनों को इकट्ठा करने और दागने के तरीके पर विचार, 2) छवि विश्लेषण और डेटा हैंडलिंग करते हैं, 3) अनुमानों की सटीकता का मूल्यांकन करते हैं, 4) मांसपेशी फाइबर प्रकारों के बीच भेदभाव करते हैं, और 5) पद्धतिगत नुकसान और सीमाएं शामिल हैं।

Introduction

ग्लाइकोजन कण ग्लूकोज और विभिन्न संबद्ध प्रोटीन 1 के शाखित पॉलिमर से बने होते हैं और उच्च चयापचय मांगों के दौरान एक महत्वपूर्ण ईंधन का गठन करते हैं2। हालांकि व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त नहीं है, ग्लाइकोजन कण भी एक स्थानीय ईंधन का गठन करते हैं, जहां कुछ उपकोशिकीय प्रक्रियाएं प्लाज्मा ग्लूकोज और फैटी एसिड के रूप में अन्य और अधिक लंबे समय तक चलने वाले ईंधन की उपलब्धता के बावजूद ग्लाइकोजन का उपयोग करती हैं3,4।

एक उपकोशिकीय विशिष्ट स्थानीयकृत ईंधन के रूप में ग्लाइकोजन के भंडारण के महत्व पर कई समीक्षाओं में चर्चा की गई है5,6 मुख्य रूप से संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 7,8 द्वारा ग्लाइकोजन के उपकोशिकीय वितरण के कुछ शुरुआती दस्तावेजों पर आधारित है। पहले अध्ययनों ने ग्लाइकोजन के विपरीत को हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग तकनीकों से नकारात्मक और सकारात्मक धुंधला 9,10 तक बढ़ाने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग किया। एक महत्वपूर्ण methodological विकास पोटेशियम फेरोसायनाइड-कम osmium11,12,13,14 के साथ परिष्कृत पोस्ट-फिक्सेशन प्रोटोकॉल था, जिसने ग्लाइकोजन कणों के विपरीत में काफी सुधार किया। इस परिष्कृत प्रोटोकॉल का उपयोग व्यायाम-प्रेरित ग्लाइकोजन कमी 15 पर कुछ अग्रणी कार्यों में नहीं किया गया था, लेकिन ग्राहम और सहकर्मियों द्वारा फिर से पेश किया गया था16,17।

2-आयामी छवियों के आधार पर, ग्लाइकोजन के उपकोशिकीय वितरण को अक्सर तीन पूलों में स्थित ग्लाइकोजन कणों के रूप में वर्णित किया जाता है: सबसारकोलेमल (सतह की झिल्ली के ठीक नीचे), इंटरमायोफाइब्रिलर (मायोफाइब्रिल के बीच), या इंट्रामायोफाइब्रिलर (मायोफिब्रिल के भीतर)। हालांकि, ग्लाइकोजन कणों को भी संबद्ध के रूप में वर्णित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम 7 या न्यूक्ल्यूक्लियम 18। उपकोशिकीय वितरण के अलावा, टीईएम-अनुमानित ग्लाइकोजन सामग्री का लाभ यह भी है कि एकल फाइबर स्तर पर परिमाणीकरण आयोजित किया जा सकता है। यह फाइबर-टू-फाइबर परिवर्तनशीलता की जांच की अनुमति देता है और माइटोकॉन्ड्रिया और लिपिड बूंदों के रूप में फाइबर प्रकार और सेलुलर घटकों के साथ correlative विश्लेषण करता है।

यहां, कंकाल की मांसपेशी तंतुओं में ग्लाइकोजन के तीन सामान्य उपकोशिकीय पूलों (सबसारकोलेमल, इंटरमायोफिब्रिलर, और इंट्रामायोफाइब्रिलर) की टीईएम-अनुमानित फाइबर प्रकार-विशिष्ट वॉल्यूमेट्रिक सामग्री के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस विधि को मनुष्यों से कंकाल की मांसपेशियों पर लागू किया गया है19, चूहों 20, और mice21; साथ ही पक्षियों और मछलियों 22; और चूहों से कार्डियोमायोसाइट्स23.

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Protocol

मानव बायोप्सी कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों का उपयोग करके वर्तमान प्रोटोकॉल को दक्षिणी डेनमार्क के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान नैतिकता पर क्षेत्रीय समितियों (एस -20170198) द्वारा अनुमोदित किया गया था। मांसपेशियों की बायोप्सी को स्थानीय संज्ञाहरण के बाद सक्शन के साथ एक बर्गस्ट्रोम सुई का उपयोग करके वास्तु पार्श्वसपेशी से त्वचा में एक चीरा के माध्यम से प्राप्त किया गया था (लिडोकेन 2% प्रति चीरा के 1-3 मिलीलीटर)। यदि अलग-थलग पूरे चूहे की मांसपेशियों का उपयोग किया गया था, तो मांसपेशियों की बायोप्सी प्राप्त करने से पहले जानवरों को गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान कर दिया गया था, ओडेंस विश्वविद्यालय अस्पताल, डेनमार्क में पशु नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार।

1. प्राथमिक निर्धारण, पोस्ट-फिक्सेशन, एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, और विपरीत

  1. एक 2 mL माइक्रो centrifugation ट्यूब में प्राथमिक fixative समाधान (0.1 M सोडियम cacodylate बफर (pH 7.3)) में 2.5% glutaraldehyde) के 1.6 mL तैयार करें। इसे अधिकतम 14 दिनों के लिए 5 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. मांसपेशियों की बायोप्सी या पूरी मांसपेशी से, एक छोटे से नमूने को अलग करें, जिसमें किसी भी दिशा में 1 मिमी का अधिकतम व्यास होता है और क्रॉस-सेक्शनल (अभिविन्यास उद्देश्यों के लिए) की तुलना में अनुदैर्ध्य फाइबर दिशा में थोड़ा लंबा होता है।
  3. ठंडे प्राथमिक निर्धारण समाधान युक्त ट्यूब में नमूने को रखें। इसे 24 घंटे के लिए 5 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. नमूने को चार बार धोएं (प्रत्येक धोने के बीच 15 मिनट) 0.1 एम सोडियम कैशोडिलेट बफर (पीएच 7.3) में। स्थानांतरण पिपेट्स का उपयोग करके, नमूना अछूता छोड़कर ट्यूब से उपयोग किए गए बफर को हटा दें, और बाद में ताजा बफर जोड़ें।
    नोट: अंतिम धोने के बाद, नमूना 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर में कई महीनों के लिए 5 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है11. प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
  5. 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (OsO4) और 1.5% पोटेशियम फेरोसायनाइड (K4Fe (CN)6) के साथ पोस्टफिक्स 0.1 M सोडियम cacodylate बफर (pH 7.3) में 4 °C पर 120 मिनट के लिए।
    नोट: 1.5% पोटेशियम फेरोसायनाइड (K4Fe (CN)6) का उपयोग ग्लाइकोजन कणों के इष्टतम विपरीत के लिए आवश्यक है11,12,13.
  6. कमरे के तापमान (आरटी) पर डबल-आसुत पानी में दो बार कुल्ला करें।
  7. निम्नलिखित सांद्रता का उपयोग करके आरटी पर अल्कोहल (इथेनॉल) की एक श्रेणीबद्ध श्रृंखला में डूबकर निर्जलित करें: 70% (10 मिनट), 70% (10 मिनट), 95% (10 मिनट), 100% (10 मिनट), और 100% (10 मिनट)।
    नोट: प्रत्येक चरण में, नमूना इथेनॉल में डूब जाता है, जिसे बाद में नमूने को सुखाने से बचने के लिए केवल आंशिक रूप से हटा दिया जाता है। अंत में, बचे हुए इथेनॉल को छोड़ दिया जाता है।
  8. निम्नलिखित मात्रा अनुपात (प्रोपलीन ऑक्साइड / एपोसिडिक राल) का उपयोग करके आरटी पर प्रोपलीन ऑक्साइड और एपोसिडिक राल के वर्गीकृत मिश्रण के साथ घुसपैठ करें: 1/0 (10 मिनट), 1/0 (10 मिनट), 3/1 (45 मिनट), 1/1 (45 मिनट), 1/3 (45 मिनट), 0/1 (रातभर)। अगले दिन, मोल्ड्स में 100% ताजा एपोसिडिक राल में नमूनों को एम्बेड करें और 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पोलीमराइज़ करें।
    नोट:: यह वर्गीकृत विधि पिछले प्रोटोकॉल11,12 के अनुसार है। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
  9. अनुदैर्ध्य रूप से उन्मुख फाइबर के अल्ट्रा-पतले (60-70 एनएम) वर्गों को काटें और उन्हें एक-छेद तांबे के ग्रिड पर निम्नानुसार एकत्र करें।
    1. अल्ट्रामाइक्रोटोम धारक पर एक नमूने के ब्लॉक माउंट करें।
    2. ऊतक के स्तर तक पहुंचने के लिए एक रेजर ब्लेड के साथ सतह पर ब्लॉक को ट्रिम करें।
    3. नमूने के सामने एक हीरे के चाकू (अल्ट्राकट 45) माउंट करें और चाकू के समानांतर नमूना सतह को संरेखित करें।
    4. नमूने के अभिविन्यास की जांच करने के लिए हीरे के चाकू के साथ एक अर्ध-पतली (1 μm) अनुभाग का उत्पादन करें। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ अवलोकन के लिए टोल्यूइडिन नीले रंग के साथ अर्ध-पतली अनुभाग को दाग दें।
    5. उचित अल्ट्राथिन वर्गों को प्राप्त करने के लिए ब्याज के क्षेत्र को कम करने के लिए ब्लॉक को और ट्रिम करें।
    6. एक दूसरे हीरे के चाकू (अल्ट्राकट 45) के साथ अल्ट्राथिन (60-70 एनएम) वर्गों को काटें।
    7. एक सही लूप का उपयोग कर एक छेद तांबा ग्रिड पर 1-2 वर्गों ले लीजिए.
      नोट: एक छेद तांबा ग्रिड Formvar समर्थन झिल्ली के साथ बीच में एक ही छेद है.
  10. यूरेनिल एसीटेट और सीसा साइट्रेट के साथ इसके विपरीत अनुभागों को 20 मिनट के लिए यूरेनिल एसीटेट समाधान (डबल-आसुत पानी में 0.5%) में उपरोक्त ग्रिड को डुबोकर, और फिर 15 मिनट के लिए लीड साइट्रेट समाधान (डबल-आसुत पानी में 1%) में। दो दागों के बीच और बाद में डबल-आसुत पानी में ग्रिड को धोएं।
    नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।

2. इमेजिंग

  1. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (80 केवी के त्वरित वोल्टेज पर संचालित), कंप्यूटर और छवि रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर को चालू करें। एक डिजिटल धीमी गति से स्कैन 2 k x 2 k सीसीडी कैमरा और संबंधित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ डिजिटल छवियों को रिकॉर्ड करें।
  2. माइक्रोस्कोप चरण में कई वर्गों के साथ ग्रिड डालें।
  3. ग्रिड को शुरू में कम आवर्धन (जैसे, x100) पर स्क्रीन करें ताकि वर्गों की गुणवत्ता (यानी, सहायक झिल्ली, मलबे, आदि में छेद) निर्धारित की जा सके और सर्वोत्तम गुणवत्ता वर्गों का चयन किया जा सके। कम आवर्धन पर, मांसपेशियों के तंतुओं की दिशा निर्धारित करें।
  4. अगला, अनुभाग में एक परिधीय फाइबर पर केंद्रित बीम के साथ आवर्धन बढ़ाएं। छवि में पर्याप्त ठीक विवरण सुनिश्चित करने के लिए 30 k से ऊपर आवर्धन पर छवि पर ध्यान केंद्रित करें, यदि उपलब्ध हो तो रियल-टाइम फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्मेशन द्वारा निर्देशित। अंत में, वांछित आवर्धन पर 1 s एक्सपोज़र समय के साथ रिकॉर्ड छवियों।
  5. एक बेतरतीब ढंग से चयनित फाइबर की कुल 24 छवियों को प्राप्त करें, यानी, मायोफिब्रिलर स्पेस की 12 छवियां और सबसारकोलेमल स्पेस की 12 छवियां, 10 k और 40 k के बीच आवर्धन पर। सुनिश्चित करें कि छवियों को निष्पक्ष परिणाम प्राप्त करने के लिए एक यादृच्छिक लेकिन व्यवस्थित क्रम में फाइबर की लंबाई और चौड़ाई में वितरित किया जाता है (चित्रा 1 ए)।
    नोट:: इष्टतम आवर्धन उपलब्ध कैमरा रिज़ॉल्यूशन और माइक्रोग्राफ के आकार पर निर्भर करता है। लक्ष्य एक अंतिम संकल्प प्राप्त करना है, जहां ग्लाइकोजन कण व्यास को 1 एनएम चरणों के भीतर मापा जा सकता है, और कम से कम 70 μm2 के मायोफिब्रिलर क्षेत्र के कुल क्षेत्र को शामिल करने के लिए और कम से कम 25 μm के फाइबर की कुल लंबाई मायोफिब्रिलर स्पेस की 12 छवियों और प्रति फाइबर सबसारकोलेमल स्पेस की 12 छवियों में वितरित की जा सकती है, क्रमशः। प्रति फाइबर 24 छवियां सबसे अधिक संभावना मानव, चूहे और चूहों कंकाल की मांसपेशियों से व्यक्तिगत फाइबर में 0.1 और 0.2 के बीच ग्लाइकोजन के विभिन्न पूलों की वॉल्यूमेट्रिक सामग्री की एक परिशुद्धता (त्रुटि का गुणांक) देंगी20,21,24 (चित्रा 2ई)।
  6. चरण 2.4 और 2.5 को तब तक दोहराएं जब तक कि कुल 6-10 फाइबर की छवि न हो जाए। यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त वर्गों में कटौती करें (पहले से ही इमेज्ड फाइबर के ओवरलैप से बचने के लिए कम से कम 150 μm द्वारा अलग किया गया) और चरण 1.9-2.5 को दोहराएं।

3. छवि विश्लेषण

  1. फ़ाइल > खोलें पर क्लिक करके ImageJ करने के लिए छवियों को आयात करें।
  2. स्केल सेट करें > विश्लेषण पर क्लिक करके छवि के मूल आकार से मेल खाने के लिए वैश्विक स्केल सेट करें.
  3. छवि > ज़ूम > इन पर क्लिक करके 100% ज़ूम इन करें।
  4. उपकरण मेनू (चित्रा 1 डी) से सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करके मायोफिब्रिलर स्पेस (12 प्रति फाइबर) की छवि प्रति एक जेड-डिस्क की मोटाई को मापें। 6-10 तंतुओं में से प्रत्येक की औसत Z-डिस्क मोटाई की गणना करें।
  5. सबसे मोटे औसत जेड-डिस्क के साथ 2-3 फाइबर को टाइप 1 फाइबर और टाइप 2 फाइबर के रूप में सबसे पतले औसत जेड-डिस्क के साथ 2-3 फाइबर के रूप में परिभाषित करें। आगे के विश्लेषण के लिए मध्यवर्ती 2-4 फाइबर की उपेक्षा करें (चित्रा 1 ई)।
    नोट:: निम्न चरणों नमूने से 4-6 तंतुओं में से प्रत्येक के लिए दोहराया जाता है। ग्लाइकोजन आयतन अंशों का अनुमान बिंदु गणना द्वारा लगाया जाता है जैसा कि कहीं और वर्णित है25,26। ग्रिड के आकार को अनुमानों की संतोषजनक उच्च परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए चुना जाता है। यह अक्सर 250 हिट प्राप्त करके प्राप्त किया जाता है, जो तब आवश्यक बिंदुओं की कुल संख्या को निर्धारित करता है और बदले में, प्रति बिंदु क्षेत्र।
  6. सबसारकोलेमल क्षेत्र (चित्रा 2A) के ठीक नीचे दिखाई देने वाले सबसे बाहरी मायोफिब्रिल की लंबाई को मापने के लिए खंडित रेखा उपकरण का उपयोग करें।
    नोट: इस लंबाई का उपयोग प्रति सतह क्षेत्र के उप-सारकोलेमल ग्लाइकोजन को व्यक्त करने के लिए किया जाता है (यानी, अनुभाग (60 एनएम) की मोटाई से गुणा किए गए सबसे बाहरी मायोफिब्रिल की लंबाई; चरण 4.5 देखें)। इसलिए, केवल subsarcolemmal क्षेत्र, जो इस लंबाई द्वारा दर्शाया जाता है, विश्लेषण में शामिल है।
  7. ग्रिड > उपकरण का विश्लेषण > करें पर क्लिक करके एक ग्रिड सम्मिलित करें और 32,400 nm2 पर प्रति बिंदु क्षेत्र सेट करें। 12 subsarcolemmal छवियों में उपलब्ध लंबाई के भीतर हिट की संख्या की गणना करें, जहां एक क्रॉस सबसारकोलेमल ग्लाइकोजन (चित्रा 2 ए) को हिट करता है। एक हिट को एक क्रॉस के ऊपरी-दाएं कोने में मौजूद ग्लाइकोजन कण के रूप में परिभाषित किया गया है।
  8. ग्रिड > > उपकरण का विश्लेषण करें पर क्लिक करके एक ग्रिड सम्मिलित करें और 160,000 nm2 पर प्रति बिंदु क्षेत्र सेट करें। 12 मायोफिब्रिलर छवियों में हिट की संख्या की गणना करें, जहां एक क्रॉस इंट्रामायोफाइब्रिलर स्पेस (चित्रा 2 बी) को हिट करता है।
  9. ग्रिड > > उपकरण का विश्लेषण करें पर क्लिक करके एक ग्रिड सम्मिलित करें और 3,600 nm2 पर प्रति बिंदु क्षेत्र सेट करें। 12 मायोफिब्रिलर छवियों में हिट की संख्या की गणना करें, जहां एक क्रॉस इंट्रामायोफाइब्रिलर ग्लाइकोजन (चित्रा 2 सी) को मारता है।
  10. ग्रिड > > उपकरण का विश्लेषण करें पर क्लिक करके एक ग्रिड सम्मिलित करें और 32,400 nm2 पर प्रति बिंदु क्षेत्र सेट करें। 12 मायोफिब्रिलर छवियों में हिट की संख्या की गणना करें, जहां एक क्रॉस इंटरमायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन (चित्रा 2 डी) को हिट करता है।
  11. स्ट्रेट लाइन टूल का उपयोग करके, प्रति फाइबर प्रति पूल 60 कणों का औसत प्राप्त करने के लिए 12 छवियों में से प्रत्येक के लिए प्रत्येक पूल के पांच बेतरतीब ढंग से चुने गए ग्लाइकोजन कणों के व्यास को मापें।
    नोट: 60 कणों का औसत काफी हद तक फाइबर (चित्रा 2 एफ) के भीतर भिन्नता को कवर करता है।

4. गणना

  1. 12 छवियों (चरण 3.8 से) से सभी बिंदुओं के योग से विभाजित सभी हिट के योग के रूप में प्रति मायोफिब्रिलर स्पेस के इंट्रामायोफिब्रिलर स्पेस के स्पष्ट क्षेत्र अंश (एए) की गणना करें।
  2. इंट्रामायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन प्रति मायोफाइब्रिलर क्षेत्र के स्पष्ट क्षेत्र अंश की गणना करें, मायोफाइब्रिलर क्षेत्र में इंटरमायोफाइब्रिलर ग्लाइकोजन प्रति मायोफाइब्रिलर ग्लाइकोजन, और प्रति छवि क्षेत्र के सबसारकोलेमल ग्लाइकोजन 12 छवियों (चरण 3.7, 3.9, और 3.10 से) से सभी बिंदुओं के योग से विभाजित सभी हिट के योग के रूप में।
  3. क्रमशः इंट्रामायोफाइब्रिलर, इंटरमायोफाइब्रिलर और सबसारकोलेमल ग्लाइकोजन के आयतन अंश (वीवी) की गणना करें, क्योंकि स्पष्ट क्षेत्र अंश (एए) खंड मोटाई (टी) के साथ सतह घनत्व (एसवी) के उत्पाद को घटाता है, जहां सतह घनत्व माध्य कण सतह से गुणा किए गए कणों का संख्यात्मक घनत्व है:
    Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
    कहां
    Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
    t = 0.06 μm
    H = कणों का माध्य व्यास (μm)
    नोट: मात्रा अंश स्लाइस 25 के बाहर उनके केंद्र के साथ कणों से कैप्स के योगदान के कारण स्पष्ट क्षेत्र अंश से छोटा है।
  4. इंट्रामायोफाइब्रिलर ग्लाइकोजन प्रति इंट्रामायोफाइब्रिलर स्पेस को व्यक्त करने के लिए, इंट्रामायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन (चरण 4.2) के क्षेत्र अंश को इंट्रामायोफिब्रिलर स्पेस (चरण 4.1) के क्षेत्र अंश से विभाजित करें। इंटरमायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन को पिछले चरण (चरण 4.3) में गणना के रूप में प्रति मायोफाइब्रिलर स्पेस में व्यक्त किया जाता है।
  5. फाइबर (VS) (सबसे बाहरी मायोफिब्रिल) के प्रति सतह क्षेत्र के subsarcolemmal ग्लाइकोजन को व्यक्त करने के लिए, ग्लाइकोजन के आयतन अंश को छवि (क्षेत्र और अनुभाग मोटाई के उत्पाद) की मात्रा के साथ गुणा करके और अनुभाग मोटाई (टी) के साथ माध्य उपलब्ध लंबाई (चरण 3.6 से) के उत्पाद से विभाजित करके एक पूर्ण राशि में परिवर्तित करें।
  6. चरण 4.1, 4.4, और 4.5 से मानों का उपयोग करके कुल वॉल्यूमेट्रिक ग्लाइकोजन सामग्री का अनुमान लगाएं, निम्नानुसार:
    मायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन = इंटरमायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन + (इंट्रामायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन · इंट्रामायोफिब्रिलर स्पेस का क्षेत्र अंश)
    40 μm27 की औसत फाइबर त्रिज्या को मानते हुए, सतह का आयतन अनुपात 20: 1 है, इसलिए कुल ग्लाइकोजन क्या है?
    कुल ग्लाइकोजन (वीवी) = मायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन + (सबसारकोलेमल ग्लाइकोजन (वी एस) / 20)
    नोट: 20: 1 की सतह अनुपात के लिए मात्रा वास्तविक फाइबर आकार और subsarcolemmal क्षेत्र के आकार के आधार पर फाइबर से फाइबर के लिए भिन्न हो सकते हैं। इसे वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ ध्यान में नहीं रखा गया है।
  7. इससे, प्रत्येक पूल से सापेक्ष योगदान की गणना कुल ग्लाइकोजन के अंशों के रूप में की जाती है:
    Intermyofibrillar ग्लाइकोजन / कुल ग्लाइकोजन = Intermyofibrillar ग्लाइकोजन / कुल ग्लाइकोजन
    Intramyofibrillar ग्लाइकोजन / कुल ग्लाइकोजन = (Intramyofibrillar ग्लाइकोजन · intramyofibrillar अंतरिक्ष का क्षेत्र अंश) / कुल ग्लाइकोजन
    Subsarcolemmal ग्लाइकोजन / कुल ग्लाइकोजन = Subsarcolemmal ग्लाइकोजन / 20 / कुल ग्लाइकोजन
  8. प्रत्येक ग्लाइकोजन पूल के लिए, त्रुटि के गुणांक (सीई) की गणना करें, जो एक फाइबर स्तर पर ग्लाइकोजन अनुमान की अनिश्चितता को व्यक्त करता है, छवियों की संख्या (एन), प्रत्येक छवि (एक्स) में क्रॉस की कुल संख्या, और प्रत्येक छवि (वाई) में प्रासंगिक पूल में ग्लाइकोजन को मारने वाले क्रॉस की संख्या निम्नानुसार 28:
    CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑ (xy) · ∑x-1 · ∑y-1

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, ग्लाइकोजन कण काले और अलग दिखाई देते हैं (आंकड़े 1 और चित्र2)। ग्लाइकोजन के सामान्य मूल्यों को चित्र 3 में दर्शाया गया है। ये डेटा 41 स्वस्थ युवा पुरुषों के कुल 362 फाइबर पर आधारित हैं, जैसा कि विभिन्न पिछले अध्ययनों में एकत्र किया गया है19,24,29,30,31। यहां, यह देखा जा सकता है कि इंटरमायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन मूल्यों को सामान्य के करीब वितरित किया जाता है, जबकि इंट्रामायोफिब्रिलर और सबसारकोलेमल ग्लाइकोजन दोनों एक विषम वितरण दिखाते हैं, जहां फाइबर में कभी-कभी ग्लाइकोजन की अत्यधिक मात्रा होती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सामान्य आकार के मांसपेशी फाइबर (60-80 μm का व्यास) में, इंटरमायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन सबसे बड़ा पूल है जो कुल ग्लाइकोजन सामग्री का लगभग 80% है। Intramyofibrillar और subsarcolemmal ग्लाइकोजन प्रत्येक कुल सामग्री का लगभग 10% का गठन करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: इमेजिंग और फाइबर टाइपिंग। (A) प्रत्येक फाइबर को एक यादृच्छिक व्यवस्थित क्रम में चित्रित किया जाता है। (बी) सबसारकोलेमल अंतरिक्ष से एक छवि का उदाहरण। (C) मायोफिब्रिलर अंतरिक्ष से एक छवि का उदाहरण। (डी) प्रत्येक मायोफिब्रिलर छवि में, एक जेड-डिस्क की चौड़ाई को मापा जाता है (लाल रेखाएं)। कुल 12 Z-डिस्क (प्रति छवि एक) के माप लगभग 0.03 की त्रुटि का गुणांक देते हैं। (ई) 10 बायोप्सी में से प्रत्येक के 6-10 फाइबर में औसत फाइबर जेड-डिस्क चौड़ाई का विशिष्ट वितरण। प्रत्येक बायोप्सी से, 2-3 फाइबर को बायोप्सी वितरण के आधार पर प्रकार 1 और 2 के रूप में परिभाषित किया जाता है। छवियों की उत्पत्ति पिछले अध्ययन 29 में शामिल एक पावरलिफ्टर के एम. वास्तुस लेटरलिस की बायोप्सी से होती है। m: माइटोकॉन्ड्रिया और Z: Z-डिस्क। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ग्लाइकोजन विश्लेषण करता है। (A) प्रति सतह क्षेत्र में सबसारकोलेमल ग्लाइकोजन आयतन का अनुमान 180 nm x 180 nm के ग्रिड आकार का उपयोग करके बिंदु गणना द्वारा किया जाता है, जो सबसे बाहरी मायोफिब्रिल की लंबाई और इस लंबाई (नीली बिंदीदार रेखाओं) के लंबवत सबसारकोलेमल क्षेत्र द्वारा परिभाषित क्षेत्र के भीतर होता है। (बी) मायोफिब्रिलर आयतन अंश का अनुमान 400 एनएम x 400 एनएम के ग्रिड आकार का उपयोग करके बिंदु गणना द्वारा लगाया जाता है। (ग) इंट्रामायोफिब्रिलर ग्लाइकोजन के आयतन अंश का अनुमान 60 एनएम x 60 एनएम के ग्रिड आकार का उपयोग करके बिंदु गणना द्वारा लगाया जाता है। (घ) इंटरमायोफाइब्रिलर ग्लाइकोजन के आयतन अंश का अनुमान 180 एनएम x 180 एनएम के ग्रिड आकार का उपयोग करके बिंदु गणना द्वारा लगाया जाता है। ए-डी में, लाल सर्कल हिट (एक क्रॉस जो ग्लाइकोजन कण को मारता है) का संकेत देता है। (ई) एक स्टेरियोलॉजिकल अनुपात अनुमान 24 के लिए त्रुटि का अनुमानित गुणांक 2 से 12 विश्लेषण छवियों के लिए। त्रुटि के गुणांक का अनुमान गणना की संख्या के आधार पर लगाया जाता है और इसलिए ग्लाइकोजन एकाग्रता के आधार पर नमूनों के बीच भिन्न होता है। यह अक्सर अपेक्षाकृत कम होता है जब ग्लाइकोजन सामग्री उच्च होती है और इसके विपरीत होती है। (च) 2-99 कणों को मापने के बाद ग्लाइकोजन कण व्यास की भिन्नता का गुणांक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कंकाल की मांसपेशी में ग्लाइकोजन के तीन उपकोशिकीय पूल के सामान्य मूल्य। वायलिन भूखंड 41 स्वस्थ युवा पुरुषों (18-39 वर्ष की आयु) से 362 तंतुओं पर आधारित हैं। फाइबर पिछले अध्ययनों से उत्पन्न होते हैं, जिसमें आराम या नियंत्रण की स्थिति में एम. वास्तुस लेटरलिस से बायोप्सी प्राप्त की गई थी19,24,29,30,31। मानों को माध्यिका के लिए एक मार्कर के साथ एक बॉक्स प्लॉट के रूप में दिखाया गया है और एक बॉक्स इंटरक्वार्टल रेंज को इंगित करता है। रेखाएँ ऊपरी और निचले आसन्न मानों का प्रतिनिधित्व करती हैं। बक्से कर्नेल घनत्व भूखंडों द्वारा overlaid कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

विधि का महत्वपूर्ण कदम पोस्ट-फिक्सेशन के दौरान पोटेशियम फेरोसायनाइड द्वारा कम ऑस्मियम का उपयोग है। ग्लाइकोजन का पता लगाने के लिए इस संशोधित फिक्सेटिव की चयनात्मकता को रसायन विज्ञान द्वारा पूरी तरह से समझाया नहीं जा सकता है, लेकिन इसमें प्रयोगात्मक निष्कर्ष भी शामिल हैं जो ग्लाइकोजन से मुक्त या बाह्य कोशिकीय अंतरिक्ष 11 में ज्ञात ऊतकों में ऐसे कणों का कोई पता नहीं लगाते हैं।

महत्वपूर्ण पैरामीटर अनुमानों की सटीकता और फाइबर-टू-फाइबर भिन्नता हैं। इमेजिंग के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल का पालन करके, प्रति फाइबर ग्लाइकोजन के विभिन्न पूलों के अनुमानों के 0.1 और 0.2 के बीच त्रुटि का गुणांक प्राप्त किया जाता है। त्रुटि का यह स्तर अलग-अलग फाइबर (चित्रा 3) के बीच भिन्नता से नीचे है। ग्लाइकोजन की वॉल्यूमेट्रिक सामग्री का अनुमान लगाते समय इस तरह के सटीक अनुमानों की रिपोर्ट करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। प्रस्तुत फाइबर टाइपिंग विधि मायोसिन ATPase isoform29 के खिलाफ मान्य है। जेड-डिस्क मोटाई और माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम अंश का उपयोग फाइबर प्रकार को इंगित करने के लिए संयोजन में भी किया जा सकता है, लेकिन अकेले माइटोकॉन्ड्रियल वॉल्यूम अंश नहीं।

विधि की प्रमुख सीमाएं बहुत छोटे ग्लाइकोजन कणों का पता लगाने में असमर्थता हैं और ग्लाइकोजन कणों के प्रोफाइल अनुमानित छवि 28 में ओवरलैप हो सकते हैं। पहली सीमा औसत कण आकार के एक सच्चे माप को अमान्य करती है। यह एक गंभीर पूर्वाग्रह बन जाता है जब ग्लाइकोजन कणों को उच्च चयापचय मांगों के दौरान अपमानित किया जा रहा होता है, जबकि पूर्वाग्रह महत्वहीन हो सकता है जब ग्लाइकोजन कण ग्लाइकोजन पुनर्संश्लेषण या सुपर-मुआवजे के दौरान मध्यम से बड़े आकार में बढ़ते हैं। हालांकि यह कम ग्लाइकोजन स्तरों पर औसत ग्लाइकोजन कण आकार के अनुमान के लिए भारी निहितार्थ हो सकता है, वॉल्यूमेट्रिक ग्लाइकोजन सांद्रता के अनुमान मजबूत हैं, क्योंकि छोटे, अनदेखे ग्लाइकोजन कण कुल ग्लाइकोजन सामग्री की ओर बहुत कम योगदान करते हैं। दूसरी सीमा उस स्थिति से उत्पन्न होती है, जहां ग्लाइकोजन कण वर्गों की मोटाई की तुलना में बहुत छोटे होते हैं। यह पूर्वाग्रह ज्यादातर बहुत उच्च ग्लाइकोजन सांद्रता में मौजूद है और विभिन्न मोटाई के साथ वर्गों के ग्लाइकोजन वॉल्यूम अंशों की तुलना करके जांच की जा सकती है। यदि एक मोटा खंड एक उच्च ग्लाइकोजन वॉल्यूम अंश द्वारा समानांतर नहीं है, तो यह सबसे मोटे खंड में अधिक अतिव्यापी कणों के कारण कम करके आंकने के कारण होना चाहिए। पिछले अध्ययनों में, ग्लाइकोजन वॉल्यूम अंश 50 से 600 mmol kg dw-1 तक की सीमा के भीतर ग्लाइकोजन एकाग्रता के साथ सहसंबंधित है जो कणों के स्पष्ट ओवरलैपिंग का संकेत नहीं देता है। हालांकि, यदि ग्लाइकोजन एकाग्रता इस स्तर से ऊपर बढ़ जाती है, तो इंटरमायोफाइब्रिलर ग्लाइकोजन में कोई वृद्धि नहीं होती है जो ओवरलैप 33 का संकेत देती है। यह ग्लाइकोजन मात्रा अंश और कम ग्लाइकोजन सांद्रता पर एकाग्रता के बीच संबंध extrapolating द्वारा हल किया जा सकता है।

टीईएम द्वारा प्रदान किए गए एनएम रिज़ॉल्यूशन के आधार पर, यह प्रोटोकॉल वर्तमान में ग्लाइकोजन के उपकोशिकीय वितरण का अनुमान लगाने का एकमात्र तरीका है। इसके अलावा, पद्धति भी एक बड़े पैमाने पर मात्रात्मक दृष्टिकोण (जैसा कि यहां वर्णित है) की अनुमति देती है, जहां मात्रात्मक मूल्यों को एकल फाइबर स्तर पर प्राप्त किया जा सकता है। यह विभिन्न प्रकार के व्यायाम 2 के दौरान फाइबर भर्ती में उच्च विषमता के साथ कंकाल की मांसपेशियों में अत्यधिक महत्व का है, जहां ग्लाइकोजन-निर्भर थकान तंत्र केवल कुछ फाइबर में होते हैं। विधि में कार्डियोमायोसाइट्स के रूप में अन्य उत्तेजक ऊतकों के लिए भी क्षमता है, जहां ग्लाइकोजन को सामान्य हृदय समारोह के लिए आवश्यक और ischemia23,34 के दौरान महत्वपूर्ण माना जाता है।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को स्वीडिश ओलंपिक समिति द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Propylene oxide Merck 75-56-9
Embedding 812 resin medium kit Taab T031
Glutaraldehyde solution 25% Merck 1.04239.0250
ITEM Olympus Imaging software
Leica EM AC20 Leica Automatic contrasting system
OSIS Veleta digital camera Olympus
Osmium tetroxide 4% solution Polysciences 0972A
Philips CM 100 Transmission EM Philips
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate Sigma-Aldrich 455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 Ampliqon.com AMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7 Leica
Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution Leica 16707235
Uranyl acetate dihydrate Polysciences 6159-44-0

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References

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जैव रसायन अंक 180
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Jensen, R., Ørtenblad, N., di Benedetto, C., Qvortrup, K., Nielsen, J. Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63347, doi:10.3791/63347 (2022).

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