Summary
Ein modifiziertes Postfixationsverfahren erhöht den Kontrast von Glykogenpartikeln im Gewebe. Dieses Papier bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das beschreibt, wie man mit dem Gewebe umgeht, die Bildgebung durchführt und sterelorische Methoden verwendet, um unvoreingenommene und quantitative Daten über die fasertypspezifische subzelluläre Glykogenverteilung in der Skelettmuskulatur zu erhalten.
Abstract
Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie können hochauflösende Bilder von fixierten Proben mit einzelnen Muskelfasern gewonnen werden. Dies ermöglicht die Quantifizierung ultrastruktureller Aspekte wie Volumenanteile, Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnisse, Morphometrie und physikalische Kontaktstellen verschiedener subzellulärer Strukturen. In den 1970er Jahren wurde ein Protokoll zur verstärkten Färbung von Glykogen in Zellen entwickelt, das den Weg für eine Reihe von Studien zur subzellulären Lokalisation von Glykogen und Glykogenpartikelgröße mittels Transmissionselektronenmikroskopie ebnete. Während die meisten Analysen Glykogen so interpretieren, als ob es homogen in den Muskelfasern verteilt wäre und nur einen einzigen Wert (z. B. eine durchschnittliche Konzentration) liefert, hat die Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt, dass Glykogen als diskrete Glykogenpartikel gespeichert ist, die sich in verschiedenen subzellulären Kompartimenten befinden. Hier wird das Schritt-für-Schritt-Protokoll von der Gewebeentnahme bis zur quantitativen Bestimmung des Volumenanteils und des Partikeldurchmessers von Glykogen in den verschiedenen subzellulären Kompartimenten einzelner Skelettmuskelfasern beschrieben. Überlegungen zum 1) Sammeln und Färben von Gewebeproben, 2) Durchführen von Bildanalysen und Datenverarbeitung, 3) Bewerten der Genauigkeit von Schätzungen, 4) Unterscheiden zwischen Muskelfasertypen und 5) methodische Fallstricke und Einschränkungen sind enthalten.
Introduction
Glykogenpartikel bestehen aus verzweigten Polymeren der Glukose und verschiedenen assoziierten Proteinen1 und stellen einen wichtigen Brennstoff bei hohen Stoffwechselanforderungen dar2. Obwohl nicht allgemein anerkannt, stellen Glykogenpartikel auch einen lokalen Brennstoff dar, bei dem einige subzelluläre Prozesse trotz der Verfügbarkeit anderer und langlebigerer Brennstoffe wie Plasmaglukose und Fettsäuren bevorzugt Glykogen verwenden3,4.
Die Bedeutung der Speicherung von Glykogen als subzellulärer spezifischer lokalisierter Brennstoff wurde in mehreren Übersichtsarbeiten5,6 diskutiert, die hauptsächlich auf einigen der frühesten Dokumentationen der subzellulären Verteilung von Glykogen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)7,8 basieren. Die ersten Studien verwendeten verschiedene Protokolle, um den Kontrast von Glykogen von histochemischen Färbetechniken zu negativen und positiven Färbungen zu erhöhen9,10. Eine wichtige methodische Weiterentwicklung war das verfeinerte Nachfixationsprotokoll mit dem kaliumferrocyanidreduzierten Osmium11,12,13,14, das den Kontrast von Glykogenpartikeln signifikant verbesserte. Dieses verfeinerte Protokoll wurde bei einigen der Pionierarbeiten zur belastungsinduzierten Glykogenabbau15 nicht verwendet, sondern von Graham und Kollegen wieder eingeführt16,17.
Basierend auf den 2-dimensionalen Bildern wird die subzelluläre Verteilung von Glykogen am häufigsten als Glykogenpartikel beschrieben, die sich in drei Pools befinden: subsarkolemmal (direkt unter der Oberflächenmembran), intermyofibrillar (zwischen den Myofibrillen) oder intramyofibrillar (innerhalb der Myofibrillen). Glykogenpartikel könnten jedoch auch als assoziiert mit beispielsweise sarkoplasmatischem Retikulum7 oder Kernen18 beschrieben werden. Neben der subzellulären Verteilung besteht der Vorteil des TEM-geschätzten Glykogengehalts auch darin, dass die Quantifizierung auf Einzelfaserebene durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht die Untersuchung der Faser-zu-Faser-Variabilität und korrelative Analysen mit Fasertypen und zellulären Komponenten wie Mitochondrien und Lipidtröpfchen.
Hier wird das Protokoll für den TEM-geschätzten fasertypspezifischen volumetrischen Gehalt der drei gemeinsamen subzellulären Glykogenpools (subsarkolemmal, intermyofibrillär und intramyofibrillär) in Skelettmuskelfasern beschrieben. Die Methode wurde auf die Skelettmuskulatur von Menschen19, Ratten20 und Mäusen21 angewendet; sowie Vögel und Fische22; und Kardiomyozyten von Ratten23.
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Protocol
Das vorliegende Protokoll mit humanen biopsierten Skelettmuskelproben wurde von den Regionalkomitees für Gesundheitsforschungsethik für Süddänemark genehmigt (S-20170198). Muskelbiopsien wurden durch einen Schnitt in der Haut aus dem Musculus vastus lateralis unter Verwendung einer Bergström-Nadel mit Absaugung erhalten, nachdem die Lokalanästhesie subkutan verabreicht wurde (1-3 ml Lidocain 2% pro Einschnitt). Wenn isolierte ganze Rattenmuskeln verwendet wurden, wurden die Tiere durch Zervixdislokation geopfert, bevor die Muskelbiopsien gemäß den Richtlinien der Tierethikkommission am Universitätskrankenhaus Odense, Dänemark, erhalten wurden.
1. Primäre Fixierung, Nachfixierung, Einbettung, Schnitt und Kontrastierung
- 1,6 ml primäre Fixierlösung (2,5% Glutaraldehyd in 0,1 m Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3)) in einem 2 ml Mikrozentrifugationsröhrchen herstellen. Lagern Sie es bei 5 ° C für maximal 14 Tage.
- Von der Muskelbiopsie oder dem ganzen Muskel isolieren Sie eine kleine Probe, die einen maximalen Durchmesser von 1 mm in jede Richtung hat und in Längsfaserrichtung etwas länger ist als Querschnitt (zur Orientierung).
- Legen Sie die Probe in das Röhrchen, das die kalte primäre Fixierlösung enthält. Lagern Sie es bei 5 °C für 24 h.
- Waschen Sie die Probe viermal (15 Minuten zwischen jeder Wäsche) in 0,1 m Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3). Entfernen Sie mit Transferpipetten den verwendeten Puffer aus dem Rohr, so dass die Probe unberührt bleibt, und fügen Sie anschließend den frischen Puffer hinzu.
HINWEIS: Nach der Endwäsche kann die Probe mehrere Monate im 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei 5 °C gelagert werden11. Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Postfix mit 1% Osmiumtetroxid (OsO4) und 1,5% Kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3) für 120 min bei 4 °C.
HINWEIS: Die Verwendung von 1,5% Kaliumferrocyanid (K4Fe (CN) 6) ist für einen optimalen Kontrast von Glykogenpartikeln unerlässlich11,12,13. - Zweimal in doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur (RT) abspülen.
- Dehydrieren Sie durch Eintauchen in eine abgestufte Reihe von Alkohol (Ethanol) bei RT mit den folgenden Konzentrationen: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) und 100% (10 min).
HINWEIS: In jedem Schritt wird die Probe in Ethanol getaucht, das anschließend nur teilweise entfernt wird, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden. Schließlich wird das übrig gebliebene Ethanol verworfen. - Infiltrieren Sie mit abgestuften Gemischen aus Propylenoxid und Epossidic Harz bei RT unter Verwendung der folgenden Volumenverhältnisse (Propylenoxid/Epossidisches Harz): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (über Nacht). Am nächsten Tag betten Sie Proben in 100% frisches epossidisches Harz in Formen ein und polymerisieren bei 60 ° C für 48 h.
HINWEIS: Diese abgestufte Methode entspricht den vorherigen Protokollen11,12. Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Schneiden Sie ultradünne (60-70 nm) Abschnitte von längsorientierten Fasern und sammeln Sie sie wie folgt auf Einloch-Kupfergittern.
- Montieren Sie den Block einer Probe auf dem Ultramikrotomhalter.
- Schneiden Sie den Block auf der Oberfläche mit einer Rasierklinge ab, um das Niveau des Gewebes zu erreichen.
- Montieren Sie ein Diamantmesser (Ultracut 45) vor der Probe und richten Sie die Probenoberfläche parallel zum Messer aus.
- Erzeugen Sie mit dem Diamantmesser einen halbdünnen (1 μm) Abschnitt, um die Ausrichtung der Probe zu überprüfen. Färben Sie den halbdünnen Schnitt mit Toluidinblau zur Beobachtung mit Lichtmikroskopie.
- Schneiden Sie den Block weiter zu, um den interessierenden Bereich zu reduzieren, um richtige ultradünne Abschnitte zu erhalten.
- Ultradünne (60-70 nm) Abschnitte mit einem zweiten Diamantmesser (Ultracut 45) schneiden.
- Sammeln Sie 1-2 Abschnitte auf Einloch-Kupfergittern mit einem Perfect Loop.
HINWEIS: Ein Einloch-Kupfergitter hat ein einzelnes Loch in der Mitte mit Formvar-Stützmembran.
- Kontrastieren Sie Abschnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat, indem Sie die obigen Gitter 20 min in Uranylacetatlösung (0,5% in doppelt destilliertem Wasser) und dann 15 min in Bleicitratlösung (1% in doppelt destilliertem Wasser) tauchen. Waschen Sie die Gitter in doppelt destilliertem Wasser zwischen und nach den beiden Flecken.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
2. Bildgebung
- Schalten Sie das Transmissionselektronenmikroskop (betrieben mit einer Beschleunigungsspannung von 80 kV), den Computer und die Bildaufzeichnungssoftware ein. Nehmen Sie digitale Bilder mit einer digitalen Slow-Scan 2 k x 2 k CCD-Kamera und der zugehörigen Bildgebungssoftware auf.
- Fügen Sie das Raster mit mehreren Abschnitten in die Mikroskopstufe ein.
- Sieb das Gitter zunächst bei geringer Vergrößerung (z. B. x100), um die Qualität der Abschnitte (d. h. Löcher in der Stützmembran, Ablagerungen usw.) zu bestimmen und die Abschnitte mit der besten Qualität auszuwählen. Bestimmen Sie bei geringer Vergrößerung die Richtung der Muskelfasern.
- Als nächstes erhöhen Sie die Vergrößerung mit dem Balken, der auf einer peripheren Faser im Abschnitt zentriert ist. Fokussieren Sie das Bild bei einer Vergrößerung über 30 k, um genügend feine Details im Bild zu gewährleisten, die von einer schnellen Echtzeit-Fourier-Transformation geleitet werden, falls verfügbar. Nehmen Sie schließlich Bilder mit 1 s Belichtungszeit bei der gewünschten Vergrößerung auf.
- Erfassen Sie insgesamt 24 Bilder einer zufällig ausgewählten Faser, d. h. 12 Bilder des myofibrillären Raums und 12 Bilder des subsarkolämischen Raums, bei einer Vergrößerung zwischen 10 k und 40 k. Stellen Sie sicher, dass die Bilder über die Länge und Breite der Faser in einer randomisierten, aber systematischen Reihenfolge verteilt sind, um unverzerrte Ergebnisse zu erhalten (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die optimale Vergrößerung hängt von der verfügbaren Kameraauflösung und der Größe der Mikroaufnahmen ab. Ziel ist es, eine endgültige Auflösung zu erreichen, bei der Glykogenpartikeldurchmesser innerhalb von 1 nm-Schritten gemessen werden können, und eine Gesamtfläche der myofibrillären Region von mindestens 70 μm2 und eine Gesamtlänge der Faser von mindestens 25 μm, verteilt auf 12 Bilder des myofibrillären Raumes und 12 Bilder des subsarkolämischen Raums pro Faser, beziehungsweise. Die 24 Bilder pro Faser ergeben höchstwahrscheinlich eine Genauigkeit (Fehlerkoeffizient) des volumetrischen Gehalts der verschiedenen Glykogenpools zwischen 0,1 und 0,2 in einzelnen Fasern aus der Skelettmuskulatur von Menschen, Ratten und Mäusen20,21,24 (Abbildung 2E). - Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5, bis insgesamt 6-10 Fasern abgebildet sind. Schneiden Sie bei Bedarf zusätzliche Abschnitte (mindestens 150 μm voneinander entfernt, um eine Überlappung bereits abgebildeter Fasern zu vermeiden) und wiederholen Sie die Schritte 1.9-2.5.
3. Bildanalysen
- Importieren Sie Bilder in ImageJ, indem Sie auf Datei > Öffnen klicken.
- Stellen Sie die globale Skalierung so ein, dass sie der ursprünglichen Größe des Bildes entspricht, indem Sie auf Analyze > Set Scale klicken.
- Vergrößern Sie 100%, indem Sie auf Bild > Zoom > In klicken.
- Messen Sie die Dicke einer Z-Disc pro Bild des myofibrillären Raums (12 pro Faser) mit dem Werkzeug "Gerade Linie " im Menü "Werkzeuge" (Abbildung 1D). Berechnen Sie die durchschnittliche Z-Disc-Dicke jeder der 6-10 Fasern.
- Definieren Sie 2-3 Fasern mit der dicksten durchschnittlichen Z-Disc als Typ-1-Fasern und 2-3 Fasern mit der dünnsten durchschnittlichen Z-Disc als Typ-2-Fasern. Lassen Sie die Zwischenfasern 2-4 für weitere Analysen außer Acht (Abbildung 1E).
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für jede der 4-6 Fasern aus der Probe wiederholt. Die Glykogenvolumenanteile werden durch Punktzählung geschätzt, wie an anderer Stelle beschrieben25,26. Die Größe der Gitter wird gewählt, um eine zufriedenstellend hohe Genauigkeit der Schätzungen zu erhalten. Dies wird oft durch das Erreichen von 250 Treffern erreicht, was dann die Gesamtzahl der benötigten Punkte und damit die Fläche pro Punkt bestimmt. - Verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linie , um die Länge des äußersten Myofibrils zu messen, das direkt unter der subsarkolämischen Region sichtbar ist (Abbildung 2A).
HINWEIS: Diese Länge wird verwendet, um subsarkolemmales Glykogen pro Oberfläche zu exprimieren (d. h. Länge des äußersten Myofigrils multipliziert mit der Dicke des Abschnitts (60 nm); siehe Schritt 4.5). Daher wird nur die subsarkolemmale Region, die durch diese Länge dargestellt wird, in die Analyse einbezogen. - Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analyze > Tools > Grid klicken und Area Per Point auf 32.400 nm2 festlegen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer innerhalb der verfügbaren Länge in den 12 subsarkolämischen Bildern, wobei ein Kreuz auf das subsarkolämale Glykogen trifft (Abbildung 2A). Ein Treffer ist definiert als ein Glykogenteilchen, das in der oberen rechten Ecke eines Kreuzes vorhanden ist.
- Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analyze > Tools > Grid klicken und Area Per Point auf 160.000 nm2 festlegen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf den intramyofibrillären Raum trifft (Abbildung 2B).
- Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analyze > Tools > Grid klicken und Area Per Point auf 3.600 nm2 festlegen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intramyofibrilläre Glykogen trifft (Abbildung 2C).
- Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analyze > Tools > Grid klicken und Area Per Point auf 32.400 nm2 festlegen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intermyofibrilläre Glykogen trifft (Abbildung 2D).
- Messen Sie mit dem Werkzeug "Gerade Linie " den Durchmesser von fünf zufällig ausgewählten Glykogenpartikeln jedes Pools für jedes der 12 Bilder, um durchschnittlich 60 Partikel pro Pool und Faser zu erhalten.
HINWEIS: Der Durchschnitt von 60 Partikeln deckt weitgehend die Variation innerhalb der Faser ab (Abbildung 2F).
4. Berechnungen
- Berechnen Sie den scheinbaren Flächenanteil (AA) des intramyofibrillären Raums pro myofibrillärem Raum als Summe aller Treffer dividiert durch die Summe aller Punkte aus den 12 Bildern (aus Schritt 3.8).
- Berechnen Sie den scheinbaren Flächenanteil von intramyofibrillärem Glykogen pro myofibrillärer Fläche, intermyofibrillärem Glykogen pro myofibrillärem Bereich und subsarkolemmalem Glykogen pro Bildfläche als Summe aller Treffer dividiert durch die Summe aller Punkte aus den 12 Bildern (aus den Schritten 3.7, 3.9 und 3.10).
- Berechnen Sie den Volumenanteil (VV) von intramyofibrillärem, intermyofibrillärem und subsarkolemmalem Glykogen als scheinbare Flächenfraktion (AA) abzüglich des Produkts der Oberflächendichte (SV) mit Schnittdicke (t), wobei die Oberflächendichte die numerische Dichte der Partikel multipliziert mit der mittleren Partikeloberfläche ist:
Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
wo
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
t = 0,06 μm
H = mittlerer Durchmesser der Partikel (μm)
HINWEIS: Der Volumenanteil ist kleiner als der scheinbare Flächenanteil aufgrund des Beitrags von Kappen aus Partikeln mit ihrer Mitte außerhalb der Scheibe25. - Um intramyofibrilläres Glykogen pro intramyofibrillärem Raum zu exprimieren, dividieren Sie die Flächenfraktion des intramyofibrillären Glykogens (Schritt 4.2) durch die Flächenfraktion des intramyofibrillären Raums (Schritt 4.1). Das intermyofibrilläre Glykogen wird pro myofibrillärem Raum exprimiert, wie im vorherigen Schritt (Schritt 4.3) berechnet.
- Um subsarkolämisches Glykogen pro Oberfläche der Faser (VS) (äußeres Myofibrill) zu exprimieren, wandeln Sie den Volumenanteil des Glykogens in eine absolute Menge um, indem Sie mit dem Volumen des Bildes (Produkt aus Flächen- und Schnittdicke) multiplizieren und durch das Produkt der mittleren verfügbaren Länge (aus Schritt 3.6) mit der Abschnittsdicke (t) dividieren.
- Schätzen Sie den gesamten volumetrischen Glykogengehalt anhand der Werte aus den Schritten 4.1, 4.4 und 4.5 wie folgt:
Myofibrilläres Glykogen = Intermyofibrilläres Glykogen + (intramyofibrilläres Glykogen · Flächenanteil des intramyofibrillären Raums)
Unter der Annahme eines durchschnittlichen Faserradius von 40 μm27 beträgt das Verhältnis von Volumen zu Oberfläche 20:1, so dass das Gesamtglykogen wie folgt lautet:
Gesamtglykogen (VV) = Myofibrilläres Glykogen + (subsarkolemmales Glykogen (VS) / 20)
HINWEIS: Das Verhältnis von Volumen zu Oberfläche von 20: 1 kann von Faser zu Faser variieren, abhängig von der tatsächlichen Fasergröße und der Größe der subsarkolemmalen Region. Dies wird mit dem vorliegenden Protokoll nicht berücksichtigt. - Daraus ergibt sich der relative Beitrag jedes Pools als Bruchteile des Gesamtglykogens:
Intermyofibrilläres Glykogen / Gesamtglykogen = Intermyofibrilläres Glykogen / Gesamtglykogen
Intramyofibrilläres Glykogen / Gesamtglykogen = (Intramyofibrilläres Glykogen · Flächenanteil des intramyofibrillären Raumes) / Gesamtglykogen
Subsarkolämisches Glykogen / Gesamtglykogen = Subsarkolämmales Glykogen / 20 / Gesamtglykogen - Berechnen Sie für jeden Glykogenpool den Fehlerkoeffizienten (CE), der die Unsicherheit der Glykogenschätzung auf Faserebene ausdrückt, basierend auf der Anzahl der Bilder (n), der Gesamtzahl der Kreuze in jedem Bild (x) und der Anzahl der Kreuze, die in dem entsprechenden Pool in jedem Bild (y) auf Glykogen treffen, wie folgt28:
CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑j-1
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Protokolls erscheinen Glykogenpartikel schwarz und deutlich (Abbildungen 1 und Abbildung 2). Die Normalwerte von Glykogen sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Daten basieren auf insgesamt 362 Ballaststoffen von 41 gesunden jungen Männern, die in verschiedenen früheren Studien gesammelt wurden19,24,29,30,31. Hier kann gesehen werden, dass intermyofibrilläre Glykogenwerte nahe dem Normalwert verteilt sind, während sowohl intramyofibrilläres als auch subsarkolämales Glykogen eine schiefe Verteilung aufweisen, wobei Fasern manchmal eine übermäßige Menge an Glykogen aufweisen. Es ist wichtig zu beachten, dass in normal großen Muskelfasern (Durchmesser von 60-80 μm) intermyofibrilläres Glykogen der größte Pool ist, der etwa 80% des gesamten Glykogengehalts ausmacht. Intramyofibrilläres und subsarkolämales Glykogen machen jeweils etwa 10% des Gesamtgehalts aus.
Abbildung 1: Bildgebung und Fasertypisierung . (A) Jede Faser wird in einer randomisierten systematischen Reihenfolge abgebildet. (B) Beispiel eines Bildes aus dem subsarkolemmalen Raum. (C) Beispiel eines Bildes aus dem myofibrillären Raum. (D) In jedem myofibrillären Bild wird die Breite einer Z-Disc gemessen (rote Linien). Die Messungen von insgesamt 12 Z-Scheiben (eine pro Bild) ergeben einen Fehlerkoeffizienten von etwa 0,03. (E) Die typische Verteilung der durchschnittlichen Faser-Z-Scheibenbreite in 6-10 Fasern jeder der 10 Biopsien. Aus jeder Biopsie werden 2-3 Fasern als Typ 1 und 2 definiert, basierend auf der Verteilung innerhalb der Biopsie. Die Bilder stammen aus einer Biopsie von m. vastus lateralis eines Powerlifters, der in einer früheren Studie enthalten war29. m: Mitochondrien und Z: Z-Scheibe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Glykogenanalysen. (A) Das subsarkolämmale Glykogenvolumen pro Oberfläche wird durch Punktzählung unter Verwendung einer Gittergröße von 180 nm x 180 nm innerhalb einer Region geschätzt, die durch die Länge des äußersten Myofibrils und der subsarkolämischen Region senkrecht zu dieser Länge definiert ist (blau gepunktete Linien). (B) Der myofibrilläre Volumenanteil wird durch Punktzählung unter Verwendung einer Gittergröße von 400 nm x 400 nm geschätzt. (C) Der Volumenanteil des intramyofibrillären Glykogens wird durch Punktzählung unter Verwendung einer Gittergröße von 60 nm x 60 nm geschätzt. (D) Der Volumenanteil des intermyofibrillären Glykogens wird durch Punktzählung unter Verwendung einer Gittergröße von 180 nm x 180 nm geschätzt. In A-D zeigen die roten Kreise Treffer an (ein Kreuz, das auf ein Glykogenpartikel trifft). (E) Der geschätzte Fehlerkoeffizient für eine Stereologik-Verhältnisschätzung24 für 2 bis 12 analysierte Bilder. Der Fehlerkoeffizient wird basierend auf der Anzahl der Zählungen geschätzt und variiert daher zwischen den Proben basierend auf der Glykogenkonzentration. Sie ist oft relativ niedrig, wenn der Glykogengehalt hoch ist und umgekehrt. (F) Der Variationskoeffizient des Glykogenpartikeldurchmessers nach Messung von 2-99 Partikeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Normalwerte der drei subzellulären Glykogenpools in der Skelettmuskulatur. Die Geigenplots basieren auf 362 Fasern von 41 gesunden jungen Männern (18-39 Jahre alt). Die Fasern stammen aus früheren Studien, wobei Biopsien von m. vastus lateralis in Ruhe- oder Kontrollzustand erhalten wurden19,24,29,30,31. Werte werden als Boxplot mit einer Markierung für den Median und einem Feld angezeigt, das den Interquartilsbereich angibt. Die Linien stellen obere und untere benachbarte Werte dar. Die Boxen werden von Kernel-Density-Plots überlagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Der kritische Schritt der Methode ist die Verwendung von reduziertem Osmium durch Kaliumferrocyanid während der Postfixation. Die Selektivität dieses modifizierten Fixiermittels für den Glykogennachweis kann nicht vollständig durch die Chemie erklärt werden, sondern umfasst auch experimentelle Ergebnisse, die zeigen, dass solche Partikel in Geweben, von denen bekannt ist, dass sie frei von Glykogen sind, oder im extrazellulären Raum nicht nachgewiesen wurden11.
Kritische Parameter sind die Genauigkeit der Schätzungen und die Faser-zu-Faser-Variation. Durch Befolgung des vorliegenden Protokolls für die Bildgebung erhält man einen Fehlerkoeffizienten zwischen 0,1 und 0,2 der Schätzungen der verschiedenen Glykogenpools pro Faser. Diese Fehlerstufe liegt deutlich unter der Variation zwischen einzelnen Fasern (Abbildung 3). Es wird empfohlen, solche Präzisionsschätzungen bei der Schätzung des volumetrischen Gehalts an Glykogen zu melden. Die vorgestellte Fasertypisierungsmethode ist gegen Myosin-ATPase-Isoform29 validiert. Die Z-Scheibendicke und die mitochondriale Volumenfraktion können auch in Kombination verwendet werden, um den Fasertyp anzugeben, aber nicht die mitochondriale Volumenfraktion allein32.
Die Haupteinschränkungen der Methode sind die Unfähigkeit, die sehr kleinen Glykogenpartikel nachzuweisen, und dass sich Profile von Glykogenpartikeln im projizierten Bild überlappen können28. Die erste Einschränkung macht ein wahres Maß für die durchschnittliche Partikelgröße ungültig. Dies wird zu einer schweren Verzerrung, wenn die Glykogenpartikel während hoher metabolischer Anforderungen abgebaut werden, während die Verzerrung unbedeutend sein kann, wenn die Glykogenpartikel während der Glykogenresynthese oder Superkompensation von einer mittleren zu einer größeren Größe wachsen. Während dies enorme Auswirkungen auf die Schätzung der durchschnittlichen Glykogenpartikelgröße bei niedrigen Glykogenspiegeln haben kann, sind die Schätzungen der volumetrischen Glykogenkonzentrationen robust, da kleine, unbeobachtete Glykogenpartikel sehr wenig zum Gesamtglykogengehalt beitragen. Die zweite Einschränkung ergibt sich aus dem Zustand, bei dem die Glykogenpartikel viel kleiner sind als die Dicke der Abschnitte. Diese Verzerrung liegt meist bei sehr hohen Glykogenkonzentrationen vor und könnte durch den Vergleich der Glykogenvolumenfraktionen von Abschnitten mit unterschiedlichen Dicken untersucht werden. Wenn ein dickerer Abschnitt nicht von einem hohen Glykogenvolumenanteil begleitet wird, muss dies auf eine Unterschätzung aufgrund von mehr überlappenden Partikeln im dicksten Abschnitt zurückzuführen sein. In früheren Studien korreliert die Glykogenvolumenfraktion mit der Glykogenkonzentration im Bereich von 50 bis 600 mmol kg dw-1, was auf keine ausgeprägte Überlappung der Partikel hinweist. Wenn die Glykogenkonzentration jedoch über dieses Niveau steigt, gibt es keinen Anstieg des intermyofibrillären Glykogens, was auf eine Überlappung hinweist33. Dies kann gelöst werden, indem die Beziehung zwischen dem Glykogenvolumenanteil und der Konzentration bei den niedrigeren Glykogenkonzentrationen extrapoliert wird.
Basierend auf der von TEM bereitgestellten nm-Auflösung ist dieses Protokoll derzeit die einzige Methode, um die subzelluläre Verteilung von Glykogen abzuschätzen. Darüber hinaus erlaubt die Methodik auch einen großräumigen quantitativen Ansatz (wie hier beschrieben), bei dem quantitative Werte auf der Ebene der einzelnen Fasern erhalten werden können. Dies ist von immenser Bedeutung in der Skelettmuskulatur mit hoher Heterogenität in der Faserrekrutierung während verschiedener Arten von Übungen2, wo glykogenabhängige Ermüdungsmechanismen nur in einigen Fasern auftreten. Die Methode hat auch Potenzial für andere erregbare Gewebe wie Kardiomyozyten, von denen bekannt ist, dass Glykogen für die normale Herzfunktion unerlässlich und während der Ischämie kritisch ist23,34.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Schwedischen Olympischen Komitee unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
