Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

מאמר זה מתאר כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד קריו-EM, כלומר, cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3, כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים של חלקיקים בודדים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.

Abstract

ההתפתחויות האחרונות הן בתוכנות מכשור והן בתוכנת עיבוד תמונה הפכו מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון של חלקיק יחיד (קריו-EM) לשיטה המועדפת על ביולוגים מבניים לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של מגוון רחב של מקרומולקולות. חבילות תוכנה מרובות זמינות למשתמשים חדשים ומומחים לעיבוד תמונה וחישוב מבנה, המייעלים את אותה זרימת עבודה בסיסית: סרטים שנרכשו על ידי גלאי המיקרוסקופ עוברים תיקון להערכת תנועה והעברת ניגודיות (CTF) הנגרמת על ידי קרן. לאחר מכן, תמונות חלקיקים נבחרות ומופקות ממסגרות סרט ממוצעות לסיווג דו-ממדי ותלת-ממדי איטראטיבי, ולאחר מכן שחזור, עידון ואימות תלת-ממדיים. מכיוון שחבילות תוכנה שונות משתמשות באלגוריתמים שונים ודורשות רמות שונות של מומחיות כדי לפעול, המפות התלת-ממדיות שהן מייצרות שונות לעתים קרובות באיכות וברזולוציה. לכן, משתמשים באופן קבוע להעביר נתונים בין מגוון רחב של תוכניות לקבלת תוצאות אופטימליות. מאמר זה מספק מדריך למשתמשים לנווט בזרימת עבודה על פני חבילות התוכנה הפופולריות: cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3 כדי לקבל מבנה רזולוציה כמעט אטומית של הווירוס הקשור לאדנו (AAV). אנו מפרטים תחילה צינור עיבוד תמונה עם cryoSPARC v3, שכן האלגוריתמים היעילים שלו ו- GUI קל לשימוש מאפשרים למשתמשים להגיע במהירות למפה תלת-ממדית. בשלב הבא, אנו משתמשים ב- PyEM ובסקריפטים פנימיים כדי להמיר ולהעביר קואורדינטות חלקיקים מהשחזור התלת-ממדי האיכותי ביותר המתקבל ב- cryoSPARC v3 ל- RELION-3 ו- Scipion 3 ולחשב מחדש מפות תלת-ממדיות. לבסוף, אנו מתארים שלבים לעידון נוסף ואימות של המבנים המתקבלים על ידי שילוב אלגוריתמים מ- RELION-3 ו- Scipion 3. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.

Introduction

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) וניתוח חלקיקים בודדים (SPA) מאפשרים קביעת מבנה של מגוון רחב של מכלולים ביו-מולקולריים במצבם הלחותי, ומסייעים להאיר את תפקידיהם של מקרומולקולות אלה בפירוט אטומי. שיפורים במיקרוסקופ אופטיקה, חומרת מחשב, ותוכנה לעיבוד תמונה אפשרו לקבוע מבנים של ביומולקולות ברזולוציה להגיע מעבר 2 Å1,2,3. יותר מ-2,300 מבני קריו-EM הופקדו במאגר נתוני החלבון (PDB) ב-2020, לעומת 192 מבנים ב-2014, מה שמצביע על כך שהקפאה-EM הפכה לשיטת הבחירה של ביולוגים מבניים רבים. כאן אנו מתארים זרימת עבודה המשלבת שלוש תוכניות ספא שונות לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה (איור 1).

המטרה של SPA היא לשחזר אמצעי אחסון תלת-ממדיים של דגימת יעד מתמונות דו-ממדיות רועשות שנרשמו על ידי גלאי מיקרוסקופ. גלאים אוספים תמונות כסרטים עם מסגרות בודדות של אותו שדה ראייה. על מנת לשמר את המדגם, מסגרות נאספים עם מינון אלקטרונים נמוך ולכן יש יחס אות לרעש גרוע (SNR). בנוסף, חשיפה לאלקטרונים יכולה לגרום לתנועה בתוך רשתות ההקפאה-EM המיובשות, וכתוצאה מכך טשטוש תמונה. כדי להתגבר על בעיות אלה, מסגרות מיושרות כדי לתקן עבור תנועה הנגרמת על ידי קרן וממוצע להניב מיקרוגרף עם SNR מוגבר. מיקרוגרפים אלה עוברים הערכה של פונקציית העברת ניגודיות (CTF) כדי להסביר את ההשפעות של דפוקוס וסטיות שהוטלו על ידי המיקרוסקופ. מהמיקרוגרפים המתוקנים של CTF, חלקיקים בודדים נבחרים, מופקים ומוינים לממוצעים דו-ממדיים המייצגים אוריינטציות שונות שאומצו על ידי הדגימה בקרח זגוגי. קבוצת החלקיקים ההומוגנית שנוצרת משמשת כקלט לשחזור תלת-ממדי ab initio כדי ליצור מודל או מודלים גסים, אשר לאחר מכן מעודנים באופן איטרטיבי כדי לייצר מבנה אחד או יותר ברזולוציה גבוהה. לאחר השחזור, שיפורים מבניים מבוצעים כדי לשפר עוד יותר את האיכות והרזולוציה של מפת cryo-EM. לבסוף, מודל אטומי נגזר ישירות מהמפה, או שהמפה מצוידת בקואורדינטות אטומיות המתקבלות במקום אחר.

חבילות תוכנה שונות זמינות כדי להשלים את המשימות המתוארות לעיל, כולל Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, ואחרים. בעוד שתוכניות אלה מבצעות שלבי עיבוד דומים, הן משתמשות באלגוריתמים שונים, לדוגמה, כדי לבחור חלקיקים, ליצור מודלים ראשוניים ולמקד שחזורים. בנוסף, תוכניות אלה דורשות רמה משתנה של ידע משתמש והתערבות לפעול, כמו כמה תלויים כוונון עדין של פרמטרים שיכולים לשמש משוכה עבור משתמשים חדשים. אי-התאמות אלה גורמות לעתים קרובות למפות עם איכות ורזולוציה לא עקביות בפלטפורמות14, מה שגורם לחוקרים רבים להשתמש בחבילות תוכנה מרובות כדי למקד ולאמת תוצאות. במאמר זה, אנו מדגישים את השימוש של cryoSPARC v3, RELION-3, ו Scipion 3 כדי לקבל שחזור 3D ברזולוציה גבוהה של AAV, וקטור נפוץ לטיפול גנטי15. חבילות התוכנה הנ"ל הן בחינם למשתמשים אקדמיים; cryoSPARC v3 ו Scipion 3 דורשים רישיונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. יצירת פרויקט v3 קריוSPARC חדש וייבוא נתונים

הערה: הנתונים נרכשו באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (OHSU) בפורטלנד באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים טיטאן Krios 300 kV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר פלקון 3. התמונות נאספו במצב ספירה עם מינון כולל של 28.38 e−/Å2 מחולק על פני 129 מסגרות, וטווח defocus מ-0.5 מיקרומטר ל-2.5 מיקרומטר-, בגודל פיקסל של 1.045 Å באמצעות EPU. המדגם של AAV- DJ סופק על ידי הצוות של OHSU.

  1. פתח את cryoSPARC v3 בדפדפן אינטרנט ולחץ על הכותרת פרוייקטים . בחר + הוסף כדי ליצור פרוייקט חדש. הכותרת הראשית של הפרוייקט בהתאם וספק נתיב לספריה קיימת שבה יישמרו משימות ונתונים.
  2. צור סביבת עבודה עבור הפרוייקט על-ידי פתיחת הפרוייקט, לחיצה על + הוספה ובחירה בסביבת עבודה חדשה. תן כותרת לסביבת העבודה ולחץ על צור.
  3. נווט אל סביבת העבודה החדשה ופתח את בונה המשימות בחלונית הימנית. כרטיסיה זו מציגה את כל הפונקציות הזמינות ב- cryoSPARC v3. לחץ על ייבוא סרטים ולספק את נתיב הסרטים, להשיג נתיב קובץ התייחסות, ולהגדיר פרמטרי רכישה כדלקמן: גודל פיקסל גולמי 1.045 Å, האצת מתח 300 kV, סטייה כדורית 2.7 מ"מ, מינון חשיפה כולל 28.38 e-/Å^2.
  4. לחץ על תור, בחר נתיב להפעלת המשימה וסביבת העבודה ולחץ על צור.
    הערה: פרמטרי הרכישה הם מדגם ותלויים במיקרוסקופ.

2. CryoSPARC v3 - יישור סרט והערכת CTF

  1. פתח את תיקון תנועת התיקון (מרובה). משימה זו דורשת את הסרטים המיובאים בשלב 1.3 כקלט. פתח את כרטיס המשימה ייבוא סרטים בסביבת העבודה וגרור את פלט Imported_movies למציין המיקום של הסרטים במשימה החדשה. תעמיד את המשימה בתור .
    הערה: לקבלת מידע נוסף אודות שיטות cryoSPARC המתוארות במאמר זה, עיין בערכת הלימוד של cryoSPARC16.
  2. כדי לבצע הערכת CTF, פתח את הערכת CTF של Patch (Multi). הזן את המיקרוגרפים שנוצרו בשלב 2.1 ותתן את המשימה בתור.
  3. כדי לבדוק את המיקרוגרפים הממוצעים המתוקנים ב- CTF ולבחור קבוצת משנה לעיבוד נוסף, פתח את אצור חשיפות והזן את החשיפות שהושגו בשלב 2.2. תעמיד את המשימה בתור .
  4. לאחר שהמשימה נכנסת למצב המתנה , לחץ על הכרטיסיה אינטראקציה בכרטיס העבודה, התאם את סף הפרמטרים וקבל או דחה מיקרוגרפים בודדים לעיבוד נוסף. קבלו מיקרוגרפים עם CTF מוערך וניסיוני (איור 2) והשליכו את אלה עם אסטיגמציה גבוהה, כושר CTF לקוי וקרח עבה.
  5. בעת עיבוד הנתונים הנוכחיים, הגדר את הסף העליון של אסטיגמציה ל 400 Å, CTF להתאים רזולוציה ל 5 Å, ועובי קרח יחסית ל 2. לחץ על בוצע כדי לבחור את המיקרוגרפים לעיבוד במורד הזרם.

3. CryoSPARC v3 - קטיף חלקיקים ידני ומבוסס תבנית

  1. פתח את בורר ידני, הזן את החשיפות המקובלות משלבים 2.4-2.5 ותתן את המשימה בתור. לחץ על הכרטיסייה אינטראקטיבית , הגדר את גודל התיבה (px) ל- 300 ולחץ על כמה מאות חלקיקים על פני מיקרוגרפים מרובים והימנע מבחירת חלקיקים חופפים. כאן נבחרו 340 חלקיקים על פני 29 מיקרוגרפים. בסיום, לחץ על סיום איסוף! לחלץ חלקיקים.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש באיסוף חלקיקים ידני כדי ליצור תבניות לבחירה אוטומטית. עם זאת, שיטות אחרות זמינות גם כן17.
  2. כדי ליצור תבניות לקטיף חלקיקים אוטומטי, לחץ על סיווג דו-ממדי והזן את בחירות החלקיקים שנוצרו בשלב 3.1. שנה את מספר המחלקות הדו-ממדיות ל- 10 ותתקין את המשימה בתור.
  3. פתחו את 'בחר מחלקות דו-ממדיות'. הזן את החלקיקים ואת ממוצעי המחלקות שהושגו בשלב 3.2 ולחץ על הכרטיסיה אינטראקטיבי. בחר מחלקות דו-ממדיות מייצגות עם SNR טוב ולחץ על בוצע.
    הערה: ממוצעי המחלקות משקפים תצוגות חלקיקים שונות. בחר ממוצעי מחלקה המשקפים כל תצוגה. המטרה היא לייצר תבניות מוגדרות היטב המייצגות תצוגות שונות של הדגימה לקטיף אוטומטי.
  4. פתח את בורר התבניות והזן את המחלקות הדו-ממדיות שנבחרו בשלב 3.3 ובמיקרוגרף משלבים 2.4-2.5. הגדר את קוטר החלקיקים (Å) ל- 220 Å ותעמוד בתור למשימה.
  5. כדי לבדוק את הבחירות האוטומטיות, פתחו את 'בחר בוררי חלקיקים', הזינו את החלקיקים והמיקרוגרפים שנוצרו בשלב 3.4 ותנו את המשימה בתור .
  6. בכרטיס העבודה בחירת חלקיקים, לחץ על הכרטיסיה אינטראקטיבי והגדר את גודל התיבה (px) ל- 300. לחץ על מיקרוגרף בודד, התאם את מסנן lowpass עד שחלקיקים נראים בבירור, והגדר את סף המתאם הצולב המנורמל (NCC) ל- 0.41 ואת סף צריכת החשמל בין 54000 ל- 227300 .
  7. בדוק מספר מיקרוגרפים, ובמידת הצורך התאם את הסף כך שרוב החלקיקים נבחרים מבלי לכלול תוצאות חיוביות שגויות. בסיום, לחץ על סיום האיסוף! לחלץ חלקיקים.
    הערה: לחלקיקים אמיתיים יש בדרך כלל NCC גבוה וציון הספק, המציין שהם דומים לתבנית ויש להם SNR גבוה, בהתאמה.
  8. פתח את התמצית ממיקרוגרפים והזן את המיקרוגרפים והחלקיקים משלב 3.7. הגדר את גודל התיבה שחולצה (px) ל- 300 ותעמוד בתור למשימה.

4. CryoSPARC v3 - סיווג דו-ממדי

  1. לחץ על סיווג דו-ממדי והזן את החלקיקים שחולצו משלב 3.8. הגדר את מספר המחלקות הדו-ממדיות ל- 50 ותתקין את המשימה בתור.
  2. לבחירת המחלקות הדו-ממדיות הטובות ביותר לעיבוד נוסף, פתחו את 'בחר מחלקות דו-ממדיות'. הזן את החלקיקים ואת ממוצעי המחלקות שהושגו בשלב 4.1. לחצו על הכרטיסייה 'אינטראקטיבי ' ובחרו מחלקות דו-ממדיות בהתבסס על הרזולוציה ומספר החלקיקים במחלקה (איור 3). אל תבחר מחלקות המכילות חפצים. לאחר הבחירה, לחץ על סיום.
    הערה: בדרך כלל, נדרשים סבבים מרובים של סיווג דו-ממדי כדי להסיר חלקיקים, שאינם מתכנסים למחלקות נפרדות ומוגדרות היטב. הפעל כמה שיותר סיבובים של סיווג דו-ממדי לפי הצורך כדי להסיר חלקיקים כאלה מערכת הנתונים (איור 3).

5. CryoSPARC v3 - שחזור ab-initio ועידון הומוגני

  1. כדי ליצור נפח תלת-ממדי ראשוני, פתחו את שחזור Ab-initio והזן את החלקיקים שהושגו בשלב 4.2 או מהסיווג הדו-ממדי הסופי. התאם את הסימטריה לאיקוסהדרל. תעמיד את המשימה בתור .
    הערה: סימטריה תלויה בדגימה ויש לשנותה בהתאם. אם לא ידוע, השתמש בסימטריה C1.
  2. פתח עידון הומוגני. הזן את עוצמת הקול משלב 5.1 וחלקיקים מ- 4.2 או את הסיווג הדו-ממדי הסופי. שנה את הסימטריה ותציב את המשימה בתור. בסיום המשימה, בדוק את עקומת מתאם המעטפת של פורייה (FSC) והורד את אמצעי האחסון לבדיקה ב- UCSF Chimera18.

6. ייצוא קואורדינטות חלקיקים מ cryoSPARC v3 וייבואם ל- RELION-3 באמצעות PyEM

הערה: קואורדינטות חלקיקים נושאות מידע על מיקומם של חלקיקים בודדים בכל מיקרוגרף. העברת קואורדינטות במקום ערימות חלקיקים ל- RELION-3 מאפשרת הפעלת שלבי עידון שאחרת לא היו זמינים. לדוגמה, ליטוש חלקיקים דורש גישה למסגרות סרט ראשוניות. לפיכך, לפני ייצוא קואורדינטות חלקיקים מ cryoSPARC v3 כדי RELION-3, לייבא סרטים ולבצע תיקון תנועה והערכת CTF ב RELION-3. עיין בערכת הלימוד של RELION-319 לקבלת פרטים.

  1. נווט לספריית הפרוייקטים RELION-3 והפעל את RELION-3.
  2. פתח את ייבוא מדפדפן סוג המשימה וציין את הנתיב לסרטים ולפרמטרים של רכישה כמו בשלב 1.3.
  3. כדי לבצע תיקון תנועה, השתמש ב- UCSF MotionCor220 באמצעות ממשק המשתמש הגרפי RELION-3, פתח את תיקון התנועה והגדר את פרמטרי ברירת המחדל כמו במדריך UCSF MotionCor2221. הזן את הנתיב לסרטים המיובאים בשלב 6.2. בכרטיסיה תנועה, ציין את הנתיב לקובץ ההפעלה motioncor2.
    הערה: ניתן להפעיל את MotionCor2 במקביל באמצעות מעבדים גרפיים מרובים.
  4. בצע הערכת CTF באמצעות CTFFIND-4.122 באמצעות ממשק המשתמש הגרפי RELION-3. פתח את הערכת CTF והזן את המיקרוגרף.star שנוצר בשלב 6.3. בכרטיסיה CTFFIND-4.1, ציין את הנתיב לקובץ ההפעלה CTFFIND-4.1 והגדר פרמטרים כמו בערכת הלימוד RELION-3.119.
  5. על מנת לייבא ערימות חלקיקים מ cryoSPARC v3 כדי RELION-3, הם חייבים להיות מיוצאים תחילה מ cryoSPARC v3. ב- cryoSPARC v3, פתח את כרטיס העבודה של המשימה בחר מחלקה דו-ממדית משלב 4.2 או מהסיווג הדו-ממדי הסופי. בכרטיסיה פרטים , לחץ על ייצוא משימה. משימת ייצוא יוצרת פלט של קובץ particles_exported.cs.
  6. לפני ייבוא קואורדינטות חלקיקים מ- cryoSPARC v3 ל- RELION-3, יש להמיר את קובץ particles_exported.cs משלב 6.5 לתבנית .star. באמצעות PyEM23, המר את קובץ particles_exported.cs לתבנית .star על-ידי ביצוע הפקודה הבאה: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. ב RELION-3, לחץ על הכרטיסיה איסוף ידני ובכרטיסיה קלט/פלט , הזן את המיקרוגרפים מעידון CTF המתואר בשלב 6.4. בכרטיסיה תצוגה , הזן את הפרמטרים הבאים: קוטר חלקיקים (A): 220, מסנן Lowpass (A): -1 , קנה מידה עבור תמונת CTF: 0.5. תנהל את העבודה. ספריה בשם ManualPick נוצרת בתיקיה הראשית RELION-3.
    הערה: שלב זה מבוצע כדי ליצור מבנה תיקיית איסוף ידני ב- RELION-3. בעת הפעלת קטיף ידני, קובץ .star יחיד המכיל קואורדינטות של חלקיקים שנאספו נוצר עבור כל מיקרוגרף ממוצע המשמש לקטיף ב- RELION-3 GUI.
  8. נווט לתיקיה המכילה את הקובץ particles_exported.star משלב 6.6 והפעל סקריפט ביתי המפיק קובץ manualpick.star יחיד עבור כל מיקרוגרף ממוצע המשמש לקטיף חלקיקי קריו-SPARC v3, שתרם לסיווג הדו-ממדי הסופי שיוצא בשלב 6.5. קבצי הקואורדינטות המתקבלים נשמרים בתיקיה ManualPick/Movies.
  9. חזור ל- RELION-3 ופתח מחדש את משימת האיסוף הידני . לחץ על המשך. זה יציג חלקיקים שנקטפו בעבר ב- cryoSPARC v3 ב- RELION-3 GUI. בדוק כמה מיקרוגרפים כדי לוודא אם ההעברה של קואורדינטות חלקיקים הושגה ואם חלקיקים נבחרו כראוי.

7. RELION-3 - מיצוי חלקיקים וסיווג דו-ממדי

  1. לחץ על מיצוי חלקיקים. בכרטיסיה קלט/פלט , הזן את המיקרוגרפים המתוקנים של CTF משלב 6.4 וקואורדינטות משלב 6.9. לחץ על הכרטיסיה חלץ ושנה את גודל קופסת החלקיקים (pix) ל- 300. תנהל את העבודה.
  2. בצע סיווג דו-ממדי כדי לנקות עוד יותר את ערכת החלקיקים שנוצרה ב- cryoSPARC v3 כדי להשיג שחזור ברזולוציה גבוהה יותר. לחץ על סיווג דו-ממדי ובכרטיסיה קלט/פלט , הזן את הקובץ particles.star שנוצר בשלב 7.1. בכרטיסיה מיטוב , הגדר את מספר המחלקות ל- 50 ואת קוטר המסכה (A) ל- 280. תנהל את העבודה.
    הערה: המסכה צריכה להקיף את החלקיק כולו.
  3. כדי לבחור את המחלקות הדו-ממדיות הטובות ביותר, לחץ על שיטת בחירת קבוצת המשנה , הזן את הקובץ _model.star משלב 7.2 והפעל את המשימה. בחר כיתות כמתואר בשלב 4.2.
  4. חזור על שלבים 7.2 ו- 7.3 כדי להסיר חלקיקים שאינם מתכנסים.

8. RELION-3 - עידון תלת-ממדי, יצירת מסיכות ופוסט-עיבוד

  1. השתמש במפה שנוצרה ב- cryoSPARC v3 (שלב 5.2) כמודל ראשוני לעידון תלת-ממדי ב- RELION-3. בחר את שיטת הייבוא והגדר את הפרמטרים הבאים בכרטיסיה קלט/פלט : ייבוא סרטים גולמיים/מיקרוגרפים: לא, קבצי קלט גולמיים: סרטים/*.mrc.
  2. ספק את קובץ ה- MTF והזן את פרמטרי רכישת הסרט כמתואר בשלב 1.3. בכרטיסיה אחרים , בחר את מפת v3 של cryoSPARC כקובץ הקלט, שנה את סוג הצומת להפניה תלת-ממדית ( .mrc) והפעל את המשימה.
  3. בחרו 'מקד אוטומטי תלת-ממדי ' ובכרטיסיה קלט/פלט , הגדירו את 'תמונות קלט' כקובץ particles.star משלב 7.3 או ממשימת הבחירה האחרונה. תן את שחזור ה- v3 של cryoSPARC כמפת הייחוס. לחץ על הכרטיסיה הפניה ושנה את המסנן הראשוני Low-Pass (Å) ל- 50 וסימטריה לאיקוסהדרל. בכרטיסיה מיטוב , שנה את קוטר המסיכה (Å) ל- 280 והפעל את המשימה.
  4. לאחר סיום הריצה, פתח את run_class001.mrc ב- UCSF Chimera.
  5. ב- UCSF Chimera, לחץ על כלים ותחת נתוני עוצמת קול, בחר מציג עוצמת הקול. פעולה זו תפתח חלון חדש להתאמת הגדרות עוצמת הקול. שנה את השלב ל- 1 והתאם את המחוון עד שתגיע לערך הרמה שבו המפה אינה כוללת רעש. רשום ערך זה, מכיוון שהוא ישמש ליצירת מסיכה בשלב הבא.
  6. המפה המופקת מעידון אוטומטי אינה משקפת את ה- FSC האמיתי, שכן רעש מהממס שמסביב מוריד את הרזולוציה. לפני לאחר העיבוד, צור מסיכה כדי להבחין בין הדגימה לאזור הממס.
    1. לחץ על יצירת מסכה וקלט run_class001.mrc משלב 8.3.
    2. לחץ על הכרטיסייה מסיכה והתאם פרמטרים כדלקמן: מפת מסנן Lowpass (Å): 10, גודל פיקסל (Å): 1.045, סף Binarization ראשוני: ערך הרמה המתקבל בשלב 8.5, הרחב מפה בינארית כל כך הרבה פיקסלים: 3, והוסף קצה רך של פיקסלים רבים אלה: 3. הפעל את העבודה.
  7. בדוק את המסכה בכימרה UCSF. אם המסיכה הדוקה מדי, הגדל את הרחב מפה בינארית כה רבה של פיקסלים ו/או הוסף קצה רך של פיקסלים רבים אלה. חשוב ליצור מסכה עם קצוות רכים, שכן מסכה חדה עלולה להוביל להתאמת יתר.
  8. לחץ על לאחר העיבוד ובכרטיסיית הקלט/פלט , הזן את חצאי המפות שנוצרו בשלב 8.3 ומסכה מ- 8.6. הגדר גודל פיקסל מכויל ל- 1.045 Å. בכרטיסיה חידוד , הזן את הדברים הבאים: הערכת גורם B באופן אוטומטי?: כן, הרזולוציה הנמוכה ביותר עבור התאמה אוטומטית של B (A): 10, השתמש ב- B-Factor משלך?: לא. בכרטיסיה סינון , הגדר את דלג על Fsc-Weighting? כ-No . הפעל את המשימה.

9. RELION-3 - אימון ליטוש וליטוש חלקיקים

  1. לפני תיקון לתנועה הנגרמת על-ידי קרן חלקיקים, השתמש תחילה במצב האימון כדי לזהות מסלולי תנועה אופטימליים עבור ערכת הנתונים. פתח את הליטוש הבייסיאני ובכרטיסיית הקלט/פלט , הזן את המיקרוגרפים המתוקנים בתנועה משלב 6.3, חלקיקים משלב 8.3 וקובץ .star לאחר עיבוד משלב 8.8. לחץ על הכרטיסיה הדרכה והגדר את הפרמטרים הבאים: לאמן פרמטרים אופטימליים: כן, שבר של פיקסלים פורייה לבדיקה: 0.5, השתמש בחלקיקים רבים אלה: 5000. תנהל את העבודה.
    הערה: קובץ Script זה יפיק קובץ opt_params_all_groups.txt בתיקיה הפולנית RELION-3 המכיל פרמטרי ליטוש ממוטבים הדרושים לביצוע השלב הבא.
  2. לאחר סיום עבודת ההכשרה, לחץ על ליטוש בייסיאני. לחץ על הכרטיסיה הדרכה והגדר את פרמטרים אופטימליים של רכבת? בחר את הכרטיסיה פולנית ובקובץ פרמטר ממוטב ציין את הנתיב לקובץ opt_params_all_groups.txt משלב 9.1. לחץ על הפעל.
  3. חזור על עידון תלת-ממדי (שלב 8.3) ולאחר עיבוד (שלב 8.8) עם קבוצה של חלקיקים מלוטשים.

10. RELION-3 - עידון CTF ולחלקיקים

  1. כדי להעריך סטיות מסדר גבוה יותר, פתח את עידון CTF ובכרטיסיה קלט/פלט תחת חלקיקים, בחר את הנתיב לקובץ ה- .star המכיל חלקיקים מלוטשים ממשימת Refine 3D האחרונה (run_data.star).
    1. תחת קובץ כוכב לאחר עיבוד, הגדר את הנתיב לפלט ממשימת הפוסט-עיבוד האחרונה (שלב 9.3).
    2. בחר בכרטיסיה התאמה והגדר את הפרמטרים הבאים: הערכה (הגדלה אניסוטרופית): לא, בצע התאמת פרמטר CTF? לא, הערכת Beamtilt: כן, גם להעריך Trefoil? כן, הערכה של צו 4? כן. תנהל את העבודה.
  2. חזור על שלב 10.1 באמצעות חלקיקי קלט (מתוך Refine3D) שנוצרו במשימה הקודמת (particles_ctf_refine.star). בכרטיסיה התאמה , שנה את הערכה (הגדלה אניסוטרופית) ל'כן ' והפעל את המשימה.
  3. חזור על שלב 10.2 באמצעות חלקיקי קלט (מתוך Refine3D) המיוצרים במשימה הקודמת (particles_ctf_refine.star). בכרטיסיה התאמה, הגדר את הפרמטרים הבאים: הערכה (הגדלה אניסוטרופית): לא, בצע התאמת פרמטר CTF?: כן, התאם Defocus?: לכל חלקיק, התאם אסטיגמציה? לכל מיקרוגרף, Fit B-factor?: לא, התאמה שלב-Shift: לא, הערכת Beamtilt?: לא, הערכה סטיות סדר 4?: לא. להפעיל אותו.
    הערה: בהתחשב בכך שלחלקיק יש ניגודיות מספקת, ניתן להגדיר את הכרטיסייה Fit Astigmatism ל- Per-particle. עבור ערכת נתונים זו, עידון אסטיגמציה לכל חלקיק לא שיפר את האיכות והרזולוציה של המפה.
  4. חזור על עידון תלת-ממדי עם החלקיקים משלב 10.3 ובכרטיסיית הקלט/פלט, הגדר את האפשרות השתמש ב- FSCs משטחי ממסים? לאחר סיום הריצה, בצע משימת לאחר העיבוד (שלב 8.8) ובחן את המפה בכימרה של UCSF (שלב 5.2).

11. העברת קואורדינטות חלקיקים RELION-3 ומפה תלת-ממדית ל- Scipion 3

  1. כדי למקד ולאמת עוד יותר את מפת RELION-3, תחילה ייבא את אמצעי האחסון והחלקיקים ממשימת הפוסט-עיבוד האחרונה (שלב 10.4) ל- Scipion 3. הפעל Scipion 3 וליצור פרויקט חדש.
  2. בחלונית 'פרוטוקולים' מימין, בחרו ברשימה הנפתחת 'יבוא' ולחצו על 'ייבוא חלקיקים'. שנה את הפרמטרים הבאים: ייבוא מ: RELION-3, קובץ כוכב: postprocess.star, וציין פרמטרי רכישה כמו בשלב 1.3. לחץ על בצע.
  3. לחץ על הרשימה הנפתחת פעולות ייבוא ובחר ייבוא אמצעי אחסון. תחת ייבוא מ לתת את הנתיב למפת RELION-3. שנה גודל פיקסל (קצב דגימה) Å/px ל- 1.045 ובצע.

12. Scipion 3 - עידון ברזולוציה גבוהה

  1. תחילה, בצע יישור כללי. בחרו ברשימה הנפתחת 'מקד' בחלונית 'פרוטוקולים' ולחצו על Xmipp3 - highres24. הזן את החלקיקים והנפחים המיובאים משלבים 11.2 ו- 11.3 כתמונות בגודל מלא וכרכי אחסון ראשוניים, בהתאמה והגדר את קבוצת הסימטריה לאיקוסהדרל. בכרטיסיה יישור תמונה תחת הקצאה זוויתית, בחר כללי והגדר את רזולוציית היעד המרבית ל- 3 Å והפעל את המשימה.
  2. לאחר סיום המשימה, לחץ על נתח תוצאות. בחלון החדש, לחץ על סמל כימרה UCSF כדי לבחון את אמצעי האחסון המעודן. בנוסף, לחץ על התוויות רזולוציית תצוגה (FSC) כדי לראות כיצד ה- FSC השתנה לאחר הזיכוך, כמו גם התווה היסטוגרמה עם שינויים זוויתיים כדי לראות אם הקצאות הזווית של אוילר השתנו.
    הערה: בהתאם לרזולוציה של מבנה RELION-3 הקלט, שלב זה עשוי לחזור על עצמו מספר פעמים עם ערכים שונים שהוגדרו עבור רזולוציית היעד המרבית תחת הכרטיסיה הקצאה זוויתית . לקבלת מידע נוסף, עיין בערכת הלימוד של Scipion25.
  3. חזור על שלב 12.1 עם יישור מקומי. העתק את המשימה הקודמת ושנה את האפשרות בחר הפעלה קודמת ל - Xmipp3 - highres Global. בכרטיסיה הקצאה זוויתית , שנה את יישור תמונה למקומי. הגדר את רזולוציית היעד המרבית ל- 2.1 Å.
  4. בחן את המפה המעודנת בכימרה של UCSF וניתח את השינוי במשימות FSC וזוויתיות (שלב 12.2). חזור על עידון מקומי עד שהרזולוציה לא תשתפר וההקצאות הזוויתיות יתכנסו, תוך התאמת רזולוציית היעד המרבית לפי הצורך.
  5. מפת הפלט מ Scipion 3 ניתן לשנות בנוסף צפיפות ולחדד Phenix26.

13. סיפיון 3 - אימות מפה

  1. בחן את הרזולוציה המקומית של המפה הסופית שנוצרה ב- Xmipp3 - highres. פתח את Xmipp - MonoRes27 המקומי והזן את אמצעי האחסון הסופי מהמשימה והמסכה הקודמת שנוצרו בשלב 8.6. הגדר טווח רזולוציה מ- 1 עד 6 Å עם מרווח זמן של 0.1 Å ובצע את המשימה.
  2. בסיום הריצה, לחץ על ניתוח תוצאות ובחן את היסטוגרמה הרזולוציה ופרוסות עוצמת הקול הצבעוניות ברזולוציה.
  3. כדי לראות אם החלקיקים מיושרים היטב, פתח את Alignability Multireference28 והזן את החלקיקים והנפח משלב 12.3. לחץ על נתח תוצאות כדי להציג את התוויית האימות. באופן אידיאלי, כל הנקודות צריכות להיות מקובצות סביב (1.0,1.0).
  4. Open Xmipp3 - אמת התאמה יתר. הזן את החלקיקים והנפחים משלב 12.3. לאחר סיום ההפעלה, נתח את התוצאות ובדוק את התוויית ההתאמה יתר על המידה. חציית רעש גאוס מיושר ועקומות חלקיקים מיושרים מצביעה על התאמה יתר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הצגנו צינור ספא מקיף כדי לקבל מבנה ברזולוציה גבוהה באמצעות שלוש פלטפורמות עיבוד שונות: cryoSPARC v3, RELION-3, ו Scipion 3. איור 1 ואיור 4 מסכמים את זרימת העבודה הכללית של העיבוד, וטבלה 1 מפרטת פרוטוקולי עידון. פרוטוקולים אלה שימשו במהלך עידון של מבנה 2.3 Å של AAV, השגת ליד רזולוציה Nyquist.

סרטים יובאו תחילה ל- cryoSPARC v3 ולאחר מכן תוקנו בתנועה וב-CTF כדי ליצור מיקרוגרפים ממוצעים. בעת בחירת מיקרוגרפים לעיבוד נוסף, חשוב לבחור את בעלי ההתאמה ל-CTF טובה ואסטיגמציה נמוכה (איור 2), שכן הכללת מיקרוגרפים באיכות ירודה עלולה לעכב שלבי עיבוד מאוחרים יותר, וכתוצאה מכך שחזור ברזולוציה נמוכה יותר. 27,364 חלקיקים נאספו וחולצו מהמיקרוגרפים שנבחרו. מכיוון שהקוטר של ה- AAV הוא כ- 220 Å וגודל הפיקסלים הוא 1.045 Å, נעשה שימוש בגודל תיבה של 300 px. לאחר מכן, סיווג דו-ממדי איטרטיבי שימש להסרת חפצים וחלקיקים שאינם מתכנסים למחלקות יציבות. דוגמאות לממוצעי מחלקה דו-ממדיים שנבחרו ולא נכללו מוצגות באיור 3. חשוב גם לציין כי ממוצעי הכיתה המשקפים קונפורמציות שונות של הדגימה צריכים להיות מעודנים בנפרד כדי להניב שחזורים תלת-ממדיים מרובים. במקרה כזה, יש לחשב כרכים התחלתיים מרובים של ab initio . כאן, 26,741 חלקיקים נבחרו ושימשו למידול ab initio ועידון הומוגני של מבנה יחיד של 2.9 Å.

לאחר העברת קואורדינטות של חלקיקים שנקטפו ב- cryoSPARC v3 ל- RELION-3, ביצענו ארבעה סבבים נוספים של סיווג דו-ממדי עד שערכת הנתונים התכנסה למחלקות דו-ממדיות יציבות. הסיווג הדו-ממדי המתואר לעיל הסיר 3,154 חלקיקים נוספים מערכת הנתונים. באמצעות המבנה שנוצר cryoSPARC v3 כמודל ראשוני, עידון 3D ב RELION-3 הפיק מבנה עם רזולוציה כמעט שווה של 2.95 Å. שיפורים מבניים מאוחרים יותר, שכללו תיקון תנועה לכל חלקיקים ושיפורים של CTF, הגדילו את הרזולוציה ל-2.61 Å. רשימה מלאה של שיפורים שביצענו מוצגת בטבלה 1. אמצעי האחסון המחושב ב- RELION-3 שוכלל עוד יותר ב- Scipion 3 באמצעות סיבובים מרובים של עידון ברזולוציה גבוהה (Xmipp3 - highres). במהלך סבבי הזיכוך הבאים, 3,186 חלקיקים נוספים הוסרו מערכת הנתונים, וכתוצאה מכך נוצרה קבוצה סופית של 20,401 חלקיקים, שיצרו שחזור של 2.3 Å של AAV (איור 5 ואיור 6). לכן, בהתחשב בגודל הפיקסלים של 1.045 Å, השיפורים שלנו כמעט הגיעו לגבול הנייקוויסט. עקומות FSC המייצגות מבנים שחושבו באמצעות כל תוכנית מוצגות באיור 6. עקומות FSC אלה מציינות את הרזולוציה גדלה לאורך זרימת העבודה. מאחר שהרזולוציה עשויה להשתנות מנקודה לנקודה במפה, לעתים קרובות מתאים יותר להציג את ההתפלגות של אומדני רזולוציה מקומיים במפה במקום לדווח על הערכת רזולוציה אחת בהתאם לקריטריון יחיד (לדוגמה, 0.143 קריטריון) מעקומת FSC. לכן, ביצענו ניתוח כזה באמצעות Xmipp - MonoRes ב Scipion 3. איור 7 מציג השוואה של אומדני רזולוציה מקומיים עבור מפות שהושגו עם cryoSPARC v3 ו- Scipion 3. הערכות רזולוציה בארבע פרוסות שונות דרך המבנים (איור 7A,B) והיסטוגרמה ברזולוציה (איור 7C) ממחישות בבירור את השיפור המצטבר ברזולוציה המקומית בין המפות לאורך כל זרימת העבודה. עקומת ה- FSC המחושבת באמצעות התוכנית Xmipp3 - שיאים ב- Scipion 3 מציינים כי מגבלת Nyquist הושגה (איור 6), דבר המצביע על הערכת הרזולוציה מוגבלת מאוד על ידי דגימה נמוכה29. עם זאת, ניתוח MonoRes שהוצג באיור 7C, יחד עם ניתוח מדוקדק של מפת EM ומפה התואמים לקואורדינטות אטומיות של AAV (איור 5) מצביעים על כך שהערכת רזולוציה נאותה יותר למפה היא 2.3 Å. אסטרטגיה דומה המיישבת את הערכות הרזולוציה של FSC ו- MonoRes הוצגה מוקדם יותר 24,25. מכיוון שהערכות רזולוציה יכולות להיות מושפעות מהמסיכה המשמשת במהלך שלבי עידון, חשוב לוודא שהמסיכה אינה שוללת חלק כלשהו מהצפיפות. המסכה המשמשת במחקר זה החופפת לשחזורים התלת-ממדיים מוצגת באיור 7D. העלייה ההדרגתית ברזולוציה בזרימת העבודה המוצגת מדגישה את היתרון של שימוש באלגוריתמים מחבילות תוכנות ספא מרובות כדי להשיג שחזור תלת-ממדי באיכות גבוהה וברזולוציה גבוהה.

בניית מודל In-situ או התאמת המפה עם מודל אטומי קיים מראש יכול לשמש בדיקת איכות עבור המבנה המחושב. דמיינו את המפה הסופית בכימרה UCSF והתקמנו את המפה עם מודל אטומי שפורסם בעבר (PDB ID: 7kfr)30. איור 5 מציג אזורים במפת ההקפאה-EM המצוידים בקואורדינטות אטומיות של AAV. צפיפות אלקטרומגנטית מוגדרת היטב מאפשרת התאמת שרשראות צד של חומצות אמינו בודדות, מולקולות מים ויוני מגנזיום ומאשרת את הסכמת מפת ההקפאה-EM עם המודל האטומי.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה מלאה של SPA ברחבי cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 ו- Phenix 1.18. שלבים שהושלמו ב- cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 ו- Phenix 1.18 מסומנים בקופסאות סגולות, כתומות, ירוקות ואפורות, בהתאמה. הזמן הדרוש להשלמת כל שלב באמצעות שרת העיבוד המצויד ב-8 מעבדים גרפיים, 40 מעבדים ו-750 GB של זיכרון RAM מצוין בכל תיבה בודדת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בחירת מיקרוגרפים לעיבוד במורד הזרם בהקפאהSPARC v3. (A) מיקרוגרפים עם טבעות תון משוערות וניסיוניות תואמות היטב שימשו לעיבוד נוסף, ואילו אלה עם אסטיגמציה גבוהה וכושר לקוי (B) הושלכו. מיקרוגרפים עם CTF-fit מעל 5 Å, אסטיגמציה מעל 400 Å, ועובי קרח יחסי מתחת 2 הוסרו מעיבוד נוסף, כלומר, 70/395 מיקרוגרפים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בחירת מחלקות דו-ממדיות. ממוצעי מחלקות דו-ממדיים המכילים מחלקות מוגדרות היטב נבחרים (A), ואלה עם רזולוציה נמוכה, רעש וחלקיקים חלקיים נדחים (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זרימת עבודה ותוצאות מייצגות לעיבוד AAV ברחבי cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3. השלבים שהושלמו בהקפאת ה- cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3 מסומנים בחצים סגולים, כתומים וירוקים, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מבנה ברזולוציה גבוהה של AAV מציג צפיפות EM מוגדרת היטב המייצגת אלמנטים שונים של מבנה משני ושרשראות צד בודדות של חומצות אמינו. (א) מפה סופית של AAV. (B) חלק מהמפה המייצג גליונות ביתא המצוידים בקואורדינטות אטומיות של AAV (מזהה PDB: 7kfr)30. (ג) מיפוי צפיפות המייצגת חומצות אמינו בודדות. משמאל לימין: ארגינין, פנילאלנין וטיפטופן. (D) תכונות ברזולוציה גבוהה של המפה כוללות מולקולות מים המוצגות ביונים אדומים ומגנזיום המוצגים ככדורים ירוקים. Mg2 + יון המוצג באיור מתואם על ידי היסטידין (משמאל) ושאריות ארגינין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: עקומות FSC מ-cryoSPARC v3, RELION-3 ו-Scipion 3 מראות רזולוציה הולכת וגוברת בזרימת העבודה. בעוד עקומת FSC מחושב באמצעות התוכנית Xmipp3 - גבוהים ב Scipion 3 מציין את מגבלת Nyquist כבר הגיע, מה שמרמז על הערכת הרזולוציה מוגבלת על ידי undersampling29, ניתוח הולם יותר של רזולוציית המפה מוצג באיור 7 ונדון בסעיף תוצאות נציגות 24,25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: אימות השחזור הסופי ב-Scipion 3 באמצעות Xmipp - MonoRes. רזולוציית המפה מתוארת טוב יותר על-ידי הצגת התפלגות רזולוציה מקומית ולא על-ידי הערכת רזולוציה אחת על-פי קריטריון יחיד מעקומת FSC. (א-ב) לוחות A ו- B מציגים פרוסות שונות ממפות שנוצרו ב- cryoSPARC v3 ו- Scipion 3, בהתאמה. (ג) היסטוגרמה המדגימה עלייה שיטתית ברזולוציה המקומית עבור מפות המחושב ב- cryoSPARC v3 (פסים ורודים) ו- Scipion 3 (פסים כחולים). (D) המסיכה (אפורה) המשמשת לחישובי רזולוציה מקומיים מכילה את כל חלקי דחיסות AAV המעודנות בשתי התוכניות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תוכנית סוג עידון סקריפט
cryoSPARC v3 עידון הומוגני עידון הומוגני
עידון לא אחיד עידון לא אחיד
עידון הטרוגניים עידון הטרוגניים
תיקון תנועה לכל חלקיק תיקון תנועה מקומית
RELION-3 עידון תלת-ממדי מקד תלת-ממד
לאחר עיבוד - חידוד גורם B, תיקון MTF מקד תלת-ממד
ליטוש חלקיקים ליטוש בייסיאני
עידון CTF - הטיית קרן CtfRefine
עידון CTF - הגדלה אניסוטרופית CtfRefine
עידון CTF - דפוקוס לכל חלקיק, אסטיגמציה לכל חלקיק/מיקרוגרף CtfRefine
תיקון עקמומיות כדור אוואלד Relion_reconstruct
סיפיון 3 עידון ברזולוציה גבוהה Xmipp3 - highres
פניקס 1.18 שינוי צפיפות וחידוד ResolveCryoEM

טבלה 1: שיפורים המיושמים בזרימת העבודה. השאלה אם שיפורים מסוימים חלים על פרוייקט מסוים תלויה באיכות הנתונים ובפרמטרים של רכישה. לדוגמה, ניתן להחיל את תיקון העקמומיות של כדור אוואלד עבור מפות שכבר יש להן רזולוציה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, אנו מציגים זרימת עבודה חזקה של SPA לעיבוד נתונים Cryo-EM בפלטפורמות תוכנה שונות כדי להשיג שחזורי תלת-ממד ברזולוציה גבוהה (איור 1). זרימת עבודה זו חלה על מגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות. השלבים הבאים של הפרוטוקול מפורטים באיור 4, כולל טרום עיבוד סרט, קטיף וסיווג חלקיקים ושיטות מרובות לעידון מבנה (טבלה 1) ואימות. הוצגו שלבי עיבוד ב- cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3, כמו גם שיטות להעברת נתונים בין חבילות התוכנה. הצגנו את מבני הביניים שהושגו לאורך הפרוטוקול ברזולוציה הולכת וגוברת (איור 4, איור 6 ואיור 7).

בעוד השיטות המתוארות בכתב יד זה יכולות לשמש לקביעת מבנה של חלבונים שונים ומכלולים ביולוגיים, חשוב לציין כי AAV הוא מועמד אידיאלי לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי cryo-EM ו- SPA, שכן גודלו הגדול מייצר ניגודיות גבוהה במיקרוסקופ וסימטריה איקוסהדרלית מניבה חלקיקים עם יתירות תת-יחידה פי 60. קבלת שחזורים ברזולוציה גבוהה הופכת לקשה יותר ויותר עבור דגימות קטנות (כלומר, פחות מ-100 kD), דינמיות והטרוגניות. על מנת לבצע פרוטוקול זה בהצלחה, זה קריטי כי סרטים באיכות גבוהה רבים נאספים לעיבוד. עם נתונים גולמיים באיכות ירודה, קבלת רזולוציה גבוהה ושחזור באיכות גבוהה אינה אפשרית. לדוגמה, אם עובי הקרח אינו אופטימלי לקביעת מבנה או אם חלקיקים דבקים בממשק מי הקרח או מציגים אוריינטציות מועדפות, בקרו שוב בתנאי הקפאת הרשת.

שלב חשוב נוסף בזרימת העבודה הוא איסוף וחילוץ חלקיקים. במהלך קטיף החלקיקים, גודל התיבה צריך להיות גדול בערך פי 1.4-2.5 מהציר הארוך ביותר של החלקיק, מכיוון שנדרש גודל תיבה מספיק כדי ללכוד מידע ברזולוציה גבוהה הפרוס עקב דפוקוס. גדלי תיבות גדולים יותר, עם זאת, דורשים זמני עיבוד ארוכים יותר בשל הגודל המוגדל של קבצים שנוצרו במהלך חילוץ חלקיקים. בעת בחירת גודל תיבה, שקול קוטר חלקיקים וגודל פיקסל. עם חלקיקים רבים, המשתמש עשוי לרצות סל חלקיקים במהלך החילוץ לעיבוד ראשוני ולאחר מכן לחלץ מחדש חלקיקים בגודל מלא עבור עידונים סופיים. פרוטוקול זה משתמש באיסוף חלקיקים ידני כדי ליצור תבניות לבחירה אוטומטית. עם זאת, cryoSPARC v3 מציע גם שיטות קטיף אוטומטיות לחלוטין, כולל בורר מבוסס כתמים ועטיפת טופז, המשתמשת בלמידה עמוקה כדי לבחור חלקיקים על סמך בחירות קודמות. בעוד אלגוריתמים אלה הם חזקים מאוד, מספר משמעותי של בחירות יהיה צורך להסיר מאוחר יותר על ידי סיווג 2D ותלת-ממד.

צעדים קריטיים כוללים גם סיווג דו-ממדי ותלת-ממדי המשמש להסרת חפצים, כגון חלקיקים פגועי קרינה וצורות מבניות שונות נפרדות של הדגימה הקיימת במדגם, בהתאמה. מספר המחלקות הדו-ממדיות שנקבעו על ידי המשתמש צריך להיות תלוי במספר החלקיקים המופקים ממיקרוגרפים, ניגודיות והטרוגניות בדגימה, שכן המטרה היא להפריד כל תצוגה בודדת של החלקיק למחלקה דו-ממדית נפרדת. ככלל, הוסף מחלקה דו-ממדית עבור כל 100 חלקיקים, ואם עיבוד מדגם חדש עם מספר רב של חלקיקים, 100 מחלקות הן נקודת התחלה טובה. אם מתקבלת רזולוציה נמוכה או בינונית גם לאחר סבבים רבים של סיווג דו-ממדי ותלת-ממדי, נסה לחלץ מחדש חלקיקים עם גודל תיבה גדול יותר כדי לראות אם ניתן להשיג מידע מבני נוסף. בעת דיווח על ההחלטה של השחזור הסופי, יש לנתח את עקומת FSC המתקבלת על פי שיטת תקן הזהב, יחד עם הערכות ההחלטה המקומית ובדיקה מדוקדקת של צפיפות המפה, כמו גם את הסכמתם עם המודל האטומי.

עבור עידונים של מבני הנגיף, תיקון עקמומיות כדור Ewald מיושם RELION-3 הפגין שיפורים ברזולוציה גבוהה31. אם מעדנים מבנים של מתחמי מולטי-פרוטאין דינמיים, נסו עידון רב-גוף תלת-ממדי המיושם ב-RELION-3 או בסיווג ממוקד עם חיסור תמונה המיושם ב-RELION-3 וב-cryoSPARC v3. אם הטרוגניות לא ניתן לפתור חישובית, יש צורך לבקר מחדש את תנאי הכנת מדגם32. טוהר לא מספיק או הכנה לקויה וכתוצאה מכך ירידה בחלבון יפגע באיכות של שחזור 3D. בנוסף, תנאי חיץ המערערים חלבונים או מקדמים צבירה מגבילים מאוד את מספר החלקיקים המוגדרים היטב שניתן להשתמש בהם לחישוב מבנה. לכן, כדי לנצל בצורה היעילה ביותר את השיטות המוצגות כאן, חובה לזהות תנאים אופטימליים ליציבות המדגם. אנו ממליצים על מיקרוסקופיית אלקטרונים מכתימה שלילית כדי לסנן את הדגימות לפני cryo-EM.

כמו cryo-EM הפך לשיטה המועדפת לקביעת מבנה 3D עבור מספר גדל והולך של ביולוגים מבניים, הצורך בזרימת עבודה אינטגרטיבית וחזקה לעיבוד תמונה וקביעת מבנה הופך ברור יותר. CryoSPARC מציע ממשק משתמש גרפי (GUI) מבוסס אינטרנט וקל לשימוש המאפשר למשתמשים בכל רמות הניסיון לעבד נתונים במהירות ולחשב מבנה תלת-ממדי. ראוי לציין, CryoSPARC משתמש בירידה הדרגתית סטוכסטית כדי לבצע שחזור 3D ab initio. יתר על כן, התוכנה משתמשת באלגוריתם אופטימיזציה של סניף וסבירות מאוגדת עבור עידון מהיר של מפת תלת-ממד7. צינור העיבוד המתואר במאמר זה משתמש ב- cryoSPARC v3 כדי להניב מפה תלת-ממדית ראשונית. השחזור התלת-ממדי מעודן לאחר מכן ב- RELION-3, חבילה פופולרית המשתמשת בגישה בייסית אמפירית כדי להעריך פרמטרים קריטיים בהתבסס על ערכת הנתונים של המשתמש, ובכך להפחית את הצורך בידע מומחה לפעולת תוכנית10. באופן ספציפי, אנו משתמשים בליטוש בייסיאני לתיקון תנועה לכל חלקיקים ושיפורים של CTF כדי לשפר את הרזולוציה. לבסוף, המבנה המתקבל מעודן ומאומת עוד יותר ב- Scipion 311, מעטפת פייתון אינטגרטיבית התומכת באלגוריתמים מפלטפורמות מרובות, כולל Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 ואחרות. בעוד שחבילות תוכנה רבות ושונות זמינות למשתמשי Cryo-EM, אין כיום פלטפורמת ספא אוניברסלית המקובלת על התחום. למרות שניתן לבצע את זרימת העבודה של SPA במלואה בכל אחת משלוש חבילות התוכנה המתוארות במאמר זה, אלגוריתמים שונים עשויים להניב תוצאות שונות. כתוצאה מכך, יש להתאים אישית שלבים בודדים בהתאם לדגימה ולאיכות הנתונים. לדוגמה, עבור ערכת הנתונים הנוכחית, 3Drefine ב RELION-3 הגדיל את הרזולוציה של שחזור 3D, בעוד עידון Nonuniform ב cryoSPARC v3 הוביל לירידה קלה ברזולוציה. לכן, זה מועיל מאוד לנצל מגוון רחב של תוכניות כדי לחשב מחדש מבנים כדי להשיג איכות ורזולוציה אופטימלית כדי להקל על אימות של השחזורים. אמנם, Scipion 3 מכיל אלגוריתמים רבים של cryoSPARC v3 ו RELION-3, היישומים האחרונים של תוכניות אלה אינם זמינים באופן מיידי ב- Scipion. לדוגמה, מבין התוכניות המשמשות בכתב יד זה, רק RELION-3 מציע תיקון עקמומיות כדור Ewald באמצעות Relion_reconstruct התסריט. הצינור המוצג במאמר זה מספק מדריך למשתמשים חדשים ומנוסים להשתמש בהצלחה באלגוריתמים המיושמים ב- cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3 כדי לחשב מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה כמעט אטומית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לקרלוס אוסקר סורזאנו על העזרה בהתקנת Scipion3 וקיליאן שנלה וארנה מולר על העזרה בהעברת נתונים בין פלטפורמות עיבוד שונות. חלק ממחקר זה נתמך על ידי מענק NIH U24GM129547 ובוצע ב- PNCC ב- OHSU ונגיש באמצעות EMSL (רשת.436923.9), משרד DOE של מתקן משתמש מדע בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי. מחקר זה נתמך על ידי מענק סטארט-אפ מאוניברסיטת ראטגרס לארק קולצ'יק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Tags

ביוכימיה גיליון 179 מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון קריו-EM ניתוח חלקיקים בודדים SPA cryoSPARC RELION Scipion עיבוד תמונה חישוב מבנה AAV
תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter