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Biochemistry

एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

यह आलेख वर्णन करता है कि तीन क्रायो-ईएम प्रसंस्करण प्लेटफ़ॉर्म, यानी, क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 का प्रभावी ढंग से उपयोग कैसे करें, उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए विभिन्न प्रकार के एकल-कण डेटा सेट पर लागू एकल और मजबूत वर्कफ़्लो बनाने के लिए।

Abstract

इंस्ट्रूमेंटेशन और इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर दोनों में हाल की प्रगति ने एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को संरचनात्मक जीवविज्ञानियों के लिए पसंदीदा विधि बना दिया है ताकि मैक्रोमोलेक्यूल्स की एक विस्तृत विविधता की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को निर्धारित किया जा सके। छवि प्रसंस्करण और संरचना गणना के लिए नए और विशेषज्ञ उपयोगकर्ताओं के लिए कई सॉफ़्टवेयर सुइट्स उपलब्ध हैं, जो एक ही मूल वर्कफ़्लो को सुव्यवस्थित करते हैं: माइक्रोस्कोप डिटेक्टरों द्वारा अधिग्रहित फिल्में बीम-प्रेरित गति और कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) अनुमान के लिए सुधार से गुजरती हैं। इसके बाद, कण छवियों का चयन किया जाता है और पुनरावर्ती 2 डी और 3 डी वर्गीकरण के लिए औसत फिल्म फ्रेम से निकाला जाता है, इसके बाद 3 डी पुनर्निर्माण, शोधन और सत्यापन होता है। क्योंकि विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेज विभिन्न एल्गोरिदम को नियोजित करते हैं और संचालित करने के लिए विशेषज्ञता के विभिन्न स्तरों की आवश्यकता होती है, इसलिए वे जो 3 डी मानचित्र उत्पन्न करते हैं, वे अक्सर गुणवत्ता और संकल्प में भिन्न होते हैं। इस प्रकार, उपयोगकर्ता नियमित रूप से इष्टतम परिणामों के लिए विभिन्न प्रकार के कार्यक्रमों के बीच डेटा स्थानांतरित करते हैं। यह पेपर उपयोगकर्ताओं को लोकप्रिय सॉफ़्टवेयर पैकेजों में वर्कफ़्लो नेविगेट करने के लिए एक मार्गदर्शिका प्रदान करता है: adeno-संबद्ध वायरस (AAV) की निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करने के लिए क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3। हम पहले क्रायोस्पार्क वी 3 के साथ एक छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन का विस्तार करते हैं, क्योंकि इसके कुशल एल्गोरिदम और उपयोग में आसान जीयूआई उपयोगकर्ताओं को जल्दी से 3 डी मानचित्र पर पहुंचने की अनुमति देता है। अगले चरण में, हम PyEM और इन-हाउस लिपियों का उपयोग करने के लिए परिवर्तित करने के लिए और cryoSPARC v3 में प्राप्त सबसे अच्छी गुणवत्ता 3 डी पुनर्निर्माण से कण निर्देशांक स्थानांतरित करने के लिए RELION-3 और Scipion 3 और Scipion 3 और recalculate 3 डी नक्शे. अंत में, हम RELION-3 और Scipion 3 से एल्गोरिदम को एकीकृत करके परिणामी संरचनाओं के आगे शोधन और सत्यापन के लिए चरणों की रूपरेखा तैयार करते हैं। इस आलेख में, हम वर्णन करते हैं कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए विभिन्न प्रकार के डेटा सेट पर लागू एकल और मजबूत वर्कफ़्लो बनाने के लिए तीन प्रसंस्करण प्लेटफ़ॉर्म का प्रभावी ढंग से उपयोग कैसे करें.

Introduction

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) और एकल-कण विश्लेषण (एसपीए) अपने हाइड्रेटेड राज्य में विभिन्न प्रकार के बायोमोलेक्यूलर असेंबली की संरचना निर्धारण को सक्षम करते हैं, जिससे परमाणु विस्तार में इन मैक्रोमोलेक्यूल्स की भूमिकाओं को रोशन करने में मदद मिलती है। माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स, कंप्यूटर हार्डवेयर और छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में सुधार ने 2 Å1,2,3 से परे तक पहुंचने वाले रिज़ॉल्यूशन पर बायोमोलेक्यूल्स की संरचनाओं को निर्धारित करना संभव बना दिया है। 20144 में 192 संरचनाओं की तुलना में 2020 में प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में 2,300 से अधिक क्रायो-ईएम संरचनाएं जमा की गई थीं, जो यह दर्शाती हैं कि क्रायो-ईएम कई संरचनात्मक जीवविज्ञानियों के लिए पसंद की विधि बन गई है। यहां, हम उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण (चित्रा 1) के लिए तीन अलग-अलग एसपीए कार्यक्रमों के संयोजन वाले वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं।

एसपीए का लक्ष्य एक माइक्रोस्कोप डिटेक्टर द्वारा दर्ज शोर 2 डी छवियों से एक लक्ष्य नमूने के 3 डी वॉल्यूम का पुनर्निर्माण करना है। डिटेक्टरों को देखने के एक ही क्षेत्र के व्यक्तिगत फ्रेम के साथ फिल्मों के रूप में छवियों को इकट्ठा करते हैं। नमूने को संरक्षित करने के लिए, फ्रेम को कम इलेक्ट्रॉन खुराक के साथ एकत्र किया जाता है और इस प्रकार एक खराब सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) होता है। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रॉन एक्सपोजर विट्रिफाइड क्रायो-ईएम ग्रिड के भीतर गति को प्रेरित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि-धुंधला हो जाती है। इन मुद्दों को दूर करने के लिए, फ्रेम को बीम-प्रेरित गति के लिए सही करने के लिए संरेखित किया जाता है और एक बढ़े हुए एसएनआर के साथ एक माइक्रोग्राफ उत्पन्न करने के लिए औसत किया जाता है। ये माइक्रोग्राफ तब माइक्रोस्कोप द्वारा लगाए गए डिफोकस और विपथन के प्रभावों के लिए खाते में कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) अनुमान से गुजरते हैं। सीटीएफ-सही माइक्रोग्राफ से, व्यक्तिगत कणों का चयन किया जाता है, निकाला जाता है, और 2 डी वर्ग के औसत में क्रमबद्ध किया जाता है जो विट्रियस बर्फ में नमूने द्वारा अपनाए गए विभिन्न झुकावों का प्रतिनिधित्व करता है। कणों के परिणामी सजातीय सेट का उपयोग एक मोटे मॉडल या मॉडल उत्पन्न करने के लिए एब इनिशियो 3 डी पुनर्निर्माण के लिए इनपुट के रूप में किया जाता है, जो तब एक या अधिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए पुनरावर्ती रूप से परिष्कृत होते हैं। पुनर्निर्माण के बाद, क्रायो-ईएम मानचित्र की गुणवत्ता और संकल्प में और सुधार करने के लिए संरचनात्मक शोधन किए जाते हैं। अंत में, या तो एक परमाणु मॉडल सीधे नक्शे से व्युत्पन्न होता है, या मानचित्र को कहीं और प्राप्त परमाणु निर्देशांक के साथ फिट किया जाता है।

विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेज ऊपर उल्लिखित कार्यों को पूरा करने के लिए उपलब्ध हैं, जिनमें Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13, और अन्य शामिल हैं। जबकि ये कार्यक्रम समान प्रसंस्करण चरणों का पालन करते हैं, वे विभिन्न एल्गोरिदम को नियोजित करते हैं, उदाहरण के लिए, कणों को चुनने, प्रारंभिक मॉडल उत्पन्न करने और पुनर्निर्माण को परिष्कृत करने के लिए। इसके अतिरिक्त, इन कार्यक्रमों को संचालित करने के लिए उपयोगकर्ता ज्ञान और हस्तक्षेप के एक अलग स्तर की आवश्यकता होती है, क्योंकि कुछ पैरामीटर की ठीक-ट्यूनिंग पर निर्भर करते हैं जो नए उपयोगकर्ताओं के लिए बाधा के रूप में कार्य कर सकते हैं। इन विसंगतियों के परिणामस्वरूप अक्सर प्लेटफ़ॉर्म 14 में असंगत गुणवत्ता और रिज़ॉल्यूशन के साथ नक्शे होते हैं, जिससे कई शोधकर्ताओं को परिणामों को परिष्कृत और मान्य करने के लिए कई सॉफ़्टवेयर पैकेजों का उपयोग करने के लिए प्रेरित किया जाता है। इस लेख में, हम क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 के उपयोग को उजागर करते हैं ताकि AAV के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 D पुनर्निर्माण को प्राप्त किया जा सके, जो जीन थेरेपी 15 के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला वेक्टर है। उपर्युक्त सॉफ़्टवेयर पैकेज अकादमिक उपयोगकर्ताओं के लिए स्वतंत्र हैं; क्रायोस्पार्क v3 और Scipion 3 को लाइसेंस की आवश्यकता होती है।

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Protocol

1. एक नया क्रायोस्पार्क v3 परियोजना बनाना और डेटा आयात करना

नोट: पोर्टलैंड में ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी (OHSU) में एक फाल्कन 3 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से सुसज्जित 300 केवी टाइटन क्रिओस इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डेटा का अधिग्रहण किया गया था। छवियों को 28.38 e−/Å2 की कुल खुराक के साथ एक गिनती मोड में एकत्र किया गया था, जो 129 फ्रेम में भिन्न था, और ईपीयू का उपयोग करके 1.045 Å के पिक्सेल आकार पर -0.5 μm से -0.5 μm तक एक डिफोकस रेंज थी। एएवी-डीजे का नमूना ओएचएसयू के कर्मचारियों द्वारा प्रदान किया गया था।

  1. किसी वेब ब्राउज़र में cryoSPARC v3 खोलें और प्रोजेक्ट्स हेडर पर क्लिक करें। एक नया प्रोजेक्ट बनाने के लिए + जोड़ें का चयन करें। तदनुसार परियोजना को शीर्षक दें और किसी मौजूदा निर्देशिका के लिए एक पथ प्रदान करें जहां नौकरियां और डेटा सहेजे जाएंगे।
  2. प्रोजेक्ट खोलकर, + जोड़ें क्लिक करके, और नया कार्यस्थान का चयन करके प्रोजेक्ट के लिए कोई कार्यस्थान बनाएँ. कार्यस्थान को शीर्षक दें और Create पर क्लिक करें।
  3. नए कार्यस्थान पर नेविगेट करें और दाएँ पैनल पर जॉब बिल्डर खोलें. यह टैब क्रायोस्पार्क v3 में उपलब्ध सभी फ़ंक्शंस प्रदर्शित करता है. आयात मूवीज़ पर क्लिक करें और फिल्मों पथ प्रदान करते हैं, संदर्भ फ़ाइल पथ प्राप्त करते हैं, और निम्नानुसार अधिग्रहण पैरामीटर सेट करते हैं: कच्चे पिक्सेल आकार 1.045 Å, त्वरित वोल्टेज 300 kV, गोलाकार विपथन 2.7 मिमी, कुल एक्सपोजर खुराक 28.38 e-/
  4. क्यू पर क्लिक करें, नौकरी और एक कार्यस्थान चलाने के लिए एक लेन का चयन करें, और बनाएँ पर क्लिक करें।
    नोट:: अधिग्रहण पैरामीटर नमूना और माइक्रोस्कोप निर्भर हैं।

2. क्रायोस्पार्क v3 - फिल्म संरेखण और सीटीएफ अनुमान

  1. खुला पैच मोशन सुधार (मल्टी). इस कार्य के लिए चरण 1.3 में इनपुट के रूप में आयात की गई चलचित्रों की आवश्यकता होती है. कार्यस्थान में आयात चलचित्र जॉब कार्ड खोलें और Imported_movies आउटपुट को नए कार्य पर चलचित्र प्लेसहोल्डर पर खींचें. कार्य को पंक्तिबद्ध करें.
    नोट:: इस आलेख में उल्लिखित cryoSPARC विधियों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, cryoSPARC tutorial16 देखें।
  2. CTF अनुमान निष्पादित करने के लिए, पैच CTF अनुमान (बहु) खोलें। चरण 2.1 में उत्पन्न माइक्रोग्राफ इनपुट करें और कार्य को पंक्तिबद्ध करें.
  3. औसत और सीटीएफ-सही माइक्रोग्राफ का निरीक्षण करने के लिए और आगे के प्रसंस्करण के लिए एक सबसेट का चयन करने के लिए, क्यूरेट एक्सपोज़र खोलें और चरण 2.2 में प्राप्त एक्सपोज़र को इनपुट करें। कार्य को पंक्तिबद्ध करें.
  4. कार्य प्रतीक्षा मोड में प्रवेश करने के बाद, जॉब कार्ड पर इंटरैक्शन टैब पर क्लिक करें, पैरामीटर थ्रेशोल्ड समायोजित करें, और आगे की प्रक्रिया के लिए अलग-अलग माइक्रोग्राफ को स्वीकार या अस्वीकार करें। अच्छी तरह से मिलान अनुमानित और प्रयोगात्मक CTFs (चित्रा 2) के साथ माइक्रोग्राफ स्वीकार करें और उच्च अस्थिरता, गरीब सीटीएफ फिट, और मोटी बर्फ के साथ उन लोगों को त्याग दें।
  5. वर्तमान डेटा को संसाधित करते समय, अस्थिरता की ऊपरी सीमा को 400 Å पर सेट करें, CTF 5 Å पर रिज़ॉल्यूशन फिट करें, और सापेक्ष बर्फ की मोटाई को 2 पर सेट करें। डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग के लिए माइक्रोग्राफ का चयन करने के लिए Done पर क्लिक करें।

3. क्रायोस्पार्क v3 - मैनुअल और टेम्पलेट-आधारित कण उठा

  1. मैन्युअल पिकर खोलें, चरण 2.4-2.5 से स्वीकृत एक्सपोज़र इनपुट करें, और कार्य को पंक्तिबद्ध करें। इंटरैक्टिव टैब पर क्लिक करें, बॉक्स आकार (px) को 300 पर सेट करें, और कई माइक्रोग्राफ में कुछ सौ कणों पर क्लिक करें और ओवरलैपिंग कणों का चयन करने से बचें। यहां, 29 माइक्रोग्राफ में 340 कणों का चयन किया गया था। समाप्त होने पर, Done Picking पर क्लिक करें! निकालें कणों.
    नोट:: यह प्रोटोकॉल स्वचालित चयन के लिए टेम्पलेट्स जनरेट करने के लिए मैन्युअल कण चयन का उपयोग करता है। हालांकि, अन्य तरीके भी उपलब्ध हैं17.
  2. स्वचालित कण चुनने के लिए टेम्पलेट्स उत्पन्न करने के लिए, 2 डी वर्गीकरण पर क्लिक करें और चरण 3.1 में उत्पन्न कण पिक्स इनपुट करें। 2D कक्षाओं की संख्या को 10 में परिवर्तित करें और कार्य को पंक्तिबद्ध करें.
  3. 2D कक्षाओं का चयन करें खोलें. चरण 3.2 में प्राप्त कणों और वर्ग औसत इनपुट और इंटरैक्टिव टैब पर क्लिक करें। अच्छे एसएनआर के साथ प्रतिनिधि 2 डी कक्षाओं का चयन करें और डन पर क्लिक करें।
    नोट:: वर्ग औसत विभिन्न कण दृश्यों को प्रतिबिंबित करता है। प्रत्येक दृश्य को प्रतिबिंबित करने वाले वर्ग औसत का चयन करें. लक्ष्य स्वचालित पिकिंग के लिए नमूने के विभिन्न विचारों का प्रतिनिधित्व करने वाले अच्छी तरह से परिभाषित टेम्पलेट्स का उत्पादन करना है।
  4. टेम्पलेट पिकर खोलें और चरण 3.3 में चयनित 2D वर्गों और चरण 2.4-2.5 से माइक्रोग्राफ इनपुट करें। कण व्यास (Å) 220 Å करने के लिए सेट करें और काम कतार.
  5. स्वचालित पिक्स का निरीक्षण करने के लिए, चुनें पार्टिकल पिक्स खोलें, चरण 3.4 में उत्पन्न कणों और माइक्रोग्राफ को इनपुट करें, और कार्य को कतारबद्ध करें।
  6. कण पिक्स जॉब कार्ड का चयन करें पर, इंटरैक्टिव टैब पर क्लिक करें और बॉक्स आकार (px) को 300 पर सेट करें. एक व्यक्तिगत माइक्रोग्राफ पर क्लिक करें, लोपास फ़िल्टर को तब तक समायोजित करें जब तक कि कण स्पष्ट रूप से दिखाई न दें, और सामान्यीकृत क्रॉस सहसंबंध (एनसीसी) थ्रेशोल्ड को 0.41 और पावर थ्रेशोल्ड को 54000 और 227300 के बीच सेट करें।
  7. कई माइक्रोग्राफ का निरीक्षण करें और, यदि आवश्यक हो, तो थ्रेसहोल्ड को समायोजित करें जैसे कि अधिकांश कणों को झूठे सकारात्मक को शामिल किए बिना चुना जाता है। समाप्त होने पर, पूर्ण पिकिंग पर क्लिक करें! निकालें कणों.
    नोट: सच्चे कणों में आमतौर पर एक उच्च एनसीसी और पावर स्कोर होता है, यह दर्शाता है कि वे टेम्पलेट के समान हैं और क्रमशः एक उच्च एसएनआर है।
  8. माइक्रोग्राफ से खुला निकालें और चरण 3.7 से माइक्रोग्राफ और कणों इनपुट। निकाले गए बॉक्स आकार (px) को 300 पर सेट करें और कार्य को पंक्तिबद्ध करें.

4. क्रायोस्पार्क v3 - 2 डी वर्गीकरण

  1. 2 डी वर्गीकरण पर क्लिक करें और चरण 3.8 से निकाले गए कणों को इनपुट करें। 50 करने के लिए 2D वर्गों की संख्या सेट करें और कार्य कतार।
  2. आगे की प्रक्रिया के लिए सर्वश्रेष्ठ 2 डी कक्षाओं का चयन करने के लिए, 2 डी कक्षाओं का चयन करें खोलें। चरण 4.1 में प्राप्त कणों और वर्ग औसत इनपुट. इंटरैक्टिव टैब पर क्लिक करें और रिज़ॉल्यूशन और कक्षा में कणों की संख्या के आधार पर 2 डी कक्षाएं चुनें (चित्रा 3)। कलाकृतियों वाली कक्षाओं का चयन न करें। चयन करने के बाद, Done पर क्लिक करें।
    नोट: आमतौर पर, कणों को हटाने के लिए 2 डी वर्गीकरण के कई दौर की आवश्यकता होती है, जो अलग-अलग, अच्छी तरह से परिभाषित वर्गों में अभिसरण नहीं करते हैं। डेटा सेट (चित्रा 3) से ऐसे कणों को हटाने के लिए आवश्यक के रूप में 2 डी वर्गीकरण के कई दौर ों के रूप में चलाएँ।

5. क्रायोस्पार्क v3 - ab-initio पुनर्निर्माण और सजातीय शोधन

  1. एक प्रारंभिक 3 डी वॉल्यूम उत्पन्न करने के लिए, Ab-initio Reconstruction खोलें और चरण 4.2 या अंतिम 2D वर्गीकरण से प्राप्त कणों को इनपुट करें। icosahedral के लिए समरूपता को समायोजित करें। कार्य को पंक्तिबद्ध करें.
    नोट:: समरूपता नमूना निर्भर है और तदनुसार परिवर्तित किया जाना चाहिए। यदि अज्ञात है, तो C1 समरूपता का उपयोग करें।
  2. खुला सजातीय शोधन. चरण 5.1 से मात्रा और 4.2 या अंतिम 2 डी वर्गीकरण से कणों को इनपुट करें। समरूपता परिवर्तित करें और कार्य को पंक्तिबद्ध करें. जब कार्य समाप्त हो जाता है, तो फूरियर शेल सहसंबंध (FSC) वक्र का निरीक्षण करें और UCSF Chimera18 में जांच करने के लिए वॉल्यूम डाउनलोड करें।

6. क्रायोस्पार्क v3 से कण निर्देशांक निर्यात और उन्हें RELION-3 करने के लिए PyEM का उपयोग कर आयात

नोट: कण निर्देशांक प्रत्येक माइक्रोग्राफ में अलग-अलग कणों के स्थान के बारे में जानकारी ले जाते हैं। RELION-3 के लिए कण ढेर के बजाय निर्देशांक का स्थानांतरण शोधन चरणों को चलाने की अनुमति देता है जो अन्यथा उपलब्ध नहीं होगा। उदाहरण के लिए, कण चमकाने के लिए प्रारंभिक फिल्म फ्रेम तक पहुंच की आवश्यकता होती है। इसलिए, क्रायोस्पार्क v3 से RELION-3 तक कण निर्देशांक निर्यात करने से पहले, फिल्में आयात करें और RELION-3 में गति सुधार और CTF अनुमान करें। विवरण के लिए RELION-3 tutorial19 देखें।

  1. RELION-3 परियोजना निर्देशिका के लिए नेविगेट करें और RELION-3 लॉन्च करें।
  2. कार्य-प्रकार ब्राउज़र से आयात खोलें और चरण 1.3 के रूप में चलचित्रों और अधिग्रहण पैरामीटर्स के लिए पथ निर्दिष्ट करें.
  3. गति सुधार करने के लिए, UCSF MotionCor220 का उपयोग RELION-3 GUI के माध्यम से करें, गति सुधार खोलें और UCSF MotionCor2 manual21 के रूप में डिफ़ॉल्ट पैरामीटर सेट करें। चरण 6.2 में आयात की गई चलचित्रों के लिए पथ इनपुट करें। गति टैब पर, motioncor2 निष्पादन योग्य के लिए पथ निर्दिष्ट करें।
    नोट:: MotionCor2 एकाधिक GPUs का उपयोग कर समानांतर में चलाया जा सकता है।
  4. RELION-3 GUI के माध्यम से CTFFIND-4.122 का उपयोग कर CTF अनुमान निष्पादित करें। CTF अनुमान खोलें और चरण 6.3 में उत्पन्न micrographs.star इनपुट करें। CTFFIND-4.1 टैब पर, CTFFIND-4.1 निष्पादन योग्य के लिए पथ निर्दिष्ट करें और RELION-3.1 tutorial19 के रूप में पैरामीटर सेट करें।
  5. क्रायोस्पार्क v3 से RELION-3 तक कण स्टैक आयात करने के लिए, उन्हें पहले क्रायोस्पार्क v3 से निर्यात किया जाना चाहिए। क्रायोस्पार्क v3 में, चरण 4.2 या अंतिम 2D वर्गीकरण से 2D श्रेणी का चयन करें नौकरी का जॉब कार्ड खोलें. विवरण टैब पर, निर्यात कार्य पर क्लिक करें. निर्यात कार्य particles_exported.cs फ़ाइल outputs.
  6. क्रायोस्पार्क v3 से RELION-3 तक कण निर्देशांक आयात करने से पहले, चरण 6.5 से particles_exported.cs फ़ाइल को .star स्वरूप में कनवर्ट किया जाना चाहिए. PyEM23 का उपयोग करके, निम्न आदेश निष्पादित करके particles_exported.cs फ़ाइल को .star स्वरूप में कनवर्ट करें: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. RELION-3 में, मैन्युअल पिकिंग टैब पर क्लिक करें और I/O टैब पर, चरण 6.4 में वर्णित CTF परिशोधन से माइक्रोग्राफ इनपुट करें। प्रदर्शन टैब पर, निम्न पैरामीटर इनपुट: कण व्यास (A): 220, Lowpass फ़िल्टर (A): -1, CTF छवि के लिए स्केल: 0.5. नौकरी चलाएं । ManualPick नामक एक निर्देशिका RELION-3 होम फ़ोल्डर में जनरेट किया गया है।
    नोट:: यह चरण RELION-3 में मैन्युअल पिकिंग फ़ोल्डर संरचना बनाने के लिए किया जाता है। मैन्युअल पिकिंग चलाते समय, एक एकल .star फ़ाइल जिसमें चुने गए कणों के निर्देशांक होते हैं, RELION-3 GUI में चुनने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक औसत माइक्रोग्राफ के लिए बनाई जाती है।
  8. चरण 6.6 से particles_exported.star फ़ाइल वाले फ़ोल्डर पर नेविगेट करें और क्रायो-SPARC v3 कणों को चुनने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक औसत माइक्रोग्राफ के लिए एक एकल manualpick.star फ़ाइल का उत्पादन करने वाली एक घर-लिखित स्क्रिप्ट चलाएं, जिसने चरण 6.5 में निर्यात किए गए अंतिम 2D वर्गीकरण में योगदान दिया। परिणामी निर्देशांक फ़ाइलें ManualPick/Movies फ़ोल्डर में सहेजी जाती हैं।
  9. RELION-3 पर लौटें और मैन्युअल पिकिंग कार्य को फिर से खोलें। Continue पर क्लिक करें। यह पहले relion-3 GUI में cryoSPARC v3 में उठाया कणों को प्रदर्शित करेगा। यह सत्यापित करने के लिए कुछ माइक्रोग्राफ का निरीक्षण करें कि क्या कण निर्देशांक का हस्तांतरण पूरा हो गया है और यदि कणों को ठीक से चुना गया है।

7. RELION-3 - कण निष्कर्षण और 2 डी वर्गीकरण

  1. कण निष्कर्षण पर क्लिक करें. I/O टैब पर, इनपुट CTF चरण 6.4 से माइक्रोग्राफ और चरण 6.9 से निर्देशांक से सही किया। निकालें टैब पर क्लिक करें और कण बॉक्स आकार (pix) को 300 में बदलें। नौकरी चलाएं।
  2. एक उच्च संकल्प पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए क्रायोस्पार्क v3 में उत्पन्न कण सेट को और साफ करने के लिए 2 डी वर्गीकरण निष्पादित करें। 2 डी वर्गीकरण पर क्लिक करें और I/O टैब पर, चरण 7.1 में उत्पन्न particles.star फ़ाइल इनपुट करें। ऑप्टिमाइज़ेशन टैब पर, कक्षाओं की संख्या को 50 और मास्क व्यास (A) को 280 पर सेट करें. नौकरी चलाएं ।
    नोट: मुखौटा पूरे कण को शामिल करना चाहिए।
  3. सर्वश्रेष्ठ 2D वर्गों को चुनने के लिए, सबसेट चयन विधि पर क्लिक करें, चरण 7.2 से _model.star फ़ाइल इनपुट करें, और कार्य चलाएँ । चरण 4.2 में वर्णित के रूप में वर्गों का चयन करें।
  4. गैर-अभिसरण कणों को निकालने के लिए चरण 7.2 और 7.3 को दोहराएँ।

8. RELION-3 - 3 डी शोधन, मुखौटा निर्माण, और पोस्ट प्रसंस्करण

  1. क्रायोस्पार्क v3 (चरण 5.2) में उत्पन्न मानचित्र का उपयोग RELION-3 में 3D परिशोधन के लिए एक प्रारंभिक मॉडल के रूप में करें। आयात विधि का चयन करें और I/O टैब पर निम्न पैरामीटर सेट करें: आयात रॉ मूवीज़/माइक्रोग्राफ: नहीं, रॉ इनपुट फ़ाइलें: Movies/*.mrc.
  2. MTF फ़ाइल की आपूर्ति करें और चरण 1.3 में वर्णित के रूप में चलचित्र अधिग्रहण पैरामीटर इनपुट करें। अन्य टैब पर , इनपुट फ़ाइल के रूप में cryoSPARC v3 मैप का चयन करें, नोड प्रकार को 3D संदर्भ (.mrc) में परिवर्तित करें, और कार्य चलाएँ .
  3. 3D स्वत: परिशोधित का चयन करें और I/O टैब पर, चरण 7.3 या अंतिम चयन कार्य से particles.star फ़ाइल के रूप में इनपुट छवियाँ सेट करें. संदर्भ मानचित्र के रूप में cryoSPARC v3 पुनर्निर्माण दें। संदर्भ टैब पर क्लिक करें और प्रारंभिक लो-पास फ़िल्टर (Å) को 50 और समरूपता को icosahedral में बदलें। ऑप्टिमाइज़ेशन टैब पर, मास्क व्यास (Å) को 280 में बदलें और कार्य चलाएँ.
  4. रन समाप्त होने के बाद, यूसीएसएफ चिमेरा में run_class001.mrc खोलें।
  5. UCSF Chimera में, उपकरण पर क्लिक करें और वॉल्यूम डेटा के तहत, वॉल्यूम व्यूअर का चयन करें। यह वॉल्यूम सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए एक नई विंडो खोलेगा। चरण को 1 में बदलें और उस स्तर मान तक पहुंचने तक स्लाइडर को समायोजित करें जहाँ मानचित्र में कोई शोर नहीं है. इस मान को रिकॉर्ड करें, क्योंकि इसका उपयोग अगले चरण में मास्क निर्माण के लिए किया जाएगा.
  6. ऑटो-शोधन से उत्पादित नक्शा सच्चे एफएससी को प्रतिबिंबित नहीं करता है, क्योंकि आसपास के विलायक से शोर रिज़ॉल्यूशन को कम करता है। पोस्ट-प्रोसेसिंग से पहले, विलायक क्षेत्र से नमूने को अलग करने के लिए एक मुखौटा बनाएं।
    1. मास्क निर्माण पर क्लिक करें और चरण 8.3 से इनपुट run_class001.mrc.
    2. मास्क टैब पर क्लिक करें और निम्नानुसार पैरामीटर समायोजित करें: Lowpass फ़िल्टर मानचित्र (Å): 10, पिक्सेल आकार (Å): 1.045, प्रारंभिक Binarization थ्रेशोल्ड: चरण 8.5 में प्राप्त स्तर मान, बाइनरी मानचित्र इस कई पिक्सेल का विस्तार करें: 3, और इस कई पिक्सेल का एक सॉफ्ट-एज जोड़ें: 3. नौकरी चलाएँ।
  7. UCSF Chimera में मास्क की जांच करें। यदि मुखौटा बहुत तंग है, तो इस कई पिक्सेल का बाइनरी मैप बढ़ाएं और / या इस कई पिक्सेल का सॉफ्ट-एज जोड़ें। नरम किनारों के साथ एक मुखौटा बनाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक तेज मुखौटा ओवरफिटिंग का कारण बन सकता है।
  8. पोस्ट-प्रोसेसिंग पर क्लिक करें और I/O टैब पर, चरण 8.3 में बनाए गए आधे नक्शे और 8.6 से मास्क इनपुट करें। कैलिब्रेटेड पिक्सेल आकार को 1.045 Å पर सेट करें. शार्पन टैब पर, निम्न इनपुट करें: अनुमान B-Factor स्वचालित रूप से?: हाँ, ऑटो-B फ़िट (A) के लिए निम्नतम रिज़ॉल्यूशन: 10, अपने स्वयं के B-Factor का उपयोग करें?: नहीं. फ़िल्टर टैब पर, Fsc-Weighting छोड़ें? नहीं. कार्य चलाएँ पर सेट करें.

9. RELION-3 - चमकाने प्रशिक्षण और कण चमकाने

  1. प्रति-कण बीम-प्रेरित गति के लिए सही करने से पहले, पहले डेटा सेट के लिए इष्टतम गति पटरियों की पहचान करने के लिए प्रशिक्षण मोड का उपयोग करें। बायेसियन पॉलिशिंग खोलें और I/O टैब पर, चरण 6.3 से गति-सही माइक्रोग्राफ, चरण 8.3 से कण, और चरण 8.8 से पोस्टप्रोसेस .star फ़ाइल इनपुट करें। प्रशिक्षण टैब पर क्लिक करें और निम्न पैरामीटर सेट करें: इष्टतम पैरामीटर्स को प्रशिक्षित करें: हाँ, परीक्षण के लिए फूरियर पिक्सेल का अंश: 0.5, इस कई कणों का उपयोग करें: 5000. नौकरी चलाएं ।
    नोट:: यह स्क्रिप्ट निम्न चरण को निष्पादित करने के लिए आवश्यक अनुकूलित चमकाने पैरामीटर युक्त RELION-3 पोलिश फ़ोल्डर में opt_params_all_groups.txt फ़ाइल का उत्पादन करेगा।
  2. एक बार प्रशिक्षण का काम समाप्त हो जाने के बाद, बायेसियन पॉलिशिंग पर क्लिक करें। प्रशिक्षण टैब पर क्लिक करें और ट्रेन इष्टतम पैरामीटर सेट करें? पोलिश टैब का चयन करें और अनुकूलित पैरामीटर फ़ाइल में चरण 9.1 से opt_params_all_groups.txt फ़ाइल के लिए पथ निर्दिष्ट करें। Run पर क्लिक करें।
  3. पॉलिश कणों के एक सेट के साथ 3 डी शोधन (चरण 8.3) और पोस्ट-प्रोसेसिंग (चरण 8.8) को दोहराएं।

10. RELION-3 - सीटीएफ और प्रति कण शोधन

  1. उच्च क्रम aberrations का अनुमान लगाने के लिए, CTF परिशोधन खोलें और, कणों के अंतर्गत I/O टैब पर, हाल ही में परिष्कृत 3D कार्य (run_data.star) से पॉलिश कणों वाली .star फ़ाइल के पथ का चयन करें।
    1. Postprocess Star फ़ाइल के अंतर्गत, नवीनतम पोस्ट-प्रोसेसिंग कार्य (चरण 9.3) से आउटपुट के लिए पथ सेट करें।
    2. फ़िट टैब का चयन करें और निम्न पैरामीटर सेट करें: अनुमान (अनिसोट्रोपिक आवर्धन): नहीं, CTF पैरामीटर फिटिंग निष्पादित करें? नहीं, अनुमान Beamtilt: हाँ, यह भी अनुमान Trefoil? हाँ, अनुमान 4 आदेश abberations? हाँ। नौकरी चलाएं।
  2. पिछले कार्य (particles_ctf_refine.star) में उत्पन्न इनपुट पार्टिकल्स (रिफाइन 3 डी से) के रूप में उपयोग करके चरण 10.1 दोहराएँ। फ़िट टैब पर, अनुमान (अनिसोट्रोपिक आवर्धन) को हाँ में परिवर्तित करें और कार्य चलाएँ .
  3. पिछले कार्य (particles_ctf_refine.star) में उत्पादित इनपुट कणों (रिफाइन 3 डी से) के रूप में उपयोग करके चरण 10.2 को दोहराएँ। फ़िट टैब पर, निम्न पैरामीटर सेट करें: अनुमान (अनिसोट्रोपिक आवर्धन): नहीं, CTF पैरामीटर फिटिंग निष्पादित करें?: हाँ, फ़िट Defocus?: प्रति-कण, फ़िट Astigmatism? प्रति-माइक्रोग्राफ, फिट बी-फैक्टर?: नहीं, फिट फेज-शिफ्ट: नहीं, अनुमान बीमटाइल्ट?: नहीं, अनुमान 4 वें ऑर्डर Aberrations?: नहीं।
    नोट: यह देखते हुए कि कण में पर्याप्त कंट्रास्ट है, फिट अस्थिरता? टैब को प्रति-कण पर सेट किया जा सकता है। इस डेटासेट के लिए, प्रति-कण अस्थिरता शोधन ने मानचित्र की गुणवत्ता और संकल्प में सुधार नहीं किया।
  4. चरण 10.3 से कणों के साथ 3 डी शोधन दोहराएं और आई / ओ टैब पर, विलायक-चपटा एफएससी का उपयोग करें ? जब चल रहा समाप्त हो जाता है, तो एक पोस्ट-प्रोसेसिंग कार्य (चरण 8.8) निष्पादित करें और UCSF Chimera (चरण 5.2) में मानचित्र की जांच करें।

11. स्थानांतरण RELION-3 कण निर्देशांक और 3 डी मानचित्र Scipion 3 करने के लिए

  1. RELION-3 मानचित्र को और अधिक परिष्कृत और मान्य करने के लिए, पहले अंतिम पोस्ट-प्रोसेसिंग कार्य (चरण 10.4) से Scipion 3 के लिए वॉल्यूम और कणों को आयात करें। Scipion 3 लॉन्च करें और एक नई परियोजना बनाएं।
  2. बाएँ प्रोटोकॉल पैनल पर , आयात ड्रॉप-डाउन का चयन करें और आयात कणों पर क्लिक करें। निम्न पैरामीटर परिवर्तित करें: से आयात करें: RELION-3, स्टार फ़ाइल: postprocess.star, और चरण 1.3 के रूप में अधिग्रहण पैरामीटर निर्दिष्ट करें। Execute पर क्लिक करें।
  3. आयात ड्रॉप-डाउन पर क्लिक करें और आयात वॉल्यूम का चयन करें। के अंतर्गत आयात से RELION-3 मानचित्र के लिए पथ दें। पिक्सेल आकार (नमूना दर) Å/px को 1.045 और निष्पादित करने के लिए परिवर्तित करें।

12. Scipion 3 - उच्च - संकल्प शोधन

  1. सबसे पहले, एक वैश्विक संरेखण प्रदर्शन करें। प्रोटोकॉल पैनल पर परिष्कृत ड्रॉप-डाउन का चयन करें और Xmipp3 - highres24 पर क्लिक करें। क्रमशः पूर्ण आकार छवियों और प्रारंभिक वॉल्यूम के रूप में चरण 11.2 और 11.3 से आयातित कणों और वॉल्यूम इनपुट करें और समरूपता समूह को icosahedral पर सेट करें। कोणीय असाइनमेंट के अंतर्गत छवि संरेखण टैब पर, वैश्विक चुनें और अधिकतम लक्ष्य रिज़ॉल्यूशन को 3 Å पर सेट करें, और कार्य चलाएँ.
  2. जब कार्य समाप्त हो जाए, तो परिणामों का विश्लेषण करें पर क्लिक करें. नई विंडो में, परिष्कृत मात्रा की जांच करने के लिए UCSF Chimera आइकन पर क्लिक करें। इसके अतिरिक्त, यह देखने के लिए प्रदर्शन रिज़ॉल्यूशन प्लॉट्स (FSC) पर क्लिक करें कि परिष्करण के बाद FSC कैसे बदल गया है, साथ ही साथ कोणीय परिवर्तनों के साथ प्लॉट हिस्टोग्राम यह देखने के लिए कि यूलर कोण असाइनमेंट बदल गए हैं या नहीं।
    नोट:: इनपुट RELION-3 संरचना के रिज़ॉल्यूशन के आधार पर, यह चरण कोणीय असाइनमेंट टैब के अंतर्गत अधिकतम लक्ष्य रिज़ॉल्यूशन के लिए सेट किए गए विभिन्न मानों के साथ कई बार दोहराया जा सकता है। अधिक जानकारी के लिए Scipion tutorial25 देखें।
  3. एक स्थानीय संरेखण के साथ चरण 12.1 दोहराएँ। पिछले कार्य की प्रतिलिपि बनाएँ और Xmipp3 करने के लिए पिछले रन का चयन करें परिवर्तित करें - highres Global. कोणीय असाइनमेंट टैब पर , छवि संरेखण को स्थानीय में परिवर्तित करें। अधिकतम लक्ष्य रिज़ॉल्यूशन को 2.1 Å पर सेट करें.
  4. UCSF Chimera में परिष्कृत मानचित्र की जांच करें और FSC और कोणीय असाइनमेंट (चरण 12.2) में परिवर्तन का विश्लेषण करें। स्थानीय परिशोधन को तब तक दोहराएं जब तक कि रिज़ॉल्यूशन में सुधार नहीं होता है और कोणीय असाइनमेंट अभिसरण नहीं करते हैं, अधिकतम लक्ष्य रिज़ॉल्यूशन को आवश्यकतानुसार समायोजित करते हैं।
  5. Scipion 3 से आउटपुट मानचित्र अतिरिक्त घनत्व संशोधित और Phenix26 में तेज किया जा सकता है.

13. Scipion 3 - मानचित्र सत्यापन

  1. Xmipp3 - highres में उत्पन्न अंतिम मानचित्र के स्थानीय रिज़ॉल्यूशन की जाँच करें। Xmipp खोलें - स्थानीय MonoRes27 और इनपुट पिछले काम से अंतिम मात्रा और चरण 8.6 में उत्पन्न मुखौटा। एक 0.1 Å अंतराल के साथ 1 से 6 Å करने के लिए रिज़ॉल्यूशन रेंज सेट करें और कार्य निष्पादित करें।
  2. जब चल रहा समाप्त हो जाए, तो परिणामों का विश्लेषण करें पर क्लिक करें और रिज़ॉल्यूशन हिस्टोग्राम और रिज़ॉल्यूशन द्वारा रंगीन वॉल्यूम स्लाइस की जांच करें।
  3. यह देखने के लिए कि क्या कण अच्छी तरह से संरेखित हैं, Multireference Alignability28 खोलें और चरण 12.3 से कणों और मात्रा को इनपुट करें। सत्यापन प्लॉट प्रदर्शित करने के लिए परिणामों का विश्लेषण करें पर क्लिक करें। आदर्श रूप से, सभी बिंदुओं को (1.0,1.0) के आसपास क्लस्टर किया जाना चाहिए।
  4. खोलें Xmipp3 - सत्यापित Overfitting. चरण 12.3 से कणों और वॉल्यूम इनपुट करें। जब चल रहा समाप्त हो जाता है, तो परिणामों का विश्लेषण करें और ओवरफिटिंग प्लॉट का निरीक्षण करें। संरेखित गाऊसी शोर और संरेखित कणों के वक्रों को पार करना ओवरफिटिंग को इंगित करता है।

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Representative Results

हमने तीन अलग-अलग प्रसंस्करण प्लेटफार्मों का उपयोग करके एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करने के लिए एक व्यापक एसपीए पाइपलाइन प्रस्तुत की है: क्रायोस्पार्क वी 3, रेलिओन -3, और स्किपियन 3। चित्र1 और चित्र4 सामान्य संसाधन वर्कफ़्लो को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं, और तालिका 1 परिशोधन प्रोटोकॉल का विवरण देती है. इन प्रोटोकॉल का उपयोग एएवी की 2.3 Å संरचना के शोधन के दौरान किया गया था, जो Nyquist रिज़ॉल्यूशन के पास प्राप्त करता है।

फिल्मों को पहले क्रायोस्पार्क v3 और बाद में गति- और CTF-औसत माइक्रोग्राफ उत्पन्न करने के लिए सही करने के लिए आयात किया गया था। आगे के प्रसंस्करण के लिए माइक्रोग्राफ का चयन करते समय, एक अच्छे सीटीएफ-फिट और कम अस्थिरता (चित्रा 2) वाले लोगों को चुनना महत्वपूर्ण है, क्योंकि खराब गुणवत्ता वाले माइक्रोग्राफ सहित बाद के प्रसंस्करण चरणों में बाधा डाल सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण होता है। 27,364 कणों को तब चुना गया था और चयनित माइक्रोग्राफ से निकाला गया था। क्योंकि AAV का व्यास लगभग 220 Å है और पिक्सेल का आकार 1.045 Å है, इसलिए 300 px के बॉक्स आकार का उपयोग किया गया था। इसके बाद, पुनरावर्ती 2 डी वर्गीकरण का उपयोग कलाकृतियों और कणों को हटाने के लिए किया गया था जो स्थिर वर्गों में अभिसरण नहीं करते थे। चयनित और बहिष्कृत 2D वर्ग औसत के उदाहरण चित्र 3 में प्रस्तुत किए गए हैं। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि नमूने की विभिन्न संरचनाओं को प्रतिबिंबित करने वाले वर्ग औसत को कई 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए अलग से परिष्कृत किया जाना चाहिए। ऐसे मामले में, एकाधिक ab initio प्रारंभिक संस्करणों की गणना की जानी चाहिए। यहां, 26,741 कणों का चयन किया गया था और एक एकल 2.9 Å संरचना के एब इनीशीओ मॉडलिंग और सजातीय शोधन के लिए उपयोग किया गया था।

क्रायोस्पार्क v3 में चुने गए कणों के निर्देशांक को RELION-3 में स्थानांतरित करने के बाद, हमने 2 D वर्गीकरण के चार अतिरिक्त दौर किए जब तक कि डेटा सेट स्थिर 2 D वर्गों में अभिसरण नहीं हो गया। उपर्युक्त वर्णित 2 डी वर्गीकरण ने डेटा सेट से एक अतिरिक्त 3,154 कणों को हटा दिया। एक प्रारंभिक मॉडल के रूप में क्रायोस्पार्क v3 में उत्पन्न संरचना का उपयोग करते हुए, RELION-3 में 3 D शोधन ने 2.95 Å के लगभग बराबर रिज़ॉल्यूशन के साथ एक संरचना का उत्पादन किया। बाद के संरचनात्मक शोधन, जिसमें प्रति-कण गति सुधार और सीटीएफ शोधन शामिल थे, ने संकल्प को 2.61 Å तक बढ़ा दिया। हमारे द्वारा किए गए शोधनों की एक पूरी सूची तालिका 1 में प्रस्तुत की गई है। RELION-3 में गणना की गई मात्रा को तब उच्च-रिज़ॉल्यूशन शोधन (Xmipp3 - highres) के कई दौर का उपयोग करके Scipion 3 में और अधिक परिष्कृत किया गया था। शोधन के बाद के दौर के दौरान, डेटा सेट से एक अतिरिक्त 3,186 कणों को हटा दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप 20,401 कणों का अंतिम सेट हुआ, जिसने एएवी के 2.3 Å पुनर्निर्माण का उत्पादन किया (चित्रा 5 और चित्रा 6)। इस प्रकार, 1.045 Å के पिक्सेल आकार को देखते हुए, हमारे शोधन लगभग Nyquist सीमा तक पहुंच गए हैं। प्रत्येक प्रोग्राम का उपयोग करके गणना की गई संरचनाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले एफएससी वक्र चित्र 6 में दिखाए गए हैं। ये FSC वक्र पूरे वर्कफ़्लो में रिज़ॉल्यूशन वृद्धि को इंगित करते हैं. क्योंकि रिज़ॉल्यूशन मानचित्र में बिंदु से बिंदु तक भिन्न हो सकता है, इसलिए एफएससी वक्र से एकल मानदंड (जैसे, 0.143 मानदंड) के अनुसार एकल रिज़ॉल्यूशन अनुमान की रिपोर्ट करने के बजाय मानचित्र में स्थानीय रिज़ॉल्यूशन अनुमानों के वितरण को प्रस्तुत करना अक्सर अधिक उपयुक्त होता है। इस प्रकार, हमने Scipion 3 में Xmipp - MonoRes का उपयोग करके इस तरह के विश्लेषण का प्रदर्शन किया। चित्रा 7 क्रायोस्पार्क v3 और Scipion 3 के साथ प्राप्त मानचित्रों के लिए स्थानीय संकल्प अनुमानों की तुलना दिखाता है। संरचनाओं (चित्रा 7A, B) और रिज़ॉल्यूशन हिस्टोग्राम (चित्रा 7C) के माध्यम से चार अलग-अलग स्लाइस पर रिज़ॉल्यूशन अनुमान स्पष्ट रूप से पूरे वर्कफ़्लो में मानचित्रों के बीच स्थानीय रिज़ॉल्यूशन में वृद्धिशील सुधार को प्रदर्शित करते हैं। FSC वक्र कार्यक्रम Xmipp3 का उपयोग करके गणना की - Scipion 3 में highres इंगित करता है कि Nyquist सीमा तक पहुँच गया है (चित्रा 6), यह सुझाव देते हुए कि संकल्प अनुमान undersampling29 द्वारा सीमित होने की संभावना है। हालांकि, चित्रा 7 C में प्रस्तुत मोनोरेस विश्लेषण, एएवी (चित्रा 5) के परमाणु निर्देशांक के साथ ईएम मानचित्र और मानचित्र फिटिंग के सावधानीपूर्वक विश्लेषण के साथ सुझाव देता है कि मानचित्र के लिए अधिक पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन अनुमान 2.3 Å है। FSC और MonoRes संकल्प अनुमानों को समेटने वाली एक समान रणनीति पहले 24,25 प्रस्तुत की गई है। क्योंकि रिज़ॉल्यूशन अनुमान परिशोधन चरणों के दौरान उपयोग किए जाने वाले मुखौटे से प्रभावित हो सकते हैं, इसलिए यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मुखौटा घनत्व के किसी भी हिस्से को बाहर नहीं करता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मुखौटे को 3 डी पुनर्निर्माण के साथ ओवरलैप किया गया है, जिसे चित्र 7 डी में प्रस्तुत किया गया है। प्रस्तुत वर्कफ़्लो में रिज़ॉल्यूशन में क्रमिक वृद्धि एक उच्च गुणवत्ता और उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए एकाधिक एसपीए सॉफ़्टवेयर पैकेजों से एल्गोरिदम का उपयोग करने के लाभ पर प्रकाश डालती है।

इन-सीटू मॉडल का निर्माण या पहले से मौजूद परमाणु मॉडल के साथ मानचित्र को फिट करना गणना की गई संरचना के लिए गुणवत्ता जांच के रूप में काम कर सकता है। हमने यूसीएसएफ चिमेरा में अंतिम मानचित्र की कल्पना की है और पहले से प्रकाशित परमाणु मॉडल (पीडीबी आईडी: 7kfr) 30 के साथ मानचित्र को फिट किया है। चित्रा 5 क्रायो-ईएम मानचित्र के क्षेत्रों को एएवी के परमाणु निर्देशांक के साथ फिट करता है। अच्छी तरह से परिभाषित ईएम घनत्व व्यक्तिगत अमीनो एसिड, पानी के अणुओं और मैग्नीशियम आयनों की साइड-चेन को फिट करने की अनुमति देते हैं और परमाणु मॉडल के साथ क्रायो-ईएम मानचित्र के समझौते की पुष्टि करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3, और Phenix 1.18 भर में पूर्ण एसपीए वर्कफ़्लो. क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, Scipion 3, और Phenix 1.18 में पूरा किए गए चरणों को क्रमशः बैंगनी, नारंगी, हरे और ग्रे बक्से के साथ दर्शाया जाता है। 8 GPUs, 40 CPU और 750 GB RAM से सुसज्जित प्रसंस्करण सर्वर का उपयोग करके प्रत्येक चरण को पूरा करने के लिए आवश्यक समय प्रत्येक व्यक्तिगत बॉक्स में निर्दिष्ट किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: क्रायोस्पार्क v3 में डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए माइक्रोग्राफ का चयन. (ए) अच्छी तरह से मिलान किए गए अनुमानित और प्रयोगात्मक थॉन रिंगों के साथ माइक्रोग्राफ का उपयोग आगे के प्रसंस्करण के लिए किया गया था, जबकि उच्च अस्थिरता और खराब फिट (बी) वाले लोगों को छोड़ दिया गया था। 5 Å से ऊपर CTF-फिट के साथ माइक्रोग्राफ, 400 Å से अधिक अस्थिरता, और 2 से नीचे सापेक्ष बर्फ की मोटाई को आगे के प्रसंस्करण से हटा दिया गया था, यानी, 70/395 माइक्रोग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 2 डी कक्षाओं का चयन करना। अच्छी तरह से परिभाषित वर्गों वाले 2 डी वर्ग के औसत का चयन किया जाता है (ए), और कम-रिज़ॉल्यूशन, शोर और आंशिक कणों वाले लोगों को अस्वीकार कर दिया जाता है (बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 भर में AAV प्रसंस्करण के लिए वर्कफ़्लो और प्रतिनिधि परिणाम। क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 में पूरा किए गए चरणों को क्रमशः बैंगनी, नारंगी और हरे तीर के साथ दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एएवी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना विभिन्न माध्यमिक संरचना तत्वों और व्यक्तिगत अमीनो एसिड साइड चेन का प्रतिनिधित्व करने वाले अच्छी तरह से परिभाषित ईएम घनत्व दिखाती है। (ए) एएवी का एक अंतिम मानचित्र। (बी) एएवी (पीडीबी आईडी: 7केएफआर) 30 के परमाणु निर्देशांक के साथ फिट बीटा शीट का प्रतिनिधित्व करने वाले मानचित्र का एक हिस्सा। (c) व्यक्तिगत अमीनो एसिड का प्रतिनिधित्व करने वाले मानचित्र घनत्व। बाएं से दाएं: आर्जिनिन, फेनिलएलनिन और ट्रिप्टोफैन। (डी) मानचित्र की उच्च-रिज़ॉल्यूशन विशेषताओं में लाल और मैग्नीशियम आयनों में प्रस्तुत पानी के अणु शामिल हैं जो हरे गोले के रूप में प्रस्तुत किए गए हैं। आकृति में प्रदर्शित Mg2+ आयन हिस्टिडीन (बाएं) और arginine अवशेषों द्वारा समन्वित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 से FSC घटता वर्कफ़्लो भर में बढ़ते रिज़ॉल्यूशन दिखाते हैं। जबकि FSC वक्र कार्यक्रम Xmipp3 का उपयोग करके गणना की - Scipion 3 में highres इंगित करता है कि Nyquist सीमा तक पहुंच गया है, यह सुझाव देते हुए कि संकल्प अनुमान undersampling29 द्वारा सीमित है, मानचित्र संकल्प का अधिक पर्याप्त विश्लेषण चित्रा 7 में प्रस्तुत किया गया है और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग 24,25 में चर्चा की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: Xmipp का उपयोग कर Scipion 3 में अंतिम पुनर्निर्माण मान्य - MonoRes. मानचित्र का रिज़ॉल्यूशन FSC वक्र से एक एकल मानदंड के अनुसार एकल रिज़ॉल्यूशन अनुमान के बजाय स्थानीय रिज़ॉल्यूशन वितरण प्रस्तुत करके बेहतर तरीके से वर्णित है। (A-B) पैनल ए और बी क्रमशः क्रायोस्पार्क वी 3 और स्किपियन 3 में उत्पन्न मानचित्रों से अलग-अलग स्लाइस दिखाते हैं। (सी) हिस्टोग्राम क्रायोस्पार्क v3 (गुलाबी सलाखों) और Scipion 3 (नीली सलाखों) में गणना किए गए मानचित्रों के लिए स्थानीय संकल्प में एक व्यवस्थित वृद्धि का प्रदर्शन करता है। (डी) स्थानीय रिज़ॉल्यूशन गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले मास्क (ग्रे) में दोनों कार्यक्रमों में परिष्कृत एएवी घनत्व के सभी हिस्से होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रोग्राम परिशोधन प्रकार लिपि
क्रायोस्पार्क v3 सजातीय शोधन सजातीय शोधन
गैर-समान परिशोधन गैर-समान परिशोधन
विषम परिष्करण विषम परिष्करण
प्रति कण गति संशोधन स्थानीय गति सुधार
RELION-3 3 डी शोधन परिष्कृत3D
पोस्टप्रोसेसिंग - बी-फैक्टर शार्पनिंग, एमटीएफ सुधार परिष्कृत3D
कण चमकाने बायेसियन पॉलिशिंग
CTF शोधन - बीम झुकाव CtfRefine
CTF परिशोधन - अनिसोट्रोपिक आवर्धन CtfRefine
सीटीएफ परिशोधन - प्रति-कण डीफोकस, प्रति-कण / माइक्रोग्राफ अस्थिरता CtfRefine
एवाल्ड गोले वक्रता सुधार Relion_reconstruct
स्किपियन 3 उच्च संकल्प परिशोधन Xmipp3 - highres
Phenix 1.18 घनत्व संशोधन और तेज करना ResolvCryoEM

तालिका 1: पूरे वर्कफ़्लो में लागू किए गए परिशोधन. क्या कुछ शोधन किसी विशिष्ट परियोजना पर लागू होते हैं, यह डेटा की गुणवत्ता और अधिग्रहण पैरामीटर पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, Ewald क्षेत्र वक्रता सुधार पहले से ही उच्च रिज़ॉल्यूशन वाले मानचित्रों के लिए लागू किया जा सकता है।

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Discussion

इस लेख में, हम उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण (चित्रा 1) प्राप्त करने के लिए विभिन्न सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म पर क्रायो-ईएम डेटा प्रोसेसिंग के लिए एक मजबूत एसपीए वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं। यह वर्कफ़्लो विभिन्न प्रकार के जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स पर लागू होता है. प्रोटोकॉल के बाद के चरणों को चित्र 4 में रेखांकित किया गया है, जिसमें फिल्म प्री-प्रोसेसिंग, कण पिकिंग और वर्गीकरण, और संरचना शोधन (तालिका 1) और सत्यापन के लिए कई विधियां शामिल हैं। क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 में प्रसंस्करण चरणों को प्रस्तुत किया गया है, साथ ही साथ सॉफ़्टवेयर पैकेजों के बीच डेटा स्थानांतरित करने के लिए विधियां भी प्रस्तुत की गई हैं। हमने बढ़ते रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 4, चित्रा 6 और चित्रा 7) के साथ प्रोटोकॉल के दौरान प्राप्त मध्यवर्ती संरचनाओं को दिखाया है।

जबकि इस पांडुलिपि में उल्लिखित विधियों का उपयोग विभिन्न प्रोटीनों और जैविक विधानसभाओं की संरचना निर्धारण के लिए किया जा सकता है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एएवी क्रायो-ईएम और एसपीए द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए एक आदर्श उम्मीदवार है, क्योंकि इसका बड़ा आकार माइक्रोस्कोप में उच्च विपरीत पैदा करता है और इकोसाहेड्रल समरूपता 60 गुना सबयूनिट अतिरेक के साथ कणों की पैदावार करती है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण प्राप्त करना छोटे (यानी, 100 केडी से कम), गतिशील और विषम नमूनों के लिए तेजी से मुश्किल हो जाता है। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि कई उच्च गुणवत्ता वाली फिल्मों को प्रसंस्करण के लिए एकत्र किया जाता है। खराब गुणवत्ता वाले कच्चे डेटा के साथ, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन और उच्च-गुणवत्ता वाले पुनर्निर्माण प्राप्त करना संभव नहीं है। उदाहरण के लिए, यदि बर्फ की मोटाई संरचना निर्धारण के लिए इष्टतम नहीं है या यदि कण बर्फ-पानी इंटरफ़ेस का पालन करते हैं या पसंदीदा झुकाव प्रदर्शित करते हैं, तो ग्रिड ठंड की स्थिति को फिर से देखें।

वर्कफ़्लो में एक और महत्वपूर्ण कदम कण उठाना और निष्कर्षण है। कण चुनने के दौरान, बॉक्स का आकार कण के सबसे लंबे अक्ष की तुलना में लगभग 1.4-2.5 गुना बड़ा होना चाहिए, क्योंकि डिफोकस के कारण फैली उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी को कैप्चर करने के लिए पर्याप्त बॉक्स आकार की आवश्यकता होती है। हालांकि, बड़े बॉक्स आकारों को कण निष्कर्षण के दौरान उत्पन्न फ़ाइलों के बढ़े हुए आकार के कारण लंबे समय तक प्रसंस्करण समय की आवश्यकता होती है। बॉक्स आकार चुनते समय, कण व्यास और पिक्सेल आकार पर विचार करें। कई कणों के साथ, उपयोगकर्ता प्रारंभिक प्रसंस्करण के लिए निष्कर्षण के दौरान कणों को बिन करना चाह सकता है और फिर अंतिम शोधन के लिए पूर्ण आकार के कणों को फिर से निकाल सकता है। यह प्रोटोकॉल स्वचालित चयन के लिए टेम्पलेट्स उत्पन्न करने के लिए मैन्युअल कण पिकिंग का उपयोग करता है। हालांकि, क्रायोस्पार्क वी 3 भी पूरी तरह से स्वचालित पिकिंग विधियां प्रदान करता है, जिसमें एक ब्लॉब-आधारित पिकर और एक पुखराज रैपर शामिल है, जो पिछले पिक्स के आधार पर कणों का चयन करने के लिए गहरी शिक्षा का उपयोग करता है। जबकि ये एल्गोरिदम बहुत मजबूत हैं, पिक्स की एक महत्वपूर्ण संख्या को बाद में 2 डी और 3 डी वर्गीकरण द्वारा हटा दिया जाना चाहिए।

महत्वपूर्ण चरणों में कलाकृतियों को हटाने के लिए उपयोग किए जाने वाले 2 डी और 3 डी वर्गीकरण भी शामिल हैं, जैसे कि विकिरण-क्षतिग्रस्त कण और नमूने में मौजूद नमूने के विभिन्न संरचनात्मक रूपों को अलग करना, क्रमशः। उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित 2 डी वर्गों की संख्या माइक्रोग्राफ, कंट्रास्ट और नमूने में विषमता से निकाले गए कणों की संख्या पर निर्भर करनी चाहिए, क्योंकि लक्ष्य कण के प्रत्येक व्यक्तिगत दृश्य को एक अलग 2 डी वर्ग में अलग करना है। एक सामान्य नियम के रूप में, प्रत्येक 100 कणों के लिए एक 2 डी वर्ग जोड़ें, और यदि बड़ी संख्या में कणों के साथ एक नए नमूने को संसाधित करना, तो 100 कक्षाएं एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। यदि 2 डी और 3 डी वर्गीकरण के कई दौरों के बाद भी कम या मध्यम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जाता है, तो यह देखने के लिए कि क्या अधिक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त की जा सकती है, एक बड़े बॉक्स आकार के साथ कणों को फिर से निकालने का प्रयास करें। अंतिम पुनर्निर्माण के संकल्प की रिपोर्ट करते समय, किसी को सोने के मानक विधि के अनुसार प्राप्त एफएससी वक्र का विश्लेषण करना चाहिए, साथ ही साथ स्थानीय संकल्प अनुमानों और मानचित्र घनत्व के सावधानीपूर्वक निरीक्षण के साथ-साथ परमाणु मॉडल के साथ उनके समझौते के साथ।

वायरस संरचनाओं के शोधन के लिए, RELION-3 में लागू Ewald क्षेत्र वक्रता सुधार उच्च संकल्प 31 पर सुधार का प्रदर्शन किया है। यदि गतिशील मल्टीप्रोटीन परिसरों की संरचनाओं को परिष्कृत करते हैं, तो 3 डी बहु-शरीर परिशोधन का प्रयास करें जो RELION-3 में लागू किया गया है या RELION-3 और cryoSPARC v3 में लागू छवि घटाव के साथ केंद्रित वर्गीकरण पर ध्यान केंद्रित करता है। यदि विषमता को कम्प्यूटेशनल रूप से हल नहीं किया जा सकता है, तो नमूना तैयारी की स्थिति 32 को फिर से देखना आवश्यक है। अपर्याप्त शुद्धता या अपर्याप्त तैयारी जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन क्षरण होता है, 3 डी पुनर्निर्माण की गुणवत्ता में बाधा डालेगा। इसके अतिरिक्त, बफ़र स्थितियां जो प्रोटीन को अस्थिर करती हैं या एकत्रीकरण को बढ़ावा देती हैं, संरचना गणना के लिए उपयोग किए जा सकने वाले अच्छी तरह से परिभाषित कणों की संख्या को गंभीर रूप से सीमित करती हैं। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत विधियों का सबसे प्रभावी ढंग से उपयोग करने के लिए, नमूना स्थिरता के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान करना अनिवार्य है। हम क्रायो-ईएम से पहले नमूनों को स्क्रीन करने के लिए नकारात्मक-धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की सिफारिश करते हैं।

जैसा कि क्रायो-ईएम संरचनात्मक जीवविज्ञानियों की बढ़ती संख्या के लिए 3 डी संरचना निर्धारण के लिए पसंदीदा विधि बन गई है, छवि प्रसंस्करण और संरचना निर्धारण के लिए एक एकीकृत और मजबूत वर्कफ़्लो की आवश्यकता अधिक स्पष्ट हो जाती है। क्रायोस्पार्क एक आसान-से-उपयोग, वेब-आधारित ग्राफिक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (जीयूआई) प्रदान करता है जो सभी अनुभव स्तरों के उपयोगकर्ताओं को डेटा को जल्दी से संसाधित करने और 3 डी संरचना की गणना करने की अनुमति देता है। विशेष रूप से, क्रायोस्पार्क एक स्टोकेस्टिक ग्रेडिएंट वंश का उपयोग करता है ताकि एब इनिशियो 3 डी पुनर्निर्माण किया जा सके। इसके अलावा, सॉफ़्टवेयर त्वरित 3 डी मानचित्र शोधन 7 के लिए एक शाखा और बाध्य संभावना अनुकूलन एल्गोरिथ्म को नियोजित करता है। इस आलेख में वर्णित संसाधन पाइपलाइन एक प्रारंभिक 3D मानचित्र उत्पन्न करने के लिए cryoSPARC v3 का उपयोग करता है। 3 डी पुनर्निर्माण को तब RELION-3 में परिष्कृत किया जाता है, एक लोकप्रिय पैकेज जो उपयोगकर्ता के डेटा सेट के आधार पर महत्वपूर्ण मापदंडों का अनुमान लगाने के लिए एक अनुभवजन्य बायेसियन दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जिससे प्रोग्राम ऑपरेशन 10 के लिए विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता कम हो जाती है। विशेष रूप से, हम संकल्प में सुधार करने के लिए प्रति-कण गति सुधार और सीटीएफ शोधन के लिए बायेसियन चमकाने का उपयोग करते हैं। अंत में, परिणामी संरचना को आगे परिष्कृत किया जाता है और सिपियन 311 में मान्य किया जाता है, एक एकीकृत पायथन खोल जो Xmipp13, EMAN28, SPIDER12, और अन्य सहित कई प्लेटफार्मों से एल्गोरिदम का समर्थन करता है। जबकि क्रायो-ईएम उपयोगकर्ताओं के लिए कई अलग-अलग सॉफ़्टवेयर पैकेज उपलब्ध हैं, वर्तमान में क्षेत्र द्वारा स्वीकार किए गए कोई सार्वभौमिक एसपीए प्लेटफ़ॉर्म नहीं हैं। यद्यपि SPA वर्कफ़्लो इस आलेख में वर्णित तीन सॉफ़्टवेयर पैकेजों में से किसी में भी पूरी तरह से निष्पादित किया जा सकता है, विभिन्न एल्गोरिदम अलग-अलग परिणाम दे सकते हैं. नतीजतन, डेटा के नमूने और गुणवत्ता के आधार पर अलग-अलग चरणों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, वर्तमान डेटा सेट के लिए, RELION-3 में 3Drefine ने 3D पुनर्निर्माण के रिज़ॉल्यूशन में वृद्धि की, जबकि क्रायोस्पार्क v3 में Nonuniform परिशोधन ने थोड़ी रिज़ॉल्यूशन कमी का नेतृत्व किया। इस प्रकार, इष्टतम गुणवत्ता और संकल्प प्राप्त करने और पुनर्निर्माण के सत्यापन की सुविधा के लिए संरचनाओं की पुनर्गणना करने के लिए विभिन्न प्रकार के कार्यक्रमों का उपयोग करना बहुत फायदेमंद है। हालांकि, Scipion 3 में क्रायोस्पार्क v3 और RELION-3 से कई एल्गोरिदम शामिल हैं, इन कार्यक्रमों के सबसे हाल के कार्यान्वयन तुरंत Scipion में उपलब्ध नहीं हैं। उदाहरण के लिए, इस पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले कार्यक्रमों में से, केवल RELION-3 स्क्रिप्ट Relion_reconstruct के माध्यम से Ewald Sphere Curve Correction प्रदान करता है। इस आलेख में प्रस्तुत पाइपलाइन क्रायोस्पार्क v3, RELION-3, और Scipion 3 में लागू किए गए एल्गोरिदम का सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए नए और अनुभवी दोनों उपयोगकर्ताओं के लिए एक मार्गदर्शिका प्रदान करती है ताकि निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन पर 3D संरचनाओं की गणना की जा सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम Scipion3 स्थापना और Kilian Schnelle और Arne Moeller विभिन्न प्रसंस्करण प्लेटफार्मों के बीच डेटा हस्तांतरण के साथ मदद के लिए मदद के लिए कार्लोस ऑस्कर Sorzano धन्यवाद. इस शोध का एक हिस्सा एनआईएच अनुदान U24GM129547 द्वारा समर्थित था और OHSU में PNCC में प्रदर्शन किया गया था और EMSL (grid.436923.9) के माध्यम से एक्सेस किया गया था, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय द्वारा प्रायोजित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा का एक डीओई कार्यालय। इस अध्ययन को रटगर्स विश्वविद्यालय से अरेक कुल्जिक को स्टार्ट-अप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

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References

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DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

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