Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

Den här artikeln beskriver hur man effektivt använder tre kryo-EM-bearbetningsplattformar, dvs. cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3, för att skapa ett enda och robust arbetsflöde som är tillämpligt på en mängd olika enpartikeldatauppsättningar för högupplöst strukturbestämning.

Abstract

Nya framsteg inom både instrumentering och bildbehandlingsprogramvara har gjort kryoelektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) till den föredragna metoden för strukturbiologer att bestämma högupplösta strukturer av en mängd olika makromolekyler. Flera programvarusviter är tillgängliga för nya och expertanvändare för bildbehandling och strukturberäkning, vilket effektiviserar samma grundläggande arbetsflöde: filmer som förvärvas av mikroskopdetektorerna genomgår korrigering för uppskattning av strålinducerad rörelse och kontrastöverföringsfunktion (CTF). Därefter väljs partikelbilder och extraheras från genomsnittliga filmramar för iterativ 2D- och 3D-klassificering, följt av 3D-rekonstruktion, förfining och validering. Eftersom olika mjukvarupaket använder olika algoritmer och kräver olika kompetensnivåer för att fungera, skiljer sig de 3D-kartor de genererar ofta i kvalitet och upplösning. Således överför användare regelbundet data mellan en mängd olika program för optimala resultat. Detta dokument ger en guide för användare att navigera i ett arbetsflöde över de populära mjukvarupaketen: cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 för att få en nära atomupplösningsstruktur för det adenoassocierade viruset (AAV). Vi beskriver först en bildbehandlingspipeline med cryoSPARC v3, eftersom dess effektiva algoritmer och lättanvända GUI gör det möjligt för användare att snabbt komma fram till en 3D-karta. I nästa steg använder vi PyEM och interna skript för att konvertera och överföra partikelkoordinater från 3D-rekonstruktion av bästa kvalitet som erhållits i cryoSPARC v3 till RELION-3 och Scipion 3 och beräkna om 3D-kartor. Slutligen beskriver vi steg för ytterligare förfining och validering av de resulterande strukturerna genom att integrera algoritmer från RELION-3 och Scipion 3. I den här artikeln beskriver vi hur du effektivt använder tre bearbetningsplattformar för att skapa ett enda och robust arbetsflöde som är tillämpligt på en mängd olika datauppsättningar för högupplöst strukturbestämning.

Introduction

Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) och enpartikelanalys (SPA) möjliggör strukturbestämning av en mängd olika biomolekylära sammansättningar i deras hydratiserade tillstånd, vilket hjälper till att belysa dessa makromolekylers roller i atomdetaljer. Förbättringar av mikroskopoptik, datorhårdvara och bildbehandlingsprogramvara har gjort det möjligt att bestämma strukturer för biomolekyler med upplösning som når bortom 2 Å1,2,3. Mer än 2 300 kryo-EM-strukturer deponerades i Protein Data Bank (PDB) 2020, jämfört med 192 strukturer 20144, vilket indikerar att kryo-EM har blivit den valda metoden för många strukturbiologer. Här beskriver vi ett arbetsflöde som kombinerar tre olika SPA-program för högupplöst strukturbestämning (Figur 1).

Målet med SPA är att rekonstruera 3D-volymer av ett målprov från bullriga 2D-bilder som spelats in av en mikroskopdetektor. Detektorer samlar in bilder som filmer med enskilda bildrutor med samma synfält. För att bevara provet samlas ramar in med en låg elektrondos och har därmed ett dåligt signal-brusförhållande (SNR). Dessutom kan elektronexponering inducera rörelse inom de förglasade kryo-EM-rutnäten, vilket resulterar i bildsuddning. För att övervinna dessa problem justeras ramarna för att korrigera för strålinducerad rörelse och i genomsnitt för att ge en mikrograf med en ökad SNR. Dessa mikrografer genomgår sedan uppskattning av kontrastöverföringsfunktionen (CTF) för att ta hänsyn till effekterna av defokus och avvikelser som mikroskopet påför. Från de CTF-korrigerade mikrograferna väljs, extraheras och sorteras enskilda partiklar i 2D-klassmedelvärde som representerar olika orienteringar som antas av provet i glasis. Den resulterande homogena uppsättningen partiklar används som ingång för ab initio 3D-rekonstruktion för att generera en grov modell eller modeller, som sedan iterativt förfinas för att producera en eller flera högupplösta strukturer. Efter rekonstruktion utförs strukturella förfiningar för att ytterligare förbättra kryo-EM-kartans kvalitet och upplösning. Slutligen är antingen en atommodell direkt härledd från kartan, eller kartan är utrustad med atomkoordinater som erhållits någon annanstans.

Olika mjukvarupaket är tillgängliga för att utföra de uppgifter som beskrivs ovan, inklusive Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 och andra. Medan dessa program följer liknande bearbetningssteg använder de olika algoritmer, till exempel för att plocka partiklar, generera initiala modeller och förfina rekonstruktioner. Dessutom kräver dessa program en varierande nivå av användarkunskap och ingripande för att fungera, eftersom vissa är beroende av finjustering av parametrar som kan fungera som ett hinder för nya användare. Dessa avvikelser resulterar ofta i kartor med inkonsekvent kvalitet och upplösning över plattformar14, vilket får många forskare att använda flera mjukvarupaket för att förfina och validera resultat. I den här artikeln belyser vi användningen av cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 för att få en högupplöst 3D-rekonstruktion av AAV, en allmänt använd vektor för genterapi15. De ovannämnda mjukvarupaketen är gratis för akademiska användare; cryoSPARC v3 och Scipion 3 kräver licenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Skapa ett nytt cryoSPARC v3-projekt och importera data

OBS: Data förvärvades vid Oregon Health and Science University (OHSU) i Portland med hjälp av ett 300 kV Titan Krios elektronmikroskop utrustat med en Falcon 3 direkt elektrondetektor. Bilderna samlades in i ett räkneläge med en total dos på 28,38 e−/Å2 fraktionerad över 129 bildrutor och ett defokusområde från -0,5 μm till -2,5 μm, vid en pixelstorlek på 1,045 Å med EPU. Provet av AAV-DJ tillhandahölls av OHSU: s personal.

  1. Öppna cryoSPARC v3 i en webbläsare och klicka på rubriken Projekt . Välj + Lägg till för att skapa ett nytt projekt. Namnge projektet i enlighet med detta och ange en sökväg till en befintlig katalog där jobb och data sparas.
  2. Skapa en arbetsyta för projektet genom att öppna projektet, klicka på + Lägg till och välja Ny arbetsyta. Namnge arbetsytan och klicka på Skapa.
  3. Navigera till den nya arbetsytan och öppna Job Builder på den högra panelen. På den här fliken visas alla funktioner som är tillgängliga i cryoSPARC v3. Klicka på Importera filmer och ange filmens sökväg, få referensfilsökväg och ställ in förvärvsparametrar enligt följande: Rå pixelstorlek 1.045 Å, accelererande spänning 300 kV, sfärisk aberration 2.7 mm, total exponeringsdos 28.38 e-/Å^2.
  4. Klicka på Kö, välj en bana för att köra jobbet och en arbetsyta och klicka på Skapa.
    OBS: Förvärvsparametrarna är prov- och mikroskopberoende.

2. CryoSPARC v3 - filmjustering och CTF-uppskattning

  1. Öppna Patch Motion Correction (Multi). Det här jobbet kräver att filmerna importerades i steg 1.3 som indata. Öppna jobbkortet importera filmer på arbetsytan och dra Imported_movies utdata till filmplatshållaren för det nya jobbet. Köa jobbet.
    OBS: Mer information om cryoSPARC-metoderna som beskrivs i den här artikeln finns i cryoSPARC-handledningen16.
  2. Om du vill utföra CTF-uppskattning öppnar du Patch CTF Estimation (Multi). Ange mikrograferna som genererades i steg 2.1 och köa jobbet.
  3. För att inspektera de genomsnittliga och CTF-korrigerade mikrograferna och välja en delmängd för vidare bearbetning, öppna Curate Exposures och mata in de exponeringar som erhållits i steg 2.2. Köa jobbet.
  4. När jobbet går in i vänteläge klickar du på fliken Interaktion på jobbkortet, justerar parametertrösklar och accepterar eller avvisar enskilda mikrografer för vidare bearbetning. Acceptera mikrografer med väl matchade uppskattade och experimentella CTF (figur 2) och kassera dem med hög astigmatism, dålig CTF-passform och tjock is.
  5. När du bearbetar aktuella data, ställ in det övre tröskelvärdet för astigmatism till 400 Å, CTF-anpassningsupplösning till 5 Å och relativ istjocklek till 2. Klicka på Klar för att välja mikrografer för nedströms bearbetning.

3. CryoSPARC v3 - manuell och mallbaserad partikelplockning

  1. Öppna Manuell väljare, mata in godkända exponeringar från steg 2.4–2.5 och Köa jobbet. Klicka på fliken Interaktiv , ställ in Box Size (px) till 300 och klicka på några hundra partiklar över flera mikrografer och undvik att välja överlappande partiklar. Här valdes 340 partiklar över 29 mikrografer. När du är klar klickar du på Klar plockning! Extrahera partiklar.
    OBS: Detta protokoll använder manuell partikelplockning för att generera mallar för automatiskt val. Men andra metoder finns också tillgängliga17.
  2. För att generera mallar för automatiserad partikelplockning, klicka på 2D-klassificering och mata in partikelvalen som genererades i steg 3.1. Ändra antalet 2D-klasser till 10 och köa jobbet.
  3. Öppna Välj 2D-klasser. Ange partiklarna och klassmedelvärdet som erhållits i steg 3.2 och klicka på fliken Interaktiv . Välj representativa 2D-klasser med bra SNR och klicka på Klar.
    OBS: Klassmedelvärdet återspeglar olika partikelvyer. Välj klassmedelvärde som återspeglar varje vy. Målet är att ta fram väldefinierade mallar som representerar olika vyer av provet för automatiserad plockning.
  4. Öppna Mallväljaren och mata in de 2D-klasser som valdes i steg 3.3 och mikrografer från steg 2.4–2.5. Ställ in partikeldiametern (Å) på 220 Å och ställ in jobbet i kö .
  5. Om du vill inspektera de automatiska plockningarna öppnar du Välj partikelplockningar, matar in partiklarna och mikrograferna som genererades i steg 3.4 och Köar jobbet.
  6. På jobbkortet Välj partikelval klickar du på fliken Interaktiv och anger Box-storlek (px) till 300. Klicka på en enskild mikrograf, justera lowpassfiltret tills partiklarna är tydligt synliga och ställ in Normalized Cross Correlation (NCC) Threshold till 0,41 och Power Threshold mellan 54000 och 227300 .
  7. Inspektera flera mikrografer och justera vid behov tröskelvärdena så att de flesta partiklar väljs utan att inkludera falska positiva resultat. När du är klar klickar du på Klar plockning! Extrahera partiklar.
    OBS: Sanna partiklar har vanligtvis en hög NCC- och effektpoäng, vilket indikerar att de liknar mallen respektive har en hög SNR.
  8. Öppna Extract from Micrographs och mata in mikrografer och partiklar från steg 3.7. Ange Extraherad rutstorlek (px) till 300 och köa jobbet.

4. CryoSPARC v3 - 2D-klassificering

  1. Klicka på 2D-klassificering och mata in de extraherade partiklarna från steg 3.8. Ange Antalet 2D-klasser till 50 och Köa jobbet.
  2. Om du vill välja de bästa 2D-klasserna för vidare bearbetning öppnar du Välj 2D-klasser. Mata in de partiklar och klassmedelvärde som erhållits i steg 4.1. Klicka på fliken Interaktiv och välj 2D-klasser baserat på upplösningen och antalet partiklar i klassen (Figur 3). Välj inte klasser som innehåller artefakter. När du har valt klickar du på Klar.
    OBS: Vanligtvis krävs flera omgångar av 2D-klassificering för att avlägsna partiklar, som inte konvergerar till distinkta, väldefinierade klasser. Kör så många omgångar av 2D-klassificering som behövs för att ta bort sådana partiklar från datauppsättningen (figur 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio rekonstruktion och homogen förfining

  1. För att generera en initial 3D-volym, öppna Ab-initio Rekonstruktion och mata in de partiklar som erhållits i steg 4.2 eller från den slutliga 2D-klassificeringen. Justera symmetrin till icosahedral. Köa jobbet.
    OBS: Symmetrin är samplingsberoende och bör ändras i enlighet därefter. Om det är okänt, använd C1-symmetri.
  2. Öppna homogen förfining. Mata in volymen från steg 5.1 och partiklar från 4.2 eller den slutliga 2D-klassificeringen. Ändra symmetrin och köa jobbet. När jobbet är klart, inspektera Fourier Shell Correlation (FSC) kurvan och ladda ner volymen för att undersöka i UCSF Chimera18.

6. Exportera partikelkoordinater från cryoSPARC v3 och importera dem till RELION-3 med PyEM

OBS: Partikelkoordinater bär information om placeringen av enskilda partiklar i varje mikrograf. Överföring av koordinater istället för partikelstackar till RELION-3 möjliggör körning av förfiningssteg som annars inte skulle vara tillgängliga. Till exempel kräver partikelpolering tillgång till initiala filmramar. Innan du exporterar partikelkoordinater från cryoSPARC v3 till RELION-3 ska du därför importera filmer och utföra rörelsekorrigering och CTF-skattning i RELION-3. Mer information finns i RELION-3-självstudien19.

  1. Navigera till relion-3-projektkatalogen och starta RELION-3.
  2. Öppna Importera från webbläsaren av jobbtyp och ange sökvägen till film- och förvärvsparametrarna enligt steg 1.3.
  3. För att utföra rörelsekorrigering, använd UCSF MotionCor220 via RELION-3 GUI, öppna Motion Correction och ställ in standardparametrarna som i UCSF MotionCor2 manual21. Ange sökvägen till filmerna som importerades i steg 6.2. På fliken Rörelse anger du sökvägen till den körbara motioncor2.- och rörelsebanan.
    OBS: MotionCor2 kan köras parallellt med flera GPU: er.
  4. Utför CTF-uppskattning med CTFFIND-4.122 via RELION-3 GUI. Öppna CTF Estimation och mata in micrographs.star som genererades i steg 6.3. På fliken CTFFIND-4.1 anger du sökvägen till ctffind-4.1 körbar fil och anger parametrar som i RELION-3.1-självstudien19.
  5. För att kunna importera partikelstackar från cryoSPARC v3 till RELION-3 måste de först exporteras från cryoSPARC v3. I cryoSPARC v3 öppnar du jobbkortet för klassjobbet Välj 2D från steg 4.2 eller den slutliga 2D-klassificeringen. Klicka på Exportera jobb på fliken Information. Exportjobbet matar ut particles_exported.cs filen.
  6. Innan partikelkoordinater importeras från cryoSPARC v3 till RELION-3 måste den particles_exported.cs filen från steg 6.5 konverteras till .star-format. Med PyEM23 konverterar du particles_exported.cs-filen till .star-format genom att köra följande kommando: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. I RELION-3 klickar du på fliken Manuell plockning och på fliken I/O matar du in mikrograferna från CTF-förfining som beskrivs i steg 6.4. På fliken Display anger du följande parametrar: Partikeldiameter (A): 220, Lowpass-filter (A): -1 , Skala för CTF-bild: 0,5. Kör jobbet. En katalog som heter ManualPick genereras i RELION-3-hemmappen.
    OBS: Detta steg utförs för att skapa en manuell plockmappstruktur i RELION-3. När du kör manuell plockning skapas en enda .star-fil som innehåller koordinater för plockade partiklar för varje genomsnittlig mikrograf som används för plockning i RELION-3 GUI.
  8. Navigera till mappen som innehåller filen particles_exported.star från steg 6.6 och kör ett hemskrivet skript som producerar en enda manualpick.star-fil för varje genomsnittlig mikrograf som används för att plocka cryo-SPARC v3-partiklar, vilket bidrog till den slutliga 2D-klassificeringen som exporterades i steg 6.5. De resulterande koordinatfilerna sparas i mappen ManualPick/Movies.
  9. Gå tillbaka till RELION-3 och öppna jobbet manuell plockning igen . Klicka på Fortsätt. Detta visar partiklar som tidigare plockats i cryoSPARC v3 i RELION-3 GUI. Inspektera några mikrografer för att verifiera om överföringen av partikelkoordinater har uppnåtts och om partiklar är korrekt valda.

7. RELION-3 - Partikelextraktion och 2D-klassificering

  1. Klicka på Particle Extraction. På fliken I/O anger du de CTF-korrigerade mikrograferna från steg 6.4 och koordinaterna från steg 6.9. Klicka på fliken Extrahera och ändra Particle Box Size (pix) till 300. Kör jobbet.
  2. Utför 2D-klassificering för att ytterligare rengöra partikeluppsättningen som genereras i cryoSPARC v3 för att uppnå en rekonstruktion med högre upplösning. Klicka på 2D-klassificering och på fliken I/O matar du in filen particles.star som genererades i steg 7.1. På fliken Optimering anger du Antal klasser till 50 och Maskdiameter (A) till 280. Kör jobbet.
    OBS: Masken ska omfatta hela partikeln.
  3. Om du vill välja de bästa 2D-klasserna klickar du på metoden Subset Selection, matar in filen _model.star från steg 7.2 och kör jobbet. Välj klasser enligt beskrivningen i steg 4.2.
  4. Upprepa steg 7.2 och 7.3 för att avlägsna icke-konvergerande partiklar.

8. RELION-3 - 3D-förfining, maskskapande och efterbehandling

  1. Använd kartan som genereras i cryoSPARC v3 (steg 5.2) som en första modell för 3D-förfining i RELION-3. Välj metoden Importera och ställ in följande parametrar på fliken I/O : Importera råfilmer/mikrografer: Nej, Råa indatafiler: Filmer/*.mrc.
  2. Ange MTF-filen och mata in parametrarna för filmförvärv enligt beskrivningen i steg 1.3. På fliken Övriga väljer du cryoSPARC v3-mappningen som indatafil, ändrar Nodtyp till 3D-referens (.mrc) och Kör jobbet.
  3. Välj 3D Auto-Refine och på fliken I/O anger du Input Images som filen particles.star från steg 7.3 eller det senaste urvalsjobbet. Ge kryoSPARC v3-rekonstruktionen som referenskarta. Klicka på fliken Referens och ändra Initial Low-Pass filter (Å) till 50 och Symmetry till icosahedral. På fliken Optimering ändrar du maskdiametern (Å) till 280 och kör jobbet.
  4. När körningen är klar öppnar du run_class001.mrc i UCSF Chimera.
  5. I UCSF Chimera klickar du på Verktyg och under Volymdata väljer du Volymvisare. Detta öppnar ett nytt fönster för att justera volyminställningarna. Ändra steg till 1 och justera skjutreglaget tills du når nivåvärdet där kartan inte har något brus. Registrera det här värdet eftersom det kommer att användas för att skapa mask i nästa steg.
  6. Kartan som produceras från automatisk förfining återspeglar inte den sanna FSC, eftersom brus från det omgivande lösningsmedlet sänker upplösningen. Innan du efterbehandling, skapa en mask för att skilja provet från lösningsmedelsområdet.
    1. Klicka på Mask Creation och mata in run_class001.mrc från steg 8.3.
    2. Klicka på fliken Mask och justera parametrarna enligt följande: Lowpass Filter Map (Å): 10, Pixel Size (Å): 1.045, Initial Binarization Threshold: level value som erhölls i steg 8.5, Extend Binary Map så många pixlar: 3 och Lägg till en soft-edge av så många pixlar: 3. Kör jobbet.
  7. Undersök masken i UCSF Chimera. Om masken är för snäv, öka Extend Binary Map så många pixlar och / eller lägg till en mjuk kant av så många pixlar. Det är viktigt att skapa en mask med mjuka kanter, eftersom en skarp mask kan leda till övermontering.
  8. Klicka på Efterbehandling och på fliken I/O , mata in halvkartorna som skapades i steg 8.3 och maskera från 8.6. Ställ in kalibrerad pixelstorlek på 1,045 Å. På fliken Skärpa anger du följande: Uppskatta B-faktor automatiskt?: Ja, Lägsta upplösning för Auto-B-passform (A): 10, Använd din egen B-faktor?: Nej. På fliken Filter anger du Hoppa över Fsc-viktning? till Nej. Kör jobbet.

9. RELION-3 - Poleringsträning och partikelpolering

  1. Innan du korrigerar för per-partikelstråleinducerad rörelse, använd först träningsläget för att identifiera optimala rörelsespår för datauppsättningen. Öppna Bayesiansk polering och mata in de rörelsekorrigerade mikrograferna från steg 6.3, partiklar från steg 8.3 och postprocess .star-fil från steg 8.8 på fliken I /O . Klicka på fliken Träning och ställ in följande parametrar: Träna optimala parametrar: Ja, Bråkdel av Fourierpixlar för testning: 0,5, Använd så här många partiklar: 5000. Kör jobbet.
    OBS: Detta skript kommer att producera opt_params_all_groups.txt fil i relion-3 polska mappen som innehåller optimerade poleringsparametrar som krävs för att utföra följande steg.
  2. När träningsjobbet är klart klickar du på Bayesiansk polering. Klicka på fliken Träning och ställ in Träna optimala parametrar? till Nej. Välj fliken Polska och i Optimerad parameterfil anger du sökvägen till den opt_params_all_groups.txt filen från steg 9.1. Klicka på Kör.
  3. Upprepa 3D-förfining (steg 8.3) och efterbehandling (steg 8.8) med en uppsättning polerade partiklar.

10. RELION-3 - CTF och per partikelförfining

  1. Om du vill uppskatta avvikelser i högre ordning öppnar du CTF Refinement och väljer på fliken I/O under Partiklar sökvägen till .star-filen som innehåller polerade partiklar från det senaste Refine 3D-jobbet (run_data.star).
    1. Under Postprocess Star File anger du sökvägen till utdata från det senaste efterbearbetningsjobbet (steg 9.3).
    2. Välj fliken Anpassa och ställ in följande parametrar: Uppskattning (anisotrop förstoring): Nej, utför CTF-parametermontering? Nej, uppskatta Beamtilt: Ja, uppskattar också Trefoil? Ja, uppskattning 4: e ordningens förkortningar? Ja. Kör jobbet.
  2. Upprepa steg 10.1 med som indata Partiklar (från Refine3D) som genererades i föregående jobb (particles_ctf_refine.star). På fliken Anpassa ändrar du Uppskattning (anisotrop förstoring) till Ja och Kör jobbet.
  3. Upprepa steg 10.2 med som indata Partiklar (från Refine3D) som producerades i föregående jobb (particles_ctf_refine.star). På fliken Anpassa anger du följande parametrar: Uppskattning (anisotrop förstoring): Nej, Utför CTF-parameteranpassning?: Ja, Passa defokus?: Per-partikel, Passa astigmatism? Per mikrograf, Fit B-faktor?: Nej, Fit Phase-Shift: Nej, Estimate Beamtilt?: Nej, Estimate 4th Order Aberrations?: Nej. Kör den.
    OBS: Med tanke på att partikeln har tillräcklig kontrast kan fliken Fit Astigmatism? ställas in på Per-partikel. För denna datauppsättning förbättrade per-partikelstigmatismförfining inte kartans kvalitet och upplösning.
  4. Upprepa 3D-förfining med partiklarna från steg 10.3 och på fliken I/O ställer du in Använd lösningsmedelsplattade FSC?-filer? till ja. När du är klar med körningen kör du ett efterbearbetningsjobb (steg 8.8) och undersöker kartan i UCSF Chimera (steg 5.2).

11. Överföring av RELION-3-partikelkoordinater och 3D-karta till Scipion 3

  1. För att ytterligare förfina och validera RELION-3-kartan importerar du först volymen och partiklarna från det senaste efterbehandlingsjobbet (steg 10.4) till Scipion 3. Starta Scipion 3 och skapa ett nytt projekt.
  2. På den vänstra panelen Protokoll väljer du rullgardinsmenyn Importer och klickar på Importera partiklar. Ändra följande parametrar: Importera från: RELION-3, Star File: postprocess.star och ange förvärvsparametrar som i steg 1.3. Klicka på Kör.
  3. Klicka på rullgardinsmenyn Importer och välj Importera volymer. Under Importera från anger du sökvägen till RELION-3-kartan. Ändra pixelstorlek (samplingsfrekvens) Å/px till 1,045 och kör.

12. Scipion 3 - Förfining med hög upplösning

  1. Utför först en global justering. Välj rullgardinsmenyn Förfina på panelen Protokoll och klicka på Xmipp3 - highres24. Mata in de importerade partiklarna och volymerna från steg 11.2 och 11.3 som fullstora bilder respektive initialvolymer och ställ in symmetrigruppen på ikosaedrisk. På fliken Bildjustering under Vinkeltilldelning väljer du Global och anger Max målupplösning till 3 Å och Kör jobbet.
  2. När jobbet är klart klickar du på Analysera resultat. I det nya fönstret klickar du på UCSF Chimera-ikonen för att undersöka den raffinerade volymen. Klicka dessutom på Display Resolution Plots (FSC) för att se hur FSC har förändrats efter förfiningen, samt Plot Histogram with Angular Changes för att se om Euler-vinkeltilldelningarna har ändrats.
    OBS: Beroende på upplösningen på relion-3-strukturen kan detta steg upprepas flera gånger med olika värden inställda för maxmålupplösningen under fliken Vinkeltilldelning. Mer information finns i Scipion-självstudien25.
  3. Upprepa steg 12.1 med en lokal justering. Kopiera föregående jobb och ändra Välj föregående körning till Xmipp3 – highres Global. På fliken Vinkeltilldelning ändrar du Bildjustering till Lokal. Ställ in Max Target Resolution på 2,1 Å.
  4. Undersök den förfinade kartan i UCSF Chimera och analysera förändringen i FSC- och vinkeltilldelningar (steg 12.2). Upprepa lokal förfining tills upplösningen inte förbättras och vinkeltilldelningarna har konvergerat, justera Max Target Resolution efter behov.
  5. Utdatakartan från Scipion 3 kan dessutom densitetsmodifieras och skärpas i Phenix26.

13. Scipion 3 - Kartvalidering

  1. Undersök den lokala upplösningen för den slutliga kartan som genereras i Xmipp3 - highres. Öppna Xmipp - lokala MonoRes27 och mata in den slutliga volymen från föregående jobb och mask som genererades i steg 8.6. Ställ in upplösningsområdet från 1 till 6 Å med ett intervall på 0,1 Å och utför jobbet.
  2. När du är klar med körningen klickar du på Analysera resultat och undersöker upplösnings histogrammet och volymskivorna färgade efter upplösning.
  3. För att se om partiklarna är väl inriktade öppnar du Multireference Alignability28 och matar in partiklarna och volymen från steg 12.3. Klicka på Analysera resultat för att visa valideringsdiagrammet. Helst bör alla punkter grupperas runt (1.0,1.0).
  4. Öppna Xmipp3 – Validera överanpassning. Mata in partiklarna och volymerna från steg 12.3. När du är klar med körningen, analysera resultaten och inspektera övermonteringsdiagrammet. Korsning av det inriktade Gaussiska bruset och inriktade partikelkurvor indikerar överanpassning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har presenterat en omfattande SPA-pipeline för att få en högupplöst struktur med hjälp av tre olika bearbetningsplattformar: cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3. Figur 1 och figur 4 sammanfattar det allmänna bearbetningsarbetsflödet och tabell 1 beskriver förfiningsprotokoll. Dessa protokoll användes vid förfining av en 2,3 Å-struktur av AAV, vilket uppnådde nära Nyquist-upplösning.

Filmer importerades först till cryoSPARC v3 och därefter rörelse- och CTF-korrigerade för att generera genomsnittliga mikrografer. När du väljer mikrografer för vidare bearbetning är det viktigt att välja de med god CTF-passform och låg astigmatism (figur 2), eftersom inklusive mikrografer av dålig kvalitet kan hindra senare bearbetningssteg, vilket resulterar i en rekonstruktion med lägre upplösning. 27 364 partiklar plockades sedan och extraherades från de utvalda mikrograferna. Eftersom diametern på AAV är cirka 220 Å och pixelstorleken är 1.045 Å, användes en lådstorlek på 300 px. Därefter användes iterativ 2D-klassificering för att avlägsna artefakter och partiklar som inte konvergerar till stabila klasser. Exempel på utvalda och exkluderade 2D-klassmedelvärde presenteras i figur 3. Det är också viktigt att notera att klassmedelvärde som återspeglar olika konformationer av provet bör förfinas separat för att ge flera 3D-rekonstruktioner. I ett sådant fall bör flera ab initio startvolymer beräknas. Här valdes 26 741 partiklar ut och användes för ab initio-modellering och homogen förfining av en enda 2,9 Å-struktur.

Efter att ha överfört koordinater för partiklar plockade i cryoSPARC v3 till RELION-3 genomförde vi ytterligare fyra omgångar av 2D-klassificering tills datauppsättningen konvergerade till stabila 2D-klasser. Den ovan beskrivna 2D-klassificeringen avlägsnade ytterligare 3 154 partiklar från datauppsättningen. Med hjälp av strukturen som genererades i cryoSPARC v3 som en initial modell producerade 3D-förfining i RELION-3 en struktur med en nästan likvärdig upplösning på 2,95 Å. Efterföljande strukturella förfiningar, som inkluderade rörelsekorrigering per partikel och CTF-förfiningar, ökade upplösningen till 2,61 Å. En fullständig lista över de förbättringar vi utfört presenteras i tabell 1. Volymen beräknad i RELION-3 förfinades sedan ytterligare i Scipion 3 med hjälp av flera omgångar av högupplöst förfining (Xmipp3 - highres). Under efterföljande omgångar av förfining avlägsnades ytterligare 3 186 partiklar från datauppsättningen, vilket resulterade i en slutlig uppsättning av 20 401 partiklar, vilket gav en 2,3 Å rekonstruktion av AAV (figur 5 och figur 6). Således, med tanke på pixelstorleken på 1.045 Å, har våra förfiningar nästan nått Nyquist-gränsen. FSC-kurvor som representerar strukturer beräknade med hjälp av varje program visas i figur 6. Dessa FSC-kurvor indikerar upplösningsökningen i hela arbetsflödet. Eftersom upplösningen kan variera från punkt till punkt på kartan är det ofta lämpligare att presentera fördelningen av lokala resolutionsuppskattningar på kartan i stället för att rapportera en enda resolutionsuppskattning enligt ett enda kriterium (t.ex. 0,143-kriteriet) från FSC-kurvan. Således utförde vi en sådan analys med Xmipp - MonoRes i Scipion 3. Figur 7 visar en jämförelse av lokala upplösningsuppskattningar för kartor erhållna med cryoSPARC v3 och Scipion 3. Upplösningsuppskattningar vid fyra olika segment genom strukturerna (figur 7A,B) och upplösnings histogrammen (figur 7C) visar tydligt den stegvisa förbättringen av den lokala upplösningen mellan kartorna i hela arbetsflödet. FSC-kurvan beräknad med programmet Xmipp3 - highres i Scipion 3 indikerar att Nyquist-gränsen har uppnåtts (figur 6), vilket tyder på att upplösningsuppskattningen mycket sannolikt begränsas av undersampling29. MonoRes-analys som presenteras i figur 7C, tillsammans med en noggrann analys av EM-kartan och kartan som passar med atomkoordinater för AAV (figur 5) tyder dock på att en mer adekvat upplösningsuppskattning för kartan är 2,3 Å. En liknande strategi som förenar FSC:s och MonoRes resolutionsestimat har presenterats tidigare24,25. Eftersom upplösningsuppskattningar kan påverkas av masken som används under förfiningsstegen är det viktigt att se till att masken inte utesluter någon del av densiteten. Masken som användes i denna studie överlappade med 3D-rekonstruktionerna presenteras i figur 7D. Den gradvisa ökningen av upplösningen i det presenterade arbetsflödet belyser fördelen med att använda algoritmer från flera SPA-programvarupaket för att uppnå en högkvalitativ och högupplöst 3D-rekonstruktion.

In-situ-modell som bygger eller monterar kartan med en befintlig atommodell kan fungera som kvalitetskontroll för den beräknade strukturen. Vi har visualiserat den slutliga kartan i UCSF Chimera och utrustat kartan med en tidigare publicerad atommodell (PDB-ID: 7kfr)30. Figur 5 visar regioner på kryo-EM-kartan utrustade med atomkoordinater för AAV. Väldefinierade EM-densiteter möjliggör montering av sidokedjor av enskilda aminosyror, vattenmolekyler och magnesiumjoner och bekräftar överensstämmelsen med kryo-EM-kartan med atommodellen.

Figure 1
Bild 1: Komplett SPA arbetsflöde över cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 och Phenix 1.18. Steg som slutförts i cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 och Phoenix 1.18 betecknas med lila, orange, gröna respektive grå lådor. Den tid som krävs för att slutföra varje steg med hjälp av bearbetningsservern utrustad med 8 GPU: er, 40 processorer och 750 GB RAM anges i varje enskild låda. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Urval av mikrografer för nedströms bearbetning i kryoSPARC v3. (A) Mikrografer med väl matchade uppskattade och experimentella Thon-ringar användes för vidare bearbetning, medan de med hög astigmatism och dålig passform (B) kasserades. Mikrografer med CTF-passform över 5 Å, astigmatism över 400 Å och relativ istjocklek under 2 avlägsnades från vidare bearbetning, dvs 70/395 mikrografer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Välja 2D-klasser. 2D-klassmedelvärde som innehåller väldefinierade klasser väljs (A), och de med låg upplösning, brus och partiella partiklar avvisas (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Arbetsflöde och representativa resultat för AAV-bearbetning över cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3. Steg som slutförts i cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 betecknas med lila, orange respektive gröna pilar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Högupplöst struktur av AAV visar väldefinierade EM-densiteter som representerar olika sekundära strukturelement och individuella aminosyras sidokedjor. (A) En slutlig karta över AAV. (B) En del av kartan som representerar betaark försedda med atomkoordinater för AAV (PDB-ID: 7kfr)30. (C) Kartlägg densiteter som representerar enskilda aminosyror. Från vänster till höger: arginin, fenylalanin och tryptofan. (D) Högupplösta egenskaper på kartan inkluderar vattenmolekyler som presenteras i röda och magnesiumjoner som presenteras som gröna sfärer. Mg2+ jon som visas i figuren koordineras av histidin (vänster) och argininrester. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: FSC-kurvor från cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 visar ökande upplösning i hela arbetsflödet. Medan FSC-kurvan beräknad med programmet Xmipp3 - highres i Scipion 3 indikerar att Nyquist-gränsen har uppnåtts, vilket tyder på att upplösningsuppskattningen begränsas av undersampling29, presenteras en mer adekvat analys av kartupplösningen i figur 7 och diskuteras i avsnittet Representativa resultat24,25. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Validering av den slutliga rekonstruktionen i Scipion 3 med Xmipp - MonoRes. Kartans upplösning beskrivs bättre genom att presentera lokala upplösningsfördelningar snarare än en enda upplösningsuppskattning enligt ett enda kriterium från FSC-kurvan. (A-B) Panelerna A och B visar olika skivor från kartor som genereras i cryoSPARC v3 respektive Scipion 3. (C) Histogram som visar en systematisk ökning av den lokala upplösningen för kartor beräknade i kryoSPARC v3 (rosa staplar) och Scipion 3 (blå staplar). (D) Masken (grå) som används för lokala upplösningsberäkningar innehåller alla delar av AAV-densiteterna som förfinats i båda programmen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Program Typ av förfining Manus
cryoSPARC v3 Homogen förfining Homogen förfining
Ojämn förfining Ojämn förfining
Heterogen förfining Heterogen förfining
Rörelsekorrigering per partikel Lokal rörelsekorrigering
RELION-3 3D-förfining Förfina3D
Efterbehandling - B-faktorslipning, MTF-korrigering Förfina3D
Polering av partiklar Bayesiansk polering
CTF-förfining - strållutning CtfRefine
CTF-förfining - anisotrop förstoring CtfRefine
CTF-förfining - per partikeldefokusering, per partikel / mikrografastigmatism CtfRefine
Ewaldsfärens krökningskorrigering Relion_reconstruct
Scipion 3 Förfining med hög upplösning Xmipp3 - highres
Fenix 1.18 Densitetsmodifiering och skärpning ResolveCryoEM

Tabell 1: Förbättringar som implementeras i hela arbetsflödet. Huruvida vissa förbättringar är tillämpliga på ett visst projekt beror på datakvalitet och förvärvsparametrar. Till exempel kan Ewald-sfärens krökningskorrigering tillämpas på kartor som redan har hög upplösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den här artikeln presenterar vi ett robust SPA-arbetsflöde för kryo-EM-databehandling över olika mjukvaruplattformar för att uppnå högupplösta 3D-rekonstruktioner (Figur 1). Detta arbetsflöde är tillämpligt på en mängd olika biologiska makromolekyler. De efterföljande stegen i protokollet beskrivs i figur 4, inklusive förbehandling av film, partikelplockning och klassificering samt flera metoder för strukturförfining (tabell 1) och validering. Bearbetningssteg i cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 har presenterats, liksom metoder för överföring av data mellan mjukvarupaketen. Vi har visat de mellanliggande strukturerna som erhållits i hela protokollet med ökande upplösning (figur 4, figur 6 och figur 7).

Medan metoderna som beskrivs i detta manuskript kan användas för strukturbestämning av olika proteiner och biologiska sammansättningar, är det viktigt att notera att AAV är en idealisk kandidat för högupplöst strukturbestämning av kryo-EM och SPA, eftersom dess stora storlek ger hög kontrast i mikroskopet och ikosaedrisk symmetri ger partiklar med 60-faldig subenhetsredundans. Att få högupplösta rekonstruktioner blir allt svårare för små (dvs. mindre än 100 kD), dynamiska och heterogena prover. För att framgångsrikt kunna genomföra detta protokoll är det viktigt att många högkvalitativa filmer samlas in för bearbetning. Med rådata av dålig kvalitet är det inte möjligt att få en högupplöst och högkvalitativ rekonstruktion. Till exempel, om istjockleken inte är optimal för strukturbestämning eller om partiklar fäster vid is-vattengränssnittet eller uppvisar föredragna orienteringar, se över gallrets frysningsförhållanden.

Ett annat viktigt steg i arbetsflödet är partikelplockning och extraktion. Under partikelplockning bör lådans storlek vara ungefär 1,4-2,5 gånger större än partikelns längsta axel, eftersom tillräcklig lådstorlek krävs för att fånga högupplöst information som sprids ut på grund av defokusering. Större lådstorlekar kräver dock längre bearbetningstider på grund av den ökade storleken på filer som genereras under partikelextraktion. När du väljer en lådstorlek, överväga partikeldiameter och pixelstorlek. Med många partiklar kanske användaren vill bin partiklar under extraktionen för initial bearbetning och sedan extrahera partiklar i full storlek för slutlig förfining. Detta protokoll använder manuell partikelplockning för att generera mallar för automatiskt val. CryoSPARC v3 erbjuder dock också helautomatiska plockningsmetoder, inklusive en blobbaserad plockare och en Topaz-omslag, som använder djupinlärning för att välja partiklar baserat på tidigare val. Även om dessa algoritmer är mycket robusta, skulle ett betydande antal val senare behöva tas bort genom 2D- och 3D-klassificering.

Kritiska steg inkluderar också 2D- och 3D-klassificering som används för att avlägsna artefakter, såsom strålningsskadade partiklar och separera olika strukturella former av provet som finns i provet. Antalet 2D-klasser som anges av användaren bör bero på antalet partiklar som extraheras från mikrografer, kontrast och heterogenitet i provet, eftersom målet är att separera varje enskild vy av partikeln i en separat 2D-klass. Som en allmän regel lägger du till en 2D-klass för varje 100 partiklar, och om du bearbetar ett nytt prov med ett stort antal partiklar är 100 klasser en bra utgångspunkt. Om en låg eller måttlig upplösning erhålls även efter många omgångar av 2D- och 3D-klassificering, försök att extrahera partiklar med en större lådstorlek för att se om mer strukturell information kan erhållas. När man rapporterar upplösningen av den slutliga rekonstruktionen bör man analysera FSC-kurvan som erhållits enligt guldstandardmetoden, tillsammans med de lokala upplösningsuppskattningarna och noggrann inspektion av kartdensiteterna, liksom deras överenskommelse med atommodellen.

För förfining av virusstrukturerna har Ewaldsfärens krökningskorrigering som implementerats i RELION-3 visat förbättringar vid hög upplösning31. Om du förfinar strukturer av dynamiska multiproteinkomplex, prova 3D-flerkroppsförfining implementerad i RELION-3 eller fokuserad klassificering med bildsubtraktion implementerad i RELION-3 och cryoSPARC v3. Om heterogeniteten inte kan lösas beräkningsmässigt är det nödvändigt att se över provberedningsförhållandena32. Otillräcklig renhet eller otillräcklig beredning som resulterar i proteinnedbrytning kommer att hindra kvaliteten på 3D-rekonstruktionen. Dessutom begränsar buffertförhållanden som destabiliserar proteiner eller främjar aggregering allvarligt antalet väldefinierade partiklar som kan användas för strukturberäkning. För att mest effektivt kunna använda de metoder som presenteras här är det således absolut nödvändigt att identifiera optimala förhållanden för provstabilitet. Vi rekommenderar negativ färgning av elektronmikroskopi för att screena proverna före kryo-EM.

Eftersom kryo-EM har blivit den föredragna metoden för 3D-strukturbestämning för ett ökande antal strukturbiologer blir behovet av ett integrerat och robust arbetsflöde för bildbehandling och strukturbestämning tydligare. CryoSPARC erbjuder ett lättanvänt, webbaserat grafiskt användargränssnitt (GUI) som gör det möjligt för användare på alla erfarenhetsnivåer att snabbt bearbeta data och beräkna en 3D-struktur. I synnerhet använder CryoSPARC en stokastisk gradientnedstigning för att utföra ab initio 3D-rekonstruktion. Dessutom använder programvaran en gren- och bunden sannolikhetsoptimeringsalgoritm för snabb 3D-kartförfining7. Bearbetningspipelinen som beskrivs i den här artikeln använder cryoSPARC v3 för att ge en första 3D-karta. 3D-rekonstruktionen förfinas sedan i RELION-3, ett populärt paket som använder ett empiriskt Bayesianskt tillvägagångssätt för att uppskatta kritiska parametrar baserat på användarens datauppsättning, vilket minskar behovet av expertkunskap för programdrift10. Specifikt använder vi Bayesiansk polering för rörelsekorrigering per partikel och CTF-förfiningar för att förbättra upplösningen. Slutligen förfinas och valideras den resulterande strukturen ytterligare i Scipion 311, ett integrerat Python-skal som stöder algoritmer från flera plattformar, inklusive Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 och andra. Medan många olika mjukvarupaket är tillgängliga för kryo-EM-användare, finns det för närvarande ingen universell SPA-plattform som accepteras av fältet. Även om SPA arbetsflödet kan köras fullständigt i något av de tre programvarupaket som beskrivs i den här artikeln kan olika algoritmer ge varierande resultat. Följaktligen måste enskilda steg anpassas beroende på urvalet och kvaliteten på data. Till exempel, för den nuvarande datauppsättningen ökade 3Drefine i RELION-3 upplösningen av 3D-rekonstruktionen, medan Nonuniform förfining i cryoSPARC v3 ledde till en liten upplösningsminskning. Således är det mycket fördelaktigt att använda en mängd olika program för att omberäkna strukturer för att uppnå optimal kvalitet och upplösning och för att underlätta validering av rekonstruktionerna. Även om Scipion 3 innehåller många algoritmer från cryoSPARC v3 och RELION-3, är de senaste implementeringarna av dessa program inte omedelbart tillgängliga i Scipion. Till exempel, av de program som används i detta manuskript, erbjuder endast RELION-3 Ewald Sphere Curvature Correction genom skriptet Relion_reconstruct. Pipelinen som presenteras i den här artikeln ger en guide för både nya och erfarna användare att framgångsrikt använda algoritmer implementerade i cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 för att beräkna 3D-strukturer med nära atomär upplösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Carlos Oscar Sorzano för hjälp med Scipion3 installation och Kilian Schnelle och Arne Moeller för hjälp med dataöverföring mellan olika bearbetningsplattformar. En del av denna forskning stöddes av NIH-anslaget U24GM129547 och utfördes vid PNCC vid OHSU och nås via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsrad av Office of Biological and Environmental Research. Denna studie stöddes av ett startbidrag från Rutgers University till Arek Kulczyk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Tags

Biokemi utgåva 179 kryoelektronmikroskopi kryo-EM enpartikelanalys SPA cryoSPARC RELION Scipion bildbehandling strukturberäkning AAV
Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A… More

DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. J. Vis. Exp. (179), e63387, doi:10.3791/63387 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter