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Biochemistry

Un flux de travail robuste de traitement par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à particule unique avec cryoSPARC, RELION et Scipion

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63387
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

Summary

Cet article explique comment utiliser efficacement trois plates-formes de traitement cryo-EM, à savoir cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3, pour créer un flux de travail unique et robuste applicable à une variété d’ensembles de données monoparticulaires pour la détermination de la structure à haute résolution.

Abstract

Les progrès récents dans les logiciels d’instrumentation et de traitement d’images ont fait de la cryo-microscopie électronique à particule unique (cryo-EM) la méthode préférée des biologistes structuraux pour déterminer les structures à haute résolution d’une grande variété de macromolécules. Plusieurs suites logicielles sont disponibles pour les utilisateurs nouveaux et experts pour le traitement d’image et le calcul de structure, qui rationalisent le même flux de travail de base: les films acquis par les détecteurs de microscope subissent une correction pour l’estimation de la fonction de transfert de mouvement et de contraste induit par faisceau (CTF). Ensuite, les images de particules sont sélectionnées et extraites des images de film moyennées pour une classification itérative 2D et 3D, suivie d’une reconstruction, d’un raffinement et d’une validation 3D. Parce que divers progiciels utilisent des algorithmes différents et nécessitent différents niveaux d’expertise pour fonctionner, les cartes 3D qu’ils génèrent diffèrent souvent en qualité et en résolution. Ainsi, les utilisateurs transfèrent régulièrement des données entre une variété de programmes pour des résultats optimaux. Cet article fournit un guide permettant aux utilisateurs de naviguer dans un flux de travail à travers les progiciels populaires : cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 afin d’obtenir une structure de résolution quasi atomique du virus adéno-associé (AAV). Nous détaillons d’abord un pipeline de traitement d’image avec cryoSPARC v3, car ses algorithmes efficaces et son interface graphique facile à utiliser permettent aux utilisateurs d’arriver rapidement à une carte 3D. Dans l’étape suivante, nous utilisons PyEM et des scripts internes pour convertir et transférer les coordonnées des particules de la meilleure reconstruction 3D obtenue dans cryoSPARC v3 vers RELION-3 et Scipion 3 et recalculer les cartes 3D. Enfin, nous décrivons les étapes à suivre pour affiner et valider davantage les structures résultantes en intégrant les algorithmes de RELION-3 et Scipion 3. Dans cet article, nous décrivons comment utiliser efficacement trois plates-formes de traitement pour créer un flux de travail unique et robuste applicable à une variété d’ensembles de données pour la détermination de la structure haute résolution.

Introduction

La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) et l’analyse monoparticulaire (SPA) permettent de déterminer la structure d’une grande variété d’assemblages biomoléculaires à l’état hydraté, contribuant ainsi à éclairer les rôles de ces macromolécules dans les détails atomiques. Les améliorations apportées à l’optique du microscope, au matériel informatique et aux logiciels de traitement d’images ont permis de déterminer les structures des biomolécules à une résolution supérieure à 2 Å1,2,3. Plus de 2 300 structures cryo-EM ont été déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB) en 2020, contre 192 structures en 20144, ce qui indique que la cryo-EM est devenue la méthode de choix pour de nombreux biologistes structuraux. Nous décrivons ici un flux de travail combinant trois programmes SPA différents pour la détermination de la structure à haute résolution (Figure 1).

L’objectif de SPA est de reconstruire les volumes 3D d’un spécimen cible à partir d’images 2D bruyantes enregistrées par un détecteur de microscope. Les détecteurs collectent des images sous forme de films avec des images individuelles du même champ de vision. Afin de préserver l’échantillon, les trames sont collectées avec une faible dose d’électrons et ont donc un faible rapport signal/bruit (SNR). De plus, l’exposition aux électrons peut induire un mouvement dans les grilles cryo-EM vitrifiées, ce qui entraîne un flou de l’image. Pour surmonter ces problèmes, les cadres sont alignés pour corriger le mouvement induit par le faisceau et moyennés pour produire une micrographie avec un SNR accru. Ces micrographies subissent ensuite une estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) pour tenir compte des effets de la mise au point et des aberrations imposées par le microscope. À partir des micrographies corrigées par le CTF, les particules individuelles sont sélectionnées, extraites et triées en moyennes de classe 2D représentant différentes orientations adoptées par l’échantillon dans la glace vitrée. L’ensemble homogène de particules résultant est utilisé comme entrée pour la reconstruction 3D ab initio afin de générer un ou plusieurs modèles grossiers, qui sont ensuite affinés de manière itérative pour produire une ou plusieurs structures à haute résolution. Après la reconstruction, des améliorations structurelles sont effectuées pour améliorer encore la qualité et la résolution de la carte cryo-EM. Enfin, soit un modèle atomique est directement dérivé de la carte, soit la carte est équipée de coordonnées atomiques obtenues ailleurs.

Différents progiciels sont disponibles pour accomplir les tâches décrites ci-dessus, notamment Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 et autres. Bien que ces programmes suivent des étapes de traitement similaires, ils utilisent différents algorithmes, par exemple, pour sélectionner des particules, générer des modèles initiaux et affiner les reconstructions. De plus, ces programmes nécessitent un niveau variable de connaissances et d’intervention de l’utilisateur pour fonctionner, car certains dépendent du réglage fin des paramètres qui peuvent constituer un obstacle pour les nouveaux utilisateurs. Ces écarts se traduisent souvent par des cartes de qualité et de résolution incohérentes sur toutes les plates-formes14, ce qui incite de nombreux chercheurs à utiliser plusieurs progiciels pour affiner et valider les résultats. Dans cet article, nous soulignons l’utilisation de cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 pour obtenir une reconstruction 3D haute résolution de l’AAV, un vecteur largement utilisé pour la thérapie génique15. Les progiciels susmentionnés sont gratuits pour les utilisateurs académiques; cryoSPARC v3 et Scipion 3 nécessitent des licences.

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Protocol

1. Création d’un nouveau projet cryoSPARC v3 et importation de données

REMARQUE: Les données ont été acquises à l’Oregon Health and Science University (OHSU) à Portland à l’aide d’un microscope électronique Titan Krios de 300 kV équipé d’un détecteur d’électrons directs Falcon 3. Les images ont été collectées en mode comptage avec une dose totale de 28,38 e−/Å2 fractionnée sur 129 images, et une plage de mise au point de -0,5 μm à -2,5 μm, à une taille de pixel de 1,045 Å en utilisant l’EPU. L’échantillon d’AAV-DJ a été fourni par le personnel de l’OHSU.

  1. Ouvrez cryoSPARC v3 dans un navigateur Web et cliquez sur l’en-tête Projets . Sélectionnez + Ajouter pour créer un nouveau projet. Intitulez le projet en conséquence et fournissez un chemin d’accès à un répertoire existant où les tâches et les données seront enregistrées.
  2. Créez un espace de travail pour le projet en ouvrant le projet, en cliquant sur + Ajouter, puis en sélectionnant Nouvel espace de travail. Intitulez l’espace de travail et cliquez sur Créer.
  3. Accédez au nouvel espace de travail et ouvrez job builder dans le panneau de droite. Cet onglet affiche toutes les fonctions disponibles dans cryoSPARC v3. Cliquez sur Importer des films et indiquez le chemin des films, obtenez le chemin du fichier de référence et définissez les paramètres d’acquisition comme suit: Taille de pixel brute 1.045 Å, Tension d’accélération 300 kV, Aberration sphérique 2,7 mm, Dose totale d’exposition 28.38 e-/Å^2.
  4. Cliquez sur File d’attente, sélectionnez une voie pour exécuter le travail et un espace de travail, puis cliquez sur Créer.
    REMARQUE: Les paramètres d’acquisition dépendent de l’échantillon et du microscope.

2. CryoSPARC v3 - alignement du film et estimation CTF

  1. Ouvrez Patch Motion Correction (Multi). Cette tâche nécessite l’importation des films à l’étape 1.3 en entrée. Ouvrez la fiche de travail d’importation de films dans l’espace de travail et faites glisser la sortie Imported_movies vers l’espace réservé des films sur la nouvelle tâche. Mettre le travail en file d’attente .
    REMARQUE : Pour plus d’informations sur les méthodes cryoSPARC décrites dans cet article, consultez le didacticiel cryoSPARC16.
  2. Pour effectuer une estimation CTF, ouvrez Patch CTF Estimation (Multi). Entrez les micrographies générées à l’étape 2.1 et Mettez la tâche en file d’attente .
  3. Pour inspecter les micrographies moyennées et corrigées par le CTF et sélectionner un sous-ensemble pour un traitement ultérieur, ouvrez Curate Exposures et entrez les expositions obtenues à l’étape 2.2. Mettre le travail en file d’attente .
  4. Une fois que la tâche est entrée en mode Attente , cliquez sur l’onglet Interaction de la fiche de tâche, ajustez les seuils de paramètres et acceptez ou rejetez des micrographies individuelles pour un traitement ultérieur. Acceptez les micrographies avec des CTF estimés et expérimentaux bien appariés (Figure 2) et jetez celles qui ont un astigmatisme élevé, un mauvais ajustement CTF et une glace épaisse.
  5. Lors du traitement des données actuelles, définissez le seuil supérieur d’astigmatisme à 400 Å, la résolution d’ajustement CTF à 5 Å et l’épaisseur relative de la glace à 2. Cliquez sur Terminé pour sélectionner les micrographies à traiter en aval.

3. CryoSPARC v3 - prélèvement manuel et basé sur un modèle de prélèvement de particules

  1. Ouvrez le sélecteur manuel, entrez les expositions acceptées des étapes 2.4 à 2.5 et mettez le travail en file d’attente . Cliquez sur l’onglet Interactif , définissez la taille de la boîte (px) sur 300, cliquez sur quelques centaines de particules sur plusieurs micrographies et évitez de sélectionner des particules qui se chevauchent. Ici, 340 particules réparties sur 29 micrographies ont été sélectionnées. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Terminé le prélèvement! Extraire des particules.
    REMARQUE: Ce protocole utilise la sélection manuelle des particules pour générer des modèles de sélection automatique. Cependant, d’autres méthodes sont également disponibles17.
  2. Pour générer des modèles pour la sélection automatisée de particules, cliquez sur Classification 2D et entrez les sélections de particules générées à l’étape 3.1. Modifiez le nombre de classes 2D sur 10 et mettez le travail en file d’attente .
  3. Ouvrez Sélectionner des classes 2D. Entrez les particules et les moyennes de classe obtenues à l’étape 3.2 et cliquez sur l’onglet Interactif . Sélectionnez des classes 2D représentatives avec un bon SNR et cliquez sur Terminé.
    REMARQUE : Les moyennes de classe reflètent différentes vues de particules. Sélectionnez des moyennes de classe qui reflètent chaque vue. L’objectif est de produire des modèles bien définis représentant différentes vues de l’échantillon pour le prélèvement automatisé.
  4. Ouvrez le sélecteur de modèles et entrez les classes 2D sélectionnées à l’étape 3.3 et les micrographies des étapes 2.4 à 2.5. Définissez le diamètre des particules (Å) sur 220 Å et mettez la tâche en file d’attente .
  5. Pour inspecter les prélèvements automatisés, ouvrez Sélectionner les prélèvements de particules, entrez les particules et les micrographies générées à l’étape 3.4 et mettez la tâche en file d’attente .
  6. Sur la fiche de travail Sélectionner les choix de particules, cliquez sur l’onglet Interactif et définissez la taille de la boîte (px) sur 300. Cliquez sur une micrographie individuelle, ajustez le filtre passe-bas jusqu’à ce que les particules soient clairement visibles et définissez le seuil de corrélation croisée normalisée (NCC) à 0,41 et le seuil de puissance entre 54000 et 227300 .
  7. Inspectez plusieurs micrographies et, si nécessaire, ajustez les seuils de manière à ce que la plupart des particules soient sélectionnées sans inclure de faux positifs. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Terminé la cueillette! Extraire des particules.
    REMARQUE: Les vraies particules ont généralement un NCC et un score de puissance élevés, ce qui indique qu’elles sont similaires au modèle et ont un SNR élevé, respectivement.
  8. Ouvrez Extraire des micrographies et saisir les micrographies et les particules de l’étape 3.7. Définissez la taille de la boîte extraite (px) sur 300 et mettez le travail en file d’attente .

4. CryoSPARC v3 - Classification 2D

  1. Cliquez sur Classification 2D et entrez les particules extraites de l’étape 3.8. Définissez le nombre de classes 2D sur 50 et mettez le travail en file d’attente .
  2. Pour sélectionner les meilleures classes 2D pour un traitement ultérieur, ouvrez Sélectionner des classes 2D. Entrez les particules et les moyennes de classe obtenues à l’étape 4.1. Cliquez sur l’onglet Interactif et choisissez des classes 2D en fonction de la résolution et du nombre de particules dans la classe (Figure 3). Ne sélectionnez pas de classes contenant des artefacts. Après avoir sélectionné, cliquez sur Terminé.
    REMARQUE: Habituellement, plusieurs tours de classification 2D sont nécessaires pour éliminer les particules, qui ne convergent pas en classes distinctes et bien définies. Exécutez autant de tours de classification 2D que nécessaire pour supprimer ces particules de l’ensemble de données (Figure 3).

5. CryoSPARC v3 - reconstruction ab-initio et raffinement homogène

  1. Pour générer un volume 3D initial, ouvrez Ab-initio Reconstruction et entrez les particules obtenues à l’étape 4.2 ou à partir de la classification 2D finale. Ajuster la symétrie à l’icosaédrique. Mettre le travail en file d’attente .
    REMARQUE : La symétrie dépend de l’échantillon et doit être modifiée en conséquence. Si elle est inconnue, utilisez la symétrie C1.
  2. Ouvrir le raffinement homogène. Entrez le volume de l’étape 5.1 et les particules de la 4.2 ou la classification 2D finale. Modifiez la symétrie et mettez le travail en file d’attente . Lorsque la tâche est terminée, inspectez la courbe FSC (Fourier Shell Correlation) et téléchargez le volume à examiner dans UCSF Chimera18.

6. Exportation des coordonnées des particules de cryoSPARC v3 et importation dans RELION-3 à l’aide de PyEM

REMARQUE: Les coordonnées des particules transportent des informations sur l’emplacement des particules individuelles dans chaque micrographie. Le transfert de coordonnées au lieu de piles de particules vers RELION-3 permet d’exécuter des étapes de raffinement qui, autrement, ne seraient pas disponibles. Par exemple, le polissage des particules nécessite l’accès aux images de film initiales. Par conséquent, avant d’exporter les coordonnées des particules de cryoSPARC v3 vers RELION-3, importez des films et effectuez une correction de mouvement et une estimation CTF dans RELION-3. Voir le tutoriel RELION-319 pour plus de détails.

  1. Accédez au répertoire du projet RELION-3 et lancez RELION-3.
  2. Ouvrez Importer à partir du navigateur de type de tâche et spécifiez le chemin d’accès aux films et aux paramètres d’acquisition comme à l’étape 1.3.
  3. Pour effectuer une correction de mouvement, utilisez UCSF MotionCor220 via l’interface graphique RELION-3, ouvrez Correction de mouvement et définissez les paramètres par défaut comme dans le manuel UCSF MotionCor2221. Entrez le chemin d’accès aux films importés à l’étape 6.2. Sous l’onglet Mouvement, spécifiez le chemin d’accès à l’exécutable motioncor2.
    REMARQUE: MotionCor2 peut être exécuté en parallèle à l’aide de plusieurs GPU.
  4. Effectuez une estimation CTF à l’aide de CTFFIND-4.122 via l’interface graphique RELION-3. Ouvrez CTF Estimation et entrez le fichier micrographs.star généré à l’étape 6.3. Sous l’onglet CTFFIND-4.1, spécifiez le chemin d’accès à l’exécutable CTFFIND-4.1 et définissez les paramètres comme dans le didacticiel RELION-3.119.
  5. Pour importer des piles de particules de cryoSPARC v3 vers RELION-3, elles doivent d’abord être exportées de cryoSPARC v3. Dans cryoSPARC v3, ouvrez la fiche de travail de la tâche de classe Select 2D à partir de l’étape 4.2 ou de la classification 2D finale. Dans l’onglet Détails , cliquez sur Exporter le travail. Exporter la tâche génère le fichier particles_exported.cs.
  6. Avant d’importer les coordonnées des particules de cryoSPARC v3 vers RELION-3, le fichier particles_exported.cs de l’étape 6.5 doit être converti au format .star. À l’aide de PyEM23, convertissez le fichier particles_exported.cs au format .star en exécutant la commande suivante : csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. Dans RELION-3, cliquez sur l’onglet Prélèvement manuel et sur l’onglet E/ S, entrez les micrographies de l’affinement CTF décrit à l’étape 6.4. Sous l’onglet Affichage , entrez les paramètres suivants : Diamètre des particules (A) : 220, Filtre passe-bas (A) : -1 , Échelle de l’image CTF : 0,5. Exécutez le travail. Un répertoire appelé ManualPick est généré dans le dossier de base DE RELION-3.
    REMARQUE : Cette étape est effectuée pour créer une structure de dossiers de prélèvement manuel dans RELION-3. Lors de l’exécution de la sélection manuelle, un seul fichier .star contenant les coordonnées des particules sélectionnées est créé pour chaque micrographie moyenne utilisée pour la sélection dans l’interface graphique RELION-3.
  8. Accédez au dossier contenant le fichier particles_exported.star de l’étape 6.6 et exécutez un script écrit à la maison produisant un seul fichier manualpick.star pour chaque micrographie moyenne utilisée pour la sélection des particules cryo-SPARC v3, ce qui a contribué à la classification 2D finale exportée à l’étape 6.5. Les fichiers de coordonnées résultants sont enregistrés dans le dossier ManualPick/Movies.
  9. Revenez à RELION-3 et rouvrez la tâche prélèvement manuel . Cliquez sur Continuer. Cela affichera les particules précédemment sélectionnées dans cryoSPARC v3 dans l’interface graphique de RELION-3. Inspectez quelques micrographies pour vérifier si le transfert des coordonnées des particules a été effectué et si les particules sont correctement sélectionnées.

7. RELION-3 - Extraction de particules et classification 2D

  1. Cliquez sur Extraction de particules. Sous l’onglet E/ S, entrez les micrographies corrigées CTF de l’étape 6.4 et les coordonnées de l’étape 6.9. Cliquez sur l’onglet Extraire et modifiez la taille de la boîte à particules (pix) à 300. Exécutez le travail.
  2. Effectuez une classification 2D pour nettoyer davantage l’ensemble de particules générées dans cryoSPARC v3 afin d’obtenir une reconstruction à plus haute résolution. Cliquez sur Classification 2D et sur l’onglet E/S , entrez le fichier particles.star généré à l’étape 7.1. Sous l’onglet Optimisation , définissez le nombre de classes sur 50 et le diamètre du masque (A) sur 280. Exécutez le travail.
    REMARQUE: Le masque doit englober la particule entière.
  3. Pour choisir les meilleures classes 2D, cliquez sur la méthode Sélection de sous-ensembles , entrez le fichier _model.star de l’étape 7.2 et exécutez le travail. Sélectionnez les classes comme décrit à l’étape 4.2.
  4. Répétez les étapes 7.2 et 7.3 pour éliminer les particules non convergentes.

8. RELION-3 - Raffinement 3D, création de masques et post-traitement

  1. Utilisez la carte générée dans cryoSPARC v3 (étape 5.2) comme modèle initial pour le raffinement 3D dans RELION-3. Sélectionnez la méthode Import et définissez les paramètres suivants sous l’onglet E/S : Importer des films/micrographies bruts : Non, Fichiers d’entrée bruts : Films/*.mrc.
  2. Fournissez le fichier MTF et entrez les paramètres d’acquisition de film comme décrit à l’étape 1.3. Sous l’onglet Autres , sélectionnez la carte cryoSPARC v3 comme fichier d’entrée, remplacez Type de nœud par Référence 3D (.mrc) et Exécutez la tâche.
  3. Sélectionnez 3D Auto-Refine et, sous l’onglet E/S , définissez Input Images comme fichier particles.star à partir de l’étape 7.3 ou de la dernière tâche de sélection. Donnez la reconstruction cryoSPARC v3 comme carte de référence. Cliquez sur l’onglet Référence et remplacez le filtre passe-bas initial (Å) par 50 et la symétrie par icosaédrique. Sous l’onglet Optimisation , modifiez le diamètre du masque (Å) sur 280 et exécutez la tâche.
  4. Une fois l’exécution terminée, ouvrez run_class001.mrc dans UCSF Chimera.
  5. Dans UCSF Chimera, cliquez sur Outils et sous Volume Data, sélectionnez Volume Viewer. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre pour régler les paramètres de volume. Changez l’étape sur 1 et ajustez le curseur jusqu’à ce qu’il atteigne la valeur de niveau où la carte n’a pas de bruit. Enregistrez cette valeur, car elle sera utilisée pour la création de masques à l’étape suivante.
  6. La carte produite à partir de l’auto-raffinement ne reflète pas le véritable FSC, car le bruit du solvant environnant réduit la résolution. Avant le post-traitement, créez un masque pour distinguer l’échantillon de la région du solvant.
    1. Cliquez sur Création de masque et saisissez run_class001.mrc à partir de l’étape 8.3.
    2. Cliquez sur l’onglet Masque et ajustez les paramètres comme suit: Carte de filtre passe-bas (Å): 10, Taille de pixel (Å): 1.045, Seuil de binarisation initial: la valeur de niveau obtenue à l’étape 8.5, Étendre la carte binaire autant de pixels: 3 et Ajouter un bord souple de ce nombre de pixels: 3. Exécutez le travail.
  7. Examinez le masque dans UCSF Chimera. Si le masque est trop serré, augmentez Étendre la carte binaire de autant de pixels et/ou Ajoutez un bord souple de ce nombre de pixels. Il est important de créer un masque avec des bords doux, car un masque tranchant peut entraîner un surajustement.
  8. Cliquez sur Post-traitement et sur l’onglet E/S , entrez les demi-cartes créées à l’étape 8.3 et masquez à partir de 8.6. Définissez la taille de pixel calibrée sur 1,045 Å. Sous l’onglet Netteté , entrez ce qui suit : Estimer le facteur B automatiquement ?: Oui, Résolution la plus basse pour l’ajustement auto-B (A) : 10, Utilisez votre propre facteur B ?: Non. Sous l’onglet Filtre , définissez Ignorer la pondération Fsc ? sur Non. Exécuter la tâche.

9. RELION-3 - Formation au polissage et au polissage des particules

  1. Avant de corriger le mouvement induit par faisceau par particule, utilisez d’abord le mode d’entraînement pour identifier les pistes de mouvement optimales pour l’ensemble de données. Ouvrez Bayesian Polishing et sous l’onglet E/S , entrez les micrographies corrigées du mouvement de l’étape 6.3, les particules de l’étape 8.3 et le fichier .star post-traitement de l’étape 8.8. Cliquez sur l’onglet Entraînement et définissez les paramètres suivants : Paramètres optimaux de l’entraînement : Oui, Fraction de pixels de Fourier pour les tests : 0,5, Utiliser autant de particules : 5000. Exécutez le travail.
    REMARQUE : Ce script produira opt_params_all_groups.txt fichier dans le dossier polonais RELION-3 contenant les paramètres de polissage optimisés requis pour l’exécution de l’étape suivante.
  2. Une fois le travail de formation terminé, cliquez sur Polissage bayésien. Cliquez sur l’onglet Formation et définissez Paramètres optimaux du train? sur Non. Sélectionnez l’onglet Polonais et, dans Fichier de paramètres optimisé, spécifiez le chemin d’accès au fichier opt_params_all_groups.txt à partir de l’étape 9.1. Cliquez sur Exécuter.
  3. Répétez le raffinement 3D (étape 8.3) et le post-traitement (étape 8.8) avec un ensemble de particules polies.

10. RELION-3 - CTF et raffinements par particule

  1. Pour estimer les aberrations d’ordre supérieur, ouvrez CTF Refinement et, sous l’onglet E/S sous Particules, sélectionnez le chemin d’accès au fichier .star contenant des particules polies de la tâche Refine 3D récente (run_data.star).
    1. Sous Postprocess Star File, définissez le chemin d’accès à la sortie de la dernière tâche de post-traitement (étape 9.3).
    2. Sélectionnez l’onglet Ajuster et définissez les paramètres suivants : Estimation (grossissement anisotrope) : Non, Effectuer un ajustement des paramètres CTF ? Non, Estimation Beamtilt: Oui, Estimer aussi Trefoil? Oui, Estimer les aérations de 4ème ordre? Oui. Exécutez le travail.
  2. Répétez l’étape 10.1 en utilisant comme entrée les particules (de Refine3D) générées dans la tâche précédente (particles_ctf_refine.star). Sous l’onglet Ajustement , remplacez Estimation (grossissement anisotrope) par Oui et Exécutez la tâche.
  3. Répétez l’étape 10.2 en utilisant comme entrée les particules (de Refine3D) produites dans la tâche précédente (particles_ctf_refine.star). Sous l’onglet Ajustement , définissez les paramètres suivants : Estimation (grossissement anisotrope) : Non, Effectuer un ajustement des paramètres CTF ?: Oui, Ajuster la mise au point ?: Par particule, Ajuster l’astigmatisme ? Per-micrograph, Fit B-factor?: Non, Fit Phase-Shift: No, Estimate Beamtilt?: Non, Estimate 4th Order Aberrations?: No. Exécutez-le .
    REMARQUE: Étant donné que la particule a un contraste suffisant, l’onglet Ajuster l’astigmatisme? peut être réglé sur Par particule. Pour cet ensemble de données, le raffinement de l’astigmatisme par particule n’a pas amélioré la qualité et la résolution de la carte.
  4. Répétez le raffinement 3D avec les particules de l’étape 10.3 et sur l’onglet E/S, réglez Utiliser des FSC aplatis au solvant ? sur oui. Une fois l’exécution terminée, exécutez une tâche de post-traitement (étape 8.8) et examinez la carte dans UCSF Chimera (étape 5.2).

11. Transfert des coordonnées des particules RELION-3 et de la carte 3D vers Scipion 3

  1. Pour affiner et valider davantage la carte RELION-3, importez d’abord le volume et les particules de la dernière tâche de post-traitement (étape 10.4) vers Scipion 3. Lancez Scipion 3 et créez un nouveau projet.
  2. Dans le panneau Protocoles de gauche, sélectionnez la liste déroulante Importations et cliquez sur Importer des particules. Modifiez les paramètres suivants : Importer à partir de : RELION-3, Fichier étoile : postprocess.star et spécifiez les paramètres d’acquisition comme à l’étape 1.3. Cliquez sur Exécuter.
  3. Cliquez sur le menu déroulant Importations et sélectionnez Importer des volumes. Sous Importer de , indiquez le chemin d’accès à la carte RELION-3. Modifiez la taille des pixels (taux d’échantillonnage) Å/px en 1,045 et exécutez.

12. Scipion 3 - Raffinement haute résolution

  1. Tout d’abord, effectuez un alignement global. Sélectionnez la liste déroulante Affiner dans le panneau Protocoles et cliquez sur Xmipp3 - highres24. Entrez les particules et les volumes importés des étapes 11.2 et 11.3 en tant qu’images en taille réelle et volumes initiaux, respectivement, et définissez le groupe de symétrie sur icosaédrique. Sous l’onglet Alignement de l’image sous Affectation angulaire, choisissez Global et définissez la résolution cible maximale sur 3 Å, puis Exécutez la tâche.
  2. Lorsque le travail est terminé, cliquez sur Analyser les résultats. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur l’icône UCSF Chimera pour examiner le volume raffiné. De plus, cliquez sur Graphiques de résolution d’affichage (FSC) pour voir comment le FSC a changé après le raffinement, ainsi que sur Histogramme de tracé avec modifications angulaires pour voir si les affectations d’angle d’Euler ont changé.
    REMARQUE: Selon la résolution de la structure RELION-3 d’entrée, cette étape peut être répétée plusieurs fois avec des valeurs différentes définies pour la résolution cible maximale sous l’onglet Affectation angulaire. Pour plus d’informations, consultez le didacticiel Scipion25.
  3. Répétez l’étape 12.1 avec un alignement local. Copiez la tâche précédente et remplacez Select Previous Run par Xmipp3 - highres Global. Sous l’onglet Affectation angulaire , remplacez Alignement de l’image par Local. Définissez la résolution cible maximale sur 2,1 Å.
  4. Examinez la carte affinée dans UCSF Chimera et analysez le changement dans FSC et les affectations angulaires (étape 12.2). Répétez l’affinement local jusqu’à ce que la résolution ne s’améliore pas et que les affectations angulaires aient convergé, en ajustant la résolution cible maximale si nécessaire.
  5. La carte de sortie de Scipion 3 peut également être modifiée en termes de densité et affinée dans Phenix26.

13. Scipion 3 - Validation de la carte

  1. Examinez la résolution locale de la carte finale générée dans Xmipp3 - highres. Ouvrez Xmipp - MonoRes27 local et entrez le volume final de la tâche précédente et le masque généré à l’étape 8.6. Définissez la plage de résolution de 1 à 6 Å avec un intervalle de 0,1 Å et exécutez la tâche.
  2. Lorsque vous avez terminé l’exécution, cliquez sur Analyser les résultats et examinez l’histogramme de résolution et les tranches de volume colorées par résolution.
  3. Pour voir si les particules sont bien alignées, ouvrez Multireference Alignability28 et entrez les particules et le volume à partir de l’étape 12.3. Cliquez sur Analyser les résultats pour afficher le graphique de validation. Idéalement, tous les points devraient être regroupés (1,0,1,0).
  4. Ouvrez Xmipp3 - Validez le surajustement. Entrez les particules et les volumes de l’étape 12.3. Lorsque l’exécution est terminée, analysez les résultats et inspectez le tracé de surajustement. Le croisement des courbes de bruit gaussien aligné et des particules alignées indique un surajustement.

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Representative Results

Nous avons présenté un pipeline SPA complet pour obtenir une structure haute résolution en utilisant trois plates-formes de traitement différentes : cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3. Les figures 1 et 4 résument le flux de travail de traitement général et le tableau 1 détaille les protocoles d’affinement. Ces protocoles ont été utilisés lors des raffinements d’une structure de 2,3 Å de l’AAV, atteignant une résolution proche de Nyquist.

Les films ont d’abord été importés dans cryoSPARC v3, puis corrigés en mouvement et en CTF pour générer des micrographies moyennées. Lors de la sélection de micrographies pour un traitement ultérieur, il est important de choisir celles qui présentent un bon ajustement CTF et un faible astigmatisme (Figure 2), car l’inclusion de micrographies de mauvaise qualité peut entraver les étapes ultérieures du traitement, entraînant une reconstruction à plus faible résolution. 27 364 particules ont ensuite été prélevées et extraites des micrographies sélectionnées. Étant donné que le diamètre de l’AAV est d’environ 220 Å et la taille des pixels est de 1,045 Å, une taille de boîte de 300 px a été utilisée. Ensuite, la classification 2D itérative a été utilisée pour supprimer les artefacts et les particules ne convergeant pas vers des classes stables. Des exemples de moyennes de classes 2D sélectionnées et exclues sont présentés à la figure 3. Il est également important de noter que les moyennes de classe reflétant différentes conformations de l’échantillon doivent être affinées séparément pour produire plusieurs reconstructions 3D. Dans un tel cas, plusieurs volumes de départ ab initio doivent être calculés. Ici, 26 741 particules ont été sélectionnées et utilisées pour la modélisation ab initio et le raffinement homogène d’une seule structure de 2,9 Å.

Après avoir transféré les coordonnées des particules prélevées dans cryoSPARC v3 vers RELION-3, nous avons effectué quatre tours supplémentaires de classification 2D jusqu’à ce que l’ensemble de données converge vers des classes 2D stables. La classification 2D décrite ci-dessus a supprimé 3 154 particules supplémentaires de l’ensemble de données. En utilisant la structure générée dans cryoSPARC v3 comme modèle initial, le raffinement 3D dans RELION-3 a produit une structure avec une résolution presque équivalente de 2,95 Å. Les raffinements structurels ultérieurs, qui comprenaient la correction du mouvement par particule et les raffinements CTF, ont augmenté la résolution à 2,61 Å. Une liste complète des améliorations que nous avons apportées est présentée dans le tableau 1. Le volume calculé dans RELION-3 a ensuite été affiné dans Scipion 3 en utilisant plusieurs cycles de raffinement haute résolution (Xmipp3 - highres). Au cours des cycles de raffinement suivants, 3 186 particules supplémentaires ont été retirées de l’ensemble de données, ce qui a donné un ensemble final de 20 401 particules, ce qui a produit une reconstruction de 2,3 Å de l’AAV (figure 5 et figure 6). Ainsi, compte tenu de la taille des pixels de 1,045 Å, nos raffinements ont presque atteint la limite de Nyquist. Les courbes FSC représentant les structures calculées à l’aide de chaque programme sont illustrées à la figure 6. Ces courbes FSC indiquent l’augmentation de la résolution tout au long du flux de travail. Étant donné que la résolution peut varier d’un point à l’autre de la carte, il est souvent plus approprié de présenter la distribution des estimations de résolution locale sur la carte plutôt que de rapporter une estimation de résolution unique selon un seul critère (par exemple, le critère 0,143) de la courbe FSC. Ainsi, nous avons effectué une telle analyse en utilisant Xmipp - MonoRes dans Scipion 3. La figure 7 montre une comparaison des estimations de résolution locale pour les cartes obtenues avec cryoSPARC v3 et Scipion 3. Les estimations de résolution à quatre tranches différentes à travers les structures (Figure 7A, B) et les histogrammes de résolution (Figure 7C) démontrent clairement l’amélioration progressive de la résolution locale entre les cartes tout au long du flux de travail. La courbe FSC calculée à l’aide du programme Xmipp3 - highres dans Scipion 3 indique que la limite de Nyquist a été atteinte (Figure 6), ce qui suggère que l’estimation de la résolution est très probablement limitée par le sous-échantillonnage29. Cependant, l’analyse MonoRes présentée à la figure 7C, ainsi qu’une analyse minutieuse de la carte EM et de l’ajustement de la carte avec les coordonnées atomiques de l’AAV (figure 5) suggèrent qu’une estimation de résolution plus adéquate pour la carte est de 2,3 Å. Une stratégie similaire conciliant les estimations de résolution FSC et MonoRes a été présentée plus tôt24,25. Étant donné que les estimations de résolution peuvent être influencées par le masque utilisé lors des étapes de raffinement, il est important de s’assurer que le masque n’exclut aucune partie de la densité. Le masque utilisé dans cette étude chevauchant les reconstructions 3D est présenté à la figure 7D. L’augmentation progressive de la résolution dans le flux de travail présenté met en évidence l’avantage d’utiliser des algorithmes de plusieurs progiciels SPA pour obtenir une reconstruction 3D de haute qualité et haute résolution.

La construction de modèles in situ ou l’ajustement de la carte avec un modèle atomique préexistant peut servir de contrôle de qualité pour la structure calculée. Nous avons visualisé la carte finale dans UCSF Chimera et l’avons équipée d’un modèle atomique précédemment publié (ID PDB: 7kfr)30. La figure 5 montre les régions de la carte cryo-EM équipées des coordonnées atomiques de l’AAV. Des densités EM bien définies permettent d’ajuster des chaînes latérales d’acides aminés individuels, de molécules d’eau et d’ions magnésium et confirment l’accord de la carte cryo-EM avec le modèle atomique.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail SPA complet sur cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 et Phenix 1.18. Les étapes effectuées dans cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 et Phenix 1.18 sont désignées par des cases violettes, oranges, vertes et grises, respectivement. Le temps nécessaire pour effectuer chaque étape à l’aide du serveur de traitement équipé de 8 GPU, 40 CPU et 750 Go de RAM est spécifié dans chaque boîte individuelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Sélection de micrographies pour le traitement en aval dans cryoSPARC v3. (A) Des micrographies avec des anneaux de Thon estimés et expérimentaux bien appariés ont été utilisées pour un traitement ultérieur, tandis que celles présentant un astigmatisme élevé et un mauvais ajustement (B) ont été rejetées. Les micrographies dont l’ajustement CTF est supérieur à 5 Å, l’astigmatisme supérieur à 400 Å et l’épaisseur relative de la glace inférieure à 2 ont été retirées du traitement ultérieur, c’est-à-dire 70/395 micrographies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Sélection des classes 2D. Les moyennes de classe 2D contenant des classes bien définies sont sélectionnées (A) et celles avec une faible résolution, du bruit et des particules partielles sont rejetées (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Flux de travail et résultats représentatifs pour le traitement AAV sur cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3. Les étapes effectuées dans cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 sont désignées par des flèches violettes, orange et vertes, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : La structure à haute résolution de l’AAV montre des densités EM bien définies représentant différents éléments de structure secondaire et des chaînes latérales d’acides aminés individuelles. (A) Une carte finale de l’AAV. (B) Une partie de la carte représentant des feuilles bêta équipées des coordonnées atomiques de l’AAV (ID PDB: 7kfr)30. (C) Densités cartographiques représentant les acides aminés individuels. De gauche à droite : arginine, phénylalanine et tryptophane. (D) Les caractéristiques à haute résolution de la carte comprennent des molécules d’eau présentées dans des ions rouges et magnésium présentés sous forme de sphères vertes. L’ion Mg2+ affiché sur la figure est coordonné par des résidus d’histidine (à gauche) et d’arginine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Les courbes FSC de cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 montrent une résolution croissante dans l’ensemble du flux de travail. Alors que la courbe FSC calculée à l’aide du programme Xmipp3 - highres dans Scipion 3 indique que la limite de Nyquist a été atteinte, suggérant que l’estimation de la résolution est limitée par le sous-échantillonnage29, une analyse plus adéquate de la résolution de la carte est présentée à la figure 7 et discutée dans la section Résultats représentatifs24,25. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Validation de la reconstruction finale dans Scipion 3 à l’aide de Xmipp - MonoRes. La résolution de la carte est mieux décrite en présentant des distributions de résolution locales plutôt qu’une estimation de résolution unique selon un seul critère de la courbe FSC. (A-B) Les panneaux A et B montrent différentes tranches de cartes générées dans cryoSPARC v3 et Scipion 3, respectivement. (C) Histogrammes démontrant une augmentation systématique de la résolution locale pour les cartes calculées dans cryoSPARC v3 (barres roses) et Scipion 3 (barres bleues). (D) Le masque (gris) utilisé pour les calculs de résolution locale contient toutes les parties des densités AAV affinées dans les deux programmes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Programme Type d’affinement Script
cryoSPARC v3 Raffinement homogène Raffinement homogène
Raffinement non uniforme Raffinement non uniforme
Raffinement hétérogène Raffinement hétérogène
Correction du mouvement par particule Correction de mouvement local
RELION-3 Raffinement 3D Affiner3D
Post-traitement - Affûtage du facteur B, correction MTF Affiner3D
Polissage des particules Polissage bayésien
Raffinement CTF - inclinaison du faisceau CtfRefine
Raffinement CTF - grossissement anisotrope CtfRefine
Raffinement CTF - déconcentrage par particule, astigmatisme par particule/micrographie CtfRefine
Correction de la courbure de la sphère d’Ewald Relion_reconstruct
Scipion 3 Raffinement haute résolution Xmipp3 - hautes
Phénix 1.18 Modification de la densité et affûtage RésoudreCryoEM

Tableau 1 : Améliorations mises en œuvre tout au long du flux de travail. L’applicabilité de certains raffinements à un projet spécifique dépend de la qualité des données et des paramètres d’acquisition. Par exemple, la correction de courbure de la sphère d’Ewald peut être appliquée pour les cartes qui ont déjà une haute résolution.

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Discussion

Dans cet article, nous présentons un flux de travail SPA robuste pour le traitement des données cryo-EM sur diverses plates-formes logicielles afin de réaliser des reconstructions 3D haute résolution (Figure 1). Ce flux de travail est applicable à une grande variété de macromolécules biologiques. Les étapes suivantes du protocole sont décrites à la figure 4, y compris le prétraitement du film, la sélection et la classification des particules, ainsi que plusieurs méthodes d’affinement de la structure (tableau 1) et de validation. Les étapes de traitement de cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 ont été présentées, ainsi que les méthodes de transfert de données entre les progiciels. Nous avons montré les structures intermédiaires obtenues tout au long du protocole avec une résolution croissante (Figure 4, Figure 6 et Figure 7).

Bien que les méthodes décrites dans ce manuscrit puissent être utilisées pour la détermination de la structure de différentes protéines et assemblages biologiques, il est important de noter que l’AAV est un candidat idéal pour la détermination de la structure à haute résolution par cryo-EM et SPA, car sa grande taille produit un contraste élevé au microscope et la symétrie icosaédrique donne des particules avec une redondance de sous-unité de 60 fois. L’obtention de reconstructions à haute résolution devient de plus en plus difficile pour les échantillons de petite taille (c.-à-d. moins de 100 kD), dynamiques et hétérogènes. Afin d’exécuter avec succès ce protocole, il est essentiel que de nombreux films de haute qualité soient collectés pour traitement. Avec des données brutes de mauvaise qualité, il n’est pas possible d’obtenir une reconstruction à haute résolution et de haute qualité. Par exemple, si l’épaisseur de la glace n’est pas optimale pour la détermination de la structure ou si les particules adhèrent à l’interface glace-eau ou présentent des orientations préférées, revoyez les conditions de congélation de la grille.

Une autre étape importante du flux de travail est la cueillette et l’extraction des particules. Lors de la cueillette des particules, la taille de la boîte doit être environ 1,4 à 2,5 fois plus grande que l’axe le plus long de la particule, car une taille de boîte suffisante est nécessaire pour capturer des informations à haute résolution réparties en raison de la mise au point. Les boîtes de plus grande taille, cependant, nécessitent des temps de traitement plus longs en raison de la taille accrue des fichiers générés lors de l’extraction de particules. Lorsque vous choisissez une taille de boîte, tenez compte du diamètre des particules et de la taille des pixels. Avec de nombreuses particules, l’utilisateur peut vouloir stocker des particules pendant l’extraction pour le traitement initial, puis réex extraire des particules pleine grandeur pour les raffinements finaux. Ce protocole utilise la sélection manuelle des particules pour générer des modèles de sélection automatique. Cependant, cryoSPARC v3 propose également des méthodes de prélèvement entièrement automatisées, y compris un sélecteur à base de blob et un emballage Topaz, qui utilise l’apprentissage profond pour sélectionner les particules en fonction des prélèvements précédents. Bien que ces algorithmes soient très robustes, un nombre important de choix devraient être supprimés plus tard par classification 2D et 3D.

Les étapes critiques comprennent également la classification 2D et 3D utilisée pour éliminer les artefacts, tels que les particules endommagées par les radiations et séparer les différentes formes structurelles de l’échantillon présent dans l’échantillon, respectivement. Le nombre de classes 2D définies par l’utilisateur doit dépendre du nombre de particules extraites des micrographies, du contraste et de l’hétérogénéité dans le spécimen, car l’objectif est de séparer chaque vue individuelle de la particule en une classe 2D distincte. En règle générale, ajoutez une classe 2D pour 100 particules, et si vous traitez un nouvel échantillon avec un grand nombre de particules, 100 classes est un bon point de départ. Si une résolution faible ou modérée est obtenue même après de nombreux cycles de classification 2D et 3D, essayez de réextraire des particules avec une taille de boîte plus grande pour voir si plus d’informations structurelles peuvent être obtenues. Tout en rapportant la résolution de la reconstruction finale, il convient d’analyser la courbe FSC obtenue selon la méthode de l’étalon-or, ainsi que les estimations de résolution locale et l’inspection minutieuse des densités de la carte, ainsi que leur accord avec le modèle atomique.

Pour affiner les structures virales, la correction de courbure de la sphère d’Ewald mise en œuvre dans RELION-3 a démontré des améliorations à haute résolution31. Si vous affinez les structures de complexes multiprotéiques dynamiques, essayez le raffinement multi-corps 3D mis en œuvre dans RELION-3 ou la classification focalisée avec soustraction d’image implémentée dans RELION-3 et cryoSPARC v3. Si l’hétérogénéité ne peut pas être résolue par calcul, il est nécessaire de revoir les conditions de préparation des échantillons32. Une pureté insuffisante ou une préparation inadéquate entraînant une dégradation des protéines entravera la qualité de la reconstruction 3D. De plus, les conditions tampons qui déstabilisent les protéines ou favorisent l’agrégation limitent considérablement le nombre de particules bien définies pouvant être utilisées pour le calcul de la structure. Ainsi, pour utiliser le plus efficacement possible les méthodes présentées ici, il est impératif d’identifier les conditions optimales pour la stabilité de l’échantillon. Nous recommandons la microscopie électronique à coloration négative pour filtrer les échantillons avant la cryo-EM.

Comme la cryo-EM est devenue la méthode préférée pour la détermination de la structure 3D pour un nombre croissant de biologistes structuraux, la nécessité d’un flux de travail intégratif et robuste pour le traitement d’images et la détermination de la structure devient plus évidente. CryoSPARC offre une interface utilisateur graphique (GUI) Web facile à utiliser qui permet aux utilisateurs de tous les niveaux d’expérience de traiter rapidement les données et de calculer une structure 3D. CryoSPARC utilise notamment une descente de gradient stochastique pour effectuer une reconstruction 3D ab initio. De plus, le logiciel utilise un algorithme d’optimisation de la probabilité de branche et de limite pour affiner rapidement la carte 3D7. Le pipeline de traitement décrit dans cet article utilise cryoSPARC v3 pour produire une carte 3D initiale. La reconstruction 3D est ensuite affinée dans RELION-3, un package populaire qui utilise une approche bayésienne empirique pour estimer les paramètres critiques en fonction de l’ensemble de données de l’utilisateur, réduisant ainsi le besoin de connaissances spécialisées pour le fonctionnement du programme10. Plus précisément, nous utilisons le polissage bayésien pour la correction du mouvement par particule et les raffinements CTF pour améliorer la résolution. Enfin, la structure résultante est affinée et validée dans Scipion 311, un shell Python intégratif qui prend en charge les algorithmes de plusieurs plates-formes, notamment Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 et autres. Bien que de nombreux progiciels différents soient disponibles pour les utilisateurs de cryo-EM, il n’existe actuellement aucune plate-forme SPA universelle acceptée par le domaine. Bien que le flux de travail SPA puisse être entièrement exécuté dans l’un des trois progiciels décrits dans cet article, différents algorithmes peuvent donner des résultats variables. Par conséquent, les étapes individuelles doivent être personnalisées en fonction de l’échantillon et de la qualité des données. Par exemple, pour l’ensemble de données actuel, 3Drefine dans RELION-3 a augmenté la résolution de la reconstruction 3D, tandis que le raffinement non uniforme dans cryoSPARC v3 a entraîné une légère diminution de la résolution. Ainsi, il est très bénéfique d’utiliser une variété de programmes pour recalculer les structures afin d’obtenir une qualité et une résolution optimales et de faciliter la validation des reconstructions. Bien que Scipion 3 contienne de nombreux algorithmes de cryoSPARC v3 et RELION-3, les implémentations les plus récentes de ces programmes ne sont pas immédiatement disponibles dans Scipion. Par exemple, parmi les programmes utilisés dans ce manuscrit, seul RELION-3 offre la correction de la courbure de la sphère d’Ewald par le biais du script Relion_reconstruct. Le pipeline présenté dans cet article fournit un guide aux utilisateurs nouveaux et expérimentés pour utiliser avec succès les algorithmes implémentés dans cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 pour calculer des structures 3D à une résolution quasi atomique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Carlos Oscar Sorzano pour son aide à l’installation de Scipion3 et Kilian Schnelle et Arne Moeller pour son aide au transfert de données entre différentes plates-formes de traitement. Une partie de cette recherche a été soutenue par la subvention U24GM129547 des NIH et réalisée au PNCC de l’OHSU et accessible via EMSL (grid.436923.9), une installation d’utilisateurs du DOE Office of Science parrainée par l’Office of Biological and Environmental Research. Cette étude a été soutenue par une subvention de démarrage de l’Université Rutgers à Arek Kulczyk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CryoSPARC Structura Biotechnology Inc. https://cryosparc.com/
CTFFIND 4 Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2 UCSF Macromolecular Structure Group https://msg.ucsf.edu/software
Phenix Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) http://www.phenix-online.org/
PyEM Univerisity of California, San Francisco https://github.com/asarnow/pyem
RELION MRC Laboratory of Structural Biology https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

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References

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