Summary
Denne protokol beskriver den detaljerede prøveforberedelse med lavt input til enkeltkernesekventering, herunder dissektion af musens overlegne cervikale og stellatganglier, celledissociation, kryokonservering, kerneisolering og hashtag-stregkodning.
Abstract
Det hjerte-autonome nervesystem er afgørende for at kontrollere hjertefunktionen, såsom puls og hjertekontraktilitet, og er opdelt i sympatiske og parasympatiske grene. Normalt er der en balance mellem disse to grene for at opretholde homeostase. Imidlertid kan hjertesygdomme tilstande som myokardieinfarkt, hjertesvigt og hypertension inducere ombygning af celler involveret i hjerteinnervation, hvilket er forbundet med et negativt klinisk resultat.
Selvom der er store mængder data for det hjerteygtomiske nervesystems histologiske struktur og funktion, er dets molekylærbiologiske arkitektur inden for sundhed og sygdom stadig gådefuld i mange aspekter. Nye teknologier såsom enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq) holder løfte om genetisk karakterisering af væv ved enkeltcelleopløsning. Imidlertid kan den relativt store størrelse af neuroner hindre den standardiserede anvendelse af disse teknikker. Her udnytter denne protokol dråbebaseret single-nucleus RNA-sekventering (snRNA-seq), en metode til at karakterisere den biologiske arkitektur af hjertesympatiske neuroner i sundhed og sygdom. En trinvis tilgang er påvist at udføre snRNA-seq af de bilaterale overlegne cervikale (SCG) og stellatganglier (StG) dissekeret fra voksne mus.
Denne metode muliggør langsigtet prøvekonservering og opretholder en passende RNA-kvalitet, når prøver fra flere individer / eksperimenter ikke kan indsamles på én gang inden for en kort periode. Stregkodning af kernerne med hashtag oligos (HTRO'er) muliggør demultiplexing og tilbagesporing af forskellige ganglioniske prøver efter sekventering. Efterfølgende analyser afslørede vellykket kernefangst af neuronale, satellit glial og endotelceller i de sympatiske ganglier, som valideret af snRNA-seq. Sammenfattende giver denne protokol en trinvis tilgang til snRNA-seq af sympatiske ydre hjerteganglier, en metode, der har potentiale til bredere anvendelse i undersøgelser af innervering af andre organer og væv.
Introduction
Det autonome nervesystem (ANS) er en afgørende del af det perifere nervesystem, der opretholder kroppens homeostase, herunder tilpasningen til miljøforhold og patologi1. Det er involveret i reguleringen af flere organsystemer i hele kroppen, såsom kardiovaskulære, respiratoriske, fordøjelses- og endokrine systemer. ANS er opdelt i sympatiske og parasympatiske grene. Spinalgrene af det sympatiske nervesystem synapse i ganglier i den sympatiske kæde, beliggende bilateralt i en paravertebral position. De bilaterale cervikale og thoraxganglier, især StG, er vigtige komponenter, der deltager i hjertesympatisk innervering. I sygdomstilstande, såsom hjerteiskæmi, kan neuronal ombygning forekomme, hvilket resulterer i en sympatisk overdrive2. Den neuronale ombygning er blevet påvist i flere histologiske undersøgelser hos mennesker og flere andre dyrearter 3,4,5,6. En detaljeret biologisk karakterisering af hjerteiskæmi-induceret neuronal ombygning i hjertesympatiske ganglier mangler i øjeblikket, og de grundlæggende biologiske egenskaber ved specialiserede neuronale celletyper eller undertyper inden for det hjertesympatiske nervesystem (SNS) er endnu ikke fuldt ud bestemt i sundhed og sygdom7.
Nye teknologier, såsom scRNA-seq, har åbnet gateways for genetisk karakterisering af små væv på et enkeltcelleniveau 8,9. Imidlertid kan den relativt store størrelse af neuroner hæmme den optimerede anvendelse af disse enkeltcelleteknikker hos mennesker10. Derudover kræver enkeltcellesekventering en høj gennemstrømning af celler for at genvinde et tilstrækkeligt celleantal på grund af et højt tab i sekventeringsprocessen. Dette kan vise sig at være udfordrende, når man studerer små væv, der er svære at fange i en session og kræver flere prøver for at introducere nok enkeltceller til sekventering. Den nyligt udviklede dråbebaserede snRNA-seq-teknologi (dvs. 10x Chrom-platformen) gør det muligt at studere biologiske forskelle mellem enkeltkerner11,12. snRNA-seq har en fordel i forhold til scRNA-seq for store celler (>30 μm), som muligvis ikke fanges i Gel Bead i emulsioner (GEM'er), samt forbedret kompatibilitet med omfattende dissociation og / eller langvarig konservering 13,14,15.
Heterogenitet, antallet af neuronale celler og andre celler beriget i hjerte-SNS er vigtige aspekter for karakteriseringen af ANS i sundheds- og sygdomstilstande. Derudover bidrager den organ- eller regionsspecifikke innervering af hver sympatisk ganglion til SNS's kompleksitet. Desuden har cervikale, stellat og thoraxganglier i den sympatiske kæde vist sig at innervere forskellige regioner i hjertet16. Derfor er det nødvendigt at udføre enkeltkerneanalyse af ganglioniske celler afledt af individuelle ganglier for at studere deres biologiske arkitektur.
Dråbebaseret snRNA-seq tillader transkriptom-bred ekspressionsprofilering for en pulje på tusinder af celler fra flere prøver på én gang med lavere omkostninger end pladebaserede sekventeringsplatforme. Denne tilgang gør det muligt for dråbebaseret snRNA-seq at være mere egnet til klassificering af cellulær fænotype og ny subpopulationsidentifikation af celler inden for SCG og StG. Især giver denne protokol en kortfattet trinvis tilgang til identifikation, isolering og enkeltkerne RNA-sekventering af sympatiske ydre hjerteganglier, en metode, der har potentiale til en bred anvendelse i undersøgelser af karakteriseringen af ganglier, der innerverer andre beslægtede organer og væv i sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol beskriver alle trin, der kræves for snRNA-seq af murine cervikale og / eller cervicothoracic (stellate) ganglier. Der blev anvendt C57BL/6J-mus af hunkøn (15 uger gamle, n = 2 for hvert køn). En yderligere Wnt1-Cre;mT/mG-mus blev brugt til at visualisere ganglierne til dissektionsformål 17,18. Denne ekstra mus blev genereret ved krydsning af en B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J-mus og en B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J-mus. Alle dyreforsøg blev udført i henhold til Vejledning for Pleje og Brug af Forsøgsdyr udgivet af NIH og godkendt af Den Dyreetiske Komité ved Leiden Universitet (Licensnummer AVD1160020185325, Leiden, Holland). Se tabellen over materialer for detaljer vedrørende alle materialer, udstyr, software og dyr, der anvendes i protokollen.
1. Præparater
BEMÆRK: Alle trin udføres i et cellekulturflowskab.
- Rengør tang og saks ved at nedsænke instrumenterne i 70% ethanol i 20 min.
- Forbered ganglionmediet bestående af neurobasalt medium suppleret med B-27 plus (1x), L-glutamin (2 mM) og 1% antibiotika-antimykotisk. Forvarm ganglionmediet ved stuetemperatur.
- Fordøjelsesopløsningen forberedes: 0,25 % Trypsin-EDTA (1:1) og 1.400 U/ml kollagen af type 2 opløst i ganglionmediet.
- Forbered frisk, kold (4 °C) cellevaskbuffer (0,4 % bovin serumalbumin [BSA]) og lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 og 0,1 % ikke-iionisk vaskemiddel, 40 U/ml RNAse i nukleasefrit vand) til kerneisolering.
- Forbered kernevaskbuffer (1x fosfatbufret saltvand [PBS] med 2,0% BSA og 0,2U/μL RNasehæmmer).
- Forbered ST-farvningsbuffer (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 i nukleasefrit vand).
2. Dissektion af voksne mus overlegne cervikale ganglier (SCG)
- Afliv musene og hold dem på is.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev i alt 4 C57BL6/J-mus aflivet ved CO2 - kvælning. Alternativt kan isofluran anvendes efterfulgt af ekssanguinering, når en stor mængde blod skal indsamles til andre undersøgelsesformål. - Fastgør musen på et dissektionsbræt med stifter og douse den med 70% ethanol for at minimere spredningen af pels (barbering er ikke nødvendig).
- Under et stereomikroskop skal du åbne huden i nakkeområdet ved at lave et midterlinjesnit med en saks, flytte de submandibulære kirtler til side og fjerne sternomastoidmusklen for at udsætte og lokalisere den fælles halspulsåre og dens bifurcation (figur 1A, B, se pil).
- Dissekere højre og venstre halspulsåre bifurcation og vævet fastgjort til det. Overfør hvert dissekeret stykke væv til en separat 3,5 cm petriskål indeholdende kold PBS.
- Kig efter SCG'en, der er fastgjort til carotisbifurcationen. Rengør SCG yderligere ved at fjerne arterien og andet fastgjort væv i petriskålen (figur 1E).
3. Dissektion af voksne musestellatganglier (StG)
- For at dissekere StG skal du lave et midterlinjesnit i maven efterfulgt af åbning af membranen og den ventrale thoraxvæg.
- Fjern hjertet og lungerne for at udsætte den dorsale thorax. Se efter venstre og højre StG anterolateral til musculus colli longus (MCL) på niveauet for den første ribben (figur 1C, D, angivet med stiplede linjer).
- Disseker både venstre og højre StG med tang og overfør dem separat til 3,5 cm petriskåle indeholdende kold PBS (figur 1F).
4. Isolering og kryopræservering af museganglioniske celler
Trin 4-6 er opsummeret i figur 2.
- Overfør forsigtigt alle individuelle SCG og StG til separate 1,5 ml mikrocentrifugerør med tang.
BEMÆRK: Brug ikke pipettespidser til at overføre ganglierne, da ganglierne er tilbøjelige til at klæbe til væggen af plastpipettespidser. - Tilsæt 500 μL 0,25 % trypsin-EDTA-opløsning til hvert mikrocentrifugerør og inkuber i et rystevandsbad ved 37 °C i 40 minutter.
BEMÆRK: Dette trin har til formål at lette fordøjelsen og cellefrigivelsen herefter i collagenase type 2-opløsningen. - Forbered et 15 ml rør indeholdende 5 ml ganglionmedium til hver prøve. Lad ganglierne slå sig ned i bunden af mikrocentrifugerørene. Saml supernatanten, som indeholder meget få ganglioniske celler, overfør supernatanten til de forberedte 15 ml rør, og mærk hvert rør. Alternativt, for at spare lidt tid, aspirere trypsin-EDTA supernatanten uden opsamling, da meget få dissocierede celler kan detekteres i den.
BEMÆRK: En lille mængde trypsin-EDTA-opløsning (~ 10-30 μL) kan efterlades i mikrocentrifugerøret for at undgå fjernelse af ganglierne. Undgå pipettering på dette trin, fordi det kan beskadige ganglierne og føre til lav produktion af ganglioniske celler bagefter. - Tilsæt 500 μL kollagenase type 2-opløsning i hvert mikrocentrifugerør og inkuber i et rystevandsbad ved 37 °C i 35-40 minutter. Prøv at suspendere ganglionen igen efter 35 minutter; hvis ganglionen stadig er intakt og ikke dissocierer, forlænges inkubationstiden eller koncentrationen af collagenase type 2-opløsning øges efter behov.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere afhængigt af ganglionstørrelsen. - Resuspendganglierne i kollagenaseopløsning ved at pipettere op og ned ~ 10 gange, eller indtil vævsklumper ikke længere opdages.
- Overfør cellesuspensionen til det tidligere anvendte 15 ml rør, der indeholder ganglierkulturmediet og trypsin-EDTA-suspensionen fra den samme ganglion. Drej celleophænget ned med en svingende skovlrotorcentrifuge i 10 minutter, 300 × g ved stuetemperatur. Kassér forsigtigt cellesupernatanten.
BEMÆRK: Fordi ganglioncellerne er adskilt fra en enkelt ganglion, kan cellepillen være for lille til at detektere med øjet; en lille mængde supernatant kan efterlades i røret for at undgå utilsigtet fjernelse af cellepillen. - Resuspend de ganglioniske celler i 270 μL føtalt kvægserum (FBS, lavt endotoksin) og overfør hver celle-FBS-suspension til en 1 ml kryovial.
- For at tælle cellerne blandes 5 μL af ganglioncellesuspensionen med 5 μL 0,4% trypanblåt farvestof og lægger blandingen i et hæmocytometer. Tæl det samlede antal og levende celletal under et mikroskop.
BEMÆRK: Cellelevedygtigheden (levende celletal / total celletal = levedygtighed %) er normalt over 90% med denne dissociationsprotokol. Det levende celletal for en enkelt ganglion (enten SCG eller StG) falder normalt inden for området 9.000-60.000 celler, når ganglionen isoleres fra en mus i alderen 12 til 16 uger. - Tilsæt 30 μL dimethylsulfoxid (DMSO) til hver celle-FBS-suspension i kryovialene, bland godt og overfør kryovialerne til en cellefrysningsbeholder, som opbevares ved stuetemperatur. Opbevar den kryoviale lastede beholder ved -80 °C natten over, og overfør kryovialerne til flydende nitrogen den næste dag for langvarig konservering inden sekventering.
5. Kerneisolering
BEMÆRK: Venstre og højre SCG isoleret fra fire mus (i alt 8 prøver) blev anvendt som et eksempel i følgende kerneisolerings- og sekventeringspræparat. Hold alt på is under hele proceduren. På grund af usynligheden af små kernepiller anbefales en centrifuge med svingende spande stærkt for at lette fjernelse af supernatant gennem hele proceduren.
- Forbered 15 ml rør med en sil (30 μm) ovenpå og forskyl silen med 1 ml ganglionmediet.
- Tag kryoirale stoffer ud af flydende nitrogen og tø dem straks op i et vandbad ved 37 °C. Når en lille pille is er tilbage i kryovialet, skal du tage kryovialerne ud af vandbadet.
- Gendan ganglioncellerne ved at droppe 1 ml ganglionmediet i hvert kryovial, mens du ryster forsigtigt i hånden. Valgfrit: For at evaluere cellegenvinding skal du blande cellesuspensionen efter genopretning og tage 5 μL cellesuspension ud til levende celletælling som beskrevet i trin 4.8.
- Læg hver ganglionisk cellesuspension på en separat sil (fremstillet i trin 5.1), og skyl hver sil med 4-5 ml ganglionmedium.
- Centrifugering af den anstrengte cellesuspension i 5 minutter ved 300 × g, fjern supernatanten forsigtigt og resuspend cellerne i 50 μL cellevaskbuffer.
- Overfør cellesuspensionen til et lavbindende DNA/RNA 0,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern 45 μL af supernatanten uden at røre bunden af røret for at undgå at løsne cellepillen.
- Tilsæt 45 μL kølet Lysis Buffer og pipetter forsigtigt op og ned ved hjælp af en 200 μL pipettespids.
- Inkuber cellerne i 8 minutter på is.
- Tilsæt 50 μL koldkernevaskbuffer til hvert rør. Bland ikke.
- Centrifugering af kernesuspensionen ved 600 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern 95 μL af supernatanten uden at forstyrre kernepillen.
- Tilsæt 45 μL kølet kernevaskbuffer til pelleten. Valgfrit: Tag 5 μL kernesuspension, bland med 5 μL 0,4% trypanblå for at tælle, og kontroller kvaliteten af kerner under et mikroskop med et hæmocytometer.
- Centrifugering af kernesuspensionen ved 600 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten uden at røre bunden af røret for at undgå at løsne kernepillen.
6. Nucleus stregkodning med hashtag oligos (HTOs) og multiplexing
BEMÆRK: HTO-farvningstrin blev modificeret og optimeret til nuklear mærkning af meget lave mængder (ganglioniske) kerner i henhold til den tidligere anvendelse i kortikalt væv af Gaublomme et al.15.
- Tilsæt 50 μL ST-SB-buffer til kernepillen, pipetter forsigtigt 8-10 gange, indtil kernerne er fuldstændigt suspenderet.
- Der tilsættes 5 μL Fc-blokerende reagens pr. 50 μL st-SB/kerneblanding og inkuberes i 10 minutter på is.
- Tilsæt 1 μL (0,5 μg) enkeltkerne hashtag-antistof pr. rør i ST-SB/kerneblandingen og inkuber i 30 minutter på is.
BEMÆRK: Kortere inkubationstid fører til lavere effektivitet af hashtag-mærkning, som det fremgår af de repræsentative resultater. - Tilsæt 100 μL ST-SB til hvert rør. Bland ikke.
- Centrifugering af kernesuspensionen i 5 min., 600 × g ved 4 °C.
- Fjern 145 μL af supernatanten uden at forstyrre kernepillen.
- Gentag trin 6.4 og 6.5. Fjern supernatanten så meget som muligt uden at røre bunden af røret for at undgå at løsne kernepillen.
- Resuspend kernepillen i 50 μL ST-SB, og bland forsigtigt kernerne.
- Tag 5 μL af kernesuspensionen og bland den med 5 μL 0,4% trypanblå for at tælle kernerne under et mikroskop. Se figur 3A for et repræsentativt billede af kerner blandet med trypanblå og indlæst i et hæmocytometer.
- Centrifugering af kernesuspensionen i 5 minutter ved 600 × g ved 4 °C.
- Resuspend kernerne i ST-SB for at opnå en målkernekoncentration på 1.000-3.000 kerner/μL for hver prøve i henhold til det tilsvarende kerneantal.
- Pool prøverne for at opnå det ønskede antal celler.
BEMÆRK: For eksempel blev 8 prøver i dette eksperiment ligeligt samlet for at opnå i alt 25.000 kerner for straks at gå videre til 10x Genomics Chrom og snRNA-seq bagefter. Kernetallet falder normalt inden for området 6.000-40.000 celler, når ganglionen isoleres fra en mus i alderen 12 til 16 uger. Kun omkring halvdelen af de samlede belastede kerner kan fanges af dråbebaseret snRNA-seq. For eksempel blev en blanding på 25.000 kerner forberedt for at sikre indfangning af 10.000 kerner, hvilket er nødvendigt for yderligere biblioteksforberedelse og sekventering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvalitetskontrolanalyse af enkeltkernen cDNA-biblioteksforberedelse og snRNA-seq
Repræsentative resultater beskriver sekventeringsresultater af 10.000 fangede kerner i en enkelt pool med et bibliotek med 25.000 læsninger / kernegenekspressionsbibliotek og et 5.000 læsninger / kerne hashtag-bibliotek. Figur 3B illustrerer kvalitetskontrolresultaterne af 1. streng cDNA, genekspressionsbiblioteket (GEX) og HTO-biblioteket, som blev kontrolleret med Bioanalyzer. De HTO-afledte cDNA'er forventes at være mindre end 180 bp, mens mRNA-afledte cDNA'er er større end 300 bp. Et GEX-bibliotek af høj kvalitet kan detekteres som en bred top fra 300 til 1.000 bp, og HTO-biblioteket registreres som en bestemt top på 194 bp. Cell Ranger blev brugt til demultiplexing, fastq-filgenerering og læsejustering som standardindstilling. Seurat R-pakke19 blev efterfølgende anvendt til kvalitetskontrol og downstream-analyser.
Demultiplexing af snRNA-seq-dataene blev udført ved at identificere HTO'er ved hjælp af Seurat indbyggede demultiplexing-strategi. Den demultiplexerende evne for hver HTO blev først visualiseret med HTO-udtryksfiler (supplerende figur S1). I varmekortet i figur 4A detekteres singler som kerner med specifikt HTO-udtryk, mens doubler og negativer viser uspecifik ekspression af flere eller ingen HTO'er. Bemærk, at ca. 33% af kernerne blev påvist som negativer ved anvendelse af en 10 minutters HTO-antistofinkubationsmetode. Forlængelse af inkubationstiden (trin 6.3) fra 10 min til 30 min i et efterfølgende eksperiment afslørede et bemærkelsesværdigt fald i negativt mærkede kerner (supplerende figur S2). Disse resultater tyder på, at forlængelse af antistofinkubationstiden kan forbedre hashtag-effektiviteten.
Violinplotter i figur 4B-D viser antallet af gener (nFeature_RNA), antallet af unikke molekylære identifikatorer (UMI) (nCount_RNA) og procentdelen af mitokondrietal (percent.mt) inden for snRNA-seq-datasættet for at identificere outliers og kerner af lav kvalitet. Kerner blev kun medtaget i downstream-analysen, når følgende kriterier var opfyldt: i) nFeature_RNA > 500 og nCount_RNA < 20.000; ii) percent.mt < 5 % iii) den enkelte kerne viste et klart udtryk for en enkelt HTO. Genekspressionstællinger blev normaliseret ved hjælp af standardmetoden i Seurat: 875 (2,71%) gener blev påvist som meget variable gener (figur 4E). snRNA-seq GEX blev skaleret, blev udført, og albueplottet blev brugt til at vurdere inkluderingen af hovedkomponenter, der ville blive brugt til downstream-analyser (figur 4F). I alt blev 18 pc'er inkluderet. Clustering blev udført med en opløsning på 0, 4.
Kernerne blev grupperet, og dimensionsreduktion (UMAP) blev udført til visualisering af de 12 individuelle klynger (figur 5A). Det mediane antal rå gener pr. klynge varierer mellem 991,5 og 4.586 (supplerende figur S3A, B). Visualisering af opdelingen af HTO-antistofferne inden for UMAP afslører en klar fordeling af ganglier, hvilket indikerer, at alle klynger er præsenteret i hver ganglion (figur 5B). For at validere nøjagtigheden af HTO-prøvesegregation blev ekspressionen af X Inactive Specific Transcript (Xist, udtrykt i det inaktive kvindelige X-kromosom) vurderet for at identificere de mandlige prøver og de kvindelige prøver (figur 5C). Xist udtryk var i overensstemmelse med hashtag-mærkningen, hvilket viste, at HTO 1-4-mærkede prøver var kvindelige prøver, og HTO 5-8-mærkede prøver var mandlige prøver. Dette tyder på, at den kuraterede HTO-mærkning er meget specifik.
For yderligere at verificere kvaliteten og opløsningen af sekventeringsdataene med den nuværende metode blev nogle nøgletranskripter af sympatiske neuroner først undersøgt. Resultaterne viser tilstedeværelsen af sympatiske neuroner, der stærkt udtrykker Th, Dbh og Snap25 i klynger 5 og 7 (figur 5D-F). Satellit glialceller blev detekteret med ekspression af S100b i klynger 0-3 (figur 5G)20. Endotelceller blev påvist i klynge 4 med en høj ekspression af Pecam1 (figur 5H) og stromalceller i klynge 8 med en høj ekspression af Acta2 (figur 5I). Disse resultater understøtter den vellykkede kernefangst af neuronale, satellit glial, endotel- og stromalceller i den sympatiske ganglion ved hjælp af snRNA-seq.
Figur 1: Dissektion af voksne mus overlegne cervikale ganglier og stellatganglier. (A) Brightfield billede af placeringen af SCG. (B) For at lette visualiseringen blev der anvendt en Wnt1Cre;mT/mG-mus. Stjerner angiver SCG (eGFP+), pilespidser angiver bifurcationen af halspulsåren. Venstre panel, fase kontrast billede; højre panel, fluorescerende billede. (C) Brightfield-billede af StG'ens placering. (D) Stjerner angiver StG (eGFP+), stiplede linjer angiver MCL. Venstre panel, fase kontrast billede; højre panel, fluorescerende billede. (E) Dissekerede ganglier overføres separat til en petriskål til yderligere rengøring under et stereomikroskop. (F) Venstre panel, den dissekerede SCG med halspulsåren stadig fastgjort. Stiplet kontur angiver SCG. Højre panel, den dissekerede og rensede StG har form af en omvendt trekant, som angivet med den stiplede kontur. Skalabjælke = 1.000 μm. Forkortelser: SCG = overlegne cervikale ganglier; StG = stellatganglier; MCL = musculus colli longus; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsgang af prøveforberedelse og hashtag-farvningsbaseret multiplexing til snRNA-seq. Flowdiagrammet viser trinene fra dissociationen af ganglioniske celler (orange), kerneisolering (blå) og hashtag-antistoffarvning og multiplexering (grøn), der udføres for snRNA-seq. Forkortelser: FBS = føtalt kvægserum; ST-SB = ST-farvningsbuffer; snRNA-seq = single-nucleus RNA-sekventering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvalitetskontrol af kerneisolering og genekspressionsbiblioteksforberedelse. (A) Fasekontrastbillede af de HTO-farvede kerner. Kerner er angivet med pile. Skalabjælke = 100 μm. (B) Bioanalyseresultater af 1. streng cDNA (øverst), GEX-bibliotek (i midten) og HTO-bibliotek (nederst). Forkortelser: GEX = genekspression; HTO = hashtag oligo. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvalitetskontrol af hashtagget oligo mærkning effektivitet og kvalitetskontrol af snRNA-seq. (A) Heatmap over HTO farvning opnået med en inkubationstid på 10 min med hashtag antistoffer. (B-D) Violinplot af kvalitetskontrolmålinger, der viser antallet af gener (nFeature_RNA, B); antallet af UPI'er (nCount_RNA, C) procentdelen af mitokondrietællinger (percent.mt, D). (E) Af de i alt 32.285 gener, der blev sekventeret, blev 875 (2,71%) identificeret som meget variable træk som visualiseret i scatter-plottet. (F) Albueplot af pc'er for at bestemme inkludering af ægte signal, der anvendes til klyngedannelse. Forkortelser: snRNA-seq = single-nucleus RNA-sekventering; HTO = hashtag oligo; Pc'er = hovedkomponenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater af analysen af snRNA-seq. (A) UMAP-plot af det klyngede snRNA-seq-datasæt. B) UMAP-plot, der visualiserer fordelingen af de samlede HTO-prøver. (C) Violinplot, der validerer kvindelige prøver (højt xistisk udtryk) efter demultiplexing. (D-I) UMAP-plots, der viser udvalgte markørgener; klyngerne udtrykker i høj grad de tilsvarende gener, der er angivet i de røde cirkler: D-F, sympatiske neuroner (Th, Dbh, Snap25); G) Satellit glialceller (S100b) H) endotelceller (Pecam1) (I) Stromalceller (Acta2). Forkortelser: snRNA-seq = single-nucleus RNA-sekventering; HTO = hashtag oligo; UMAP = ensartet mangfoldig tilnærmelse og projektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Kvalitetskontrolmålinger for et repræsentativt enkeltkernesekventeringsresultat. HTO-ekspressionsprofiler af individuelle prøver, der visualiserer de brugte hashtag-antistoffers demultiplexerende evne. Forkortelse: HTO = hashtag oligo. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: HTO-ekspressionsvarmekort over efterfølgende prøver inkuberet med HTO-antistoffer i 30 minutter. Sammenligning af antallet af negativt mærkede kerner efter HTO-demultiplexing med figur 4A viser en markant forbedring af kernemærkning efter forlængelse af antistofinkubationstiden. Forkortelse: HTO = hashtag oligo. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Median og kvantiler af genekspression pr. Klynge. (A) Median nonzero rå genekspression af hver klynge. B) Beskrivende statistik over ikke-nul rå genekspression for hver klynge. Q1: 25. percentil, Q3: 75. percentil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives en detaljeret protokol, der fokuserer på i) dissektion af voksne mus overlegne cervikale og stellatsympatiske ganglier, ii) isolering og kryopræservering af ganglioniske celler, iii) kerneisolering og iv) kerne-stregkodning med HTO-mærkning til multiplexingformål og snRNA-seq.
Med denne protokol kan sympatiske ganglioniske celler let opnås ved at dissociere individuelle ganglier ved hjælp af almindeligt anvendt trypsin og collagenase. Langsigtet bevarelse af isolerede ganglioniske celler opnås også let ved at fryse celler i FBS suppleret med 10% DMSO, hvilket viste en høj kvalitet af genopretning efter optøning. Sammenlignet med konventionel enkeltcellet RNA-sekventering har anvendelsen af dråbebaseret snRNA-seq af enkeltmurinsympatiske ganglier kombineret med anvendelse af HTO-farvningsbaseret kernestamkodning desuden følgende fordele: i) prøver kan bevares i lang tid, indtil alle prøver er klar til yderligere kerneisolering; ii) kerner af god kvalitet, der er isoleret fra flere små ganglier, kan samles sammen til sekventering uden batcheffekt forårsaget af separeret prøveforberedelse iii) evnen til at spore den særskilte ganglioniske oprindelse efter sekventering ved hjælp af kernestregkoder og iv) omkostningseffektivitet, da der kun er behov for en enkelt biblioteksforberedelse. Det er vigtigt, at den beskrevne isolations- og cellekulturprotokol giver en enkelt ensartet metode til både murine cervikale og stellatganglier og er potentielt anvendelig på andre ganglier, såsom dorsale rodganglier og andre arter, f.eks. Humane ganglier.
En af de største fordele ved scRNA-seq er evnen til at identificere (nye) celletyper og afsløre sjældne cellepopulationer, der ikke kunne påvises ved bulk RNA-seq. Den dråbebaserede scRNA-seq-platform letter indfangning af flere celler. Det kan således give et samlet billede af celletyperne (under)typerne og transkriptionel heterogenitet af en storcellepopulation sammenlignet med en pladebaseret sekventeringsplatform. Den dråbebaserede (f.eks. 10x chrom) platform er imidlertid ikke egnet til celler større end 50 μm, hvilket begrænser dens anvendelse i store celler såsom humane neuroner (~ 100 μm). Tilgængeligheden af snRNA-seq-teknikken overvinder denne ulempe på grund af den lille størrelse af en kerne. Desuden er snRNA-seq en nyttig metode til genekspressionsundersøgelser af stærkt sammenkoblede og lavtydende celler såsom neuroner og frosne væv.
Selvom det er muligt direkte at isolere kerner fra væv uden forudgående celledisponsociation, var det gavnligt for udbyttet at tage en to-trins kerneisoleringsmetode, der først dissocierer ganglionen i enkeltceller (som kan bevares i flydende nitrogen) efterfulgt af kerneisoleringen. På grund af den lille størrelse af en musesympatisk ganglion blev det konstateret, at flere kerner blev opnået ved anvendelse af en to-trins kerneisoleringsmetode end med en et-trins kerneisoleringsmetode. Kvalitetskontrollen af cDNA-, biblioteks- og sekventeringsanalyserne indikerer god kerne/RNA-kvalitet. Derudover forbedres logistikken, da prøver kan indsamles og opbevares på forskellige tidspunkter før kollektiv sekventering. Enkeltkerneanalyse afslørede også den vellykkede genopretning og indfangning af neuroner og gliaceller, hvilket tyder på, at den beskrevne to-trins kerneisoleringsmetode kan være bedre egnet til anvendelse i små væv.
En anden fordel ved denne protokol er multiplexing med stregkodede antistoffer21. Den musesympatiske ganglion er et lille væv (gennemsnitlig størrelse 0,1 mm3), og det lave antal celler, der stammer fra en individuel ganglion, er utilstrækkeligt til dråbebaseret sekventering i sig selv. Imidlertid vil pooling af flere ganglier af forskellige mus eller forskellige ganglier af den samme mus medføre tab af enten individuel museinformation eller individuel ganglioninformation. Som en løsning er HTO-farvningstrinnet let at udføre og muliggør stregkodet mærkning af kerner afledt af forskellige mus eller forskellige ganglier før kernepooling. Nøjagtigheden af HTO-demultiplexing verificeres i denne protokol ved matchet Xist-ekspression i kendte kvindelige kernepopulationer. Nucleus multiplexing med stregkodede antistoffer reducerer derfor batcheffekter og sænker sekventeringsomkostningerne.
En potentiel begrænsning af snRNAseq kan være, at der kan være forskelle mellem RNA-sammensætningen i kernen og cytoplasmaet på grund af den naturlige tilstedeværelse af spirende transkripter i kernen, der er forbundet med tidlig respons på neuronale aktiviteter22,23. Kernen og cytoplasmaet kan også variere i transkripter afhængigt af cellecyklustilstanden24. Færre transkripter blev påvist i en individuel kerne (~ 7.000 gener) end i en celle (~ 11.000 gener)14. Derfor kan scRNA-seq og snRNA-seq give forskellige resultater på transkriptionsniveau. Ikke desto mindre viste sammenligningen mellem scRNA-seq og snRNA-seq en lignende evne til at diskriminere neuronale celletyper af hjernevæv14. For at forbedre diskriminationen mellem meget lignende celletyper eller undertyper ved hjælp af snRNA-seq kan der være behov for flere kerner for at kompensere for den lavere gendetektionsevne sammenlignet med scRNA-seq. Selv om nøjagtigheden af HTO-demultiplexing er tilstrækkelig, er tabet af nogle data uundgåeligt, da ikke alle kerner viser HTO-specificitet. Yderligere optimering af antistofinkubationen kan minimere antallet af kerner med dobbelt eller negativ ekspression af HTO'er.
Samlet set tilvejebringer denne protokol den eksperimentelle procedure til sekventering af neuronale kerner fra sympatiske ganglier ved hjælp af en let at følge arbejdsgang, der starter fra ganglionisolering til kernepræparation af lavt input af celler efterfulgt af HTO-farvningsbaseret kernemærkning til snRNA-seq. Protokollen giver et detaljeret overblik over alle vigtige trin, der let kan udføres og anvendes på forskellige ganglier i murine og andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Susan L. Kloet (Institut for Human Genetik, LUMC, Leiden, Holland) for hendes hjælp med eksperimentelt design og nyttige diskussioner. Vi takker Emile J. de Meijer (Institut for Human Genetik, LUMC, Leiden, Holland) for hjælpen med single-nucleus RNA-isolering og biblioteksforberedelse til sekventering. Dette arbejde støttes af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) [016.196.346 til M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
- McCorry, L. K.
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368 (2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010 (2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832 (2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298 (2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Grindberg, R. V., et al.
