Summary
Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte, inputarme Probenvorbereitung für die Einzelkernsequenzierung, einschließlich der Dissektion von Maus-Superior-Cervix- und Sternganglien, Zelldissoziation, Kryokonservierung, Nukleusisolierung und Hashtag-Barcoding.
Abstract
Das kardiale autonome Nervensystem ist entscheidend für die Kontrolle der Herzfunktion wie Herzfrequenz und Herzkontraktilität und ist in sympathische und parasympathische Zweige unterteilt. Normalerweise gibt es ein Gleichgewicht zwischen diesen beiden Zweigen, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Herzerkrankungen wie Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz und Bluthochdruck können jedoch den Umbau von Zellen induzieren, die an der Herzinnervation beteiligt sind, was mit einem nachteiligen klinischen Ergebnis verbunden ist.
Obwohl es riesige Datenmengen für die histologische Struktur und Funktion des kardialen autonomen Nervensystems gibt, ist seine molekularbiologische Architektur in Gesundheit und Krankheit in vielerlei Hinsicht immer noch rätselhaft. Neuartige Technologien wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) versprechen die genetische Charakterisierung von Geweben bei Einzelzellauflösung. Die relativ große Größe der Neuronen kann jedoch die standardisierte Verwendung dieser Techniken behindern. Hier nutzt dieses Protokoll die tröpfchenbasierte Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), eine Methode zur Charakterisierung der biologischen Architektur von kardialen sympathischen Neuronen in Gesundheit und Krankheit. Es wird gezeigt, dass ein schrittweiser Ansatz snRNA-seq der bilateralen oberen zervikalen (SCG) und stellaten Ganglien (StG) durchführt, die von erwachsenen Mäusen seziert wurden.
Diese Methode ermöglicht eine langfristige Probenkonservierung und hält eine angemessene RNA-Qualität aufrecht, wenn Proben von mehreren Individuen / Experimenten nicht innerhalb kurzer Zeit auf einmal gesammelt werden können. Die Barkodierung der Kerne mit Hashtag-Oligos (HTOs) ermöglicht das Demultiplexing und die Rückverfolgung verschiedener ganglionärer Proben nach der Sequenzierung. Nachfolgende Analysen zeigten eine erfolgreiche Kernerfassung von neuronalen, satellitengestützten Glia- und Endothelzellen der sympathischen Ganglien, wie durch snRNA-seq validiert. Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen schrittweisen Ansatz für snRNA-seq von sympathischen extrinsischen Herzganglien, eine Methode, die das Potenzial für eine breitere Anwendung in Studien der Innervation anderer Organe und Gewebe hat.
Introduction
Das autonome Nervensystem (ANS) ist ein entscheidender Teil des peripheren Nervensystems, das die Homöostase des Körpers aufrechterhält, einschließlich der Anpassung an Umweltbedingungen und Pathologie1. Es ist an der Regulierung mehrerer Organsysteme im ganzen Körper beteiligt, wie z. B. des Herz-Kreislauf-, Atemwegs-, Verdauungs- und endokrinen Systems. Die ANS ist in sympathische und parasympathische Zweige unterteilt. Spinaläste der Synapse des sympathischen Nervensystems in Ganglien der sympathischen Kette, bilateral in einer paravertebralen Position gelegen. Die bilateralen Hals- und Thoraxganglien, insbesondere das StG, sind wichtige Bestandteile, die an der kardialen sympathischen Innervation beteiligt sind. In Krankheitszuständen, wie z.B. Herzischämie, kann es zu neuronalem Umbau kommen, was zu einem sympathischen Overdriveführt 2. Der neuronale Umbau wurde in mehreren histologischen Studien am Menschen und mehreren anderen Tierartennachgewiesen 3,4,5,6. Eine detaillierte biologische Charakterisierung des kardialen Ischämie-induzierten neuronalen Remodells bei kardialen sympathischen Ganglien fehlt derzeit, und die grundlegenden biologischen Eigenschaften spezialisierter neuronaler Zelltypen oder Subtypen innerhalb des kardialen sympathischen Nervensystems (SNS) sind in Gesundheit und Krankheit noch nicht vollständig bestimmt7.
Neuartige Technologien wie scRNA-seq haben Gateways für die genetische Charakterisierung kleiner Gewebe auf Einzelzellebene 8,9 geöffnet. Die relativ große Größe der Neuronen kann jedoch den optimierten Einsatz dieser Einzelzelltechniken beim Menschen behindern10. Darüber hinaus erfordert die Einzelzellsequenzierung einen hohen Zelldurchsatz, um aufgrund eines hohen Verlusts im Sequenzierungsprozess eine ausreichende Zellzahl wiederherzustellen. Dies könnte sich bei der Untersuchung kleiner Gewebe, die in einer Sitzung schwer zu erfassen sind und mehrere Proben erfordern, um genügend einzelne Zellen für die Sequenzierung einzuführen, als Herausforderung erweisen. Die kürzlich entwickelte tröpfchenbasierte snRNA-seq-Technologie (d.h. die 10x Chromium-Plattform) ermöglicht die Untersuchung biologischer Unterschiede zwischen einzelnen Kernen11,12. snRNA-seq hat einen Vorteil gegenüber scRNA-seq für große Zellen (>30 μm), die möglicherweise nicht in Gelperlen in Emulsionen (GEMs) eingefangen werden, sowie eine verbesserte Kompatibilität bei extensiver Dissoziation und/oder längerer Konservierung13,14,15.
Heterogenität, die Anzahl der neuronalen Zellen und andere im kardialen SNS angereicherte Zellen sind wichtige Aspekte für die Charakterisierung des ANS in Gesundheits- und Krankheitszuständen. Darüber hinaus trägt die organ- oder regionsspezifische Innervation durch jedes sympathische Ganglion zur Komplexität des SNS bei. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass zervikale, stellare und thorakale Ganglien der sympathischen Kette verschiedene Regionen des Herzens innervieren16. Daher ist es notwendig, eine Einzelkernanalyse von Ganglienzellen durchzuführen, die aus einzelnen Ganglien stammen, um ihre biologische Architektur zu untersuchen.
Tröpfchenbasiertes snRNA-seq ermöglicht eine transkriptomweite Expressionsprofilierung für einen Pool von Tausenden von Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig mit geringeren Kosten als plattenbasierte Sequenzierungsplattformen. Dieser Ansatz ermöglicht es, dass tröpfchenbasierte snRNA-seq besser für die zelluläre Phänotypklassifizierung und die Identifizierung neuer Subpopulationen von Zellen innerhalb des SCG und des StG geeignet ist. Insbesondere bietet dieses Protokoll einen prägnanten schrittweisen Ansatz für die Identifizierung, Isolierung und Einzelkern-RNA-Sequenzierung von sympathischen extrinsischen Herzganglien, eine Methode, die das Potenzial für eine breite Anwendung in Studien zur Charakterisierung von Ganglien hat, die andere verwandte Organe und Gewebe in Gesundheit und Krankheit.
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Protocol
Dieses Protokoll beschreibt alle Schritte, die für den snRNA-seq von murinen zervikalen und/oder zervikothorakalen (stellaten) Ganglien erforderlich sind. Weibliche und männliche C57BL/6J-Mäuse (15 Wochen alt, n = 2 für jedes Geschlecht) wurden verwendet. Eine zusätzliche Wnt1-Cre;mT/mG-Maus wurde verwendet, um die Ganglien zu Dissektionszwecken zu visualisieren17,18. Diese zusätzliche Maus wurde durch die Kreuzung einer B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J-Maus und einer B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J-Maus erzeugt. Alle Tierversuche wurden gemäß dem vom NIH veröffentlichten und von der Tierethikkommission der Universität Leiden genehmigten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt (Lizenznummer AVD1160020185325, Leiden, Niederlande). In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten, Software und Tieren, die im Protokoll verwendet werden.
1. Vorbereitungen
HINWEIS: Alle Schritte werden in einem Zellkultur-Durchflussschrank durchgeführt.
- Reinigen Sie die Pinzette und die Schere, indem Sie die Instrumente 20 Minuten lang in 70% Ethanol tauchen.
- Bereiten Sie das Ganglienmedium vor, das aus neurobasalem Medium besteht, ergänzt mit B-27 plus (1x), L-Glutamin (2 mM) und 1% antibiotisch-antimykotisch. Das Ganglienmedium bei Raumtemperatur vorwärmen.
- Bereiten Sie die Aufschlusslösung vor: 0,25% Trypsin-EDTA (1:1) und 1.400 E/ml Kollagenase Typ 2 gelöst im Ganglienmedium.
- Bereiten Sie frischen, kalten (4 °C) Zellwaschpuffer (0,4% Rinderserumalbumin [BSA]) und Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl 2 und 0,1% nichtionisches Detergenzium, 40 E/ml RNAse in nukleasefreiem Wasser) für die Zellkernisolierung vor.
- Bereiten Sie den Kernwaschpuffer vor (1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] mit 2,0% BSA und 0,2 U / μL RNase-Hemmer).
- ST-Färbepuffer (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,2% BSA, 0,02% Tween-20 in nukleasefreiem Wasser).
2. Dissektion von adulten Maus-Hirnganglien (SCG)
- Euthanasiere die Mäuse und halte sie auf Eis.
HINWEIS: In der aktuellen Studie wurden insgesamt 4 C57BL6/J-Mäuse durch CO2-Erstickung eingeschläfert. Alternativ kann Isofluran gefolgt von einer Exsanguination verwendet werden, wenn eine große Menge Blut für andere Studienzwecke gesammelt werden muss. - Befestigen Sie die Maus mit Stiften auf einer Seziertafel und übergießen Sie sie mit 70% Ethanol, um die Ausbreitung des Fells zu minimieren (Rasieren ist nicht erforderlich).
- Öffnen Sie unter einem Stereomikroskop die Haut der Halsregion, indem Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt machen, bewegen Sie die submandibulären Drüsen zur Seite und entfernen Sie den Musculus sternomastoideus, um die gemeinsame Halsschlagader und ihre Verzweigung freizulegen und zu lokalisieren (Abbildung 1A, B, siehe Pfeil).
- Sezieren Sie die Verzweigung der rechten und linken Halsschlagader und das daran befestigte Gewebe. Geben Sie jedes sezierte Stück Gewebe in eine separate 3,5 cm große Petrischale, die kaltes PBS enthält.
- Suchen Sie nach dem SCG, das an der Carotis-Bifurkation befestigt ist. Reinigen Sie das SCG weiter, indem Sie die Arterie und anderes anhaftendes Gewebe in der Petrischale entfernen (Abbildung 1E).
3. Dissektion von adulten Maus-Sternganglien (StG)
- Um das StG zu sezieren, machen Sie einen Mittellinienschnitt im Bauch, gefolgt von der Öffnung des Zwerchfells und der ventralen Brustwand.
- Entfernen Sie das Herz und die Lunge, um den dorsalen Thorax freizulegen. Suchen Sie nach dem linken und rechten StG anterolateral zum Musculus colli longus (MCL) auf Höhe der ersten Rippe (Abbildung 1C, D, gekennzeichnet durch gestrichelte Linien).
- Sezieren Sie die linke und rechte StG mit einer Pinzette und geben Sie sie separat auf 3,5 cm große Petrischalen mit kaltem PBS (Abbildung 1F).
4. Isolierung und Kryokonservierung von Ganglienzellen der Maus
Die Schritte 4 bis 6 sind in Abbildung 2 zusammengefasst.
- Übertragen Sie vorsichtig alle einzelnen SCG und StG in separate 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Pinzette.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Pipettenspitzen, um die Ganglien zu übertragen, da die Ganglien dazu neigen, an der Wand aus Kunststoffpipettenspitzen zu haften. - 500 μL 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen geben und in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C für 40 min inkubieren.
HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, die Verdauung und die anschließende Zellfreisetzung in der Kollagenase-Typ-2-Lösung zu erleichtern. - Bereiten Sie für jede Probe ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Ganglienmedium vor. Lassen Sie die Ganglien sich am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen absetzen. Sammeln Sie den Überstand, der sehr wenige Ganglienzellen enthält, übertragen Sie den Überstand auf die vorbereiteten 15-ml-Röhrchen und markieren Sie jede Röhre. Alternativ, um etwas Zeit zu sparen, aspirieren Sie den Trypsin-EDTA-Überstand ohne Sammlung, da nur sehr wenige dissoziierte Zellen darin nachgewiesen werden können.
HINWEIS: Eine kleine Menge Trypsin-EDTA-Lösung (~ 10-30 μL) kann im Mikrozentrifugenröhrchen verbleiben, um die Entfernung der Ganglien zu vermeiden. Vermeiden Sie Pipettieren bei diesem Schritt, da dies die Ganglien schädigen und danach zu einer geringen Produktion von Ganglienzellen führen kann. - 500 μL Kollagenase Typ 2 Lösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen geben und in einem schüttelnden Wasserbad bei 37 °C für 35-40 min inkubieren. Versuchen Sie, das Ganglion nach 35 min wieder auszusetzen; Wenn das Ganglion noch intakt ist und nicht dissoziiert, verlängern Sie die Inkubationszeit oder erhöhen Sie die Konzentration der Kollagenase-Typ-2-Lösung nach Bedarf.
HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Gangliengröße variieren. - Resuspendieren Sie die Ganglien in Kollagenaselösung, indem Sie ~ 10 Mal auf und ab pipettieren oder bis Gewebeklumpen nicht mehr erkannt werden.
- Übertragen Sie die Zellsuspension auf die zuvor verwendete 15-ml-Röhre, die das Ganglienkulturmedium und die Trypsin-EDTA-Suspension aus demselben Ganglien enthält. Drehen Sie die Zellsuspension mit einer schwingenden Eimerrotorzentrifuge für 10 min, 300 × g bei Raumtemperatur herunter. Verwerfen Sie vorsichtig den Zellüberstand.
HINWEIS: Da die ganglionären Zellen von einem einzelnen Ganglion dissoziiert sind, kann das Zellpellet zu klein sein, um es mit dem Auge zu erkennen; Eine kleine Menge Überstand kann in der Röhre verbleiben, um eine versehentliche Entfernung des Zellpellets zu vermeiden. - Resuspendieren Sie die Ganglienzellen in 270 μL fetalem Rinderserum (FBS, niedriges Endotoxin) und übertragen Sie jede Zell-FBS-Suspension in eine 1 ml Kryoviale.
- Um die Zellen zu zählen, mischen Sie 5 μL der ganglionären Zellsuspension mit 5 μL 0,4% trypanblauem Farbstoff und laden Sie die Mischung in ein Hämozytometer. Zählen Sie die Gesamtzahl und die Anzahl der lebenden Zellen unter einem Mikroskop.
HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit (Lebendzellanzahl/Gesamtzellzahl = Lebensfähigkeit) liegt bei diesem Dissoziationsprotokoll normalerweise über 90%. Die Anzahl der lebenden Zellen eines einzelnen Ganglis (entweder SCG oder StG) liegt normalerweise im Bereich von 9.000-60.000 Zellen, wenn das Ganglion von einer Maus im Alter von 12 bis 16 Wochen isoliert wird. - Fügen Sie 30 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jeder Zell-FBS-Suspension in den Kryozellen hinzu, mischen Sie gut und geben Sie die Kryovials in einen Zellgefrierbehälter, der bei Raumtemperatur aufbewahrt wird. Lagern Sie den mit Kryo beladenen Behälter über Nacht bei -80 ° C und geben Sie die Kryoviale am nächsten Tag zur Langzeitkonservierung vor der Sequenzierung in flüssigen Stickstoff um.
5. Nukleus-Isolierung
HINWEIS: Linkes und rechtes SCG, das aus vier Mäusen (insgesamt 8 Proben) isoliert wurde, wurde als Beispiel für die folgende Nukleusisolierung und Sequenzierungsvorbereitung verwendet. Halten Sie alles während des gesamten Eingriffs auf Eis. Aufgrund der Unsichtbarkeit von kleinen Kernpellets wird eine Zentrifuge mit schwingenden Eimern dringend empfohlen, um die Entfernung von Überständen während des gesamten Verfahrens zu erleichtern.
- Bereiten Sie 15 ml-Röhrchen mit einem Sieb (30 μm) oben vor und spülen Sie das Sieb mit 1 ml des Ganglienmediums vor.
- Entnehmen Sie die Kryoviten aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie sofort in einem Wasserbad bei 37 °C auf. Wenn ein kleines Pellet Eis im Kryo verbleibt, nehmen Sie die Kryoviale aus dem Wasserbad.
- Erholen Sie die Ganglienzellen, indem Sie 1 ml des Ganglienmediums in jedes Kryo fallen lassen, während Sie vorsichtig von Hand schütteln. Optional: Um die Zellwiederherstellung zu bewerten, mischen Sie die Zellsuspension nach der Wiederherstellung und nehmen Sie 5 μL Zellsuspension für die Lebendzellzählung heraus, wie in Schritt 4.8 beschrieben.
- Jede Ganglienzellsuspension wird auf ein separates Sieb (vorbereitet in Schritt 5.1) geladen und jedes Sieb mit 4-5 ml Ganglienmedium abgespült.
- Zentrifen Sie die gespannte Zellsuspension für 5 min bei 300 × g, entfernen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie die Zellen in 50 μL Zellwaschpuffer.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein niedrig bindendes DNA/RNA 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zellsuspension bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Entfernen Sie 45 μL des Überstandes, ohne den Boden des Röhrchens zu berühren, um ein Lösen des Zellpellets zu vermeiden.
- Fügen Sie 45 μL gekühlten Lysepuffer hinzu und pipettieren Sie vorsichtig mit einer 200 μL Pipettenspitze auf und ab.
- Inkubieren Sie die Zellen für 8 min auf Eis.
- Fügen Sie jedem Röhrchen 50 μL kalten Kernwaschpuffer hinzu. Nicht mischen.
- Die Kernsuspension wird bei 600 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Entfernen Sie 95 μL des Überstandes, ohne das Kernpellet zu stören.
- 45 μL gekühlter Kernwaschpuffer in das Pellet geben. Optional: Nehmen Sie 5 μL Kernsuspension, mischen Sie mit 5 μL von 0,4% Trypanblau, um zu zählen, und überprüfen Sie die Qualität der Kerne unter einem Mikroskop mit einem Hämozytometer.
- Die Kernsuspension wird bei 600 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand, ohne den Boden des Rohres zu berühren, um ein Verschieben des Kernpellets zu vermeiden.
6. Nucleus Barcoding mit Hashtag-Oligos (HTOs) und Multiplexing
HINWEIS: HTO-Färbeschritte wurden modifiziert und optimiert für die nukleare Markierung sehr geringer Mengen von (ganglionischen) Kernen gemäß der vorherigen Anwendung in kortikalem Gewebe durch Gaublomme et al.15.
- 50 μL ST-SB-Puffer in das Kernpellet geben, 8-10 Mal vorsichtig pipettieren, bis die Kerne vollständig resuspendiert sind.
- 5 μL Fc-Blocking-Reagenz pro 50 μL der ST-SB/Nuklei-Mischung zugeben und 10 min auf Eis inkubieren.
- Fügen Sie 1 μL (0,5 μg) Einzelkern-Hashtag-Antikörper pro Röhrchen des ST-SB/Nuklei-Mixes hinzu und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
HINWEIS: Eine kürzere Inkubationszeit führt zu einer geringeren Effizienz der Hashtag-Kennzeichnung, wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen. - Fügen Sie 100 μL ST-SB zu jedem Röhrchen hinzu. Nicht mischen.
- Die Kernsuspension wird 5 min, 600 × g bei 4 °C zentrifugiert.
- Entfernen Sie 145 μL des Überstands, ohne das Kernpellet zu stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.4 und 6.5. Entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich, ohne den Boden des Rohres zu berühren, um ein Verschieben des Kernpellets zu vermeiden.
- Resuspendiert das Kernpellet in 50 μL ST-SB und mischen Sie die Kerne vorsichtig.
- Nehmen Sie 5 μL der Kernsuspension und mischen Sie sie mit 5 μL 0,4% Trypanblau, um die Kerne unter einem Mikroskop zu zählen. Siehe Abbildung 3A für ein repräsentatives Bild von Kernen, die mit Trypanblau vermischt und in ein Hämozytometer geladen werden.
- Die Kernsuspension wird 5 min bei 600 × g bei 4 °C zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie die Kerne in ST-SB, um eine Zielkernkonzentration von 1.000-3.000 Kernen / μL für jede Probe gemäß der entsprechenden Kernzahl zu erreichen.
- Poolen Sie die Proben, um die gewünschte Anzahl von Zellen zu erhalten.
HINWEIS: Zum Beispiel wurden in diesem Experiment 8 Proben gleichmäßig gepoolt, um insgesamt 25.000 Kerne zu erhalten, um sofort zu 10x Genomics Chromium und snRNA-seq zu gelangen. Die Kernzahl liegt normalerweise im Bereich von 6.000-40.000 Zellen, wenn das Ganglion von einer Maus im Alter von 12 bis 16 Wochen isoliert wird. Nur etwa die Hälfte der insgesamt belasteten Kerne kann durch tröpfchenbasierten snRNA-seq erfasst werden. Zum Beispiel wurde ein 25.000-Kern-Gemisch vorbereitet, um die Aufnahme von 10.000 Kernen zu gewährleisten, die für die weitere Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung benötigt werden.
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Representative Results
Qualitätskontrollanalyse der Einzelkern-cDNA-Bibliotheksvorbereitung und snRNA-seq
Repräsentative Ergebnisse beschreiben Sequenzierungsergebnisse von 10.000 erfassten Kernen in einem einzigen Pool mit einer Genexpressionsbibliothek mit 25.000 Lesevorgängen / Kern und einer Hashtag-Bibliothek mit 5.000 Lesevorgängen / Kernen. Abbildung 3B zeigt die Qualitätskontrollergebnisse des 1. Strangs cDNA, der Genexpressionsbibliothek (GEX) und der HTO-Bibliothek, die mit dem Bioanalyzer überprüft wurden. Es wird erwartet, dass die HTO-abgeleiteten cDNAs kleiner als 180 bp sind, während mRNA-abgeleitete cDNAs größer als 300 bp sind. Eine hochwertige GED-Bibliothek kann als breiter Peak von 300 bis 1.000 bp erkannt werden, und die HTO-Bibliothek wird als spezifischer Peak von 194 bp erkannt. Cell Ranger wurde standardmäßig für Demultiplexing, Fastq-Dateigenerierung und Leseausrichtung verwendet. Das SeuratR-Paket 19 wurde anschließend für die Qualitätskontrolle und nachgelagerte Analysen verwendet.
Das Demultiplexing der snRNA-seq-Daten erfolgte durch Identifizierung von HTOs unter Verwendung der integrierten Demultiplexstrategie von Seurat. Die Demultiplexing-Fähigkeit für jedes HTO wurde zuerst mit HTO-Ausdrucksdateien visualisiert (Ergänzende Abbildung S1). In der Heatmap von Abbildung 4A werden Singulette als Kerne mit spezifischer HTO-Expression detektiert, während Dubletten und Negative eine unspezifische Expression von mehreren oder keinen HTOs zeigen. Bemerkenswert ist, dass etwa 33% der Kerne mit einem 10-minütigen HTO-Antikörper-Inkubationsansatz als negativ nachgewiesen wurden. Die Verlängerung der Inkubationszeit (Schritt 6.3) von 10 min auf 30 min in einem nachfolgenden Experiment zeigte eine bemerkenswerte Abnahme der negativ markierten Kerne (Supplemental Figure S2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Verlängerung der Inkubationszeit von Antikörpern die Hashtag-Effizienz verbessern kann.
Geigendiagramme in Abbildung 4B-D zeigen die Anzahl der Gene (nFeature_RNA), die Anzahl der eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMI) (nCount_RNA) und den Prozentsatz der mitochondrialen Zählungen (percent.mt) innerhalb des snRNA-seq-Datensatzes, um Ausreißer und minderwertige Kerne zu identifizieren. Kerne wurden nur dann in die nachgelagerte Analyse einbezogen, wenn die folgenden Kriterien erfüllt waren: i) nFeature_RNA > 500 und nCount_RNA < 20.000; ii) percent.mt < 5%; iii) der einzelne Kern zeigte einen klaren Ausdruck eines einzigen HTO. Die Anzahl der Genexpressionen wurde mit der Standardmethode in Seurat normalisiert: 875 (2,71 %) Gene wurden als hochvariable Gene nachgewiesen (Abbildung 4E). snRNA-seq GEX wurde skaliert, durchgeführt und das Ellenbogendiagramm wurde verwendet, um die Einbeziehung von Hauptkomponenten zu bewerten, die für nachgelagerte Analysen verwendet werden würden (Abbildung 4F). Insgesamt waren 18 PCs enthalten. Das Clustering wurde mit einer Auflösung von 0,4 durchgeführt.
Die Kerne wurden geclustert, und zur Visualisierung der 12 einzelnen Cluster wurde eine Dimensionsreduktion (UMAP) durchgeführt (Abbildung 5A). Die mittlere rohe Genzahl pro Cluster variiert zwischen 991,5 und 4.586 (Ergänzende Abbildung S3A, B). Die Visualisierung der Teilung der HTO-Antikörper innerhalb des UMAP zeigt eine klare Verteilung der Ganglien, was darauf hindeutet, dass alle Cluster in jedem Ganglien dargestellt sind (Abbildung 5B). Um die Genauigkeit der HTO-Probensegregation zu validieren, wurde die Expression des X Inactive Specific Transcript (Xist, ausgedrückt im inaktiven weiblichen X-Chromosom) bewertet, um die männlichen Proben und die weiblichen Proben zu identifizieren (Abbildung 5C). Der Xist-Ausdruck entsprach der Hashtag-Kennzeichnung und zeigte, dass HTO 1-4-markierte Proben weibliche Proben und HTO 5-8-markierte Proben männliche Proben waren. Dies deutet darauf hin, dass die kuratierte HTO-Kennzeichnung sehr spezifisch ist.
Um die Qualität und Auflösung der Sequenzierungsdaten mit der vorliegenden Methode weiter zu überprüfen, wurden zunächst einige wichtige Transkripte sympathischer Neuronen untersucht. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von sympathischen Neuronen, die Th, Dbh und Snap25 in den Clustern 5 und 7 stark exprimieren (Abbildung 5D-F). Satellitengliazellen wurden mit der Expression von S100b in den Clustern 0-3 detektiert (Abbildung 5G)20. Endothelzellen wurden in Cluster 4 mit einer hohen Expression von Pecam1 (Abbildung 5H) und Stromazellen in Cluster 8 mit einer hohen Expression von Acta2 nachgewiesen (Abbildung 5I). Diese Ergebnisse unterstützen die erfolgreiche Kerneinfangung von neuronalen, satellitenglialischen, endothelialen und stromalen Zellen des sympathischen Ganglions mittels snRNA-seq.
Abbildung 1: Dissektion von adulten Maus-Oberhirnganglien und stellaten Ganglien . (A) Hellfeldbild des Standorts des SCG. (B) Um die Visualisierung zu erleichtern, wurde eine Wnt1Cre;mT/mG-Maus verwendet. Sternchen kennzeichnen das SCG (eGFP+), Pfeilspitzen zeigen die Verzweigung der Halsschlagader an. Linker Bereich, Phasenkontrastbild; rechtes Panel, fluoreszierendes Bild. (C) Hellfeldbild des Ortes des StG. (D) Sternchen zeigen das StG (eGFP+), gestrichelte Linien das MCL. Linker Bereich, Phasenkontrastbild; rechtes Panel, fluoreszierendes Bild. (E) Sezierte Ganglien werden separat in eine Petrischale zur weiteren Reinigung unter einem Stereomikroskop überführt. (F) Linkes Panel, das sezierte SCG mit der Halsschlagader noch befestigt. Gestrichelte Gliederung zeigt die SCG an. Das rechte Feld, das sezierte und gereinigte StG, hat die Form eines umgekehrten Dreiecks, wie der gestrichelte Umriss zeigt. Maßstabsleiste = 1.000 μm. Abkürzungen: SCG = Superior cervical ganglia; StG = Sternganglien; MCL = Musculus colli longus; eGFP = Enhanced Green Fluorescent Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Workflow der Probenvorbereitung und des Hashtag-Färbe-basierten Multiplexings für snRNA-seq. Das Flussdiagramm zeigt die Schritte aus der Dissoziation von Ganglienzellen (orange), der Zellzellisolierung (blau) und der Hashtag-Antikörperfärbung und -multiplexung (grün), die für snRNA-seq durchgeführt werden. Abkürzungen: FBS = fetales Rinderserum; ST-SB = ST-Färbepuffer; snRNA-seq = Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Qualitätskontrolle der Zellkernisolierung und der Vorbereitung der Genexpressionsbibliothek . (A) Phasenkontrastbild der HTO-gefärbten Kerne. Kerne sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Maßstabsleiste = 100 μm. (B) Bioanalyzer-Ergebnisse von1. Stränge cDNA (oben), GEDEX-Bibliothek (Mitte) und HTO-Bibliothek (unten). Abkürzungen: GEX = Genexpression; HTO = Hashtag Oligo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Qualitätskontrolle der Hashtag-Oligo-Markierungseffizienz und Qualitätskontrolle von snRNA-seq. (A) Heatmap der HTO-Färbung mit einer Inkubationszeit von 10 min mit Hashtag-Antikörpern erreicht. (B-D) Geigendiagramme von Qualitätskontrollmetriken, die die Anzahl der Gene darstellen (nFeature_RNA, B); die Anzahl der UMIs (nCount_RNA, C); der Prozentsatz der mitochondrialen Zählungen (percent.mt, D). (E) Von den insgesamt 32.285 sequenzierten Genen wurden 875 (2,71 %) als sehr variable Merkmale identifiziert, wie sie im Streudiagramm visualisiert wurden. (F) Ellenbogendiagramm von PCs, um die Einbeziehung des für das Clustering verwendeten echten Signals zu bestimmen. Abkürzungen: snRNA-seq = Single-Nucleus RNA Sequencing; HTO = Hashtag Oligo; PCs = Hauptkomponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der Analyse von snRNA-seq. (A) UMAP-Diagramm des geclusterten snRNA-seq-Datensatzes. (B) UMAP-Diagramm, das die Verteilung der gepoolten HTO-Stichproben visualisiert. (C) Geigenplot, der weibliche Proben (hoher Xist-Ausdruck) nach dem Demultiplexen validiert. (D-I) UMAP-Diagramme mit ausgewählten Markergenen; die Cluster exprimieren stark die entsprechenden Gene, die innerhalb der roten Kreise angezeigt sind: D-F, Sympathische Neuronen (Th, Dbh, Snap25); g) Satellitengliazellen (S100b); (H) Endothelzellen (Pecam1); (I) Stromazellen (Acta2). Abkürzungen: snRNA-seq = Single-Nucleus RNA Sequencing; HTO = Hashtag Oligo; UMAP = einheitliche mannigfaltige Approximation und Projektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Qualitätskontrollmetriken eines repräsentativen Single-Nucleus-Sequenzierungsergebnisses. HTO-Expressionsprofile einzelner Proben, die die Demultiplexfähigkeit der verwendeten Hashtag-Antikörper visualisieren. Abkürzung: HTO = Hashtag oligo. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: HTO-Expressions-Heatmap nachfolgender Proben, die 30 min lang mit HTO-Antikörpern inkubiert wurden. Der Vergleich der Anzahl der negativ markierten Kerne nach HTO-Demultiplexing mit Abbildung 4A zeigt eine deutliche Verbesserung der Kernmarkierung nach Verlängerung der Antikörperinkubationszeit. Abkürzung: HTO = Hashtag oligo. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Median und Quantile der Genexpression pro Cluster. (A) Mediane rohe Genexpression ungleich Null jedes Clusters. (B) Deskriptive Statistiken der rohen Genexpression jedes Clusters ungleich Null. Q1: 25. Perzentil, Q3: 75. Perzentil. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier wird ein detailliertes Protokoll beschrieben, das sich auf i) die Dissektion von adulten Maus-Superior-zervikalen und stellaten sympathischen Ganglien, ii) die Isolierung und Kryokonservierung der Ganglienzellen, iii) Nukleusisolierung und iv) Nukleus-Barcoding mit HTO-Markierung für Multiplexing-Zwecke und snRNA-seq konzentriert.
Mit diesem Protokoll können sympathische Ganglienzellen leicht erhalten werden, indem einzelne Ganglien unter Verwendung von häufig verwendetem Trypsin und Kollagenase dissoziiert werden. Die Langzeitkonservierung isolierter ganglionärer Zellen wird auch leicht durch das Einfrieren von Zellen in FBS erreicht, die mit 10% DMSO ergänzt werden, was eine hohe Qualität der Erholung nach dem Auftauen zeigte. Darüber hinaus hat die Verwendung von tröpfchenbasiertem snRNA-seq einzelner muriner sympathischer Ganglien in Kombination mit der Anwendung von HTO-färbungsbasiertem Nucleus-Barcoding im Vergleich zur herkömmlichen Einzelzell-RNA-Sequenzierung folgende Vorteile: i) Proben können lange aufbewahrt werden, bis alle Proben für eine weitere Nukleusisolierung bereit sind; ii) Kerne von guter Qualität, die aus mehreren kleinen Ganglien isoliert sind, können für die Sequenzierung ohne Chargeneffekt, der durch getrennte Probenvorbereitung verursacht wird, zusammengepoolt werden; iii) die Fähigkeit, den eindeutigen ganglionären Ursprung nach der Sequenzierung durch Verwendung von Nucleus-Barcodes zurückzuverfolgen; und iv) Wirtschaftlichkeit, da nur eine einzige Bibliotheksvorbereitung erforderlich ist. Wichtig ist, dass das beschriebene Isolations- und Zellkulturprotokoll eine einzige einheitliche Methode sowohl für murine zervikale als auch für stellate Ganglien bietet und möglicherweise auf andere Ganglien wie dorsale Wurzelganglien und andere Arten, z. B. menschliche Ganglien, anwendbar ist.
Einer der Hauptvorteile von scRNA-seq ist die Fähigkeit, (neuartige) Zelltypen zu identifizieren und seltene Zellpopulationen aufzudecken, die mit Bulk-RNA-seq nicht nachgewiesen werden konnten. Die tröpfchenbasierte scRNA-seq-Plattform erleichtert die Aufnahme weiterer Zellen. Es kann somit eine aggregierte Ansicht der Zell(sub)typen und der transkriptionellen Heterogenität einer großen Zellpopulation im Vergleich zu einer plattenbasierten Sequenzierungsplattform liefern. Die tröpfchenbasierte (z. B. 10x Chrom) Plattform ist jedoch nicht für Zellen geeignet, die größer als 50 μm sind, was ihre Anwendung in großen Zellen wie menschlichen Neuronen (~ 100 μm) einschränkt. Die Verfügbarkeit der snRNA-seq-Technik überwindet diesen Nachteil aufgrund der geringen Größe eines Kerns. Darüber hinaus ist snRNA-seq eine nützliche Methode für Genexpressionsstudien von hochgradig vernetzten und ertragsarmen Zellen wie Neuronen und gefrorenem Gewebe.
Obwohl es möglich ist, Kerne ohne vorherige Zelldissoziation direkt aus Geweben zu isolieren, war es für die Ausbeute von Vorteil, eine zweistufige Nukleusisolationsmethode zu wählen, bei der zuerst das Ganglion in einzelne Zellen dissoziiert wird (die in flüssigem Stickstoff konserviert werden können), gefolgt von der Nukleusisolierung. Aufgrund der geringen Größe eines sympathischen Ganglions der Maus wurde festgestellt, dass mit einer zweistufigen Nukleusisolationsmethode mehr Kerne erhalten wurden als mit einem einstufigen Nukleusisolationsansatz. Die Qualitätsprüfung der cDNA-, Bibliotheks- und Sequenzierungsanalysen zeigt eine gute Kern-/RNA-Qualität. Darüber hinaus wird die Logistik verbessert, da Proben zu verschiedenen Zeitpunkten vor der Sammelsequenzierung gesammelt und gelagert werden können. Die Einzelkernanalyse ergab auch die erfolgreiche Erholung und Erfassung von Neuronen und Gliazellen, was darauf hindeutet, dass der beschriebene zweistufige Nukleusisolationsansatz für die Anwendung in kleinen Geweben besser geeignet sein könnte.
Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist das Multiplexing mit barcodierten Antikörpern21. Das sympathische Ganglion der Maus ist ein winziges Gewebe (durchschnittliche Größe0,1 mm 3), und die geringe Anzahl von Zellen, die aus einem einzelnen Ganglien stammen, reicht für eine tröpfchenbasierte Sequenzierung allein nicht aus. Das Sammeln mehrerer Ganglien verschiedener Mäuse oder verschiedener Ganglien derselben Maus führt jedoch zum Verlust entweder einzelner Mausinformationen oder einzelner Ganglieninformationen. Als Lösung ist der HTO-Färbeschritt einfach durchzuführen und ermöglicht die barcodierte Markierung von Kernen, die von verschiedenen Mäusen oder verschiedenen Ganglien abgeleitet wurden, vor dem Nukleus-Pooling. Die Genauigkeit des HTO-Demultiplexings wird in diesem Protokoll durch übereinstimmende Xist-Expression in bekannten weiblichen Kernpopulationen verifiziert. Das Nucleus-Multiplexing mit barcodierten Antikörpern reduziert daher die Chargeneffekte und senkt die Sequenzierungskosten.
Eine mögliche Einschränkung von snRNAseq könnte sein, dass es Unterschiede zwischen der RNA-Zusammensetzung im Kern und dem Zytoplasma aufgrund des natürlichen Vorhandenseins von naszierenden Transkripten im Kern geben kann, die mit einer frühen Reaktion auf neuronale Aktivitäten verbunden sind22,23. Der Zellkern und das Zytoplasma können sich auch in den Transkripten unterscheiden, abhängig vom Zellzykluszustand24. In einem einzelnen Zellkern (~7.000 Gene) wurden weniger Transkripte nachgewiesen als in einer Zelle (~11.000 Gene)14. Daher können scRNA-seq und snRNA-seq auf Transkriptebene zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Dennoch zeigte der Vergleich zwischen scRNA-seq und snRNA-seq eine ähnliche Fähigkeit, neuronale Zelltypen von Hirngewebe zu unterscheiden14. Um die Unterscheidung zwischen sehr ähnlichen Zelltypen oder Subtypen durch snRNA-seq zu verbessern, könnten mehr Kerne benötigt werden, um die geringere Gennachweisfähigkeit im Vergleich zu scRNA-seq auszugleichen. Obwohl die Genauigkeit des HTO-Demultiplexings ausreichend ist, ist der Verlust einiger Daten unvermeidlich, da nicht alle Kerne HTO-Spezifität aufweisen. Eine weitere Optimierung der Antikörperinkubation könnte die Anzahl der Kerne mit doppelter oder negativer Expression von HTOs minimieren.
Zusammengenommen bietet dieses Protokoll das experimentelle Verfahren zur Sequenzierung neuronaler Kerne aus sympathischen Ganglien mittels eines leicht verständlichen Workflows, der von der Ganglienisolierung bis zur Nukleivorbereitung mit niedrigem Input von Zellen reicht, gefolgt von HTO-Färbe-basierter Nukleusmarkierung für snRNA-seq. Das Protokoll bietet einen detaillierten Überblick über alle wichtigen Schritte, die leicht durchgeführt und auf verschiedene Ganglien bei Murinen und anderen Arten angewendet werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Susan L. Kloet (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, Niederlande) für ihre Hilfe bei der Versuchsplanung und nützliche Diskussionen. Wir danken Emile J. de Meijer (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, Niederlande) für die Hilfe bei der Single-Nucleus-RNA-Isolierung und Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung. Diese Arbeit wird von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unterstützt [016.196.346 bis M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
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