Summary
Ce protocole décrit la préparation détaillée et à faible entrée de l’échantillon pour le séquençage à noyau unique, y compris la dissection des ganglions cervicaux et stellaires supérieurs de souris, la dissociation cellulaire, la cryoconservation, l’isolement du noyau et le codage à barres hashtag.
Abstract
Le système nerveux autonome cardiaque est crucial dans le contrôle de la fonction cardiaque, comme la fréquence cardiaque et la contractilité cardiaque, et est divisé en branches sympathiques et parasympathiques. Normalement, il y a un équilibre entre ces deux branches pour maintenir l’homéostasie. Cependant, les états pathologiques cardiaques tels que l’infarctus du myocarde, l’insuffisance cardiaque et l’hypertension peuvent induire le remodelage des cellules impliquées dans l’innervation cardiaque, ce qui est associé à un résultat clinique défavorable.
Bien qu’il existe de grandes quantités de données sur la structure histologique et la fonction du système nerveux autonome cardiaque, son architecture biologique moléculaire dans la santé et la maladie est encore énigmatique à bien des égards. De nouvelles technologies telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) sont prometteuses pour la caractérisation génétique des tissus à résolution unicellulaire. Cependant, la taille relativement grande des neurones peut entraver l’utilisation standardisée de ces techniques. Ici, ce protocole exploite le séquençage de l’ARN à noyau unique à base de gouttelettes (snRNA-seq), une méthode pour caractériser l’architecture biologique des neurones sympathiques cardiaques dans la santé et la maladie. Une approche par étapes est démontrée pour effectuer la séquence d’ARNN des ganglions cervicaux supérieurs bilatéraux (SCG) et stellaires (StG) disséqués à partir de souris adultes.
Cette méthode permet la conservation à long terme des échantillons, en maintenant une qualité d’ARN adéquate lorsque les échantillons de plusieurs individus / expériences ne peuvent pas être collectés tous en même temps dans un court laps de temps. Le codage à barres des noyaux avec des oligos de hashtag (HTO) permet de démultiplexer et de retracer des échantillons ganglionnaires distincts après le séquençage. Des analyses ultérieures ont révélé une capture réussie des noyaux des cellules neuronales, gliales satellites et endothéliales des ganglions sympathiques, validée par snRNA-seq. En résumé, ce protocole fournit une approche par étapes pour l’ARNN-seq des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques, une méthode qui a le potentiel d’une application plus large dans les études de l’innervation d’autres organes et tissus.
Introduction
Le système nerveux autonome (SNA) est une partie cruciale du système nerveux périphérique qui maintient l’homéostasie du corps, y compris l’adaptation aux conditions environnementales et à la pathologie1. Il est impliqué dans la régulation de plusieurs systèmes d’organes dans tout le corps tels que les systèmes cardiovasculaire, respiratoire, digestif et endocrinien. Le SNA est divisé en branches sympathiques et parasympathiques. Les branches vertébrales du système nerveux sympathique synapsent dans les ganglions de la chaîne sympathique, situés bilatéralement en position paravertébrale. Les ganglions cervicaux et thoraciques bilatéraux, en particulier la StG, sont des composants importants participant à l’innervation sympathique cardiaque. Dans les états pathologiques, tels que l’ischémie cardiaque, un remodelage neuronal peut se produire, entraînant une surenchère sympathique2. Le remodelage neuronal a été démontré dans de multiples études histologiques chez l’homme et plusieurs autres espèces animales 3,4,5,6. Une caractérisation biologique détaillée du remodelage neuronal induit par l’ischémie cardiaque dans les ganglions sympathiques cardiaques fait actuellement défaut, et les caractéristiques biologiques fondamentales des types ou sous-types de cellules neuronales spécialisées dans le système nerveux sympathique cardiaque (SNS) ne sont pas encore entièrement déterminées dans la santé et la maladie7.
De nouvelles technologies, telles que scRNA-seq, ont ouvert des portes pour la caractérisation génétique de petits tissus au niveau 8,9 d’une seule cellule. Cependant, la taille relativement grande des neurones peut entraver l’utilisation optimisée de ces techniques unicellulaires chez l’homme10. En outre, le séquençage unicellulaire nécessite un débit élevé de cellules pour récupérer un nombre suffisant de cellules en raison d’une perte élevée dans le processus de séquençage. Cela peut s’avérer difficile lors de l’étude de petits tissus difficiles à capturer en une seule session et nécessitant plusieurs échantillons pour introduire suffisamment de cellules uniques pour le séquençage. La technologie snRNA-seq à base de gouttelettes récemment développée (c’est-à-dire la plate-forme 10x Chromium) permet d’étudier les différences biologiques entre les noyaux simples11,12. snRNA-seq détient un avantage sur scRNA-seq pour les grandes cellules (>30 μm), qui peuvent ne pas être capturés dans Gel Bead in Emulsions (GEM), ainsi qu’une compatibilité améliorée avec une dissociation étendue et / ou une conservation prolongée 13,14,15.
L’hétérogénéité, le nombre de cellules neuronales et d’autres cellules enrichies dans le SNS cardiaque sont des aspects importants pour la caractérisation du SNA dans les états de santé et de maladie. De plus, l’innervation spécifique à un organe ou à une région par chaque ganglion sympathique contribue à la complexité du SNS. De plus, il a été démontré que les ganglions cervicaux, stellaires et thoraciques de la chaîne sympathique innervent différentes régions du cœur16. Par conséquent, il est nécessaire d’effectuer une analyse mononucléaire des cellules ganglionnaires dérivées de ganglions individuels pour étudier leur architecture biologique.
Le snRNA-seq à base de gouttelettes permet un profilage d’expression à l’échelle du transcriptome pour un pool de milliers de cellules provenant de plusieurs échantillons à la fois avec des coûts inférieurs à ceux des plates-formes de séquençage sur plaques. Cette approche permet aux snRNA-seq à base de gouttelettes d’être plus adaptés à la classification du phénotype cellulaire et à l’identification de nouvelles sous-populations de cellules au sein du SCG et du StG. Notamment, ce protocole fournit une approche concise par étapes pour l’identification, l’isolement et le séquençage de l’ARN mononuclé des ganglions cardiaques extrinsèques sympathiques, une méthode qui a le potentiel d’une large application dans les études de la caractérisation des ganglions innervant d’autres organes et tissus apparentés dans la santé et la maladie.
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Protocol
Ce protocole décrit toutes les étapes requises pour le séquençage de l’ARNn des ganglions murins cervicaux et/ou cervicothoraciques (stellaires). Des souris femelles et mâles C57BL/6J (âgées de 15 semaines, n = 2 pour chaque sexe) ont été utilisées. Une souris Wnt1-Cre;mT/mG supplémentaire a été utilisée pour visualiser les ganglions à des fins de dissection17,18. Cette souris supplémentaire a été générée par le croisement d’une souris B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J et d’une souris B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les NIH et approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Université de Leiden (numéro de licence AVD1160020185325, Leiden, Pays-Bas). Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux, équipements, logiciels et animaux utilisés dans le protocole.
1. Préparatifs
REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées dans une armoire de flux de culture cellulaire.
- Nettoyez les pinces et les ciseaux en immergeant les instruments dans de l’éthanol à 70% pendant 20 min.
- Préparer le milieu ganglionnaire composé de milieu neurobasal complété par B-27 plus (1x), L-glutamine (2 mM) et 1% antibiotique-antimycotique. Préchauffer le milieu ganglionnaire à température ambiante.
- Préparer la solution de digestion : 0,25 % de trypsine-EDTA (1:1) et 1 400 U/mL de collagénase de type 2 dissous dans le milieu ganglionnaire.
- Préparer un tampon de lavage cellulaire frais et froid (4 °C) (0,4 % d’albumine sérique bovine [BSA]) et un tampon de lyse (10 mM de Tris-HCl, 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2 et 0,1 % de détergent non ionique, 40 U/mL d’ARNase dans de l’eau sans nucléase) pour l’isolement du noyau.
- Préparer un tampon de lavage du noyau (1x solution saline tamponnée au phosphate [PBS] avec 2,0 % de BSA et 0,2U/μL d’inhibiteur de la RNase).
- Préparer le tampon de coloration ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2 % BSA, 0,02 % Tween-20 dans de l’eau sans nucléase).
2. Dissection des ganglions cervicaux supérieurs de souris adultes (SCG)
- Euthanasiez les souris et gardez-les sur la glace.
NOTE: Dans la présente étude, un total de 4 souris C57BL6 / J ont été euthanasiées par asphyxie au CO2 . Alternativement, l’isoflurane peut être utilisé suivi d’une exsanguination lorsqu’une grande quantité de sang doit être collectée à d’autres fins d’étude. - Fixez la souris sur une planche de dissection avec des broches et arrosez-la d’éthanol à 70% pour minimiser la dispersion de la fourrure (le rasage n’est pas nécessaire).
- Sous un stéréomicroscope, ouvrez la peau de la région du cou en faisant une coupe médiane avec des ciseaux, écartez les glandes sous-maxillaires et retirez le muscle sternomastoïde pour exposer et localiser l’artère carotide commune et sa bifurcation (Figure 1A, B, voir flèche).
- Disséquez la bifurcation de l’artère carotide droite et gauche et le tissu qui y est attaché. Transférer chaque morceau de tissu disséqué dans une boîte de Petri séparée de 3,5 cm contenant du PBS froid.
- Recherchez le SCG attaché à la bifurcation carotidienne. Nettoyez davantage le SCG en retirant l’artère et d’autres tissus attachés dans la boîte de Pétri (Figure 1E).
3. Dissection des ganglions stellaires de souris adultes (StG)
- Pour disséquer le StG, faites une coupe médiane dans l’abdomen, suivie de l’ouverture du diaphragme et de la paroi thoracique ventrale.
- Retirez le cœur et les poumons pour exposer le thorax dorsal. Recherchez le StG antérolatéral gauche et droit au musculus colli longus (LCM) au niveau de la première côte (Figure 1C, D, indiqué par des lignes pointillées).
- Disséquez les StG gauche et droit avec des pinces et transférez-les séparément dans des boîtes de Petri de 3,5 cm contenant du PBS froid (Figure 1F).
4. Isolement et cryoconservation des cellules ganglionnaires de souris
Les étapes 4 à 6 sont résumées à la figure 2.
- Transférez soigneusement tous les SCG et StG individuels dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL séparés à l’aide de pinces.
REMARQUE: N’utilisez pas d’embouts de pipette pour transférer les ganglions, car les ganglions sont enclins à adhérer à la paroi des embouts de pipette en plastique. - Ajouter 500 μL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans chaque tube de microcentrifugation et incuber au bain-marie agité à 37 °C pendant 40 min.
REMARQUE: Cette étape vise à faciliter la digestion et la libération cellulaire ci-après dans la solution de collagénase de type 2. - Préparer un tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu ganglionnaire pour chaque échantillon. Laissez les ganglions s’installer au fond des tubes de microcentrifugation. Recueillir le surnageant, qui contient très peu de cellules ganglionnaires, transférer le surnageant dans les tubes préparés de 15 mL et étiqueter chaque tube. Alternativement, pour gagner du temps, aspirer le surnageant trypsine-EDTA sans prélèvement car très peu de cellules dissociées peuvent y être détectées.
REMARQUE: Une petite quantité de solution de trypsine-EDTA (~ 10-30 μL) peut être laissée dans le tube de microcentrifugation pour éviter l’élimination des ganglions. Évitez le pipetage à cette étape, car il pourrait endommager les ganglions et entraîner un faible rendement de cellules ganglionnaires par la suite. - Ajouter 500 μL de solution de collagénase de type 2 dans chaque tube de microcentrifugation et incuber au bain-marie agité à 37 °C pendant 35-40 min. Essayez de remettre le ganglion en suspension après 35 minutes; si le ganglion est encore intact et ne se dissocie pas, prolongez le temps d’incubation ou augmentez la concentration de solution de collagénase de type 2 si nécessaire.
REMARQUE: Le temps d’incubation peut varier en fonction de la taille du ganglion. - Resuspendez les ganglions dans une solution de collagénase en pipetant de haut en bas ~ 10 fois ou jusqu’à ce que les amas de tissus ne soient plus détectés.
- Transférer la suspension cellulaire dans le tube de 15 mL précédemment utilisé qui contient le milieu de culture des ganglions et la suspension de trypsine-EDTA du même ganglion. Faites tourner la suspension de la cellule avec une centrifugeuse à rotor à godet oscillant pendant 10 min, 300 × g à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant cellulaire.
REMARQUE: Parce que les cellules ganglionnaires sont dissociées d’un seul ganglion, la pastille cellulaire peut être trop petite pour être détectée à l’œil nu; une petite quantité de surnageant peut être laissée dans le tube pour éviter l’enlèvement accidentel de la pastille de cellule. - Remettre en suspension les cellules ganglionnaires dans 270 μL de sérum fœtal bovin (FBS, faible endotoxine) et transférer chaque suspension cellulaire-FBS dans un cryoviral de 1 mL.
- Pour compter les cellules, mélanger 5 μL de la suspension de cellules ganglionnaires avec 5 μL de colorant bleu trypan à 0,4% et charger le mélange dans un hémocytomètre. Comptez le nombre total et le nombre de cellules vivantes au microscope.
REMARQUE: La viabilité cellulaire (nombre de cellules vivantes / nombre total de cellules = viabilité %) est généralement supérieure à 90% avec ce protocole de dissociation. Le nombre de cellules vivantes d’un seul ganglion (SCG ou StG) se situe généralement entre 9 000 et 60 000 cellules lorsque le ganglion est isolé d’une souris âgée de 12 à 16 semaines. - Ajouter 30 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque suspension cellulaire-FBS dans les cryoviales, bien mélanger et transférer les cryoviales dans un récipient de congélation cellulaire, qui est maintenu à température ambiante. Conservez le récipient chargé de cryovial à -80 °C pendant la nuit et transférez les cryoviaux dans de l’azote liquide le lendemain pour une conservation prolongée avant le séquençage.
5. Isolement du noyau
REMARQUE: Le SCG gauche et droit isolé à partir de quatre souris (au total 8 échantillons) a été utilisé comme exemple dans la préparation suivante de l’isolement et du séquençage du noyau. Gardez tout sur la glace pendant toute la procédure. En raison de l’invisibilité des petites pastilles de noyau, une centrifugeuse avec des seaux oscillants est fortement recommandée pour faciliter l’élimination des surnageants tout au long de la procédure.
- Préparer des tubes de 15 mL avec une passoire (30 μm) sur le dessus et précuire la passoire avec 1 mL du milieu ganglionnaire.
- Retirez les cryoviaux de l’azote liquide et décongelez-les immédiatement au bain-marie à 37 °C. Lorsqu’un petit boulet de glace est laissé dans le cryovial, sortez les cryoviales du bain-marie.
- Récupérez les cellules ganglionnaires en laissant tomber 1 mL du milieu ganglionnaire dans chaque cryovial tout en secouant soigneusement à la main. Facultatif : Pour évaluer la récupération cellulaire, mélanger la suspension cellulaire après la récupération et prélever 5 μL de suspension cellulaire pour le comptage des cellules vivantes, comme décrit à l’étape 4.8.
- Charger chaque suspension de cellules ganglionnaires sur une passoire séparée (préparée à l’étape 5.1) et rincer chaque passoire avec 4-5 mL de milieu ganglionnaire.
- Centrifuger la suspension de cellule tendue pendant 5 min à 300 × g, retirer soigneusement le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 50 μL de tampon de lavage cellulaire.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation à faible liaison ADN/ARN de 0,5 mL.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirez 45 μL du surnageant sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille de cellule.
- Ajouter 45 μL de tampon de lyse réfrigéré et pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
- Incuber les cellules pendant 8 min sur de la glace.
- Ajouter 50 μL de tampon de lavage à noyau froid à chaque tube. Ne pas mélanger.
- Centrifuger la suspension du noyau à 600 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirer 95 μL du surnageant sans perturber la pastille du noyau.
- Ajouter 45 μL de tampon de lavage de noyau réfrigéré à la pastille. Facultatif: Prendre 5 μL de suspension de noyau, mélanger avec 5 μL de 0,4% de bleu de trypan pour compter, et vérifier la qualité des noyaux au microscope avec un hémocytomètre.
- Centrifuger la suspension du noyau à 600 × g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirez le surnageant sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille du noyau.
6. Codage à barres du noyau avec hashtag oligos (HTOs) et multiplexage
REMARQUE: Les étapes de coloration HTO ont été modifiées et optimisées pour le marquage nucléaire de très faibles quantités de noyaux (ganglionnaires) selon l’application précédente dans le tissu cortical par Gaublomme et al.15.
- Ajouter 50 μL de tampon ST-SB à la pastille du noyau, pipeter doucement 8 à 10 fois jusqu’à ce que les noyaux soient complètement remis en suspension.
- Ajouter 5 μL de réactif Fc Blocking par 50 μL du mélange ST-SB/noyaux et incuber pendant 10 min sur de la glace.
- Ajouter 1 μL (0,5 μg) d’anticorps hashtag mononuclé par tube du mélange ST-SB/noyaux et incuber pendant 30 min sur de la glace.
REMARQUE: Un temps d’incubation plus court entraîne une baisse de l’efficacité de l’étiquetage des hashtags, comme le démontrent les résultats représentatifs. - Ajouter 100 μL de ST-SB à chaque tube. Ne pas mélanger.
- Centrifuger la suspension du noyau pendant 5 min, 600 × g à 4 °C.
- Retirer 145 μL du surnageant sans perturber la pastille du noyau.
- Répétez les étapes 6.4 et 6.5. Retirez le surnageant autant que possible sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille du noyau.
- Remettre en suspension la pastille du noyau dans 50 μL de ST-SB et mélanger doucement les noyaux.
- Prenez 5 μL de la suspension du noyau et mélangez-la avec 5 μL de bleu de trypan à 0,4% pour compter les noyaux au microscope. Voir la figure 3A pour une image représentative de noyaux mélangés à du bleu de trypan et chargés dans un hémocytomètre.
- Centrifuger la suspension du noyau pendant 5 min à 600 × g à 4 °C.
- Remettre en suspension les noyaux dans ST-SB pour atteindre une concentration cible de noyaux de 1 000 à 3 000 noyaux/μL pour chaque échantillon en fonction du nombre de noyaux correspondant.
- Regroupez les échantillons pour obtenir le nombre de cellules souhaité.
REMARQUE: Par exemple, dans cette expérience, 8 échantillons ont été également regroupés pour atteindre un total de 25 000 noyaux pour passer immédiatement à 10x Genomics Chromium et snRNA-seq par la suite. Le nombre de noyaux se situe généralement entre 6 000 et 40 000 cellules lorsque le ganglion est isolé d’une souris âgée de 12 à 16 semaines. Seulement environ la moitié des noyaux chargés totaux peuvent être capturés par snRNA-seq à base de gouttelettes. Par exemple, un mélange de 25 000 noyaux a été préparé pour assurer la capture de 10 000 noyaux, ce qui est nécessaire pour la préparation et le séquençage ultérieurs de la bibliothèque.
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Representative Results
Analyse du contrôle de la qualité de la préparation de la bibliothèque d’ADNc à noyau unique et de la formation d’ARNN
Les résultats représentatifs décrivent les résultats de séquençage de 10 000 noyaux capturés dans un seul pool avec une bibliothèque de 25 000 lectures/expression génique du noyau et une bibliothèque de hashtags de 5 000 lectures/noyau. La figure 3B illustre les résultats du contrôle de la qualité de la bibliothèque d’ADNc, d’expression génique (GEX) et de HTO du1er brin, qui ont été vérifiés avec Bioanalyzer. Les ADNc dérivés de l’HTO devraient être inférieurs à 180 pb, tandis que les ADNc dérivés de l’ARNm devraient être supérieurs à 300 pb. Une bibliothèque GEX de haute qualité peut être détectée comme un pic large de 300 à 1 000 bp, et la bibliothèque HTO est détectée comme un pic spécifique de 194 bp. Cell Ranger a été utilisé pour le démultiplexage, la génération de fichiers fastq et l’alignement de lecture par défaut. Le paquet Seurat R19 a ensuite été utilisé pour le contrôle de la qualité et les analyses en aval.
Le démultiplexage des données snRNA-seq a été effectué en identifiant les HTO à l’aide de la stratégie de démultiplexage intégrée de Seurat. La capacité de démultiplexage de chaque HTO a d’abord été visualisée avec des fichiers d’expression HTO (figure supplémentaire S1). Dans la carte thermique de la figure 4A, les singlets sont détectés comme des noyaux avec une expression HTO spécifique, tandis que les doublets et les négatifs montrent l’expression non spécifique de plusieurs ou pas d’HTO. Il convient de noter qu’environ 33 % des noyaux ont été détectés comme négatifs à l’aide d’une approche d’incubation d’anticorps HTO de 10 minutes. L’allongement du temps d’incubation (étape 6.3) de 10 min à 30 min dans une expérience ultérieure a révélé une diminution remarquable des noyaux marqués négativement (figure supplémentaire S2). Ces résultats indiquent que la prolongation du temps d’incubation des anticorps peut améliorer l’efficacité des hashtags.
Les diagrammes de violon de la figure 4B-D démontrent le nombre de gènes (nFeature_RNA), le nombre d’identificateurs moléculaires uniques (UMI) (nCount_RNA) et le pourcentage de numération mitochondriale (percent.mt) dans l’ensemble de données snRNA-seq pour identifier les valeurs aberrantes et les noyaux de faible qualité. Les noyaux n’ont été inclus dans l’analyse en aval que lorsque les critères suivants étaient remplis : i) nFeature_RNA > 500 et nCount_RNA < 20 000; ii) percent.mt < 5 %; iii) le noyau individuel a montré l’expression claire d’un seul HTO. Les comptes d’expression génique ont été normalisés à l’aide de la méthode par défaut dans Seurat : 875 gènes (2,71 %) ont été détectés comme des gènes très variables (figure 4E). snRNA-seq GEX a été mis à l’échelle, a été effectué et le diagramme du coude a été utilisé pour évaluer l’inclusion des composants principaux qui seraient utilisés pour les analyses en aval (figure 4F). Au total, 18 PC ont été inclus. Le clustering a été effectué avec une résolution de 0,4.
Les noyaux ont été regroupés et une réduction de dimension (UMAP) a été effectuée pour la visualisation des 12 clusters individuels (Figure 5A). Le nombre médian de gènes bruts par grappe varie entre 991,5 et 4 586 (figure supplémentaire S3A, B). La visualisation de la division des anticorps HTO au sein de l’UMAP révèle une distribution claire des ganglions, indiquant que tous les amas sont présentés dans chaque ganglion (Figure 5B). Pour valider l’exactitude de la ségrégation de l’échantillon HTO, l’expression de la transcription spécifique inactive X (Xist, exprimée dans le chromosome X féminin inactif) a été évaluée pour identifier les échantillons masculins et les échantillons féminins (figure 5C). L’expression Xist était conforme à l’étiquetage du hashtag, montrant que les échantillons marqués HTO 1-4 étaient des échantillons féminins et que les échantillons marqués HTO 5-8 étaient des échantillons masculins. Cela suggère que l’étiquetage HTO organisé est très spécifique.
Pour vérifier davantage la qualité et la résolution des données de séquençage avec la présente méthode, certaines transcriptions clés de neurones sympathiques ont d’abord été examinées. Les résultats montrent la présence de neurones sympathiques qui expriment fortement Th, Dbh et Snap25 dans les groupes 5 et 7 (Figure 5D-F). Des cellules gliales satellites ont été détectées avec l’expression de S100b dans les amas 0-3 (Figure 5G)20. Des cellules endothéliales ont été détectées dans le groupe 4 avec une expression élevée de Pecam1 (Figure 5H) et des cellules stromales dans le groupe 8 avec une expression élevée d’Acta2 (Figure 5I). Ces résultats soutiennent la capture réussie des noyaux des cellules neuronales, gliales satellites, endothéliales et stromales du ganglion sympathique à l’aide de snRNA-seq.
Figure 1 : Dissection des ganglions cervicaux supérieurs et des ganglions étoilés de souris adultes. (A) Image en champ clair de l’emplacement du SCG. (B) Pour faciliter la visualisation, une souris Wnt1Cre;mT/mG a été utilisée. Les astérisques indiquent le SCG (eGFP+), les pointes de flèches indiquent la bifurcation de l’artère carotide. Panneau de gauche, image à contraste de phase; panneau de droite, image fluorescente. (C) Image en champ clair de l’emplacement du StG. (D) Les astérisques indiquent le StG (eGFP+), les lignes pointillées indiquent le MCL. Panneau de gauche, image à contraste de phase; panneau de droite, image fluorescente. (E) Les ganglions disséqués sont transférés séparément dans une boîte de Pétri pour un nettoyage ultérieur sous stéréomicroscope. (F) Panneau de gauche, le SCG disséqué avec l’artère carotide toujours attachée. Le contour en pointillés indique le SCG. Panneau de droite, le StG disséqué et nettoyé a la forme d’un triangle inversé, comme indiqué par le contour en pointillés. Barre d’échelle = 1 000 μm. Abréviations: SCG = ganglions cervicaux supérieurs; StG = ganglions étoilés; LCM = musculus colli longus; eGFP = protéine fluorescente verte améliorée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Flux de travail de préparation des échantillons et multiplexage basé sur la coloration par hashtag pour snRNA-seq. L’organigramme décrit les étapes de la dissociation des cellules ganglionnaires (orange), de l’isolement du noyau (bleu) et de la coloration et du multiplexage des anticorps hashtag (vert) qui sont effectuées pour snRNA-seq. Abréviations : FBS = sérum bovin fœtal; ST-SB = tampon de coloration ST; snRNA-seq = séquençage de l’ARN à noyau unique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Contrôle de la qualité de l’isolement du noyau et de la préparation de la bibliothèque d’expression génique. (A) Image de contraste de phase des noyaux colorés en HTO. Les noyaux sont indiqués par des flèches. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Résultats du bioanalyseur de 1er brin d’ADNc (en haut), bibliothèque GEX (au milieu) et bibliothèque HTO (en bas). Abréviations : GEX = expression des gènes; HTO = hashtag oligo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Contrôle de la qualité de l’efficacité de l’étiquetage de l’oligo hashtag et contrôle de la qualité de la snRNA-seq. (A) Carte thermique de la coloration HTO obtenue avec un temps d’incubation de 10 min avec les anticorps hashtag. (B-D) Diagrammes de violon de mesures de contrôle de la qualité illustrant le nombre de gènes (nFeature_RNA, B); le nombre d’UMI (nCount_RNA, C); le pourcentage de numération mitochondriale (percent.mt, D). (E) Sur un total de 32 285 gènes séquencés, 875 (2,71 %) ont été identifiés comme des caractéristiques très variables telles que visualisées dans le nuage de points. (F) Diagramme du coude des PC pour déterminer l’inclusion du signal réel utilisé pour le clustering. Abréviations : snRNA-seq = séquençage de l’ARN à noyau unique ; HTO = hashtag oligo; PC = composants principaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultats représentatifs de l’analyse du diagramme UMAP SNRNA-seq. (A) de l’ensemble de données snRNA-seq groupé. (B) Diagramme UMAP visualisant la distribution des échantillons HTO regroupés. (C) Tracé de violon validant des échantillons féminins (expression Xist élevée) après démultiplexage. (D-I) Graphiques UMAP affichant des gènes marqueurs sélectionnés; les amas expriment fortement les gènes correspondants qui sont indiqués dans les cercles rouges : D-F, neurones sympathiques (Th, Dbh, Snap25) ; G) Cellules gliales satellites (S100b); H) Cellules endothéliales (Pecam1); (I) Cellules stromales (Acta2). Abréviations : snRNA-seq = séquençage de l’ARN à noyau unique ; HTO = hashtag oligo; UMAP = approximation et projection uniformes des collecteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Mesures de contrôle de la qualité d’un résultat représentatif de séquençage à noyau unique. Profils d’expression HTO d’échantillons individuels visualisant la capacité de démultiplexation des anticorps hashtag utilisés. Abréviation : HTO = hashtag oligo. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Carte thermique de l’expression de l’HTO des échantillons suivants incubés avec des anticorps HTO pendant 30 min. La comparaison du nombre de noyaux marqués négativement après démultiplexage HTO avec la figure 4A montre une amélioration marquée du marquage des noyaux après prolongation du temps d’incubation des anticorps. Abréviation : HTO = hashtag oligo. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Médiane et quantiles de l’expression des gènes par grappe. (A) Expression médiane des gènes bruts non nuls de chaque groupe. (B) Statistiques descriptives de l’expression génique brute non nulle de chaque groupe. Q1 :25e centile, Q3 :75e centile. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ici, un protocole détaillé est décrit qui se concentre sur i) la dissection des ganglions cervicaux et sympathiques stellaires supérieurs de souris adultes, ii) l’isolement et la cryoconservation des cellules ganglionnaires, iii) l’isolement du noyau et iv) le codage à barres du noyau avec marquage HTO à des fins de multiplexage et de séquençage de l’ARNN.
Avec ce protocole, les cellules ganglionnaires sympathiques peuvent facilement être obtenues en dissociant les ganglions individuels à l’aide de la trypsine et de la collagénase couramment utilisées. La préservation à long terme des cellules ganglionnaires isolées est également facilement obtenue en congelant des cellules dans fbS complété par 10% de DMSO, ce qui a montré une haute qualité de récupération après décongélation. De plus, par rapport au séquençage conventionnel de l’ARN unicellulaire, l’utilisation de snRNA-seq à base de gouttelettes de ganglions sympathiques murins simples combinée à l’application d’un codage à barres de noyau basé sur la coloration HTO présente les avantages suivants: i) les échantillons peuvent être conservés pendant une longue période jusqu’à ce que tous les échantillons soient prêts pour un isolement ultérieur du noyau; ii) les noyaux de bonne qualité isolés de plusieurs ganglions de petite taille peuvent être regroupés pour le séquençage sans effet de lot causé par la préparation séparée de l’échantillon; iii) la capacité de retracer l’origine ganglionnaire distincte après le séquençage en utilisant des codes-barres de noyau; et iv) le rapport coût-efficacité, puisqu’une seule bibliothèque est nécessaire. Il est important de noter que le protocole d’isolement et de culture cellulaire décrit fournit une méthode uniforme unique pour les ganglions murins du col de l’utérus et les ganglions stellaires et est potentiellement applicable à d’autres ganglions, tels que les ganglions de la racine dorsale et d’autres espèces, par exemple les ganglions humains.
L’un des principaux avantages de scRNA-seq est la capacité d’identifier des types de cellules (nouveaux) et de révéler des populations cellulaires rares qui n’ont pas pu être détectées par des séquençages d’ARN en vrac. La plate-forme scRNA-seq à base de gouttelettes facilite la capture de plus de cellules. Il peut ainsi fournir une vue agrégée des (sous-)types cellulaires et de l’hétérogénéité transcriptionnelle d’une grande population cellulaire par rapport à une plate-forme de séquençage sur plaques. Cependant, la plate-forme à base de gouttelettes (par exemple, 10x Chrome) ne convient pas aux cellules de plus de 50 μm, ce qui limite son application dans les grandes cellules telles que les neurones humains (~ 100 μm). La disponibilité de la technique snRNA-seq surmonte cet inconvénient en raison de la petite taille d’un noyau. De plus, snRNA-seq est une méthode utile pour les études d’expression génique de cellules hautement interconnectées et à faible rendement telles que les neurones et les tissus congelés.
Bien qu’il soit possible d’isoler directement les noyaux des tissus sans dissociation cellulaire préalable, il était bénéfique pour le rendement de prendre une méthode d’isolement du noyau en deux étapes qui dissocie d’abord le ganglion en cellules uniques (qui peuvent être préservées dans l’azote liquide) suivie de l’isolement du noyau. En raison de la petite taille d’un ganglion sympathique de souris, il a été constaté que plus de noyaux étaient obtenus en utilisant une méthode d’isolement de noyau en deux étapes qu’avec une approche d’isolement de noyau en une étape. Le contrôle de la qualité de l’ADNc, de la bibliothèque et des analyses de séquençage indique une bonne qualité des noyaux/ARN. En outre, la logistique est améliorée, car les échantillons peuvent être collectés et stockés à différents moments avant le séquençage collectif. L’analyse à noyau unique a également révélé la récupération et la capture réussies des neurones et des cellules gliales, suggérant que l’approche d’isolement du noyau en deux étapes décrite pourrait être mieux adaptée à l’application dans les petits tissus.
Un autre avantage de ce protocole est le multiplexage avec des anticorps à code-barres21. Le ganglion sympathique de la souris est un tissu minuscule (taille moyenne de 0,1 mm3), et le faible nombre de cellules dérivées d’un ganglion individuel est insuffisant pour le séquençage à base de gouttelettes en soi. Cependant, la mise en commun de plusieurs ganglions de souris différentes ou de différents ganglions de la même souris entraînera la perte d’informations individuelles sur la souris ou d’informations sur les ganglions individuels. En tant que solution, l’étape de coloration HTO est facile à effectuer et permet l’étiquetage par code-barres de noyaux dérivés de différentes souris ou de différents ganglions avant la mise en commun des noyaux. La précision du démultiplexage HTO est vérifiée dans ce protocole par une expression Xist appariée dans des populations de noyaux femelles connues. Le multiplexage de noyaux avec des anticorps à code-barres réduit donc les effets de lot et réduit le coût de séquençage.
Une limitation potentielle de snRNAseq pourrait être qu’il peut y avoir des différences entre la composition de l’ARN dans le noyau et le cytoplasme en raison de la présence naturelle de transcriptions naissantes dans le noyau, associées à une réponse précoce aux activités neuronales22,23. Le noyau et le cytoplasme peuvent également différer dans les transcriptions en fonction de l’état du cycle cellulaire24. Moins de transcriptions ont été détectées dans un noyau individuel (~7 000 gènes) que dans une cellule (~11 000 gènes)14. Par conséquent, scRNA-seq et snRNA-seq peuvent donner des résultats différents au niveau de la transcription. Néanmoins, la comparaison entre scRNA-seq et snRNA-seq a démontré une capacité similaire à discriminer les types de cellules neuronales du tissu cérébral14. Pour améliorer la discrimination entre des types ou des sous-types de cellules très similaires par snRNA-seq, plus de noyaux pourraient être nécessaires pour compenser la capacité de détection de gènes inférieure à celle de scRNA-seq. De plus, bien que la précision du démultiplexage HTO soit suffisante, la perte de certaines données est inévitable car tous les noyaux ne présentent pas de spécificité HTO. Une optimisation plus poussée de l’incubation des anticorps pourrait minimiser le nombre de noyaux avec une expression double ou négative des HTO.
Pris ensemble, ce protocole fournit la procédure expérimentale pour le séquençage des noyaux neuronaux à partir de ganglions sympathiques au moyen d’un flux de travail facile à suivre, allant de l’isolement ganglionnaire à la préparation des noyaux à faible entrée de cellules, suivi d’un marquage de noyau basé sur la coloration HTO pour snRNA-seq. Le protocole fournit un aperçu détaillé de toutes les étapes clés qui peuvent être facilement effectuées et appliquées à divers ganglions chez les espèces murines et autres.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Susan L. Kloet (Département de génétique humaine, LUMC, Leiden, Pays-Bas) pour son aide dans la conception expérimentale et ses discussions utiles. Nous remercions Emile J. de Meijer (Département de génétique humaine, LUMC, Leiden, Pays-Bas) pour son aide à l’isolement de l’ARN mononuclé et à la préparation de la bibliothèque pour le séquençage. Ce travail est soutenu par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) [016.196.346 à M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
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