Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

يتراكم الكينيسين-5 Cin8 الانقسامي ثنائي الاتجاه في مجموعات تنقسم وتندمج أثناء حركتها. التراكم في مجموعات يغير أيضا سرعة واتجاه Cin8. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاختبارات الحركة مع Cin8-GFP المنقى وتحليل الخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8.

Abstract

تؤدي محركات كينيسين -5 ثنائية القطب الانقسامية وظائف أساسية في ديناميكيات المغزل. تظهر هذه المحركات بنية متجانسة رباعية مع زوجين من مجالات المحركات الحفازة ، وتقع في طرفي نقيض من المجمع النشط. تمكن هذه البنية الفريدة محركات kinesin-5 من الربط والانزلاق بعيدا عن الأنابيب الدقيقة المغزل المضادة للتوازي (MTs) ، وبالتالي توفير القوة الموجهة ظاهريا التي تفصل بين قطبي المغزل عن بعضهما البعض. في السابق ، كان يعتقد أن محركات kinesin-5 موجهة حصريا بالإضافة إلى النهاية. ومع ذلك ، كشفت الدراسات الحديثة أن العديد من محركات كينيسين 5 الفطرية موجهة ناقص النهاية على مستوى الجزيء الواحد ويمكنها تغيير الاتجاه في ظل ظروف تجريبية مختلفة. يعد Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 مثالا على هذا البروتين الحركي ثنائي الاتجاه: في ظروف القوة الأيونية العالية ، تتحرك جزيئات واحدة من Cin8 في اتجاه نهاية MTs ناقص. وتبين أيضا أن Cin8 تشكل مجموعات متحركة، في الغالب في الطرف الناقص من MTs، ويسمح هذا التجمع ل Cin8 بتبديل الاتجاه والخضوع لحركية بطيئة زائدة موجهة. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لجميع خطوات العمل مع kinesin-5 Cin8 الموسوم ب GFP ، من الإفراط في التعبير عن البروتين في خلايا S. cerevisiae وتنقيته إلى فحص حركية جزيء واحد في المختبر . تساعد الطريقة المطورة حديثا الموصوفة هنا على التمييز بين الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 ، بناء على شدة التألق. تتيح هذه الطريقة تحليلا منفصلا لحركية الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 ، مما يوفر توصيف اعتماد حركية Cin8 على حجم عنقودها.

Introduction

يتم توسط عدد كبير من أحداث الحركة داخل الخلايا حقيقية النواة من خلال وظيفة البروتينات الحركية الجزيئية. تتحرك هذه المحركات على طول خيوط الهيكل الخلوي ، وخيوط الأكتين ، والأنابيب الدقيقة (MTs) ، وتحول الطاقة الكيميائية للتحلل المائي ATP إلى قوى حركية وميكانيكية مطلوبة لدفع الحركة البيولوجية داخل الخلايا. S. cerevisiae Cin8 القائم على MT هو بروتين محرك كينيسين -5 ثنائي القطب ، متجانس ، يربط ويمرر MTs المغزل بعيداعن 1. يؤدي Cin8 وظائف أساسية أثناء الانقسام ، في تجميع المغزل2،3،4 واستطالة المغزل خلال الطور5،6،7. في السابق ، ثبت أن Cin8 هو محرك ثنائي الاتجاه ، يقوم بتبديل الاتجاه في ظل ظروف تجريبية مختلفة. على سبيل المثال ، في ظل ظروف القوة الأيونية العالية ، تتحرك محركات Cin8 المفردة نحو الطرف السفلي من MTs ، بينما في المجموعات ، في اختبارات MT المنزلقة متعددة المحركات ، وبين MTs المضادة للتوازي ، تتحرك محركات Cin8 بشكل أساسي نحو النهايات الإضافية ل MTs 8,9,10,11,12 . كانت هذه النتائج غير متوقعة للغاية لعدة أسباب. أولا ، يحمل Cin8 مجال محركه الحفاز عند المحطة الأمينية وكان يعتقد سابقا أن هذه المحركات موجهة حصريا بالإضافة إلى النهاية ، في حين تبين أن Cin8 موجهة إلى نهاية ناقصة على مستوى الجزيء الواحد. ثانيا، كان يعتقد أن محركات كينيسين أحادية الاتجاه، إما ناقصة النهاية أو زائدة التوجيه، في حين تبين أن Cin8 ثنائي الاتجاه، اعتمادا على الظروف التجريبية. أخيرا ، بسبب اتجاه MT في المغزل الانقسامي ، لا يمكن تفسير الدور الكلاسيكي لمحركات kinesin-5 في فصل أقطاب المغزل أثناء تجميع المغزل و anaphase B إلا من خلال حركتها الموجهة ذات النهاية الإضافية على MTs التي تتقاطع معها 1,13. بعد التقارير الأولى عن ثنائية الاتجاه ل Cin8 ، ثبت أن بعض محركات كينيسين الأخرى ثنائية الاتجاه14،15،16 ، مما يشير إلى أن الحركة ثنائية الاتجاه لمحركات كينيسين قد تكون أكثر شيوعا مما كان يعتقد سابقا.

وقد أفيد سابقا أنه في الخلايا ، يتحرك Cin8 أيضا بطريقة ثنائية الاتجاه8 ، مما يدعم فكرة أن الحركة ثنائية الاتجاه لبعض محركات kinesin-5 مهمة لوظائفها داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن محركات kinesin-5 الثلاثة التي تم الإبلاغ عنها على أنها ثنائية الاتجاه هي من خلايا فطرية ، فقد تم مؤخرا اقتراح دور محتمل لمحركات kinesin-5 ثنائية الاتجاه في هذه الخلايا10. وفقا لهذا النموذج ، في الانقسام المغلق للخلايا الفطرية ، حيث لا ينهار المغلف النووي أثناء الانقسام ، توفر محركات kinesin-5 القوة الأولية التي تفصل قطبي المغزل قبل تجميع المغزل. لأداء هذه المهمة ، قبل فصل قطب المغزل ، تتمركز محركات kinesin-5 بالقرب من أقطاب المغزل ، من خلال حركتها الموجهة ذات النهاية الناقصة على MTs نووية واحدة. بمجرد الوصول إلى هذا الموضع ، تتجمع محركات kinesin-5 ، وتحول الاتجاه ، وتلتقط ، وتتقاطع مع MTs من أقطاب المغزل المجاورة. في وقت لاحق ، توفر محركات kinesin-5 الفصل الأولي للأقطاب عن طريق الحركة الموجهة زائد النهاية على MTs التي تتقاطع معها. من خلال هذا النموذج، يلزم وجود حركية موجهة ناقصة النهاية على MTs مفردة وحركية موجهة زائد النهاية على MTs متقاطعة أثناء الانزلاق المضاد للتوازي لمحركات kinesin-5 الفطرية لأداء أدوارها في تجميع المغزل 1,13.

الهدف العام من الطريقة الموصوفة هو الحصول على كينيسين الفطرية عالية النقاء الموسومة ب GFP-5 Cin8 وإجراء اختبارات حركية جزيء واحد (الشكل 1) مع تحليل حركية الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 بشكل منفصل. الفصل بين الجزيئات المفردة والعناقيد مهم لأن أحد العوامل التي ثبت أنها تؤثر على اتجاه Cin8 هو تراكمه في مجموعات على MTs10,12. لا توفر مقايسات الحركة البديلة ، مثل انزلاق سطح MT ومقايسات انزلاق MT معلومات تتعلق بنشاط البروتينات ذات المحرك الواحد17,18. تم تطبيق طرق فحص وتحليل حركية الجزيء الواحد القوية الموصوفة هنا بنجاح لتوصيف جوانب مختلفة من محركات كينيسين-5 ، Cin8 و Kip1 10،11،12،14،19،20.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للإفراط في التعبير والتنقية Cin8 ، وبلمرة MTs ، وفحص حركية الجزيء الواحد. وعلاوة على ذلك، فإن التحليلات الرامية إلى التمييز بين الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8، وتحديد السرعات الحركية والعنقودية المفردة عن طريق تحليل متوسط الإزاحة (MD) ومتوسط الإزاحة المربعة (MSD). يهدف هذا البروتوكول إلى مساعدة الباحثين على تصور جميع خطوات الإجراءات والمساعدة في استكشاف أخطاء هذا النوع من المقايسات وإصلاحها.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لفحص حركية الجزيء الواحد. يتم توصيل MTs الفلورسنت البيوتينيل بالسطح الزجاجي ، المطلي ب Avidin الذي يتفاعل مع البيوتينيل BSA المرتبط بالسطح. يمثل السهم الأخضر اتجاه حركة جزيئات Cin8 المفردة في ظل ظروف القوة الأيونية العالية. +/- تمثل قطبية MT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

  1. المخازن المؤقته
    1. - مزيج تسرب Leu aa: امزج 2 جم من كل من الأدينين والوراسيل والتريبتوفان والهيستيدين والليسين والميثيونين وخزن في درجة حرارة الغرفة.
    2. وسط انتقائي للخميرة مع رافينوز (1 لتر): امزج 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة (مع كبريتات الأمونيوم) ، و 2 جم من مزيج تسرب -Leu aa ، و 20 جم من الرافينوز في ماء مقطر مزدوج عن طريق التحريك (بدون تسخين) حتى يذوب تماما. باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر ، قم بتصفية المحلول في زجاجة معقمة.
    3. المخزن المؤقت للتحلل: قم بإعداد 25 مل من المحلول في الماء المقطر الثلاثي (TDW) الذي يتكون من 50 mM Tris وأنابيب 30 mM و 500 mM KCl و 10٪ جلسرين و 1.5 mM β-mercaptoethanol و 1 mM MgCl2 و 0.1 mM ATP و 0.1٪ Triton X-100. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8 باستخدام 6 M HCl.
    4. المخزن المؤقت للاستخراج: قم بإعداد 10 مل من المحلول في TDW يتكون من 50 mM Tris و 30 mM Pipes و 500 mM KCl و 350 mM imidazole و 10٪ glycerol و 1.5 mM β-mercaptoethanol و 1 mM MgCl2 و 0.1 mM ATP و 0.1٪ Triton X-100. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام 6 M HCl.
    5. P12 Buffer: قم بإعداد 10 مل من محلول في TDW يتكون من أنابيب 12 mM و 1 mM EGTA و 2 mM MgCl2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.9 باستخدام 10 أمتار من NaOH.
    6. المخزن المؤقت BRB80: قم بإعداد 50 مل من محلول يتكون من أنابيب 80 mM و 1 mM EGTA و 2 mM MgCl2 في ماء فائق النقاء. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.9 باستخدام 10 أمتار من NaOH.
    7. المخزن المؤقت العام للتوبولين (GTB): قم بإعداد 50 مل من محلول يتكون من أنابيب 80 mM و 0.5 mM EGTA و 2 mM MgCl2 في ماء فائق النقاء. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.9 باستخدام 10 أمتار من NaOH.
    8. حل أنابيب تريس: قم بإعداد 40 مل من محلول أنابيب 1M Tris-0.6 M عن طريق خلط 6.055 جم من Tris و 9.07 جم من الأنابيب في TDW واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام 6 M HCl. اجعل الحجم النهائي 50 مل مع TDW.
      ملاحظة: تستخدم المخازن المؤقتة P12 وBRB80 وTris-Pipes لإعداد حلول المخزون لفحص الحركة. يمكن تحضير هذه المخازن المؤقتة بكميات كبيرة ، ونقلها في أنابيب 1.5 مل ، وتجميدها ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  2. حلول الأسهم لفحص الحركة
    1. توبولين (10 ملغ مل-1): قم بإذابة 1 ملغ من التوبولين المجفف بالتجميد في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين البارد (4 درجات مئوية) (GTB). التقط تجميد 1 ميكرولتر من الأليكوتات وخزنها عند -80 درجة مئوية.
    2. توبولين بيوتينيل (1 ملغ مل-1): يذوب 20 ميكروغرام من توبولين المجفف بالتجميد في 20 ميكرولتر من GTB البارد. التقط تجميد 1 ميكرولتر من الأليكوتات وخزنها عند -80 درجة مئوية.
    3. رودامين المسمى توبولين (1 ملغ مل-1): إذابة 20 ميكروغرام من توبولين المجمدة بالتجميد في 20 ميكرولتر من GTB الباردة. التقط تجميد 0.5 ميكرولتر من الأليكوتات وخزنها عند -80 درجة مئوية.
    4. GMPCPP (10 ميكرومتر): يتم الحصول على GMPCPP من المورد كمحلول مائي 100 ميكرولتر وتخزينه عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة القارورة باستخدام GMPCPP على الجليد. تحضير 1 ميكرولتر aliquots ، المفاجئة تجميد وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    5. ATP: قم بإعداد محلول 500 ميكرولتر من 100 mM ATP في المخزن المؤقت 0.5 M Tris (الرقم الهيدروجيني 8). التقط تجميد 2 ميكرولتر من الأليكوتات وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    6. MgCl 2: تحضير محلول 1 مل من 200 mM MgCl2 في المخزن المؤقت P12. تخزين 5 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية.
    7. الكازين: تحضير محلول 1 مل من الكازين 5 ملغ مل - 1 في المخزن المؤقت BRB 80. التقط تجميد 10 ميكرولتر من الأليكوتات وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    8. D-الجلوكوز: قم بإعداد محلول 1 مل من 1 M D-glucose في المخزن المؤقت P12. تخزين 10 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية.
    9. أوكسيديز الجلوكوز: تحضير محلول 1 مل من أوكسيديز الجلوكوز 10 ملغم-1 في المخزن المؤقت P12. التقط تجميد 2 ميكرولتر من الأليكوتات وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    10. الكاتالاز: تحضير محلول 1 مل من 0.8 ملغ من الكاتالاز mL-1 في المخزن المؤقت P12. التقط تجميد 2 ميكرولتر من الأليكوتات وخزنها عند -20 درجة مئوية.
    11. ثنائي ثيوثريتول (DTT): قم بإعداد محلول 1 مل من 1 M DTT في المخزن المؤقت P12 في غطاء الدخان. التقط تجميد 10 ميكرولتر من الأليكوتات وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    12. فوسفات الكرياتين: قم بإعداد محلول 1 مل من فوسفات الكرياتين 1 م في المخزن المؤقت P12. التقط تجميد 2 ميكرولتر من الأليكوتات وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    13. الكرياتين فوسفوكيناز: تحضير محلول 1 مل من 5 ملغ مل - 1 الكرياتين فوسفوكيناز في 0.25 م غليسيلغليسين ، درجة الحموضة 7.4. التقط تجميد 2 ميكرولتر من الأليكوتات وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    14. EGTA: قم بإعداد محلول EGTA 100 mM في ماء فائق النقاء وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
    15. KCl: قم بإعداد محلول 1 M KCl في ماء فائق النقاء وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
  3. المخزن المؤقت للحركية ومزيج التفاعل
    1. المخزن المؤقت للحركية (MB) مع 145 mM KCl ، مخزون 2x: قم بإعداد 1 مل من مخزون 2x من المخزن المؤقت للحركة عن طريق خلط 100 ميكرولتر من محلول Tris-Pipes المصنوع مسبقا ، و 20 ميكرولتر من 100 mM EGTA ، و 290 ميكرولتر من KCl ، و 590 ميكرولتر من TDW. حافظ على المخزن المؤقت على الجليد.
    2. مزيج تفاعل الحركة: تحضير مزيج تفاعل الحركة وفقا للجدول 1 وتخزينه على الجليد.
حجم رصيد اسم الكاشف
50 ميكرولتر 2X ميغابايت (من الخطوة 1.3.1)
40 ميكرولتر - تي دي دبليو
1 ميكرولتر 100 مللي متر رابطة محترفي التنس
1 ميكرولتر 200 مللي متر مج كل2
2 ميكرولتر 5 ملغم/مل الكازين
1 ميكرولتر 1 م الجلوكوز
1 ميكرولتر 1 م دي تي تي
1 ميكرولتر 10 ملغم/مل أوكسيديز الجلوكوز
1 ميكرولتر 8 ملغم/مل كاتالاز
1 ميكرولتر 1 م فوسفوكرياتين
1 ميكرولتر 5 ملغم/مل الكرياتين فوسفوكيناز
100 ميكرولتر مجموع

الجدول 1.

2. Cin8 الإفراط في التعبير والتنقية من خلايا S. cerevisiae

  1. تنمو خلايا S. cerevisiae التي تحتوي على البلازميد للإفراط في التعبير عن Cin8-GFP-6His إلى مرحلة النمو الأسي (OD600 = 0.6-0.8) في 1 لتر من وسط الخميرة الانتقائي المكمل ب 2٪ raffinose (انظر الخطوة 1.1.2) عند 28 درجة مئوية12.
  2. حث Cin8-GFP-6له الإفراط في التعبير عن طريق إضافة 2 ٪ من الجالاكتوز. راقب نمو زراعة الخميرة عن طريق قياس الامتصاص عند 600 نانومتر.
  3. بعد خمس ساعات من إضافة الجالاكتوز ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، الخلايا في مخزن التحلل العازل وتجمد في السائل N2.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا المجمدة عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام أو طحنها فورا في السائل N2.
  4. طحن الخلايا المجمدة في السائل N2 باستخدام الملاط المبرد والمدق. أضف السائل N2 أثناء الطحن للحفاظ على المستخلصات مجمدة. عادة ما يتطلب 4-5 مرات من إضافة السائل N2.
  5. مراقبة تحلل الخلايا عن طريق الملاحظة تحت تباين الطور أو مجهر DIC.
  6. قم بإذابة الخلايا الأرضية وأجهزة الطرد المركزي عند 21000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتحميل المادة الفائقة على عمود تدفق الجاذبية المليء ب 2 مل من Ni-NTA والمتوازن مسبقا مع المخزن المؤقت للتحليل. دع السوبرناتانت يتدفق عبر العمود.
  7. اغسل العمود بخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتحلل ، ثم بخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتحلل مع 25 mM imidazole.
  8. Elute Cin8-GFP-6His مع المخزن المؤقت للإزالة (انظر الخطوة 1.1.4).
  9. قم بتحليل العينات التي تم التخلص منها عن طريق تجزئة SDS-PAGE ، متبوعة بتلطيخ Coomassie الأزرق وتحليل اللطخة الغربية التي تم فحصها باستخدام الأجسام المضادة α-GFP19.
  10. تجميع الكسور التي تحتوي على Cin8-GFP-6His (الخطوتان 2.8 و 2.9). وعلاوة على ذلك، قم بتنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) بمعدل تدفق 0.5 مل دقيقة-1 وحد ضغط عمود يبلغ 1.5 ميجا باسكال، مع رصد متزامن للامتصاص عند 280 نانومتر وانبعاث الإزهار GFP مع إثارة عند 488 نانومتر (الشكل 2A).
  11. جمع الكسور المقابلة ل Cin8-GFP tetramer وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي (انظر الخطوة 2.9) (الشكل 2B).
  12. تقدير تركيز البروتين باستخدام قياس الطيف الضوئي أو المقايسات الكيميائية الحيوية مثل فحص برادفورد ، فحص BCA وما إلى ذلك.
  13. قم بتجميع الكسور المحددة ، ثم قم بتجميدها في السائل N2 ، وخزنها حتى الاستخدام عند -80 درجة مئوية. يمكن استخدام عينات البروتين النقية هذه لمدة 6 أشهر.
    ملاحظة: يتم التعبير عن Cin8-GFP وتنقيته من سلالة S. cerevisiae التي تعاني من نقص البروتياز والتي تحتوي على بلازميد 2 ميكرومتر ل Cin8-GFP-6تعبيره الزائد من المروج المستحث للجالاكتوز ، LGY 4093: MATα ، leu2-3,112 ، reg-1-501 ، ura3-52 ، pep4-3 ، prb1-1122 ، gal1 ، pOS7 (2μ ، LEU2 ، P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). وتتوفر سلالة الخميرة والبلازميد عند الطلب.

Figure 2
الشكل 2: تنقية Cin8-GFP. (أ) كروماتوجرام استبعاد الحجم من Ni-NTA تنقية Cin8-GFP ، مع الكشف المستمر عن التألق GFP من خلال إثارة 488 نانومتر وانبعاث عند ~ 510 نانومتر. يضعف رباعي Cin8-GFP عند ~ 10 مل من عمود SEC (المميز بسهم). (ب) هلام SDS-PAGE الملطخ بالكوماسي (أعلى) و α-GFP الغربية (أسفل) من كسور Cin8-GFP المأخوذة من SEC. العينات الموجودة في الممرات هي كما يلي: M - علامة الوزن الجزيئي ، Ni2 + - Ni-NTA عينة Cin8-GFP النقية التي يتم تحميلها في عمود SEC ، كسور GF: الكسر المقابل لاستخراج Cin8-GFP SEC كما هو موضح في اللوحة A. يشير السهم الموجود على اليمين إلى حجم مونومر Cin8-GFP (متوقع في SDS-PAGE). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. فحص حركية جزيء واحد مع Cin8 النقي

  1. بلمرة البيوتين والرودامين المسمى MTs ، استقر مع GMPCPP.
    1. ابدأ بلمرة MT عن طريق خلط المكونات التالية في أنبوب 1.5 مل: 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل من بروتين توبولين ، 1 ميكرولتر من 1 ملغ / مل توبولين حيوي ، 0.5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من توبولين المسمى بالرودامين ، 1 ميكرولتر من 10 مللي متر GMPCPP ، و 6.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين (GTB). احتضن الخليط لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. بعد بلمرة MT ، أضف 80 ميكرولتر من GTB الدافئ (37 درجة مئوية) ، واخلطه بعناية وجهاز طرد مركزي عند 16500 × g لمدة 20 دقيقة.
    3. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات بعناية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام 50 ميكرولتر من GTB الدافئ. تخزين التعليق في 28 درجة مئوية.
    4. افحص MTs باستخدام مجهر التألق باستخدام قناة الرودامين 647 نانومتر (الشكل 3A).
      ملاحظة: للحصول على MTs الموسوم بالفلورسنت البيوتينيل ، يحتوي تفاعل البلمرة على توبولين غير مسمى ، بالإضافة إلى توبولين حيوي وفلورسنت. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام توبولين المسمى بالرودامين ولكن يمكن استخدام متقارنات الفلورسنت الأخرى أيضا.
  2. تجميع غرفة التدفق
    1. قم بتجميع غرفة تدفق عن طريق وضع أربعة شرائط من الشريط على الوجهين (~ 4 سم × ~ 3 مم) على شريحة زجاجية لاصقة متقدمة (موازية للحافة الأطول و ~ 3-4 مم على حدة) لإنشاء ثلاثة "ممرات" بين شرائط الشريط. قم بإزالة الورق الواقي من شرائط الشريط ووضع غطاء مبطن 10 على شرائط الشريط لإنشاء ثلاث غرف تدفق بحجم ~10 ميكرولتر.
  3. تثبيت MT على السطح المطلي بالأفيدين (الشكل 1)
    1. قم بتغطية الغطاء المائل عن طريق الدمج مع 15 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من ألبومين مصل البقر البيوتينيل (b-BSA ، المذاب في GTB) في غرفة التدفق باستخدام ماصة دقيقة. بعد 5 دقائق ، اغسل الغرفة ب 80 ميكرولتر من GTB.
    2. بعد ذلك ، كما هو الحال في الخطوة 3.3.1 ، أدخل في غرفة التدفق 15 ميكرولتر من 1 ملغ / مل Avidin (المذاب في GTB) الذي يرتبط ب b-BSA. بعد 5 دقائق ، اغسل الغرفة ب 80 ميكرولتر من GTB.
    3. قم بتخميل سطح الغطاء المائل باستخدام 20 ميكرولتر من 1٪ poloxamer. بعد 3 دقائق ، يغسل مع 80 ميكرولتر من GTB.
    4. قم بتوصيل MTs البيوتينيل (الخطوة 3.1) بغطاء b-BSA-avidin المطلي عن طريق إدخال 20 ميكرولتر من MTs المخففة عادة إلى 1:20 في GTB. احتضن الشرائح في وضع مقلوب ، أي مع توجيه الغطاء لأسفل في غرفة رطوبة داكنة (على سبيل المثال ، طبق بتري يحتوي على ورق مناديل مبلل) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، يغسل مع 200 ميكرولتر من GTB.
    5. ضع 30 ميكرولتر من مزيج تفاعل الحركة (انظر الخطوة 1.3.2) في غرفة التدفق.
    6. تمييع محركات Cin8-GFP (الخطوة 2.13) في 20 ميكرولتر من مزيج تفاعل الحركة (انظر الجدول 1) (عادة إلى تركيز نهائي من 5-10 ميكرومتر). قم بتطبيقها على غرفة التدفق وقم على الفور بتصوير حركة المحركات على طول MTs.
  4. تصوير الحركة الحركية
    ملاحظة: تم رصد تجليد MT وحركية المحركات باستخدام مجهر مقلوب فوق الفلور مجهز بمصباح قوس زئبقي، وهدف فتحة عددية 100x/1.4، ومجموعتين من مرشحات ممر النطاق الترددي الفلوري، إحداهما بطول موجي يبلغ 647 نانومتر (بالنسبة للرودامين) والأخرى بطول موجي يبلغ 488 نانومتر (بالنسبة ل GFP).
    1. ضع قطرة من زيت الغمر على هدف المجهر. ضع غرفة التدفق على مرحلة المجهر الفلورسنت مع الغطاء لأسفل في مواجهة الهدف.
    2. قم بتشغيل قناة الرودامين للتركيز على MTs المرفقة بسطح الغطاء والحصول على الصورة بتعريض ضوئي يبلغ 20 مللي ثانية باستخدام برنامج Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. قم بتشغيل قناة GFP واحصل على 90 صورة بفاصل زمني مع فاصل زمني 1 ثانية وتعرض 800 مللي ثانية ، لتحليل حركة Cin8-GFP.

Figure 3
الشكل 3: MTs و MT المرتبطة Cin8-GFP. (A) صور من حقلين (يسار ويمين) ل MTs مبلمرة وفقا للبروتوكول الموضح في الخطوة 3.1 وصورت بهدف 100x كما هو موضح في الخطوة 3.4. (ب) صور من حقلين (يسار ويمين) ل Cin8-GFP (لوحات سفلية، معلمة بأسهم) متصلة ب MT الموضحة في اللوحات العلوية. شريط المقياس: 4 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تحليل الحركة

ملاحظة: قم بإجراء جميع تحليلات الصور وإنشاء kymographs باستخدام برنامج ImageJ-Fiji.

  1. جيل الكيموغراف
    1. افتح فيلم الفاصل الزمني وصورة حقل MT المقابلة. قم بمزامنة هذين النافذتين عن طريق تحديد الخيار التالي: تحليل أدوات > > مزامنة Windows.
    2. قم بتمييز MT واحد باستخدام خيار الخط المجزأ واستخدم علامة التبويب تحليل > متعدد Kymograph للحصول على kymograph .
  2. تحديد حجم عنقود Cin8-GFP (أي عدد جزيئات Cin8 في العنقود)
    1. قم بإجراء طرح الخلفية وتصحيح الإضاءة غير المتساوية باستخدام خيار العملية > طرح الخلفية . اضبط نصف قطر الكرة المتدحرجة على 100 بكسل وتحقق من خيار القطع المكافئ المنزلق .
    2. اتبع متوسط كثافة التألق لمحرك Cin8-GFP محدد غير متحرك (الشكل 3B) كدالة للوقت داخل دائرة نصف قطرها 4 بكسل باستخدام المكون الإضافي TrackMate لبرنامج ImageJ-Fiji عن طريق تحديد الخيار التالي: المكونات الإضافية > تتبع > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. كرر الخطوة 4.2.2 لمحركات Cin8-GFP المختلفة. ارسم كثافة التألق لمحركات Cin8-GFP المختلفة كدالة للوقت.
      ملاحظة: تضع استراتيجية تجريبية لقياس حجم العنقود - أي عدد جزيئات Cin8 في المجموعة - أساسا لتحليل الحركة المرتبطة بتجميع Cin8. يستخدم التبييض الضوئي ل GFP المرتبط ب Cin8 لتحديد مساهمة جزيئات GFP المفردة في الكثافة الكلية لمجموعات Cin8. على سبيل المثال ، تنخفض كثافة التألق في خطوات ~ 50 وحدة تعسفية (a.u.) ، مع كل خطوة واحدة ربما تمثل التبييض الضوئي لجزيء GFP واحد (الشكل 4A). نظرا لأن Cin8 هو بروتين حركي متجانس رباعي ، فإنه يحتوي على أربعة جزيئات GFP. وبالتالي ، فإن جميع محركات Cin8 ذات الكثافة ≤ 200 وحدة مأكولة من المرجح أن تكون جزيئات Cin8 رباعية الأحاد. باتباع هذه الطريقة ، يتم تعيين نطاقات كثافة التألق الحركي Cin8 على النحو <200 و 200-400 و >400 لجزيئات Cin8 المفردة ، وأزواج من جزيئات Cin8 (dimer of Cin8 tetramer) ، و Cin8 oligomers ، على التوالي12.
  3. تحليل توزيع الكثافة لمحركات Cin8-GFP
    1. قم بقياس متوسط كثافة الإزهار لجميع محركات Cin8-GFP الفلورية في الإطار الأول من تسلسل الفاصل الزمني باستخدام المكون الإضافي TrackMate في ImageJ-Fiji كما هو موضح في الخطوة 4.2.2.
    2. ارسم رسما بيانيا لمتوسط كثافة Cin8-GFP بحجم صندوق 20 وحدة a.u. وتناسب الذروة الرئيسية للرسم البياني مع منحنى غاوسي (الشكل 4B).
      ملاحظة: يكمل تحليل توزيع الكثافة تحديد حجم الكتلة لمحركات Cin8-GFP من تجارب التبييض الضوئي. يبلغ المنحنى الغاوسي المتوافق مع الرسم البياني لتوزيع الكثافة لسكان Cin8-GFP ذروته عند ~ 125 a.u. ، وهو ما يتفق مع متوسط كثافة جزيئات Cin8 رباعية الأحادي التي تحتوي إما على واحد أو اثنين أو ثلاثة أو أربعة جزيئات GFP فلورية (غير مبيضة) ، مع مساهمة كل جزيء GFP فلورسنت ~ 50 a.u. وبالتالي ، باستخدام طريقة توزيع الكثافة هذه ، يمكن أيضا حساب مساهمة جزيء GFP واحد ، والذي يمكن استخدامه بشكل أكبر لتعيين حجم الكتلة لجزيئات Cin8-GFP.

Figure 4
الشكل 4: ملف تعريف التبييض Cin8-GFP وتوزيع الكثافة. (أ) التبييض الضوئي ل GFP في أربعة محركات Cin8-GFP مختلفة. تؤدي خطوات التبييض الضوئي المفردة ، التي من المحتمل أن تمثل كل منها التبييض الضوئي ل GFP واحد ، إلى انخفاض في شدة التألق ~ 50 a.u. (B) توزيع كثافة محركات Cin8-GFP في الإطار الأول من تسلسل الفاصل الزمني (inset). تمثل الذروة الغاوسية (الزرقاء) المتمركزة عند ~ 125 a.u جزيئات Cin8-GFP المفردة. تظهر هذه الذروة متوسط كثافة رباعي Cin8 واحد مع واحد أو اثنين أو ثلاثة أو أربعة جزيئات GFP الفلورية ، مع مساهمة كل جزيء GFP ~ 50 a.u. في الكثافة الكلية (أي (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تتبع حركة جزيئات Cin8-GFP على طول مسارات MT
    1. اقتصاص MT المراد تحليله في تسلسل الفاصل الزمني للإطارات المسجلة عن طريق تمييزه باستخدام أداة المستطيل ، ثم اختيار صورة > اقتصاص.
    2. اختر جسيم Cin8-GFP الفلورسنت للتحليل. سجل إحداثيات الجسيمات في كل إطار (نقطة زمنية) من تسلسل الفاصل الزمني باستخدام خيارات أداة النقطة والقياس . قم بإجراء تسجيل مماثل للإحداثيات لجسيمات الفلورسنت الأخرى في تسلسل الفاصل الزمني.
    3. قم بتعيين حجم الكتلة لجميع جسيمات Cin8-GFP التي تم فحصها في الإطار الأول من ظهورها ، كما هو موضح في الخطوة 4.2.
  2. تحليلات متوسط الإزاحة (MD) ومتوسط الإزاحة المربعة (MSD)
    1. من إحداثيات حركات Cin8-GFP المحددة في الخطوة 4.4، احسب إزاحة Cin8-GFP في كل نقطة زمنية فيما يتعلق بالإحداثيات الأولية، باستخدام معادلة حساب المسافة بين نقطتين بإحداثيات معينة:
      Equation 1
      حيث ، d t هي إزاحة Cin8-GFP في الوقت t و x t و y t هي الإحداثيات المعنية في الوقت t. x 0 و y 0 هي الإحداثيات الخاصة بكل من Cin8-GFP عندt = 0.
    2. احسب من قيم الإزاحة هذه الإزاحة لجميع الفواصل الزمنية الممكنة لجسيم Cin8-GFP محدد. كرر الإجراء لجميع جسيمات Cin8-GFP التي تم فحصها.
    3. ارسم متوسط الإزاحة (MD) لجميع جسيمات Cin8-GFP التي تم فحصها مقابل الفاصل الزمني وتخضع لتناسب خطي ، MD = v x t + c. يمثل ميل هذا التناسب (v) متوسط سرعة جسيمات Cin8-GFP المتحركة.
      ملاحظة: بهذه الطريقة، يمكن حساب متوسط سرعة جميع جزيئات Cin8-GFP التي تنتمي إلى كل حجم عنقود بشكل منفصل مع تمييز حركية أحجام العنقود المختلفة. بالإضافة إلى تحليل MD ، يمكن أيضا إجراء تحليل متوسط الإزاحة التربيعية (MSD) عن طريق تربيع قيم الإزاحة المحسوبة في الخطوتين 4.5.1 و 4.5.2. يتم رسم قيم MSD مقابل الفاصل الزمني وتركيبها على منحنى متعدد الحدود MSD = v2 x t2 + 2D x t + c ، مما يعطي المعلمة الإضافية D ، وهو معامل الانتشار لحركة Cin8-GFP. يجب إجراء تحليل MD على القطبية التي تحمل علامة MTs 8,10 ، في حين أن معرفة تحليل MSD بقطبية MT ليست ضرورية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تهدف التجربة إلى التحقيق في خصائص الحركة لبروتين المحرك ثنائي الاتجاه Cin8 بأحجام عنقودية مختلفة على MTs مفردة. الحركة التمثيلية ل Cin8-GFP واضحة أيضا من الكيموغراف في الشكل 5A ، حيث يتم عرض الموقع المكاني للمحرك بمرور الوقت.

لتحليل الخصائص المتحركة ل Cin8-GFP ، أولا ، يتم تعيين حجم الكتلة (الخطوة 4.3) لكل جسيم Cin8-GFP متحرك متصل ب MT ، ثم يتم تتبع موضع جسيمات Cin8 التي تم فحصها كدالة للوقت (الخطوة 4.4). بالنسبة لكل فئة من فئات حجم الكتلة ، تم استخراج >40 مسارا فرديا من Cin8-GFP من التسجيلات (الشكل 5B). باستخدام الإحداثيات التي تم الحصول عليها من تحليل التتبع ، يتم إجراء تحليل MD و MSD لكل مجموعة بحجم المجموعة على حدة. يتم الحصول على السرعات من التناسبات الخطية إلى MD كما هو موضح في الشكل 5C. وقد وجد أن جزيئات Cin8-GFP المفردة تتحرك بطريقة أحادية الاتجاه وموجهة ناقص النهاية بسرعة عالية، في حين أن مجموعات Cin8 تظهر سرعة أقل بكثير مع ميل أعلى للحركة ثنائية الاتجاه (الشكل 5B,C).

Figure 5
الشكل 5: حركة Cin8-GFP. (أ) تمثل الكيموجرافات حركية محركات Cin8-GFP على MTs. تمثل المحاور X و Y شبكة MT والوقت ، على التوالي. تشير الأسهم الصفراء إلى الحركة السريعة لجسيمات Cin8-GFP المفردة نحو اتجاه نهاية MT ناقص ، بينما تشير الأسهم الزرقاء إلى الحركة البطيئة لمجموعات Cin8 في الاتجاه الزائد لل MT. يشار إلى قطبية MTs في الجزء السفلي من كل kymograph (+/-). الشريط الأفقي: 4 ميكرومتر، الشريط الرأسي: 20 ثانية (ب) آثار الإزاحة للمحركات المفردة (يسار) والمجموعات (يمين) لمحركات Cin8-GFP. تم رسم آثار الإزاحة باستخدام الإحداثيات التي تم الحصول عليها بعد تتبع محركات Cin8-GFP الفردية كما هو موضح في الخطوة 4.4. تشير القيم السالبة والإيجابية للإزاحة إلى الحركة في اتجاهي النهاية الناقص والطرف الزائد ل MT ، على التوالي. لاحظ أنه تحت نفس الفحص ، تكون حركة مجموعات Cin8 أبطأ وثنائية الاتجاه مقارنة بالجزيئات المفردة ل Cin8. (ج) مخططات متوسط الإزاحة (MD) ± SEM ، من جزيئات مفردة (يسار) ومجموعات (يمين) من محركات Cin8 كدالة للفاصل الزمني. تمثل الخطوط السوداء التناسبات الخطية للمخطط (MD = v xt + c ، حيث v هي السرعة المتوسطة ، و t هي الفاصل الزمني و c تمثل الاعتراض). من التركيب ، من الواضح أن متوسط السرعة للمحركات الفردية ومجموعات Cin8 هو -265 ± 20 نانومتر / ثانية و -48 ± 5 نانومتر / ثانية ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل ، يتم تقديم بروتوكول لفحص حركية جزيء واحد مع kinesin-5 Cin8 ثنائي الاتجاه وتحليل الحركة. تم تنقية Cin818 كامل الطول بما في ذلك إشارة التوطين النووي الأصلية (NLS) في المحطة C من المضيف الأصلي S. cerevisiae. نظرا لأن Cin8 هو بروتين محرك نووي ، فقد وجد أن طحن خلايا S. cerevisiae تحت النيتروجين السائل هو الطريقة الأكثر فعالية لتحلل الخلايا. بعد التحلل ، من خلال الجمع بين تقارب المعادن وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، يتم الحصول على Cin8 عالي النقاء ، وهو أمر مهم لاختبارات حركية الجزيء الواحد. وقد أفيد سابقا أن هناك اختلافات بين الخصائص المتحركة ل Cin8 في المستخلصات الخام والعينات النقية8. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن أن ازدحام MT بالبروتينات الحركية وغير الحركية يؤثر على اتجاه kinesin-5 Cut722 ثنائي الاتجاه. وبالتالي ، فإن النقاء العالي للمحرك مطلوب لتحليل الحركة الموثوقة والاستنتاجات المتعلقة بالسلوك الحركي من النوع البري والمتحور. يمكن تكييف التقنيات الموصوفة هنا بسهولة لتنقية البروتينات النووية الأخرى من الخميرة باستخدام تعديلات عازلة مناسبة.

الموصوف هنا هو اختبار حركية جزيء واحد قوي للغاية وحساس مع Cin8 الموسوم ب GFP. يعتمد نجاح هذا الفحص بشكل كبير على بلمرة MT المناسبة وتثبيتها على السطح. يتم استخدام التفاعل القوي بين أفيدين والبيوتين لشل حركة MTs على السطح الزجاجي الكارهة للماء ، والذي يربط MTs بشكل لا رجعة فيه. على هذه MTs المجمدة باستخدام GFP المسمى Cin8 ، يمكن تتبع حركة Cin8 بشكل موثوق11،12،19.

يقال إن Cin8 يشكل مجموعات تحتوي على أكثر من محرك رباعي واحد 10,12 ، مع اختلاف حركة هذه العناقيد عن جزيئات Cin8 المفردة. لوصف حركة Cin8 بدقة كدالة لحجمها ، تم تطوير طريقة قائمة على كثافة التألق لتحديد حجم الكتلة لكل جسيم Cin812. استنادا إلى تصنيف الحجم هذا ، يتم تحليل الحركة بشكل منفصل في كل فئة حجم. بعد هذا التحليل القائم على الحجم ، يتم توفير تفاصيل ثاقبة ، والتي يمكن استخدامها لفهم السلوك المختلف للأوليغومرات من نفس الجزيء 11،12،19. يمكن تطبيق إجراء تحديد حجم الكتلة الموصوف هنا لتحديد حجم مجموعة متنوعة من الجزيئات ذات العلامات الفلورية. أثناء إجراء تحديد الحجم القائم على التألق ، يجب على المرء أن يكون حريصا على تحديد حجم الكتلة لجزيئات Cin8-GFP في الإطار الأول للظهور لتجنب تأثير التبييض ، لأن المجموعات الكبيرة يمكن أن تظهر كمجموعات أصغر بعد التبييض الضوئي.

يتم تنفيذ توصيف الحركة بواسطة تحليلات MD و / أو MSD. إذا كان من المهم تحديد سرعة المحرك فقط ، فإن تحليل MD كاف. ومع ذلك ، إذا كانت الحركة الحركية تحتوي على مكونات نشطة وسلبية على حد سواء وكان تحديد معامل الانتشار مطلوبا أيضا ، فيجب إجراء تحليل MSD20،23،24،25. بالنسبة لكل من تحليلات MD و MSD ، يجب تحديد إحداثيات المحرك لكل نقطة زمنية. من أجل التتبع الفعال ، من المهم الحفاظ على تركيز المحرك الأمثل. يجب ألا تكون MTs مزدحمة جدا بالمحركات ؛ من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هناك 3-4 محركات / جزيئات Cin8-GFP في وقت واحد على MT من ~ 10 ميكرومتر. يمكن أيضا استخدام الأدوات الآلية مثل المكون الإضافي "KymoButler" أو "TrackMate" في ImageJ-Fiji لتتبع المحركات المتحركة26,27. توفر هذه الأدوات الآلية الوقت والعمل ، ولكن لديها بعض القيود. على سبيل المثال ، إذا كانت حركة بعض الجسيمات بطيئة للغاية ، فيمكن لهذه الأدوات قراءتها على أنها جسيمات غير متحركة. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الأدوات لها حدود في التعرف على الجزيئات منخفضة الكثافة. لذلك ، يمكن أن تظهر تحيزا عالي الكثافة. من ناحية أخرى ، فإن التتبع اليدوي (على الرغم من أنه يستغرق وقتا طويلا) أقل حساسية لأخطاء التتبع.

باختصار ، يشرح هذا البروتوكول ، بدءا من تنقية Cin8 المبالغة في التعبير عنها في S. cerevisiae ، بشكل شامل فحص حركية الجزيء الواحد وتحليل الحركة اللاحق لهذا الكينيسين ثنائي الاتجاه -5. يمكن اتباع هذا البروتوكول بسهولة لتنقية وتوصيف حركة البروتينات الحركية مثل Cin8. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف الأجزاء المختلفة من البروتوكول لتنقية البروتينات من الخميرة أو تطوير اختبارات حركية جزيء واحد للبروتينات الحركية المختلفة وتوصيف حركتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال منحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF-386/18) ومنحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية ثنائية القومية (BSF-2019008) ، الممنوحة ل L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 180 ، كينيسين ، Cin8 ، حركة جزيء واحد ، الأنابيب الدقيقة ، الحركة ثنائية الاتجاه

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا <em>S. cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter