Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Подвижность одиночных молекул и кластеров двунаправленного кинезина-5 Cin8, очищенного из клеток S. cerevisiae

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

Двунаправленный митотический кинезин-5 Cin8 накапливается в кластерах, которые расщепляются и сливаются во время их подвижности. Накопление в кластерах также изменяет скорость и направленность Cin8. Здесь описан протокол анализа подвижности с очищенным Cin8-GFP и анализа подвижных свойств отдельных молекул и кластеров Cin8.

Abstract

Митотические биполярные двигатели кинезин-5 выполняют важные функции в динамике шпинделя. Эти двигатели демонстрируют гомотетрамерную структуру с двумя парами каталитических моторных доменов, расположенных на противоположных концах активного комплекса. Эта уникальная архитектура позволяет двигателям кинезина-5 сшивать и раздвигать антипараллельные шпиндельные микротрубочки (МТ), обеспечивая тем самым направленную наружу силу, которая разделяет полюса шпинделя друг от друга. Ранее считалось, что двигатели кинезин-5 направлены исключительно с плюс-концом. Однако недавние исследования показали, что несколько грибковых двигателей кинезин-5 направлены на уровень одной молекулы и могут переключать направленность в различных экспериментальных условиях. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 является примером такого двунаправленного моторного белка: в условиях высокой ионной прочности отдельные молекулы Cin8 движутся в направлении минус-конца MTs. Также было показано, что Cin8 образует подвижные кластеры, преимущественно на минусовом конце МТ, и такая кластеризация позволяет Cin8 переключать направленность и подвергаться медленной, плюс-конечной направленной подвижности. В этой статье представлен подробный протокол для всех этапов работы с GFP-меченым кинезином-5 Cin8, от гиперэкспрессии белка в клетках S. cerevisiae и его очистки до анализа подвижности одной молекулы in vitro . Недавно разработанный метод, описанный здесь, помогает дифференцировать отдельные молекулы и кластеры Cin8 на основе их интенсивности флуоресценции. Этот метод позволяет проводить раздельный анализ подвижности отдельных молекул и кластеров Cin8, обеспечивая тем самым характеристику зависимости подвижности Cin8 от размера кластера.

Introduction

Большое количество событий подвижности в эукариотических клетках опосредовано функцией молекулярных моторных белков. Эти двигатели движутся вдоль цитоскелетных нитей, актиновых нитей и микротрубочек (МТ) и преобразуют химическую энергию гидролиза АТФ в кинетические и механические силы, необходимые для управления биологической подвижностью внутри клеток. S. cerevisiae Cin8 на основе MT представляет собой биполярный гомотетрамерный моторный белок кинезин-5, который сшивает и скользит веретено MTs друг отдруга 1. Cin8 выполняет важнейшие функции при митозе, в веретенообразном сборе 2,3,4 и удлинении шпинделя при анафазе 5,6,7. Ранее было продемонстрировано, что Cin8 является двунаправленным двигателем, который переключает направленность в разных экспериментальных условиях. Например, в условиях высокой ионной прочности одиночные двигатели Cin8 движутся к минусовому концу MT, в то время как в кластерах, в многомоторных скользящих анализах MT и между противопараллельными MT двигатели Cin8 движутся в основном к плюсовым концам MTs 8,9,10,11,12 . Эти результаты были весьма неожиданными по нескольким причинам. Во-первых, Cin8 несет свой каталитический двигательный домен на амино-конце, и ранее считалось, что такие двигатели направлены исключительно плюс-конец, тогда как Cin8 был показан как минус-конец, направленный на уровень одной молекулы. Во-вторых, кинезиновые двигатели считались однонаправленными, либо минусовыми, либо плюс-концевыми, тогда как Cin8 был показан двунаправленным, в зависимости от условий эксперимента. Наконец, из-за ориентации МТ на митотическом шпинделе классическая роль двигателей кинезин-5 в разделении полюсов шпинделя при сборке шпинделя и анафазы B может быть объяснена только их направленной подвижностью на МТ, которые они сшивают 1,13. После первых сообщений о двунаправленности Cin8 было продемонстрировано, что несколько других кинезиновых двигателей являются двунаправленными 14,15,16, что указывает на то, что двунаправленная подвижность кинезиновых двигателей может быть более распространенной, чем считалось ранее.

Ранее сообщалось, что в клетках Cin8 также движется двунаправленным образом8, поддерживая представление о том, что двунаправленная подвижность некоторых двигателей кинезина-5 важна для их внутриклеточных функций. Кроме того, поскольку три двигателя кинезин-5, которые, как сообщалось, являются двунаправленными, получены из грибковых клеток, в таких клетках10 недавно была предложена возможная роль двунаправленности двигателей кинезин-5. Согласно этой модели, при закрытом митозе грибковых клеток, где ядерная оболочка не разрушается во время митоза, двигатели кинезина-5 обеспечивают начальную силу, которая разделяет полюса шпинделя друг от друга до сборки шпинделя. Для выполнения этой задачи до разделения полюсов шпинделя двигатели кинезин-5 локализуются вблизи полюсов шпинделя своей направленной подвижностью на одиночных ядерных МТ. Оказавшись в этом положении, двигатели кинезин-5 группируются, переключают направленность, захватывают и сшивают МТ с соседних полюсов шпинделя. Впоследствии двигатели кинезин-5 обеспечивают начальное разделение полюсов за счет плюсовой направленной подвижности на МТ, которые они сшивают. В соответствии с этой моделью как направленная подвижность на одиночных МТ, так и направленная подвижность на сшитых МТ во время антипараллельного скольжения необходимы для выполнения грибковых двигателей кинезин-5 для выполнения своих ролей в сборке шпинделя 1,13.

Общей целью описанного способа является получение высокочистого грибка GFP-меченого кинезина-5 Cin8 и выполнение анализа подвижности одной молекулы (рисунок 1) при отдельном анализе подвижности отдельных молекул и кластеров Cin8. Разделение между отдельными молекулами и кластерами важно, поскольку одним из факторов, которые, как было продемонстрировано, влияют на направленность Cin8, является его накопление в кластерах на MTs10,12. Альтернативные анализы подвижности, такие как поверхностное скольжение MT и скользящие анализы MT, не дают информации об активности одиночных моторных белков17,18. Надежные одномолекулярные методы анализа подвижности и анализа, описанные здесь, были успешно применены для характеристики различных аспектов двигателей кинезин-5, Cin8 и Kip1 10,11,12,14,19,20.

Здесь представлен подробный протокол для сверхэкспрессии и очистки Cin8, полимеризации МТ и анализа подвижности одной молекулы. Кроме того, описаны анализы для дифференциации отдельных молекул и кластеров Cin8, а также для определения одиночных моторных и кластерных скоростей с помощью анализа среднего смещения (MD) и среднего квадратного смещения (MSD). Этот протокол призван помочь исследователям визуализировать все этапы процедур и помочь в устранении неполадок этого типа анализов.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление анализа подвижности одной молекулы. Биотинилированные флуоресцентные МТ прикреплены к поверхности стекла, покрытой авидином, который взаимодействует с поверхностно присоединенным биотинилированным BSA. Зеленая стрелка представляет направление движения отдельных молекул Cin8 в условиях высокой ионной прочности. +/- представляют полярность MT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка буферов и реагентов

  1. Буферов
    1. -Leu aa dropout mix: смешайте по 2 г аденина, урацила, триптофана, гистидина, лизина и метионина и храните при комнатной температуре.
    2. Дрожжевая селективная среда с рафинозой (1 л): Смешайте 6,7 г дрожжевой азотистой основы (с сульфатом аммония), 2 г смеси -Leu aa и 20 г рафинозы в двухдистиллированной воде путем перемешивания (без нагревания) до полного растворения. Используя фильтр 0,22 мкм, отфильтруйте раствор в стерильный флакон.
    3. Буфер лизиса: Готовят 25 мл раствора в тройной дистиллированной воде (TDW), состоящей из 50 мМ Tris, 30 мМ труб, 500 мМ KCl, 10% глицерина, 1,5 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ АТФ и 0,1% тритона X-100. Отрегулируйте pH до 8 с помощью 6 M HCl.
    4. Буфер элюирования: Готовят 10 мл раствора в TDW, состоящего из 50 мМ Tris, 30 мМ труб, 500 мМ KCl, 350 мМ имидазола, 10% глицерина, 1,5 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМMgCl2, 0,1 мМ АТФ и 0,1% тритона X-100. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью 6 M HCl.
    5. Буфер P12: Приготовьте 10 мл раствора в TDW, состоящем из труб 12 мМ, 1 мМ EGTA и 2 мМ MgCl2. Отрегулируйте pH до 6,9 с помощью 10 M NaOH.
    6. Буфер BRB80: Подготовьте 50 мл раствора, состоящего из труб 80 мМ, 1 мМ EGTA и 2 мМ MgCl2 в сверхчистой воде. Отрегулируйте pH до 6,9 с помощью 10 M NaOH.
    7. Общий буфер тубулина (GTB): Приготовьте 50 мл раствора, состоящего из труб 80 мМ, 0,5 мМ EGTA и 2 мМ MgCl2 в сверхчистой воде. Отрегулируйте pH до 6,9 с помощью 10 M NaOH.
    8. Раствор Tris-Pipes: Подготовьте 40 мл раствора 1M Tris-0,6 M Pipes путем смешивания 6,055 г Tris и 9,07 г труб в TDW и отрегулируйте pH до 7,2 с использованием 6 M HCl. Доведите конечный объем до 50 мл с TDW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы P12, BRB80 и Tris-Pipes используются для приготовления стоковых растворов для анализа подвижности. Эти буферы могут быть приготовлены в больших количествах, аликвотированы в пробирках по 1,5 мл, заморожены и сохранены при -20 °C.
  2. Стоковые решения для анализа подвижности
    1. Тубулин (10 мг мл-1): Растворить 1 мг лиофилизированного тубулина в 100 мкл холодного (4 °C) общего тубулинового буфера (GTB). Заморозьте 1 мкл аликвоты и храните их при -80 °C.
    2. Биотинилированный тубулин (1 мг мл-1): Растворить 20 мкг лиофилизированного тубулина в 20 мкл холодного ГХГ. Заморозьте 1 мкл аликвоты и храните их при -80 °C.
    3. Трубулин, меченый родамином (1 мг мл-1): Растворить 20 мкг лиофилизированного тубулина в 20 мкл холодного ГХГБ. Заморозьте 0,5 мкл аликвот и храните их при -80 °C.
    4. GMPCPP (10 мкМ): GMPCPP получают от поставщика в виде водного раствора 100 мкл и хранят при -80 °C. Разморозьте флакон с помощью GMPCPP на льду. Приготовьте 1 мкл аликвоты, заморозьте и храните их при -80 °C.
    5. АТФ: Готовят 500 мкл раствора 100 мМ АТФ в буфере 0,5 М Трис (рН 8). Заморозьте 2 мкл аликвоты и храните их при -20 °C.
    6. MgCl2: Готовят 1 мл раствора 200 мМMgCl2 в буфере P12. Хранить 5 мкл аликвот при -20 °C.
    7. Казеин: Приготовьте 1 мл раствора 5 мг мл-1 казеина в буфере BRB 80. Заморозьте 10 мкл аликвот и храните их при -20 °C.
    8. D-глюкоза: Приготовьте 1 мл раствора 1 M D-глюкозы в буфере P12. Хранить 10 мкл аликвот при -20 °C.
    9. Глюкозооксидаза: Приготовьте 1 мл раствора 10 мг мл-1 глюкозооксидазы в буфере P12. Заморозьте 2 мкл аликвоты и храните их при -20 °C.
    10. Каталаза: Приготовьте 1 мл раствора 0,8 мг мл-1 каталазы в буфере P12. Заморозьте 2 мкл аликвоты и храните при -20 °C.
    11. Дитиотрейтол (DTT): Приготовьте 1 мл раствора 1 M DTT в буфере P12 в вытяжном шкафу. Заморозьте 10 мкл аликвот и храните их при -20 °C.
    12. Креатинфосфат: Приготовьте 1 мл раствора 1 М креатинфосфата в буфере P12. Заморозьте 2 мкл аликвоты и храните их при -20 °C.
    13. Креатинфосфокиназа: Приготовьте 1 мл раствора 5 мг мл креатинфосфокиназы в 0,25 М глицилглицина, рН 7,4. Заморозьте 2 мкл аликвоты и храните их при -20 °C.
    14. EGTA: Приготовьте раствор EGTA 100 мМ в сверхчистой воде и храните его при комнатной температуре.
    15. KCl: Приготовьте раствор 1 M KCl в сверхчистой воде и храните его при комнатной температуре.
  3. Буфер подвижности и реакционная смесь
    1. Буфер подвижности (МБ) с 145 мМ KCl, 2x запас: Подготовьте 1 мл 2x запаса буфера подвижности путем смешивания 100 мкл готового раствора Tris-Pipes, 20 мкл 100 мМ EGTA, 290 мкл KCl и 590 мкл TDW. Держите буфер на льду.
    2. Реакционная смесь подвижности: Приготовьте реакционную смесь подвижности в соответствии с таблицей 1 и храните ее на льду.
Том Запас Название реагента
50 мкл в 2 раза МБ (из шага 1.3.1)
40 мкл - ТДВ
1 мкл 100 мМ СПС
1 мкл 200 мМ МгКл2
2 мкл 5 мг/мл Казеин
1 мкл 1 М Глюкоза
1 мкл 1 М Диднавиация
1 мкл 10 мг/мл Глюкозооксидаза
1 мкл 8 мг/мл Каталазы
1 мкл 1 М Фосфокреатин
1 мкл 5 мг/мл Креатинфосфокиназа
100 мкл Итог

Таблица 1.

2. Сверхэкспрессия и очистка Cin8 от клеток S. cerevisiae

  1. Выращивают клетки S. cerevisiae , содержащие плазмиду для сверхэкспрессии Cin8-GFP-6His в фазу экспоненциального роста (OD600 = 0,6-0,8) в 1 л дрожжевой селективной среды, дополненной 2% рафинозой (см. шаг 1.1.2) при 28 °C12.
  2. Индуцирует сверхэкспрессию Cin8-GFP-6 путем добавления 2% галактозы. Мониторинг роста культуры дрожжей путем измерения абсорбции при 600 нм.
  3. Через пять часов после добавления галактозы собирают клетки центрифугированием при 4000 х г в течение 15 мин при 4 °C, привешивают клетки в буфере лизиса и замораживают в жидкостиN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные ячейки могут храниться при -80 °C для дальнейшего использования или немедленно измельчаться в жидкостиN2.
  4. Измельчите замороженные ячейки в жидкостиN2 с использованием охлажденной ступки и пестика. Добавьте жидкостьN2 во время измельчения, чтобы экстракты оставались замороженными. Обычно требуется 4-5 раз добавления жидкостиN2.
  5. Контролируют лизис клеток путем наблюдения под фазоконтрастным или ДВС-микроскопом.
  6. Разморозить наземные ячейки и центрифугу при 21 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Загрузите супернатант на столб гравитационного потока, заполненный 2 мл Ni-NTA и предварительно уравновешенный буфером лизиса. Пусть супернатант вытекает через колонну.
  7. Промыть колонну с пятью колонными объемами лизисного буфера, а затем с пятью колоннами объемами лизисного буфера, дополненного имидазолом 25 мМ.
  8. Elute Cin8-GFP-6His с буфером элюирования (см. шаг 1.1.4).
  9. Анализ элюированных образцов методом фракционирования SDS-PAGE, за которым следует синее окрашивание Coomassie и анализ вестерн-блот, исследуемый антителом α-GFP19.
  10. Объедините фракции, содержащие Cin8-GFP-6His (шаги 2.8 и 2.9). Кроме того, очищают их методом размерно-эксклюзионной хроматографии (SEC) при расходе 0,5 мл мин-1 и пределе давления в колонке 1,5 МПа, с одновременным контролем поглощения при 280 нм и излучения флуоресценции GFP с возбуждением при 488 нм (рис. 2А).
  11. Соберите фракции, соответствующие тетрамеру Cin8-GFP, и проанализируйте их с помощью SDS-PAGE и западного блоттинга (см. шаг 2.9) (рисунок 2B).
  12. Оцените концентрацию белка с помощью спектрофотометрии или биохимических анализов, таких как анализ Брэдфорда, анализ BCA и т. Д.
  13. Аликвотированные выбранные фракции, замораживают в жидкостиN2 и хранят до использования при -80 °C. Эти очищенные образцы белка можно использовать в течение 6 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Cin8-GFP чрезмерно экспрессируется и очищается от протеазно-дефицитного штамма S. cerevisiae, содержащего плазмиду 2 мкм для Cin8-GFP-6His сверхэкспрессии из индуцируемого промотором галактозы, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). Штамм дрожжей и плазмида доступны по запросу.

Figure 2
Рисунок 2: Очистка Cin8-GFP. (A) Хроматограмма исключения размера очищенного Ni-NTA Cin8-GFP с непрерывным обнаружением флуоресценции GFP через возбуждение и излучение 488 нм при ~510 нм. Тетрамер Cin8-GFP элюируется при ~10 мл от столбца SEC (отмечен стрелкой). (B) Окрашенный Coomassie гель SDS-PAGE (вверху) и западное пятно α-GFP (внизу) фракций Cin8-GFP, элюированных из SEC. Образцы в полосах следующие: M - Маркер молекулярной массы, Ni2 + - Ni-NTA очищенный образец Cin8-GFP, который загружается в колонку SEC, фракции GF: фракции, соответствующие элюированию Cin8-GFP SEC, как отмечено на панели A. Стрелка справа отмечает размер мономера Cin8-GFP (ожидается на SDS-PAGE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Одномолекулярный анализ подвижности с очищенным Cin8

  1. Полимеризация биотина и родамина меченых МТ, стабилизированных ГМПЦПП.
    1. Начинают полимеризацию МТ путем смешивания следующих компонентов в пробирке объемом 1,5 мл: 1 мкл 10 мг/мл тубулинового белка, 1 мкл биотинилированного тубулина 1 мг/мл, 0,5 мкл 1 мг/мл трубулина, меченого родамином, 1 мкл 10 мМ GMPCPP и 6,5 мкл общего тубулинового буфера (ГМБ). Инкубировать смесь в течение 1 ч при 37 °С.
    2. После полимеризации MT добавляют 80 мкл теплого (37 °C) ГНГ, тщательно перемешивают и центрифугируют при 16 500 х г в течение 20 мин.
    3. Откажитесь от супернатанта и осторожно подвешивайте гранулы, пипетируя вверх и вниз 50 мкл теплого ГРГ. Хранить суспензию при температуре 28 °C.
    4. Исследуйте МТ с помощью флуоресцентного микроскопа, используя 647 нм родаминовый канал (рисунок 3А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения биотинилированных флуоресцентно меченых МТ реакция полимеризации содержит немаркированный тубулин, а также биотинилированный и флуоресцентно меченый тубулин. В этом протоколе используется трубулин, меченый родамином, но могут использоваться и другие флуоресцентные конъюгаты.
  2. Сборка поточной камеры
    1. Соберите проточную камеру, поместив четыре полосы двусторонней ленты (~ 4 см х ~ 3 мм) на усовершенствованный клейкий стеклянный слайд (параллельный более длинному краю и ~ 3-4 мм друг от друга), чтобы создать три «полосы» между ленточными полосами. Снимите защитную бумагу с ленточных полосок и поместите силанизированную крышку10 на ленточные полосы, чтобы создать три проточные камеры объемом ~10 мкл.
  3. Иммобилизация МТ на поверхность, покрытую авидином (Рисунок 1)
    1. Покрыть силанизированный покров перфузией 15 мкл 1 мг/мл биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (b-BSA, растворенного в ГНГ) в проточную камеру с помощью микропипетки. Через 5 мин промыть камеру 80 мкл ГНГ.
    2. Впоследствии, как и на этапе 3.3.1, вставить в проточную камеру 15 мкл 1 мг/мл Авидина (растворенного в ГНГ), который связывается с b-BSA. Через 5 мин промыть камеру 80 мкл ГНГ.
    3. Пассивируйте силанизированную поверхность покрова, используя 20 мкл 1% полоксамера. Через 3 мин промыть 80 мкл ГНГ.
    4. Присоедините биотинилированные МТ (стадия 3.1) к покрытому b-BSA-авидином покровному листу путем введения 20 мкл МТ, обычно разбавленных до 1:20 в ГНГ. Инкубируйте слайды в перевернутом положении, т.е. с крышкой, обращенной вниз в темной камере влажности (например, чашке Петри, содержащей влажную папиросную бумагу) в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем промыть 200 мкл ГРГ.
    5. Нанесите 30 мкл реакционной смеси подвижности (см. этап 1.3.2) в проточную камеру.
    6. Разбавляют двигатели Cin8-GFP (стадия 2.13) в 20 мкл реакционной смеси подвижности (см. Таблицу 1) (обычно до конечной концентрации 5-10 мкМ). Нанесите их на проточную камеру и сразу же изобразите движение двигателей вдоль МТ.
  4. Визуализация двигательной подвижности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Связывание МТ и подвижность двигателей контролировались с помощью эпифлуоресцентного инвертированного микроскопа, оснащенного ртутной дуговой лампой, объективом с числовой апертурой 100x/1.4 и двумя флуоресцентными полосовыми фильтрами, один с длиной волны 647 нм (для родамина), а другой с длиной волны 488 нм (для GFP).
    1. Поместите каплю погружного масла на объектив микроскопа. Поместите проточную камеру на ступень флуоресцентного микроскопа с крышкой вниз лицом к цели.
    2. Включите канал родамина, чтобы сфокусироваться на МТ, прикрепленных к поверхности крышки, и получить изображение с экспозицией 20 мс с помощью программного обеспечения Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. Включите канал GFP и получите 90 покадровых изображений с интервалом 1 с и экспозицией 800 мс для анализа подвижности Cin8-GFP.

Figure 3
Рисунок 3: МТ и МТ связанные Cin8-GFP. (A) Изображения из двух полей (левого и правого) для МТ полимеризованы в соответствии с протоколом, описанным на этапе 3.1, и сфотографированы со 100-кратным объективом, как описано на этапе 3.4. (B) Изображения из двух полей (слева и справа) для Cin8-GFP (нижние панели, отмеченные стрелками), прикрепленные к MT, показанному на верхних панелях. Шкала: 4 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Анализ моторики

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните весь анализ изображений и сгенерируйте кимографы с помощью программного обеспечения ImageJ-Fiji.

  1. Генерация кимографов
    1. Откройте покадровый ролик и соответствующее изображение поля MT. Синхронизируйте эти два окна, выбрав следующий параметр: Анализ средств > > Синхронизация Windows.
    2. Выделите один МТ с помощью опции Сегментированная линия и используйте вкладку Анализ > Мульти Кимограф для получения кимографа.
  2. Определение размера кластера Cin8-GFP (т.е. количества молекул Cin8 в кластере)
    1. Выполните вычитание фона и коррекцию неравномерного освещения с помощью параметра Обрабатывать > Вычитать фон . Установите радиус катящегося шара на уровне 100 пикселей и установите флажок Скользящий параболоид .
    2. Следите за средней интенсивностью флуоресценции определенного неподвижного двигателя Cin8-GFP (рисунок 3B) в зависимости от времени в радиусе круга 4 пикселя с помощью плагина TrackMate программного обеспечения ImageJ-Fiji, выбрав следующую опцию: Плагины > отслеживания > TrackMate > Детектор LoG > Simple Lap Tracker.
    3. Повторите шаг 4.2.2 для различных двигателей Cin8-GFP. График интенсивности флуоресценции различных двигателей Cin8-GFP в зависимости от времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная стратегия измерения размера кластера, т.е. количества молекул Cin8 в кластере, создает основу для анализа подвижности, связанной с кластеризацией Cin8. Фотоотбеливание GFP, прикрепленного к Cin8, используется для определения вклада отдельных молекул GFP в общую интенсивность кластеров Cin8. Например, интенсивность флуоресценции уменьшается с шагом ~ 50 произвольных единиц (а.е.), причем каждый отдельный шаг, вероятно, представляет собой фотоотбеливание одной молекулы GFP (рисунок 4A). Поскольку Cin8 является гомотетрамерным моторным белком, он содержит четыре молекулы GFP. Таким образом, все двигатели Cin8, имеющие интенсивность ≤ 200 а.е., вероятно, будут одиночными тетрамерными молекулами Cin8. Следуя этому методу, диапазоны интенсивности моторной флуоресценции Cin8 назначаются как <200, 200-400 и >400 для отдельных молекул Cin8, пар молекул Cin8 (димер тетрамера Cin8) и олигомеров Cin8, соответственно12.
  3. Анализ распределения интенсивности для двигателей Cin8-GFP
    1. Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции всех флуоресцентных двигателей Cin8-GFP в первом кадре покадровой последовательности с помощью плагина TrackMate в ImageJ-Fiji, как описано в шаге 4.2.2.
    2. Постройте гистограмму средних интенсивностей Cin8-GFP с размером бункера 20 а.е. и подогнать основной пик гистограммы к кривой Гаусса (рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ распределения интенсивности дополняет определение размера кластера для двигателей Cin8-GFP из экспериментов по фотоотбеливанию. Кривая Гаусса, соответствующая гистограмме распределения интенсивности для популяции Cin8-GFP, достигает пика ~125 а.е., что согласуется со средней интенсивностью одиночных тетрамерных молекул Cin8, содержащих одну, две, три или четыре флуоресцентные (небеленые) молекулы GFP, причем каждая флуоресцентная молекула GFP вносит ~50 a.u. Таким образом, используя этот метод распределения интенсивности, также может быть рассчитан вклад одной молекулы GFP, который может быть дополнительно использован для присвоения размера кластера молекул Cin8-GFP.

Figure 4
Рисунок 4: Профиль отбеливания Cin8-GFP и распределение интенсивности. (A) Фотоотбеливание GFP в четырех различных двигателях Cin8-GFP. Отдельные этапы фотоотбеливания, каждый из которых, вероятно, представляет собой фотоотбеливание одного GFP, приводят к падению интенсивности флуоресценции ~ 50 а.е. (B) Распределение интенсивности двигателей Cin8-GFP в первом кадре покадровой последовательности (вставки). Пик Гаусса (синий), центрированный на ~ 125 a.u, представляет собой одиночные молекулы Cin8-GFP. Этот пик демонстрирует среднюю интенсивность одиночных тетрамеров Cin8 с одной, двумя, тремя или четырьмя флуоресцентными молекулами GFP, причем каждая молекула GFP вносит ~ 50 а.е. в общую интенсивность (т.е. (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Отслеживание подвижности молекул Cin8-GFP вдоль треков MT
    1. Обрежьте объект MT, подлежащий анализу, в покадровой последовательности записанных кадров, выделив его с помощью инструмента «Прямоугольник», а затем выбрав «Изображение» > «Обрезать».
    2. Выберите флуоресцентную частицу Cin8-GFP для анализа. Записывайте координаты частиц в каждом кадре (точке времени) последовательности замедленной съемки с помощью параметров Point Tool и Measure . Выполните аналогичную запись координат для других флуоресцентных частиц в покадровой последовательности.
    3. Назначьте размер кластера всем исследованным частицам Cin8-GFP в первом кадре их появления, как описано в шаге 4.2.
  2. Анализ среднего смещения (MD) и среднего квадратного смещения (MSD)
    1. Из координат движений Cin8-GFP, определенных на шаге 4.4, вычислите смещения Cin8-GFP в каждой точке времени относительно исходных координат, используя уравнение для расчета расстояния между двумя точками с заданными координатами:
      Equation 1
      где dt — смещения Cin8-GFP в момент времени t, xt и yt — соответствующие координаты в момент времени t. x0 и y0 — соответствующие координаты Cin8-GFP при t = 0.
    2. Вычислите из этих значений смещения смещение для всех возможных временных интервалов для конкретной частицы Cin8-GFP. Повторите процедуру для всех исследованных частиц Cin8-GFP.
    3. Построение среднего смещения (MD) всех исследованных частиц Cin8-GFP по отношению к временному интервалу и при условии линейного соответствия MD = v x t + c. Наклон этого соответствия (v) представляет собой среднюю скорость подвижных частиц Cin8-GFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, средняя скорость всех молекул Cin8-GFP, принадлежащих к каждому размеру кластера, может быть рассчитана отдельно, характеризуя подвижность различных размеров кластера. В дополнение к анализу MD, анализ среднего квадратичного смещения (MSD) также может быть выполнен путем квадратуры значений смещения, рассчитанных на этапах 4.5.1 и 4.5.2. Значения MSD строятся по отношению к временному интервалу и подогнаны к полиномиальной кривой MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, что дает дополнительный параметр D, который является коэффициентом диффузии движения Cin8-GFP. МД анализ должен проводиться на полярности с маркировкойMTs 8,10, тогда как для анализа MSD знание полярности MT не требуется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эксперимент направлен на исследование характеристик подвижности двунаправленного моторного белка Cin8 различных размеров кластера на одиночных МТ. Репрезентативная подвижность Cin8-GFP также очевидна из кимографов на рисунке 5А, где показано пространственное положение двигателя с течением времени.

Для анализа подвижных свойств Cin8-GFP сначала присваивается размер кластера (шаг 4.3) каждой MT-присоединенной подвижной частице Cin8-GFP, а затем положение исследуемых частиц Cin8 отслеживается как функция времени (шаг 4.4). Для каждой категории размеров кластера из записей было извлечено >40 траекторий отдельных Cin8-GFP (рисунок 5B). Используя координаты, полученные в результате анализа отслеживания, MD и MSD анализ выполняется для каждой популяции размера кластера отдельно. Скорости получаются от линейных припадков к MD, как показано на рисунке 5C. Было обнаружено, что одиночные молекулы Cin8-GFP движутся однонаправленным, направленным на минус конце с высокой скоростью, тогда как кластеры Cin8 демонстрируют значительно меньшую скорость с более высокой склонностью к двунаправленной подвижности (рисунок 5B, C).

Figure 5
Рисунок 5: Подвижность Cin8-GFP. (A) Кимографы, представляющие подвижность двигателей Cin8-GFP на MTs. Оси X и Y представляют решетку MT и время, соответственно. Желтые стрелки отмечают быструю подвижность отдельных частиц Cin8-GFP в направлении минусового конца MT, тогда как синие стрелки отмечают медленную подвижность кластеров Cin8 в направлении плюс-энд MT. Полярность МЦ указывается в нижней части каждого кимографа (+/-). Турник: 4 мкм, вертикальная полоса: 20 с. (B) Следы смещения одиночных двигателей (слева) и кластеров (справа) двигателей Cin8-GFP. Следы смещения были нанесены с использованием координат, полученных после отслеживания отдельных двигателей Cin8-GFP, как описано в шаге 4.4. Отрицательные и положительные значения смещения указывают на движение в минусовом и плюс-концевых направлениях МТ соответственно. Обратите внимание, что при том же анализе подвижность кластеров Cin8 медленнее и двунаправленна по сравнению с одиночными молекулами Cin8. (C) Графики среднего смещения (MD) ± SEM, отдельных молекул (слева) и кластеров (справа) двигателей Cin8 в зависимости от временного интервала. Черные линии представляют линейные упадки графика (MD = v xt + c, где v — средняя скорость, t — временной интервал и c — перехват). Из фитинга видно, что средняя скорость для одиночных двигателей и кластеров Cin8 составляет -265 ± 20 нм/с и -48 ± 5 нм/с соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной работе представлен протокол анализа подвижности одной молекулы с двунаправленным кинезином-5 Cin8 и анализа подвижности. Полноразмерный Cin818 , включая сигнал собственной ядерной локализации (NLS) на С-терминале, был очищен от собственного хозяина S. cerevisiae. Поскольку Cin8 является ядерно-моторным белком, измельчение клеток S. cerevisiae под жидким азотом является наиболее эффективным методом лизиса клеток. После лизиса, путем комбинирования сродства металлов и эксклюзионной хроматографии размеров, получают высокочистый Cin8, что важно для анализа подвижности одной молекулы. Ранее сообщалось, что существуют различия между подвижными свойствами Cin8 в сырых экстрактах и очищенных образцах8. Кроме того, также сообщалось, что скученность МТ моторными и немоторными белками влияет на направленность двунаправленного кинезина-5 Cut722. Таким образом, высокая чистота мотора необходима для достоверного анализа подвижности и выводов относительно дикого типа и мутантного двигательного поведения. Методы, описанные здесь, могут быть легко адаптированы для очистки других ядерных белков от дрожжей с соответствующими буферными корректировками.

Здесь описан очень надежный и чувствительный анализ подвижности одной молекулы с GFP-меткой Cin8. Успех этого анализа в значительной степени зависит от правильной полимеризации и иммобилизации МТ на поверхность. Сильное взаимодействие авидин-биотин используется для иммобилизации МТ к гидрофобной стеклянной поверхности, которая необратимо прикрепляет МТ. На этих иммобилизованных МТ, использующих GFP с маркировкой Cin8, подвижность Cin8 может быть надежно отслежена 11,12,19.

Сообщается, что Cin8 образует кластеры, содержащие более одного тетрамерногодвигателя 10,12, причем подвижность этих кластеров отличается от подвижности отдельных молекул Cin8. Чтобы точно охарактеризовать подвижность Cin8 как функцию ее размера, был разработан метод, основанный на интенсивности флуоресценции, для определения размера кластера каждой частицы Cin812. Основываясь на этой категоризации размеров, подвижность анализируется отдельно в каждой категории размеров. После этого анализа на основе размера предоставляются проницательные детали, которые могут быть использованы для понимания различного поведения олигомеров одной и той же молекулы 11,12,19. Описанная здесь процедура определения размера кластера может быть применена для определения размера различных флуоресцентно меченых молекул. При выполнении определения размера на основе флуоресценции следует быть осторожным, чтобы определить размер кластера частиц Cin8-GFP на первом кадре появления, чтобы избежать воздействия обесцвечивания, поскольку большие кластеры могут выглядеть как более мелкие после фотоотбеливания.

Характеристика подвижности выполняется с помощью анализов MD и/или MSD. Если интересно определить только скорость двигателя, достаточно анализа MD. Однако, если подвижность двигателя содержит как активные, так и пассивные компоненты и также требуется определение коэффициента диффузии, анализ MSD должен быть выполнен 20,23,24,25. Для анализа MD и MSD необходимо определить координаты двигателя для каждой точки времени. Для эффективного отслеживания важно поддерживать оптимальную концентрацию двигателя. МТ не должны быть слишком переполнены моторами; в идеале, должно быть 3-4 Cin8-GFP двигателей / частиц за раз на MT ~ 10 мкм. Автоматизированные инструменты, такие как плагин «KymoButler» или «TrackMate» в ImageJ-Fiji, также могут использоваться для отслеживания подвижныхдвигателей 26,27. Эти автоматизированные инструменты экономят время и работу, но у них есть несколько ограничений. Например, если подвижность некоторых частиц очень медленная, эти инструменты могут считывать их как неподвижные частицы. Кроме того, эти инструменты имеют ограничения в распознавании молекул низкой интенсивности. Поэтому они могут проявлять высокоинтенсивную предвзятость. С другой стороны, ручное отслеживание (хотя и отнимает много времени) менее чувствительно к ошибкам отслеживания.

Таким образом, этот протокол, начиная с очистки Cin8, переэкспрессированного в S. cerevisiae, всесторонне объясняет анализ подвижности одной молекулы и последующий анализ подвижности этого двунаправленного кинезина-5. Этот протокол можно легко соблюдать, чтобы очистить и охарактеризовать подвижность моторных белков, таких как Cin8. Кроме того, различные части протокола могут быть адаптированы для очистки белков от дрожжей или разработки одномолекулярных анализов подвижности для различных моторных белков и их характеристики подвижности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Это исследование было частично поддержано грантом Израильского научного фонда (ISF-386/18) и грантом Израильского двустороннего научного фонда (BSF-2019008), присужденным L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

Tags

Биохимия выпуск 180 кинезин Cin8 одномолекулярная подвижность микротрубочка двунаправленная подвижность

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Подвижность одиночных молекул и кластеров двунаправленного кинезина-5 Cin8, очищенного из клеток <em>S. cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter