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Biochemistry

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Abstract

Die mitotischen bipolaren Kinesin-5-Motoren erfüllen wesentliche Funktionen in der Spindeldynamik. Diese Motoren weisen eine homotetramere Struktur mit zwei Paaren katalytischer motorischer Domänen auf, die sich an gegenüberliegenden Enden des aktiven Komplexes befinden. Diese einzigartige Architektur ermöglicht es Kinesin-5-Motoren, antiparallele Spindelmikrotubuli (MTs) zu vernetzen und auseinander zu schieben und so die nach außen gerichtete Kraft bereitzustellen, die die Spindelpole voneinander trennt. Früher wurde angenommen, dass Kinesin-5-Motoren ausschließlich Plus-End-gesteuert sind. Neuere Studien zeigten jedoch, dass mehrere pilzliche Kinesin-5-Motoren am Minus-Ende auf die Einzelmolekülebene gerichtet sind und die Direktionalität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen umschalten können. Das Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 ist ein Beispiel für ein solches bidirektionales Motorprotein: Unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke bewegen sich einzelne Moleküle von Cin8 in Minus-End-Richtung der MTs. Es wurde auch gezeigt, dass Cin8 bewegliche Cluster bildet, hauptsächlich am Minus-Ende der MTs, und ein solches Clustering ermöglicht es Cin8, die Direktionalität zu wechseln und eine langsame, plus gerichtete Motilität zu durchlaufen. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für alle Schritte der Arbeit mit GFP-getaggtem Kinesin-5 Cin8, von der Proteinüberexpression in S. cerevisiae-Zellen über ihre Aufreinigung bis hin zum In-vitro-Einzelmolekül-Motilitätsassay . Eine hier beschriebene neu entwickelte Methode hilft, einzelne Moleküle und Cluster von Cin8 anhand ihrer Fluoreszenzintensität zu unterscheiden. Diese Methode ermöglicht eine separate Analyse der Motilität einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 und liefert so die Charakterisierung der Abhängigkeit der Cin8-Motilität von ihrer Clustergröße.

Introduction

Eine große Anzahl von Motilitätsereignissen in eukaryotischen Zellen wird durch die Funktion molekularer Motorproteine vermittelt. Diese Motoren bewegen sich entlang der zytoskelettalen Filamente, Aktinfilamente und Mikrotubuli (MTs) und wandeln die chemische Energie der ATP-Hydrolyse in kinetische und mechanische Kräfte um, die erforderlich sind, um die biologische Motilität in Zellen anzutreiben. Das MT-basierte S. cerevisiae Cin8 ist ein bipolares, homotetrameres Kinesin-5-Motorprotein, das Spindel-MTs vernetzt und auseinanderschiebt1. Cin8 erfüllt wesentliche Funktionen während der Mitose, bei der Spindelmontage 2,3,4 und bei der Spindeldehnung während der Anaphase 5,6,7. Zuvor war gezeigt worden, dass Cin8 ein bidirektionaler Motor ist, der die Richtungsabhängigkeit unter verschiedenen experimentellen Bedingungen schaltet. Zum Beispiel bewegen sich einzelne Cin8-Motoren unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke in Richtung des Minus-Endes der MTs, während sich Cin8-Motoren in Clustern, in mehrmotorigen MT-Gleitassays und zwischen antiparallelen MTs hauptsächlich in Richtung der Plus-Enden der MTsbewegen 8,9,10,11,12 . Diese Ergebnisse waren aus mehreren Gründen höchst unerwartet. Erstens trägt Cin8 seine katalytische motorische Domäne am Amino-Terminus, und es wurde bisher angenommen, dass solche Motoren ausschließlich plus-end gerichtet sind, während Cin8 als minus-end auf der Einzelmolekülebene gerichtet gezeigt wurde. Zweitens wurde angenommen, dass Kinesin-Motoren unidirektional sind, entweder minus-end oder plus-end gerichtet, während Cin8 abhängig von den experimentellen Bedingungen als bidirektional gezeigt wurde. Schließlich konnte aufgrund der MT-Orientierung an der mitotischen Spindel die klassische Rolle von Kinesin-5-Motoren bei der Trennung von Spindelpolen während der Spindelmontage und der Anaphase B nur durch ihre Plus-End-gerichtete Motilität auf den MTs, die sie vernetzen 1,13, erklärt werden. Nach den ersten Berichten über die Bidirektionalität von Cin8 wurde gezeigt, dass einige andere Kinesin-Motoren bidirektional14,15,16 sind, was darauf hindeutet, dass die bidirektionale Motilität von Kinesin-Motoren häufiger sein könnte als bisher angenommen.

Es wurde bereits berichtet, dass sich Cin8 in Zellen auch in einer bidirektionalen Weisebewegt 8, was die Vorstellung unterstützt, dass die bidirektionale Motilität einiger Kinesin-5-Motoren für ihre intrazellulären Funktionen wichtig ist. Da die drei Kinesin-5-Motoren, von denen berichtet wurde, dass sie bidirektional sind, aus Pilzzellen stammen, wurde kürzlich eine mögliche Rolle für die Bidirektionalität von Kinesin-5-Motoren in solchen Zellenvorgeschlagen 10. Nach diesem Modell liefern Kinesin-5-Motoren bei geschlossener Mitose von Pilzzellen, bei denen die Kernhülle während der Mitose nicht zusammenbricht, die Anfangskraft, die die Spindelpole vor der Spindelmontage voneinander trennt. Um diese Aufgabe zu erfüllen, lokalisieren sich Kinesin-5-Motoren vor der Spindelpoltrennung in der Nähe der Spindelpole durch ihre minus-endgerichtete Motilität auf einzelnen Kern-MTs. An dieser Position angekommen, gruppieren, schalten Kinesin-5-Motoren die Richtungsabhängigkeit, erfassen und vernetzen MTs von benachbarten Spindelpolen. Anschließend sorgen Kinesin-5-Motoren für die anfängliche Trennung der Pole durch Plus-End-gerichtete Motilität auf den MTs, die sie vernetzen. Bei diesem Modell sind sowohl eine gerichtete Minus-End-Motilität auf einzelnen MTs als auch eine gerichtete Plus-End-Motilität auf vernetzten MTs während des antiparallelen Gleitens erforderlich, damit Pilzkinesin-5-Motoren ihre Rolle in der Spindelbaugruppe 1,13 erfüllen können.

Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Methode besteht darin, hochreines GFP-markiertes Kinesin-5-Cin8 mit hohem Pilz zu erhalten und Einzelmolekül-Motilitätsassays durchzuführen (Abbildung 1), während die Motilität einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 separat analysiert wird. Die Trennung zwischen einzelnen Molekülen und Clustern ist wichtig, da einer der Faktoren, die nachweislich die Richtungsabhängigkeit von Cin8 beeinflussen, seine Akkumulation in Clustern auf den MTs10,12 ist. Alternative Motilitätsassays, wie die MT-Oberflächengleit- und MT-Gleitassays, liefern keine Informationen über die Aktivität einzelner motorischer Proteine17,18. Die hier beschriebenen robusten Einzelmolekül-Motilitätsassay- und Analysemethoden wurden erfolgreich angewendet, um verschiedene Aspekte der Kinesin-5-Motoren, Cin8 und Kip1 10,11,12,14,19,20, zu charakterisieren.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Cin8-Überexpression und -Reinigung, die Polymerisation von MTs und den Einzelmolekül-Motilitätsassay vorgestellt. Darüber hinaus werden auch die Analysen zur Unterscheidung zwischen einzelnen Molekülen und Clustern von Cin8 und zur Bestimmung der Einzelmotor- und Clustergeschwindigkeiten durch mittlere Verschiebung (MD) und mittlere quadratische Verschiebung (MSD) beschrieben. Dieses Protokoll soll Forschern helfen, alle Schritte der Verfahren zu visualisieren und bei der Fehlerbehebung dieser Art von Assays zu helfen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Einzelmolekül-Motilitätsassays. Biotinylierte fluoreszierende MTs sind an der Glasoberfläche befestigt, die mit Avidin beschichtet ist, das mit dem an der Oberfläche befestigten biotinylierten BSA interagiert. Der grüne Pfeil stellt die Bewegungsrichtung einzelner Cin8-Moleküle unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke dar. +/- stellen die Polarität des MT dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protocol

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

  1. Puffer
    1. -Leu aa Dropout-Mix: Je 2 g Adenin, Uracil, Tryptophan, Histidin, Lysin und Methionin mischen und bei Raumtemperatur lagern.
    2. Hefeselektives Medium mit Raffinose (1 L): 6,7 g Hefestickstoffbasis (mit Ammoniumsulfat), 2 g -Leu-aa-Tropfenmischung und 20 g Raffinose in doppelt destilliertem Wasser unter Rühren (ohne Erhitzen) mischen, bis sie vollständig aufgelöst sind. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter in eine sterile Flasche.
    3. Lysepuffer: Bereiten Sie 25 ml Lösung in dreifach destilliertem Wasser (TDW) vor, bestehend aus 50 mM Tris, 30 mM Rohren, 500 mM KCl, 10% Glycerin, 1,5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP und 0,1% Triton X-100. Stellen Sie den pH-Wert mit 6 M HCl auf 8 ein.
    4. Elutionspuffer: Bereiten Sie 10 mL Lösung in TDW vor, bestehend aus 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 350 mM Imidazol, 10% Glycerin, 1,5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP und 0,1% Triton X-100. Stellen Sie den pH-Wert mit 6 M HCl auf 7,2 ein.
    5. P12-Puffer: Bereiten Sie 10 mL einer Lösung in TDW vor, die aus 12 mM-Rohren, 1 mM EGTA und 2 mM MgCl2 besteht. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 6,9 ein.
    6. BRB80-Puffer: Bereiten Sie 50 mL einer Lösung vor, die aus 80 mM Rohren, 1 mM EGTA und 2 mMMgCl 2 in Reinstwasser besteht. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 6,9 ein.
    7. Allgemeiner Tubulinpuffer (GTB): Bereiten Sie 50 ml einer Lösung vor, die aus 80 mM Rohren, 0,5 mM EGTA und 2 mMMgCl 2 in Reinstwasser besteht. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 6,9 ein.
    8. Tris-Pipes-Lösung: Bereiten Sie 40 ml 1M Tris-0,6 M Pipes-Lösung vor, indem Sie 6,055 g Tris und 9,07 g Rohre in TDW mischen und den pH-Wert mit 6 M HCl auf 7,2 einstellen. Bringen Sie das endgültige Volumen mit TDW auf 50 ml.
      HINWEIS: P12-, BRB80- und Tris-Pipes-Puffer werden für die Herstellung von Stammlösungen für den Motilitätsassay verwendet. Diese Puffer können in großen Mengen hergestellt, in 1,5-ml-Röhrchen aliquotiert, schockgefroren und bei -20 °C gelagert werden.
  2. Lagerlösungen für den Motilitätstest
    1. Tubulin (10 mg mL-1): 1 mg lyophilisiertes Tubulin in 100 μL kaltem (4 °C) allgemeinem Tubulinpuffer (GTB) auflösen. 1 μL Aliquots einfrieren und bei -80 °C lagern.
    2. Biotinyliertes Tubulin (1 mg mL-1): 20 μg lyophilisiertes Tubulin in 20 μL kaltem GTB auflösen. 1 μL Aliquots einfrieren und bei -80 °C lagern.
    3. Rhodamin-markiertes Tubulin (1 mg ml-1): 20 μg lyophilisiertes Tubulin in 20 μL kaltem GTB auflösen. 0,5 μL Aliquots einfrieren und bei -80 °C lagern.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP wird vom Lieferanten als 100 μL wässrige Lösung erhalten und bei -80 °C gelagert. Tauen Sie das Fläschchen mit GMPCPP auf Eis auf. 1 μL Aliquots zubereiten, einfrieren und bei -80 °C lagern.
    5. ATP: Bereiten Sie 500 μL Lösung von 100 mM ATP in 0,5 M Tris Puffer (pH 8) vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    6. MgCl 2: Bereiten Sie 1 ml Lösung von 200 mMMgCl 2 im P12-Puffer vor. 5 μL Aliquots bei -20 °C lagern.
    7. Kasein: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 5 mg mL-1 Casein in BRB 80 Puffer vor. 10 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    8. D-Glucose: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 1 M D-Glucose im P12-Puffer vor. 10 μL Aliquots bei -20 °C lagern.
    9. Glucoseoxidase: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 10 mg mL-1 Glukoseoxidase im P12-Puffer vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    10. Katalase: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung mit 0,8 mg ml-1-Katalase im P12-Puffer vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    11. Dithiothreitol (DTT): Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 1 M DTT in P12-Puffer in einem Abzug vor. 10 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    12. Kreatinphosphat: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 1 M Kreatinphosphat im P12-Puffer vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    13. Kreatinphosphokinase: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 5 mg ml-1 Kreatinphosphokinase in 0,25 m Glycylglycin, pH 7,4 vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    14. EGTA: Bereiten Sie eine 100 mM EGTA-Lösung in Reinstwasser vor und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
    15. KCl: Bereiten Sie eine 1 M KCl-Lösung in Reinstwasser vor und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
  3. Motilitätspuffer und Reaktionsmischung
    1. Motilitätspuffer (MB) mit 145 mM KCl, 2x Material: Bereiten Sie 1 ml 2x Material des Motilitätspuffers vor, indem Sie 100 μL vorgefertigte Tris-Pipes-Lösung, 20 μL 100 mM EGTA, 290 μL KCl und 590 μL TDW mischen. Halten Sie den Puffer auf Eis.
    2. Motilitätsreaktionsmischung: Motilitätsreaktionsmischung gemäß Tabelle 1 vorbereiten und auf Eis lagern.
Volumen Lager Name des Reagenzes
50 μL 2-fach MB (aus Schritt 1.3.1)
40 μL - TDW
1 μL 100 mM ATP
1 μL 200 mM MgCl2
2 μL 5 mg/ml Casein
1 μL 1 Mio. Traubenzucker
1 μL 1 Mio. DVB-T
1 μL 10 mg/ml Glukoseoxidase
1 μL 8 mg/ml Katalase
1 μL 1 Mio. Phosphokreatin
1 μL 5 mg/ml Kreatinphosphokinase
100 μL Gesamt

Tabelle 1.

2. Cin8-Überexpression und Reinigung aus S. cerevisiae-Zellen

  1. Züchten Sie S. cerevisiae-Zellen , die das Plasmid zur Überexpression von Cin8-GFP-6His enthalten, bis zur exponentiellen Wachstumsphase (OD600 = 0,6-0,8) in 1 l Hefeselektivmedium, ergänzt mit 2% Raffinose (siehe Schritt 1.1.2) bei 28 °C12.
  2. Induzieren Cin8-GFP-6Seine Überexpression durch Zugabe von 2% Galaktose. Überwachen Sie das Wachstum der Hefekultur, indem Sie die Absorption bei 600 nm messen.
  3. Fünf Stunden nach der Galaktosezugabe die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C ernten, die Zellen im Lysepuffer suspendieren und in Flüssigkeit N2 einfrieren.
    HINWEIS: Gefrorene Zellen können bei -80 °C zur weiteren Verwendung gelagert oder sofort in FlüssigkeitN2 gemahlen werden.
  4. Mahlen Sie die gefrorenen Zellen in Flüssigkeit N2 mit gekühltem Mörser und Stößel. Fügen Sie während des Mahlens Flüssigkeit N2 hinzu, um die Extrakte gefroren zu halten. Es erfordert typischerweise 4-5 mal die Zugabe von Flüssigkeit N2.
  5. Überwachen Sie die Zelllyse durch Beobachtung unter Phasenkontrast- oder DIC-Mikroskop.
  6. Erdzellen auftauen und bei 21.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Laden Sie den Überstand auf eine Schwerkraftsäule, die mit 2 ml Ni-NTA gefüllt und mit Lysepuffer voräquilibriert ist. Lassen Sie den Überstand durch die Säule fließen.
  7. Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina Lysepuffer und dann mit fünf Säulenvolumina Lysepuffer, ergänzt durch 25 mM Imidazol.
  8. Eluierte Cin8-GFP-6His mit Elutionspuffer (siehe Schritt 1.1.4).
  9. Analysieren Sie die eluierten Proben mittels SDS-PAGE-Fraktionierung, gefolgt von Coomassie-Blaufärbung und Western-Blot-Analyse, die mit α-GFP-Antikörper19 untersucht wurde.
  10. Poolen Sie die Fraktionen, die Cin8-GFP-6His enthalten (Schritte 2.8 und 2.9). Darüber hinaus reinigen Sie sie durch Größenausschlusschromatographie (SEC) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml min-1 und einer Säulendruckgrenze von 1,5 MPa bei gleichzeitiger Überwachung der Absorption bei 280 nm und der GFP-Fluoreszenzemission mit Anregung bei 488 nm (Abbildung 2A).
  11. Sammeln Sie die Brüche, die dem Cin8-GFP-Tetramer entsprechen, und analysieren Sie sie mittels SDS-PAGE und Western Blotting (siehe Schritt 2.9) (Abbildung 2B).
  12. Schätzen Sie die Proteinkonzentration mithilfe von Spektrophotometrie oder biochemischen Assays wie Bradford-Assay, BCA-Assay usw.
  13. Aliquot die ausgewählten Fraktionen, in FlüssigkeitN2 einfrieren und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern. Diese gereinigten Proteinproben können 6 Monate lang verwendet werden.
    HINWEIS: Cin8-GFP wird überexprimiert und gereinigt von einem Protease-defizienten S. cerevisiae-Stamm, der ein 2-μm-Plasmid für Cin8-GFP-6His Überexpression aus dem galaktose-induzierbaren Promotor enthält, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). Der Hefestamm und das Plasmid sind auf Anfrage erhältlich.

Figure 2
Abbildung 2: Reinigung von Cin8-GFP. (A) Das Größenausschlusschromatogramm von Ni-NTA gereinigtem Cin8-GFP mit kontinuierlicher GFP-Fluoreszenzdetektion durch 488 nm Anregung und Emission bei ~510 nm. Das Cin8-GFP-Tetramer eluiert bei ~10 ml aus der SEC-Spalte (markiert mit einem Pfeil). (B) Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel (oben) und α-GFP-Western Blot (unten) von Cin8-GFP-Fraktionen, die aus SEC eluiert werden. Die Proben in den Bahnen sind wie folgt: M - Molekulargewichtsmarker, Ni 2 + - Ni-NTA-gereinigte Cin8-GFP-Probe, die in dieSEC-Spalte geladen wird, GF-Fraktionen: Fraktion, die der Cin8-GFP-SEC-Elution entspricht, wie in Panel A markiert. Der Pfeil rechts markiert die Größe des Cin8-GFP-Monomers (erwartet auf der SDS-PAGE). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Einzelmolekül-Motilitätsassay mit dem gereinigten Cin8

  1. Polymerisation von Biotin- und Rhodamin-markierten MTs, stabilisiert mit GMPCPP.
    1. Beginnen Sie mit der MT-Polymerisation, indem Sie die folgenden Komponenten in einem 1,5-ml-Röhrchen mischen: 1 μL 10 mg/ml Tubulinprotein, 1 μL 1 mg/ml biotinyliertes Tubulin, 0,5 μL 1 mg/ml Rhodamin-markiertes Tubulin, 1 μL 10 mM GMPCPP und 6,5 μL allgemeiner Tubulinpuffer (GTB). Die Mischung für 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Nach der MT-Polymerisation 80 μL warmes (37 °C) GTB hinzufügen, vorsichtig mischen und 20 min bei 16.500 x g zentrifugieren.
    3. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie es mit 50 μL warmem GTB auf und ab pipettieren. Lagern Sie die Suspension bei 28 °C.
    4. Untersuchen Sie die MTs mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des 647-nm-Rhodaminkanals (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Um biotinylierte fluoreszenzmarkierte MTs zu erhalten, enthält die Polymerisationsreaktion unmarkiertes Tubulin sowie biotinyliertes und fluoreszenzmarkiertes Tubulin. In diesem Protokoll wird Rhodamin-markiertes Tubulin verwendet, aber auch andere fluoreszierende Konjugate können verwendet werden.
  2. Durchflusskammer-Montage
    1. Montieren Sie eine Durchflusskammer, indem Sie vier Streifen doppelseitiges Klebeband (~ 4 cm x ~ 3 mm) auf einen fortschrittlichen selbstklebenden Glasschieber (parallel zur längeren Kante und ~ 3-4 mm voneinander entfernt) legen, um drei "Bahnen" zwischen den Bandstreifen zu schaffen. Entfernen Sie das Schutzpapier von den Bandstreifen und legen Sie ein silanisiertes Deckglas 10 auf die Bandstreifen, um drei Durchflusskammern mit einem Volumen von ~10 μL zu erzeugen.
  3. MT-Immobilisierung auf die avidinbeschichtete Oberfläche (Abbildung 1)
    1. Beschichten Sie den silanisierten Deckglas durch Perfusion mit 15 μL 1 mg/ml biotinyliertem Rinderserumalbumin (b-BSA, gelöst in GTB) mit einer Mikropipetette in die Durchflusskammer. Nach 5 min die Kammer mit 80 μL GTB waschen.
    2. Anschließend werden wie in Schritt 3.3.1 15 μL 15 μL 1 mg/ml Avidin (gelöst in GTB) in die Durchflusskammer eingeführt, das an die b-BSA bindet. Nach 5 min die Kammer mit 80 μL GTB waschen.
    3. Passivieren Sie die silanisierte Deckglasoberfläche mit 20 μL 1% Poloxamer. Nach 3 min mit 80 μL GTB waschen.
    4. Befestigen Sie biotinylierte MTs (Schritt 3.1) am b-BSA-avidin-beschichteten Deckglas, indem Sie 20 μL MTs einführen, die typischerweise auf 1:20 in GTB verdünnt sind. Inkubieren Sie die Objektträger in umgekehrter Position, d.h. mit dem Deckglas nach unten in einer dunklen Feuchtigkeitskammer (z. B. einer Petrischale mit nassem Seidenpapier) für 5 min bei Raumtemperatur. Dann mit 200 μL GTB waschen.
    5. 30 μL Motilitätsreaktionsmischung (siehe Schritt 1.3.2) werden in die Durchflusskammer aufgetragen.
    6. Die Cin8-GFP-Motoren (Schritt 2.13) werden in 20 μL Motilitätsreaktionsmischung (siehe Tabelle 1) verdünnt (typischerweise auf eine Endkonzentration von 5-10 μM). Tragen Sie sie auf die Durchflusskammer auf und stellen Sie sofort die Bewegung der Motoren entlang der MTs dar.
  4. Bildgebung der motorischen Motilität
    HINWEIS: Die MT-Bindung und die Motilität der Motoren wurden mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop überwacht, das mit einer Quecksilberbogenlampe, einem numerischen 100x/1,4-Blendenobjektiv und zwei Fluoreszenzbandpass-Filtersätzen ausgestattet war, eines mit einer Wellenlänge von 647 nm (für Rhodamin) und eines mit einer Wellenlänge von 488 nm (für GFP).
    1. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Mikroskopobjektiv. Platzieren Sie die Durchflusskammer auf dem Fluoreszenzmikroskoptisch mit dem Deckel nach unten zum Objektiv.
    2. Schalten Sie den Rhodaminkanal ein, um sich auf die an der Deckglasoberfläche angebrachten MTs zu konzentrieren, und erfassen Sie das Bild mit einer Belichtung von 20 ms mit der Micro-Manager ImageJ-Fiji-Software21.
    3. Schalten Sie den GFP-Kanal ein und erfassen Sie 90 Zeitrafferbilder mit einem Intervall von 1 s und einer Belichtung von 800 ms, um die Cin8-GFP-Motilität zu analysieren.

Figure 3
Abbildung 3: MTs und MT-gebundene Cin8-GFP. (A) Bilder aus zwei Feldern (links und rechts) für MTs, die nach dem in Schritt 3.1 beschriebenen Protokoll polymerisiert und mit 100-fachem Objektiv wie in Schritt 3.4 beschrieben abgebildet wurden. (B) Bilder aus zwei Feldern (links und rechts) für den Cin8-GFP (untere Tafeln, mit Pfeilen markiert), die an der in den oberen Feldern gezeigten MT befestigt sind. Maßstabsbalken: 4 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Motilitätsanalyse

HINWEIS: Führen Sie die gesamte Bildanalyse durch und generieren Sie Kymographen mit der ImageJ-Fiji Software.

  1. Generierung von Kymographen
    1. Öffnen Sie den Zeitrafferfilm und das entsprechende MT-Feldbild. Synchronisieren Sie diese beiden Fenster, indem Sie die folgende Option auswählen: Analysieren > Tools > Windows synchronisieren.
    2. Markieren Sie eine MT mit der Option Segmentierte Linie und verwenden Sie die Registerkarte > Multikymograph analysieren, um einen Kymographen zu erhalten.
  2. Bestimmung der Clustergröße von Cin8-GFP (d.h. die Anzahl der Cin8-Moleküle in einem Cluster)
    1. Führen Sie die Hintergrundsubtraktion und die Korrektur bei ungleichmäßiger Beleuchtung durch, indem Sie die Option Hintergrund > subtrahieren verwenden. Stellen Sie den Radius des rollenden Balls auf 100 Pixel ein und aktivieren Sie die Option Sliding Paraboloid.
    2. Verfolgen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität eines bestimmten nicht beweglichen Cin8-GFP-Motors (Abbildung 3B) als Funktion der Zeit innerhalb eines Kreises von 4 Pixeln Radius mit dem TrackMate-Plugin der ImageJ-Fiji-Software, indem Sie die folgende Option wählen: Plugins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Wiederholen Sie Schritt 4.2.2 für verschiedene Cin8-GFP-Motoren. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität der verschiedenen Cin8-GFP-Motoren als Funktion der Zeit auf.
      HINWEIS: Eine experimentelle Strategie zur Messung der Clustergröße - d.h. der Anzahl der Cin8-Moleküle in einem Cluster - schafft eine Grundlage für die Analyse der Cin8-Clustering-bezogenen Motilität. Photobleaching von GFP, das an Cin8 gebunden ist, wird verwendet, um den Beitrag einzelner GFP-Moleküle zur Gesamtintensität von Cin8-Clustern zu bestimmen. Zum Beispiel nehmen die Fluoreszenzintensitäten in Schritten von ~ 50 beliebigen Einheiten (a.u.) ab, wobei jeder einzelne Schritt wahrscheinlich die Photobleiche eines GFP-Moleküls darstellt (Abbildung 4A). Da Cin8 ein homotetrameres Motorprotein ist, enthält es vier GFP-Moleküle. Daher sind alle Cin8-Motoren mit einer Intensität ≤ 200 a.U. wahrscheinlich einzelne tetramere Cin8-Moleküle. Nach dieser Methode werden die Intensitätsbereiche der motorischen Cin8-Fluoreszenz als <200, 200-400 und >400 für einzelne Cin8-Moleküle, Paare von Cin8-Molekülen (Dimer von Cin8-Tetramer) und Cin8-Oligomere bzw.12 zugewiesen.
  3. Intensitätsverteilungsanalyse für Cin8-GFP-Motoren
    1. Messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität aller fluoreszierenden Cin8-GFP-Motoren im ersten Frame der Zeitraffersequenz mit dem TrackMate-Plugin in ImageJ-Fiji, wie in Schritt 4.2.2 beschrieben.
    2. Zeichnen Sie ein Histogramm der mittleren Intensitäten von Cin8-GFP mit einer Bin-Größe von 20 a.u. und passen Sie den Hauptpeak des Histogramms an eine Gaußsche Kurve an (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Die Intensitätsverteilungsanalyse ergänzt die Clustergrößenbestimmung für Cin8-GFP-Motoren aus den Photobleichexperimenten. Die Gaußsche Kurve, die an das Intensitätsverteilungshistogramm für die Cin8-GFP-Population angepasst ist, erreicht ihren Höhepunkt bei ~ 125 a.e., was mit der durchschnittlichen Intensität einzelner tetramerer Cin8-Moleküle übereinstimmt, die entweder ein, zwei, drei oder vier fluoreszierende (nicht gebleichte) GFP-Moleküle enthalten, wobei jedes fluoreszierende GFP-Molekül ~ 50 a.e. beisteuert. Somit kann mit dieser Intensitätsverteilungsmethode auch der Beitrag eines GFP-Moleküls berechnet werden, der weiter genutzt werden kann, um die Clustergröße von Cin8-GFP-Molekülen zuzuordnen.

Figure 4
Abbildung 4: Cin8-GFP-Bleichprofil und Intensitätsverteilung. (A) Photobleichen von GFP in vier verschiedenen Cin8-GFP-Motoren. Einzelne Photobleichschritte, die wahrscheinlich das Photobleichen eines GFP darstellen, führen zu einem Abfall der Fluoreszenzintensität von ~50 a.u. (B) Die Intensitätsverteilung von Cin8-GFP-Motoren im ersten Frame einer Zeitraffersequenz (Inset). Der Gaußsche Peak (blau) zentriert bei ~ 125 a.U. repräsentiert einzelne Cin8-GFP-Moleküle. Dieser Peak zeigt die durchschnittliche Intensität einzelner Cin8-Tetramere mit einem, zwei, drei oder vier fluoreszierenden GFP-Molekülen, wobei jedes GFP-Molekül ~ 50 AE zur Gesamtintensität beiträgt (dh (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Verfolgung der Motilität der Cin8-GFP-Moleküle entlang der MT-Spuren
    1. Schneiden Sie die MT zu, die in der Zeitraffersequenz der aufgezeichneten Frames analysiert werden soll, indem Sie sie mit dem Rechteckwerkzeug hervorheben und dann Bild > Zuschneiden wählen.
    2. Wählen Sie für die Analyse ein fluoreszierendes Cin8-GFP-Partikel. Zeichnen Sie die Partikelkoordinaten in jedem Frame (Zeitpunkt) der Zeitraffersequenz mit den Optionen " Punkt-Werkzeug " und " Messen" auf. Führen Sie eine ähnliche Aufzeichnung von Koordinaten für andere fluoreszierende Partikel in der Zeitraffersequenz durch.
    3. Weisen Sie allen untersuchten Cin8-GFP-Partikeln im ersten Rahmen ihres Auftretens eine Clustergröße zu, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
  2. Analysen der mittleren Verschiebung (MD) und der mittleren quadratischen Verschiebung (MSD)
    1. Berechnen Sie aus den Koordinaten der Cin8-GFP-Bewegungen, die in Schritt 4.4 bestimmt wurden, die Verschiebungen von Cin8-GFP zu jedem Zeitpunkt in Bezug auf die Anfangskoordinaten unter Verwendung der Gleichung zur Berechnung der Entfernung zwischen zwei Punkten mit bestimmten Koordinaten:
      Equation 1
      wobei d t die Verschiebungen von Cin8-GFP zum Zeitpunkt t, x t und y t die jeweiligen Koordinaten zum Zeitpunkt t sind. x 0 und y 0 sind die jeweiligen Koordinaten von Cin8-GFP beit =0.
    2. Berechnen Sie aus diesen Verschiebungswerten die Verschiebung für alle möglichen Zeitintervalle für ein bestimmtes Cin8-GFP-Partikel. Wiederholen Sie den Vorgang für alle untersuchten Cin8-GFP-Partikel.
    3. Zeichnen Sie die mittlere Verschiebung (MD) aller untersuchten Cin8-GFP-Partikel im Vergleich zum Zeitintervall auf und unterliegen Sie einer linearen Anpassung, MD = v x t + c. Die Steigung dieser Anpassung (v) stellt die mittlere Geschwindigkeit von beweglichen Cin8-GFP-Partikeln dar.
      HINWEIS: Auf diese Weise kann die durchschnittliche Geschwindigkeit aller Cin8-GFP-Moleküle, die zu jeder Clustergröße gehören, separat berechnet werden, wobei die Motilität verschiedener Clustergrößen charakterisiert wird. Zusätzlich zur MD-Analyse kann auch die MSD-Analyse (Mean Square Displacement) durchgeführt werden, indem die in den Schritten 4.5.1 und 4.5.2 berechneten Verschiebungswerte quadriert werden. MSD-Werte werden im Vergleich zum Zeitintervall aufgetragen und an die Polynomkurve MSD = v 2 x t2 +2D x t + c angepasst, wobei der zusätzliche Parameter D ergibt, der der Diffusionskoeffizient der Cin8-GFP-Bewegung ist. Die MD-Analyse sollte an den mit MT 8,10 gekennzeichneten Polarität durchgeführt werden, während für die MSD-Analyse keine Kenntnis der MT-Polarität erforderlich ist.

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Representative Results

Das Experiment zielt darauf ab, die Motilitätseigenschaften des bidirektionalen Motorproteins Cin8 verschiedener Clustergrößen auf einzelnen MTs zu untersuchen. Die repräsentative Motilität von Cin8-GFP ist auch aus den Kymographen in Abbildung 5A ersichtlich, wo die räumliche Position des Motors im Laufe der Zeit gezeigt wird.

Für die Analyse der beweglichen Eigenschaften von Cin8-GFP wird zunächst jedem MT-gebundenen beweglichen Cin8-GFP-Partikel die Clustergröße zugeordnet (Schritt 4.3) und anschließend die Position der untersuchten Cin8-Partikel als Funktion der Zeit verfolgt (Schritt 4.4). Für jede Clustergrößenkategorie wurden >40 Trajektorien einzelner Cin8-GFP aus den Aufzeichnungen extrahiert (Abbildung 5B). Unter Verwendung der Koordinaten, die aus der Nachverfolgungsanalyse gewonnen werden, werden MD- und MSD-Analysen für jede Clustergrößenpopulation separat durchgeführt. Die Geschwindigkeiten werden von linearen Anpassungen an MD erhalten, wie in Abbildung 5C dargestellt. Es wurde festgestellt, dass sich einzelne Cin8-GFP-Moleküle in unidirektionaler, minus-endgerichteter Weise mit hoher Geschwindigkeit bewegen, während die Cin8-Cluster eine wesentlich geringere Geschwindigkeit mit einer höheren Neigung zur bidirektionalen Motilität aufweisen (Abbildung 5B,C).

Figure 5
Abbildung 5: Cin8-GFP-Motilität. (A) Kymographen, die die Motilität von Cin8-GFP-Motoren auf MTs darstellen. X- und Y-Achsen stellen MT-Gitter bzw. Zeit dar. Gelbe Pfeile markieren die schnelle Motilität einzelner Cin8-GFP-Partikel in Richtung der Minus-End-Richtung des MT, während blaue Pfeile die langsame Motilität von Cin8-Clustern in der Plus-End-Richtung des MT markieren. Die Polarität der MTs wird am unteren Rand jedes Kymographen (+/-) angezeigt. Horizontaler Balken: 4 μm, vertikaler Balken: 20 s. (B) Verdrängungsspuren von Einzelmotoren (links) und Clustern (rechts) von Cin8-GFP-Motoren. Die Wegspuren wurden unter Verwendung der Koordinaten aufgezeichnet, die nach der Verfolgung der einzelnen Cin8-GFP-Motoren erhalten wurden, wie in Schritt 4.4 erläutert. Negative und positive Verdrängungswerte zeigen eine Bewegung in Minus-End- bzw. Plus-End-Richtung des MT an. Beachten Sie, dass unter dem gleichen Assay die Motilität von Cin8-Clustern im Vergleich zu den einzelnen Molekülen von Cin8 langsamer und bidirektional ist. (C) Plots der mittleren Verschiebung (MD) ± REM, von einzelnen Molekülen (links) und Clustern (rechts) von Cin8-Motoren als Funktion des Zeitintervalls. Schwarze Linien stellen lineare Anpassungen des Diagramms dar (MD = v xt + c, wobei v die mittlere Geschwindigkeit, t das Zeitintervall und c den Schnittpunkt darstellt). Aus der Armatur geht hervor, dass die mittlere Geschwindigkeit für einzelne Motoren und Cluster von Cin8 -265 ± 20 nm/s bzw. -48 ± 5 nm/s beträgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für den Einzelmolekül-Motilitätsassay mit dem bidirektionalen Kinesin-5 Cin8 und die Motilitätsanalyse vorgestellt. Das Cin818 in voller Länge einschließlich des nativen nuklearen Lokalisierungssignals (NLS) am C-Terminal wurde vom nativen Wirt S. cerevisiae gereinigt. Da das Cin8 ein Kernmotorprotein ist, erweist sich das Mahlen der S. cerevisiae-Zellen unter flüssigem Stickstoff als die effizienteste Methode für die Zelllyse. Nach der Lyse wird durch Kombination von Metallaffinitäts- und Größenausschlusschromatographie hochreines Cin8 erhalten, das für die Einzelmolekül-Motilitätsassays wichtig ist. Es wurde bereits berichtet, dass es Unterschiede zwischen den beweglichen Eigenschaften von Cin8 in Rohextrakten und gereinigten Probengibt 8. Darüber hinaus wurde auch berichtet, dass das MT-Crowding mit motorischen und nicht-motorischen Proteinen die Richtungsabhängigkeit von bidirektionalem Kinesin-5 Cut722 beeinflusst. Daher ist eine hohe Reinheit des Motors für eine zuverlässige Motilitätsanalyse und Rückschlüsse auf das Verhalten von Wildtyp- und Mutantenmotoren erforderlich. Die hier beschriebenen Techniken können leicht angepasst werden, um andere Kernproteine mit entsprechenden Pufferanpassungen aus der Hefe zu reinigen.

Hier wird ein hochrobuster und empfindlicher Einzelmolekül-Motilitätsassay mit GFP-getaggtem Cin8 beschrieben. Der Erfolg dieses Assays hängt stark von der richtigen MT-Polymerisation und Immobilisierung an der Oberfläche ab. Die starke Avidin-Biotin-Wechselwirkung wird genutzt, um die MTs an der hydrophoben Glasoberfläche zu immobilisieren, die die MTs irreversibel anbringt. Auf diesen immobilisierten MTs mit GFP mit Cin8 kann die Cin8-Motilität zuverlässig verfolgt werden11,12,19.

Es wird berichtet, dass Cin8 Cluster bildet, die mehr als einen tetrameren Motor10,12 enthalten, wobei sich die Motilität dieser Cluster von der einzelner Cin8-Moleküle unterscheidet. Um die Cin8-Motilität als Funktion ihrer Größe genau zu charakterisieren, wurde eine auf Fluoreszenzintensität basierende Methode entwickelt, um die Clustergröße jedes Cin8-Partikels12 zu identifizieren. Basierend auf dieser Größenkategorisierung wird die Motilität in jeder Größenkategorie separat analysiert. Im Anschluss an diese größenbasierte Analyse werden aufschlussreiche Details bereitgestellt, die verwendet werden können, um das unterschiedliche Verhalten von Oligomeren desselben Moleküls11,12,19 zu verstehen. Das hier beschriebene Verfahren zur Bestimmung der Clustergröße kann angewendet werden, um die Größe einer Vielzahl von fluoreszierend markierten Molekülen zu bestimmen. Bei der Durchführung der fluoreszenzbasierten Größenbestimmung sollte man darauf achten, die Clustergröße von Cin8-GFP-Partikeln im ersten Erscheinungsbild zu bestimmen, um die Auswirkungen des Bleichens zu vermeiden, da die großen Cluster nach dem Photobleichen als kleinere auftreten könnten.

Die Motilitätscharakterisierung wird durch die MD- und/oder MSD-Analysen durchgeführt. Wenn es von Interesse ist, nur die Motorgeschwindigkeit zu bestimmen, ist die MD-Analyse ausreichend. Wenn jedoch die motorische Motilität sowohl aktive als auch passive Komponenten enthält und auch die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten erforderlich ist, sollte die MSD-Analyse20,23,24,25 durchgeführt werden. Sowohl bei MD- als auch bei MSD-Analysen müssen die Koordinaten des Motors für jeden Zeitpunkt ermittelt werden. Für ein effizientes Tracking ist es wichtig, die Motorkonzentration optimal zu halten. Die MTs sollten nicht zu voll mit Motoren sein; idealerweise sollten 3-4 Cin8-GFP-Motoren/Partikel gleichzeitig auf einer MT von ~10 μm vorhanden sein. Automatisierte Tools wie das Plugin "KymoButler" oder "TrackMate" in ImageJ-Fiji können auch verwendet werden, um die beweglichen Motoren26,27 zu verfolgen. Diese automatisierten Tools sparen Zeit und Arbeit, haben aber einige Einschränkungen. Zum Beispiel, wenn die Motilität einiger Partikel sehr langsam ist, können diese Werkzeuge sie als nicht bewegliche Partikel lesen. Darüber hinaus haben diese Werkzeuge Grenzen bei der Erkennung von Molekülen mit geringer Intensität. Daher können sie eine hochintensive Verzerrung aufweisen. Auf der anderen Seite ist die manuelle Nachverfolgung (obwohl zeitaufwendig) weniger empfindlich gegenüber Tracking-Fehlern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll, ausgehend von der Reinigung von Cin8, das in S. cerevisiae überexprimiert wird, den Einzelmolekül-Motilitätsassay und die anschließende Motilitätsanalyse dieses bidirektionalen Kinesin-5 umfassend erklärt. Dieses Protokoll kann leicht befolgt werden, um die Motilität von Motorproteinen wie Cin8 zu reinigen und zu charakterisieren. Darüber hinaus können die verschiedenen Teile des Protokolls angepasst werden, um Proteine aus Hefe zu reinigen oder Einzelmolekül-Motilitätsassays für verschiedene Motorproteine und deren Motilitätscharakterisierung zu entwickeln.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde zum Teil durch das Stipendium der Israel Science Foundation (ISF-386/18) und das Stipendium der Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008) unterstützt, das an L.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

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References

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Tags

Biochemie Ausgabe 180 Kinesin Cin8 Einzelmolekülmotilität Mikrotubuli bidirektionale Motilität

Erratum

Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus <em>S. cerevisiae-Zellen</em>
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Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

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