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Biochemistry

एकल अणुओं की गतिशीलता और द्वि-दिशात्मक किनेसिन -5 Cin8 के समूहों को एस सेरेविसिया कोशिकाओं से शुद्ध किया गया

Published: February 2, 2022 doi: 10.3791/63425
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

ERRATUM NOTICE

Summary

द्वि-दिशात्मक माइटोटिक किनेसिन -5 Cin8 उन समूहों में जमा होता है जो उनकी गतिशीलता के दौरान विभाजित और विलय करते हैं। समूहों में संचय भी Cin8 के वेग और दिशात्मकता को बदलता है। यहां, शुद्ध Cin8-GFP के साथ गतिशीलता assays के लिए एक प्रोटोकॉल और एकल अणुओं और Cin8 के समूहों के गतिशील गुणों के विश्लेषण का वर्णन किया गया है।

Abstract

माइटोटिक द्विध्रुवी किनेसिन -5 मोटर्स स्पिंडल गतिशीलता में आवश्यक कार्य करते हैं। ये मोटर्स उत्प्रेरक मोटर डोमेन के दो जोड़े के साथ एक होमो-टेट्रामेरिक संरचना प्रदर्शित करते हैं, जो सक्रिय परिसर के विपरीत छोर पर स्थित है। यह अद्वितीय वास्तुकला काइनसिन -5 मोटर्स को एंटीपैरेलल स्पिंडल माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी) के अलावा क्रॉसलिंक और स्लाइड करने में सक्षम बनाती है, इस प्रकार बाहरी रूप से निर्देशित बल प्रदान करती है जो स्पिंडल ध्रुवों को अलग करती है। पहले, किनेसिन -5 मोटर्स को विशेष रूप से प्लस-एंड निर्देशित माना जाता था। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कई फंगल किनेसिन -5 मोटर्स एकल-अणु स्तर पर निर्देशित माइनस-एंड हैं और विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में दिशात्मकता को स्विच कर सकते हैं। Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 इस तरह के द्वि-दिशात्मक मोटर प्रोटीन का एक उदाहरण है: उच्च आयनिक ताकत की स्थिति में Cin8 के एकल अणु एमटी की माइनस-एंड दिशा में चलते हैं। यह भी दिखाया गया था कि Cin8 मुख्य रूप से एमटी के माइनस-एंड पर गतिशील क्लस्टर बनाता है, और इस तरह के क्लस्टरिंग Cin8 को दिशात्मकता को स्विच करने और धीमी गति से, प्लस-एंड निर्देशित गतिशीलता से गुजरने की अनुमति देता है। यह लेख GFP-टैग किए गए kinesin-5 Cin8 के साथ काम करने के सभी चरणों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, एस cerevisiae कोशिकाओं में प्रोटीन overexpression से और विट्रो एकल-अणु गतिशीलता परख में इसकी शुद्धि से। यहां वर्णित एक नई विकसित विधि एकल अणुओं और Cin8 के समूहों के बीच अंतर करने में मदद करती है, जो उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर है। यह विधि एकल अणुओं और Cin8 के समूहों की गतिशीलता के अलग-अलग विश्लेषण को सक्षम बनाती है, इस प्रकार इसके क्लस्टर आकार पर Cin8 गतिशीलता की निर्भरता का लक्षण वर्णन प्रदान करती है।

Introduction

यूकेरियोटिक कोशिकाओं के भीतर बड़ी संख्या में गतिशीलता की घटनाओं को आणविक मोटर प्रोटीन के कार्य द्वारा मध्यस्थता की जाती है। ये मोटर साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स, एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं (एमटी) के साथ चलती हैं, और एटीपी हाइड्रोलिसिस की रासायनिक ऊर्जा को कोशिकाओं के भीतर जैविक गतिशीलता को चलाने के लिए आवश्यक गतिज और यांत्रिक बलों में परिवर्तित करती हैं। एमटी-आधारित एस cerevisiae Cin8 एक द्विध्रुवी, homotetrameric kinesin-5 मोटर प्रोटीन है जो क्रॉसलिंक करता है और स्पिंडल एमटी को1 के अलावा स्लाइड करता है। Cin8 माइटोसिस के दौरान आवश्यक कार्य करता है, स्पिंडल असेंबली 2,3,4 में और एनाफेज 5,6,7 के दौरान स्पिंडल बढ़ाव। पहले, यह प्रदर्शित किया गया था कि Cin8 एक द्वि-दिशात्मक मोटर है, जो विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में दिशात्मकता को स्विच करता है। उदाहरण के लिए, उच्च आयनिक शक्ति की स्थिति के तहत, एकल Cin8 मोटर्स एमटी के माइनस-एंड की ओर बढ़ते हैं, जबकि क्लस्टर में, मल्टी-मोटर एमटी ग्लाइडिंग एसेस में, और एंटीपैरेलल एमटी के बीच, Cin8 मोटर्स मुख्य रूप से एमटी 8,9,10,11,12 के प्लस-एंड्स की ओर बढ़ते हैं . ये निष्कर्ष कई कारणों से अत्यधिक अप्रत्याशित थे। सबसे पहले, Cin8 अमीनो-टर्मिनस पर अपने उत्प्रेरक मोटर डोमेन को वहन करता है और इस तरह के मोटर्स को पहले विशेष रूप से प्लस-एंड निर्देशित माना जाता था, जबकि Cin8 को एकल-अणु स्तर पर निर्देशित माइनस-एंड दिखाया गया था। दूसरा, काइनसिन मोटर्स को यूनिडायरेक्शनल माना जाता था, या तो माइनस-एंड या प्लस-एंड निर्देशित, जबकि सिन 8 को प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर द्वि-दिशात्मक दिखाया गया था। अंत में, माइटोटिक स्पिंडल पर एमटी अभिविन्यास के कारण, स्पिंडल असेंबली और एनाफेज बी के दौरान स्पिंडल ध्रुवों के अलगाव में किनेसिन -5 मोटर्स की शास्त्रीय भूमिका को केवल एमटी पर उनके प्लस-एंड निर्देशित गतिशीलता द्वारा समझाया जा सकता है, वे 1,13 को क्रॉसलिंक करते हैं। Cin8 की द्वि-दिशात्मकता पर पहली रिपोर्ट के बाद, कुछ अन्य किनेसिन मोटर्स को द्वि-दिशात्मक14,15,16 होने का प्रदर्शन किया गया था, यह दर्शाता है कि किनेसिन मोटर्स की द्वि-दिशात्मक गतिशीलता पहले की तुलना में अधिक आम हो सकती है।

यह पहले बताया गया है कि कोशिकाओं में, Cin8 भी एक द्वि-दिशात्मक तरीके से8 में चलता है, इस धारणा का समर्थन करता है कि कुछ किनेसिन -5 मोटर्स की द्वि-दिशात्मक गतिशीलता उनके इंट्रासेल्युलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, चूंकि तीन किनेसिन -5 मोटर्स जिन्हें द्वि-दिशात्मक होने की सूचना दी गई थी, फंगल कोशिकाओं से हैं, इसलिए किनेसिन -5 मोटर्स की द्वि-दिशात्मकता के लिए एक संभावित भूमिका हाल ही मेंऐसी कोशिकाओं में प्रस्तावित की गई है। इस मॉडल के अनुसार, फंगल कोशिकाओं के बंद माइटोसिस में, जहां परमाणु लिफाफा माइटोसिस के दौरान टूटता नहीं है, किनेसिन -5 मोटर्स प्रारंभिक बल प्रदान करते हैं जो स्पिंडल असेंबली से पहले स्पिंडल ध्रुवों को अलग करता है। इस कार्य को करने के लिए, स्पिंडल पोल पृथक्करण से पहले, किनेसिन -5 मोटर्स स्पिंडल ध्रुवों के पास स्थानीयकरण करते हैं, एकल परमाणु एमटी पर उनके माइनस-एंड निर्देशित गतिशीलता द्वारा। एक बार इस स्थिति में, kinesin-5 मोटर्स क्लस्टर, स्विच दिशात्मकता, कब्जा, और पड़ोसी स्पिंडल ध्रुवों से क्रॉस-लिंक एमटी। इसके बाद, Kinesin-5 मोटर्स उन एमटी पर प्लस-एंड निर्देशित गतिशीलता द्वारा ध्रुवों के प्रारंभिक पृथक्करण को प्रदान करते हैं जो वे क्रॉसलिंक करते हैं। इस मॉडल के द्वारा, एकल एमटी पर माइनस-एंड निर्देशित गतिशीलता और एंटीपैरेलल स्लाइडिंग के दौरान क्रॉस-लिंक्ड एमटी पर प्लस-एंड निर्देशित गतिशीलता दोनों को फंगल किनेसिन -5 मोटर्स के लिए स्पिंडल असेंबली1,13 में अपनी भूमिका निभाने के लिए आवश्यक है।

वर्णित विधि का समग्र लक्ष्य उच्च शुद्धता कवक जीएफपी-टैग किए गए किनेसिन -5 Cin8 प्राप्त करना है और एकल-अणु गतिशीलता assays (चित्रा 1) का प्रदर्शन करना है, जबकि अलग से एकल अणुओं और Cin8 के समूहों की गतिशीलता का विश्लेषण करना है। एकल अणुओं और समूहों के बीच अलगाव महत्वपूर्ण है क्योंकि Cin8 की दिशात्मकता को प्रभावित करने के लिए प्रदर्शित किए गए कारकों में से एक एमटी10,12 पर क्लस्टर में इसका संचय है। वैकल्पिक गतिशीलता assays, जैसे कि एमटी सतह ग्लाइडिंग और एमटी स्लाइडिंग assays एकल मोटर प्रोटीन17,18 की गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। मजबूत एकल अणु गतिशीलता परख और विश्लेषण के तरीकों यहाँ वर्णित सफलतापूर्वक kinesin-5 मोटर्स, Cin8 और Kip1 10,11,12,14,19,20 के विभिन्न पहलुओं की विशेषता के लिए लागू किया गया है.

यहाँ, एक विस्तृत प्रोटोकॉल Cin8 overexpression और शुद्धिकरण, एमटी के polymerization, और एकल अणु गतिशीलता परख के लिए प्रस्तुत किया जाता है. इसके अलावा, एकल अणुओं और Cin8 के समूहों के बीच अंतर करने के लिए विश्लेषण, और माध्य विस्थापन (एमडी) और माध्य वर्ग विस्थापन (MSD) विश्लेषण द्वारा एकल मोटर और क्लस्टर वेग निर्धारित करने के लिए भी वर्णित हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य शोधकर्ताओं को प्रक्रियाओं के सभी चरणों की कल्पना करने और इस प्रकार के assays के समस्या निवारण में सहायता करने में मदद करना है।

Figure 1
चित्रा 1: एकल अणु गतिशीलता परख के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. बायोटिनिलेटेड फ्लोरोसेंट एमटी कांच की सतह से जुड़े होते हैं, जो एविडिन के साथ लेपित होते हैं जो सतह से जुड़े बायोटिनिलेटेड-बीएसए के साथ बातचीत करते हैं। हरा तीर उच्च आयनिक शक्ति की स्थिति के तहत एकल Cin8 अणुओं के आंदोलन की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है। +/- MT की ध्रुवीयता का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Protocol

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. बफ़र्स
    1. -Leu aa ड्रॉपआउट मिश्रण: Adenine, Uracil, Tryptophan, हिस्टिडीन, लाइसिन, और मेथिओनिन के प्रत्येक 2 ग्राम मिश्रण और कमरे के तापमान पर स्टोर।
    2. Raffinose (1 एल) के साथ खमीर चयनात्मक माध्यम: मिश्रण 6.7 खमीर नाइट्रोजन आधार के ग्राम (अमोनियम सल्फेट के साथ), 2 ग्राम -Leu aa ड्रॉपआउट मिश्रण, और 20 ग्राम raffinose डबल आसुत पानी में हिलाना (हीटिंग के बिना) पूरी तरह से भंग होने तक। एक 0.22 μm फिल्टर का उपयोग करते हुए, एक बाँझ बोतल में समाधान फ़िल्टर।
    3. Lysis बफर: ट्रिपल आसुत पानी (TDW) में 25 mL समाधान तैयार करें जिसमें 50 mM Tris, 30 mM पाइप, 500 mM KCl, 10% ग्लिसरॉल, 1.5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0.1 mM ATP, और 0.1% Triton X-100 शामिल हैं। 6 M HCl का उपयोग करके pH को 8 में समायोजित करें.
    4. क्षालन बफर: TDW में 50 mM Tris, 30 mM पाइप, 500 mM KCl, 350 mM imidazole, 10% ग्लिसरॉल, 1.5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0.1 mM ATP, और 0.1% Triton X-100 से मिलकर 10 mL समाधान तैयार करें। 6 M HCl का उपयोग करके pH को 7.2 में समायोजित करें.
    5. P12 बफर: TDW में एक समाधान के 10 mL तैयार करें जिसमें 12 mM पाइप, 1 mM EGTA, और 2 mM MgCl2 शामिल हैं। 10 M NaOH का उपयोग कर 6.9 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
    6. BRB80 बफर: अल्ट्राप्योर पानी में 80 mM पाइप, 1 mM EGTA, और 2 mM MgCl2 से मिलकर एक समाधान के 50 mL तैयार करें। 10 M NaOH का उपयोग कर 6.9 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
    7. जनरल ट्यूबुलिन बफर (जीटीबी): अल्ट्राप्योर पानी में 80 एमएम पाइप, 0.5 एमएम ईजीटीए और 2 एमएम एमजीसीएल2 से मिलकर एक समाधान का 50 एमएल तैयार करें। 10 M NaOH का उपयोग कर 6.9 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
    8. Tris-पाइप समाधान: TDW में 6.055 ग्राम Tris और 9.07 g पाइप्स को मिलाकर 1M Tris-0.6 M पाइप्स समाधान का 40 mL तैयार करें और 6 M HCl का उपयोग करके pH को 7.2 पर समायोजित करें। TDW के साथ अंतिम मात्रा को 50 mL पर लाएं।
      नोट: P12, BRB80, और Tris-पाइप्स बफ़र्स गतिशीलता परख के लिए स्टॉक समाधान की तैयारी के लिए उपयोग किया जाता है। इन बफरों को बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है, 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में एलीकोट किया जा सकता है, स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. गतिशीलता परख के लिए स्टॉक समाधान
    1. ट्यूबुलिन (10 मिलीग्राम एमएल -1): ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) सामान्य ट्यूबुलिन बफर (जीटीबी) के 100 μL में 1 मिलीग्राम लायोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन को भंग करें। स्नैप-फ्रीज 1 μL ऐलीकोट और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. बायोटिनिलेटेड ट्यूबुलिन (1 मिलीग्राम एमएल -1): ठंडे जीटीबी के 20 μL में lyophilized ट्यूबुलिन के 20 μg को भंग करें। स्नैप-फ्रीज 1 μL ऐलीकोट और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. Rhodamine लेबल ट्यूबुलिन (1 मिलीग्राम mL-1): ठंडे जीटीबी के 20 μL में lyophilized ट्यूबुलिन के 20 μg भंग. स्नैप-फ्रीज 0.5 μL ऐलीकोट और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP आपूर्तिकर्ता से 100 μL जलीय समाधान के रूप में प्राप्त किया जाता है और -80 °C पर संग्रहीत किया जाता है। बर्फ पर GMPCPP के साथ शीशी पिघला. 1 μL ऐलीकोट तैयार करें, स्नैप-फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. एटीपी: 0.5 M Tris बफर (pH 8) में 100 mM एटीपी के 500 μL समाधान तैयार करें। स्नैप-फ्रीज 2 μL ऐलीकोट और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. MgCl2: P12 बफर में 200 mM MgCl2 का 1 mL समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 μL ऐलीकोट स्टोर करें।
    7. Casein: BRB 80 बफर में 5 मिलीग्राम mL-1 casein का एक 1 mL समाधान तैयार करें। स्नैप-फ्रीज 10 μL ऐलीकोट और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. डी-ग्लूकोज: P12 बफर में 1 M D-ग्लूकोज का 1 mL समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 μL ऐलीकोट स्टोर करें।
    9. ग्लूकोज ऑक्सीडेज: P12 बफर में 10 मिलीग्राम एमएल -1 ग्लूकोज ऑक्सीडेज का 1 एमएल समाधान तैयार करें। स्नैप-फ्रीज 2 μL ऐलीकोट और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    10. Catalase: P12 बफर में 0.8 मिलीग्राम mL-1 catalase का एक 1 mL समाधान तैयार करें। स्नैप-फ्रीज 2 μL ऐलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    11. Dithiothreitol (DTT): एक धुएं हुड में P12 बफर में 1 M DTT का 1 mL समाधान तैयार करें। स्नैप-फ्रीज 10 μL ऐलीकोट और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    12. क्रिएटिन फॉस्फेट: P12 बफर में 1 M क्रिएटिन फॉस्फेट का 1 mL समाधान तैयार करें। स्नैप-फ्रीज 2 μL ऐलीकोट और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    13. क्रिएटिन फॉस्फोकिनेज: 0.25 एम ग्लाइसिलग्लाइसिन, पीएच 7.4 में 5 मिलीग्राम एमएल -1 क्रिएटिन फॉस्फोकिनेज का 1 एमएल समाधान तैयार करें। स्नैप-फ्रीज 2 μL ऐलीकोट और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    14. ईजीटीए: अल्ट्राप्योर पानी में 100 एमएम ईजीटीए समाधान तैयार करें और इसे कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    15. KCl: अल्ट्राप्योर पानी में एक 1 M KCl समाधान तैयार करें और इसे कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. गतिशीलता बफर और प्रतिक्रिया मिश्रण
    1. 145 mM KCl, 2x स्टॉक के साथ गतिशीलता बफर (MB): पूर्व-निर्मित Tris-पाइप समाधान के 100 μL, 100 mM EGTA के 20 μL, KCl के 290 μL, और TDW के 590 μL को मिलाकर गतिशीलता बफर के 2x स्टॉक का 1 mL तैयार करें। बफर को बर्फ पर रखें।
    2. गतिशीलता प्रतिक्रिया मिश्रण: तालिका 1 के अनुसार गतिशीलता प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें और इसे बर्फ पर संग्रहीत करें।
आयतन भंडार अभिकर्मक नाम
50 μL 2X MB (चरण 1.3.1 से)
40 μL - TDW
1 μL 100 mM एटीपी
1 μL 200 mM MgCl2
2 μL 5 mg/mL कैसिइन
1 μL 1 मीटर ग्लूकोज़
1 μL 1 मीटर DTT
1 μL 10 mg/mL ग्लूकोज ऑक्सीडेज
1 μL 8 mg/mL कैटालेज
1 μL 1 मीटर फॉस्फोक्रिएटिन
1 μL 5 mg/mL क्रिएटिन फॉस्फोकिनेज
100 μL कुल

तालिका 1.

2. Cin8 overexpression और S. cerevisiae कोशिकाओं से शुद्धिकरण

  1. Cin8-GFP-6His के overexpression के लिए प्लास्मिड युक्त S. cerevisiae कोशिकाओं को घातीय विकास चरण (OD600 = 0.6-0.8 ) खमीर चयनात्मक माध्यम के 1 L में 2% raffinose (चरण 1.1.2 देखें) के साथ पूरक 28 °C12 पर।
  2. Cin8-GFP-6उसकी overexpression को प्रेरित करें 2% गैलेक्टोज के अलावा। 600 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा खमीर संस्कृति वृद्धि की निगरानी।
  3. गैलेक्टोज के अलावा पांच घंटे बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं की कटाई, लाइसिस बफर में कोशिकाओं को निलंबित करें और तरल एन2 में फ्रीज करें।
    नोट: जमे हुए कोशिकाओं को आगे के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या तुरंत तरल एन2 में जमीन पर रखा जा सकता है।
  4. ठंडा मोर्टार और पेस्टल का उपयोग करके तरल एन2 में जमे हुए कोशिकाओं को पीसें। अर्क जमे हुए रखने के लिए पीसने के दौरान तरल एन2 जोड़ें। इसे आमतौर पर तरल एन2 जोड़ने के 4-5 गुना की आवश्यकता होती है।
  5. चरण-विपरीत या डीआईसी माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन द्वारा सेल लाइसिस की निगरानी करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 21,000 x g पर जमीन की कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज को पिघलाएं। Ni-NTA के 2 mL से भरे गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ पर supernatant लोड करें और lysis बफर के साथ पूर्व-संतुलित। supernatant स्तंभ के माध्यम से बाहर प्रवाह करते हैं.
  7. lysis बफर के पांच स्तंभ वॉल्यूम के साथ स्तंभ को धोएं, और फिर 25 mM imidazole के साथ पूरक lysis बफर के पांच कॉलम वॉल्यूम के साथ।
  8. Elute Cin8-GFP-6His क्षालन बफर के साथ (चरण 1.1.4 देखें)।
  9. SDS-PAGE फ्रैक्शनेशन द्वारा eluted नमूनों का विश्लेषण करें, इसके बाद Coomassie नीले रंग के दाग और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण α-GFP एंटीबॉडी19 के साथ जांच की।
  10. Cin8-GFP-6His (चरण 2.8 और 2.9) वाले अंशों को पूल करें। इसके अलावा, उन्हें आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा प्रवाह दर 0.5 एमएल मिनट -1 और 1.5 एमपीए की कॉलम दबाव सीमा पर शुद्ध करें, 280 एनएम पर अवशोषण की एक साथ निगरानी और 488 एनएम (चित्रा 2 ए) पर उत्तेजना के साथ जीएफपी फ्लोरेसेंस उत्सर्जन के साथ।
  11. Cin8-GFP tetramer के लिए इसी अंश ों को इकट्ठा करें और SDS-PAGE और पश्चिमी blotting द्वारा उनका विश्लेषण करें (चरण 2.9 देखें) (चित्रा 2B)।
  12. इस तरह के ब्रैडफोर्ड परख, बीसीए परख आदि के रूप में spectrophotometry या जैव रासायनिक assays का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाएं
  13. चयनित अंशों को एलीकोट करें, तरल एन 2 में स्नैप-फ्रीजकरें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने तक स्टोर करें। इन शुद्ध प्रोटीन नमूनों का उपयोग 6 महीने के लिए किया जा सकता है।
    नोट: Cin8-GFP overexpressed और एक प्रोटीज-कमी वाले S. cerevisiae तनाव से शुद्ध किया जाता है जिसमें Cin8-GFP-6His के लिए 2 μm प्लास्मिड होता है, गैलेक्टोज इंड्यूसिबल प्रमोटर, LGY 4093 से ओवरएक्सप्रेशन: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7(2μ, LEU2) खमीर तनाव और प्लास्मिड अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

Figure 2
चित्रा 2: Cin8-GFP का शुद्धिकरण। (ए) नी-एनटीए के आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राम ने Cin8-GFP को शुद्ध किया, जिसमें ~ 510 एनएम पर 488 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन के माध्यम से निरंतर जीएफपी प्रतिदीप्ति का पता लगाया गया। Cin8-GFP tetramer SEC स्तंभ (एक तीर के साथ चिह्नित) से ~ 10 mL पर elutes। (B) Coomassie-दाग SDS-PAGE जेल (ऊपर) और α-GFP पश्चिमी धब्बा (नीचे) Cin8-GFP अंशों के SEC से eluted. लेन में नमूने निम्नानुसार हैं: M - आणविक वजन मार्कर, Ni2+- Ni-NTA शुद्ध Cin8-GFP नमूना है कि SEC स्तंभ में लोड किया गया है, GF अंश: पैनल A में चिह्नित के रूप में Cin8-GFP SEC क्षालन के अनुरूप अंश। दाईं ओर का तीर Cin8-GFP मोनोमर के आकार को चिह्नित करता है (SDS-PAGE पर अपेक्षित)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. शुद्ध Cin8 के साथ एकल अणु गतिशीलता परख

  1. बायोटिन और रोडामाइन लेबल एमटी का पोलीमराइजेशन, जीएमपीसीपीपी के साथ स्थिर।
    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में निम्नलिखित घटकों को मिलाकर एमटी पोलीमराइजेशन शुरू करें: 10 मिलीग्राम / एमएल ट्यूबुलिन प्रोटीन का 1 μL, 1 मिलीग्राम / एमएल बायोटिनिलेटेड ट्यूबुलिन का 1 μL, 1 मिलीग्राम / एमएल रोडामाइन-लेबल ट्यूबुलिन का 0.5 μL, 10 mM GMPCPP का 1 μL, और सामान्य ट्यूबुलिन बफर (GTB) का 6.5 μL। मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. एमटी पोलीमराइजेशन के बाद, गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) जीटीबी के 80 μL जोड़ें, 20 मिनट के लिए 16,500 x g पर सावधानीपूर्वक और सेंट्रीफ्यूज मिलाएं।
    3. supernatant त्यागें और फिर से गोली को निलंबित ध्यान से ऊपर और गर्म GTB के 50 μL के साथ pipetting द्वारा नीचे. निलंबन को 28 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. 647 एनएम रोडामाइन चैनल (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ एमटी की जांच करें।
      नोट: बायोटिनिलेटेड फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एमटी प्राप्त करने के लिए, पोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया में बिना लेबल वाले ट्यूबुलिन होते हैं, साथ ही साथ बायोटिनिलेटेड और फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले ट्यूबुलिन भी होते हैं। इस प्रोटोकॉल में, रोडामाइन-लेबल वाले ट्यूबुलिन का उपयोग किया जाता है लेकिन अन्य फ्लोरोसेंट संयुग्मों का भी उपयोग किया जा सकता है।
  2. प्रवाह कक्ष असेंबली
    1. टेप स्ट्रिप्स के बीच तीन 'लेन' बनाने के लिए एक उन्नत चिपकने वाला ग्लास स्लाइड (लंबे किनारे और ~ 3-4 मिमी के अलावा) पर डबल-साइडेड टेप (~ 4 सेमी x ~ 3 मिमी) के चार स्ट्रिप्स रखकर एक प्रवाह कक्ष को इकट्ठा करें। टेप स्ट्रिप्स से सुरक्षात्मक कागज निकालें और मात्रा में ~10 μL के तीन प्रवाह कक्षों बनाने के लिए टेप स्ट्रिप्स पर एक silanized coverslip 10 जगह।
  3. एविडिन-लेपित सतह के लिए एमटी स्थिरीकरण (चित्रा 1)
    1. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्रवाह कक्ष में 1 मिलीग्राम / एमएल बायोटिनिलेटेड-गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बी-बीएसए, जीटीबी में भंग) के 15 μL के साथ परफ्यूजिंग करके सिलेनाइज्ड कवरस्लिप को कोट करें। 5 मिनट के बाद, जीटीबी के 80 μL के साथ कक्ष को धोलें।
    2. बाद में, चरण 3.3.1 के रूप में, प्रवाह कक्ष में डालें 15 μL 1 mg / mL Avidin (GTB में भंग) जो b-BSA को बांधता है। 5 मिनट के बाद, जीटीबी के 80 μL के साथ कक्ष को धोलें।
    3. 1% पोलोक्सेमर के 20 μL का उपयोग करके silanized coverslip सतह passivate. 3 मिनट के बाद, जीटीबी के 80 μL के साथ धो लें।
    4. बायोटिनिलेटेड एमटी (चरण 3.1) को बी-बीएसए-एविडिन लेपित कवरस्लिप में आमतौर पर जीटीबी में 1: 20 तक पतला एमटी के 20 μL सम्मिलित करके संलग्न करें। स्लाइड्स को एक उलटी स्थिति में इनक्यूबेट करें, यानी, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक अंधेरे आर्द्रता कक्ष (जैसे, गीले टिशू पेपर युक्त एक पेट्री डिश) में नीचे की ओर कवरस्लिप का सामना करना पड़ रहा है। फिर, जीटीबी के 200 μL के साथ धोएं।
    5. प्रवाह कक्ष में गतिशीलता प्रतिक्रिया मिश्रण के 30 μL लागू करें (चरण 1.3.2 देखें)।
    6. गतिशीलता प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 μL में Cin8-GFP मोटर्स (चरण 2.13) को पतला करें ( तालिका 1 देखें) (आमतौर पर 5-10 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए)। उन्हें प्रवाह कक्ष में लागू करें और तुरंत एमटी के साथ मोटर्स के आंदोलन की छवि बनाएं।
  4. मोटर गतिशीलता इमेजिंग
    नोट: एमटी बाइंडिंग और मोटर्स की गतिशीलता की निगरानी एक पारा आर्क लैंप, एक 100x / 1.4 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य, और दो प्रतिदीप्ति बैंडपास फिल्टर सेट से सुसज्जित एक एपिफ्लोरेसेंस उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की गई थी, एक 647 एनएम (रोडामाइन के लिए) की तरंग दैर्ध्य के साथ और दूसरा 488 एनएम (जीएफपी के लिए) की तरंग दैर्ध्य के साथ।
    1. माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप चरण पर प्रवाह कक्ष को उद्देश्य का सामना करने वाले कवरस्लिप के साथ रखें।
    2. कवरस्लिप सतह से जुड़े एमटी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए रोडामाइन चैनल को चालू करें और माइक्रो-मैनेजर इमेजजे-फिजी सॉफ़्टवेयर21 का उपयोग करके 20 एमएस एक्सपोजर के साथ छवि प्राप्त करें।
    3. GFP चैनल को चालू करें और Cin8-GFP गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए 1 s अंतराल और 800 ms एक्सपोज़र के साथ 90 टाइम-लैप्स छवियों का अधिग्रहण करें।

Figure 3
चित्रा 3: MTs और MT बाउंड Cin8-GFP. (A) MTs के लिए दो फ़ील्ड (बाएं और दाएँ) से छवियाँ चरण 3.1 में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए polymerized और चरण 3.4 में वर्णित के रूप में 100x उद्देश्य के साथ छवि। (बी) Cin8-GFP (निचले पैनलों, तीर के साथ चिह्नित) के लिए दो क्षेत्रों (बाएं और दाएं) से छवियां ऊपरी पैनलों में दिखाए गए एमटी से जुड़ी हुई हैं। स्केल बार: 4 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

4. गतिशीलता विश्लेषण

नोट:: सभी छवि विश्लेषण निष्पादित करें और ImageJ-फिजी सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर kymographs उत्पन्न करें।

  1. Kymograph पीढ़ी
    1. समय अंतराल चलचित्र और संबंधित MT फ़ील्ड छवि खोलें। निम्न विकल्प चुनकर इन दो विंडो को सिंक्रनाइज़ करें: Windows सिंक्रनाइज़ > > उपकरणका विश्लेषण करें.
    2. खंडित रेखा विकल्प का उपयोग कर एक MT हाइलाइट करें और एक kymograph प्राप्त करने के लिए > Multi Kymograph टैब का विश्लेषण करें।
  2. Cin8-GFP के क्लस्टर आकार का निर्धारण (यानी, एक क्लस्टर में Cin8 अणुओं की संख्या)
    1. पृष्ठभूमि घटाव और प्रक्रिया > घटाएँ पृष्ठभूमि विकल्प का उपयोग करके असमान रोशनी के लिए सुधार निष्पादित करें। रोलिंग बॉल रेडियस को 100 पिक्सेल पर सेट करें और स्लाइडिंग पैराबोलॉइड विकल्प की जांच करें।
    2. निम्नलिखित विकल्प चुनकर इमेजजे-फिजी सॉफ़्टवेयर के TrackMate प्लगइन का उपयोग करके 4 पिक्सेल त्रिज्या के एक सर्कल के भीतर समय के एक समारोह के रूप में एक विशिष्ट गैर-गतिशील Cin8-GFP मोटर (चित्रा 3B) की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता का पालन करें: प्लगइन्स > ट्रैकिंग > TrackMate > LoG डिटेक्टर > सरल लैप ट्रैकर।
    3. विभिन्न Cin8-GFP मोटर्स के लिए चरण 4.2.2 दोहराएँ। समय के एक समारोह के रूप में विभिन्न Cin8-GFP मोटर्स की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लॉट.
      नोट:: क्लस्टर आकार को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक रणनीति-यानी, क्लस्टर में Cin8 अणुओं की संख्या-Cin8 क्लस्टरिंग से संबंधित गतिशीलता के विश्लेषण के लिए एक आधार स्थापित करता है। Cin8 से जुड़े GFP के photobleaching को Cin8 समूहों की कुल तीव्रता में एकल GFP अणुओं के योगदान को निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जाता है। उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता ~ 50 मनमाने ढंग से इकाइयों (a.u.) के चरणों में कमी आती है, हर एक कदम के साथ शायद एक GFP अणु (चित्रा 4A) के photobleaching का प्रतिनिधित्व करते हैं। चूंकि Cin8 एक होमो-टेट्रामेरिक मोटर प्रोटीन है, इसलिए इसमें चार GFP अणु होते हैं। इस प्रकार, 200 a.u. ≤ तीव्रता वाले सभी Cin8 मोटर्स एकल टेट्रामेरिक Cin8 अणुहोने की संभावना है। इस विधि के बाद, Cin8 मोटर प्रतिदीप्ति की तीव्रता श्रेणियों को एकल Cin8 अणुओं के लिए <200, 200-400, और >400, Cin8 अणुओं के जोड़े (Cin8 tetramer का डिमर), और Cin8 oligomers, क्रमशः12 के रूप में सौंपा गया है।
  3. Cin8-GFP मोटर्स के लिए तीव्रता वितरण विश्लेषण
    1. चरण 4.2.2 में वर्णित के रूप में ImageJ-फिजी में TrackMate प्लगइन का उपयोग कर समय-चूक अनुक्रम के पहले फ्रेम में सभी फ्लोरोसेंट Cin8-GFP मोटर्स की माध्य florescence तीव्रता को मापें।
    2. 20 a.u. के बिन आकार के साथ Cin8-GFP की माध्य तीव्रता का एक हिस्टोग्राम प्लॉट करें और हिस्टोग्राम के प्रमुख शिखर को गाऊसी वक्र (चित्रा 4 B) में फिट करें।
      नोट:: तीव्रता वितरण विश्लेषण Cin8-GFP मोटर्स के लिए क्लस्टर आकार निर्धारण photobleaching प्रयोगों से पूरक करता है। Cin8-GFP जनसंख्या चोटियों के लिए तीव्रता वितरण हिस्टोग्राम के लिए फिट गाऊसी वक्र ~ 125 a.u. पर चोटियों, जो या तो एक, दो, तीन, या चार फ्लोरोसेंट (गैर-ब्लीच) GFP अणुओं वाले एकल टेट्रामेरिक Cin8 अणुओं की औसत तीव्रता के अनुरूप है, प्रत्येक फ्लोरोसेंट GFP अणु ~ 50 a.u. योगदान के साथ। इस प्रकार, इस तीव्रता वितरण विधि का उपयोग करके, एक जीएफपी अणु के योगदान की भी गणना की जा सकती है, जिसका उपयोग Cin8-GFP अणुओं के क्लस्टर आकार को असाइन करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 4
चित्रा 4: Cin8-GFP ब्लीचिंग प्रोफ़ाइल और तीव्रता वितरण(A) चार अलग-अलग Cin8-GFP मोटर्स में GFP की Photobleaching. एकल photobleaching कदम, प्रत्येक की संभावना एक GFP के photobleaching का प्रतिनिधित्व करते हुए, ~ 50 a.u. (बी) की प्रतिदीप्ति तीव्रता में गिरावट के लिए नेतृत्व एक समय-चूक अनुक्रम (इनसेट) के पहले फ्रेम में Cin8-GFP मोटर्स की तीव्रता वितरण। गाऊसी चोटी (नीला) ~ 125 a.u पर केंद्रित एकल Cin8-GFP अणुओं का प्रतिनिधित्व करता है। यह चोटी एक, दो, तीन, या चार फ्लोरोसेंट जीएफपी अणुओं के साथ एकल Cin8 टेट्रामर्स की औसत तीव्रता को प्रदर्शित करती है, जिसमें प्रत्येक जीएफपी अणु कुल तीव्रता (यानी, (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125) में ~ 50 ए.यू. का योगदान देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एमटी पटरियों के साथ Cin8-GFP अणुओं की गतिशीलता को ट्रैक करना
    1. MT को आयत उपकरण के साथ हाइलाइट करके रिकॉर्ड किए गए फ़्रेम के समय-अंतराल अनुक्रम में विश्लेषण करने के लिए फसल करें, और फिर छवि > फसल का चयन करें।
    2. विश्लेषण के लिए एक फ्लोरोसेंट Cin8-GFP कण चुनें। बिंदु उपकरण और माप विकल्पों का उपयोग करके समय अंतराल अनुक्रम के प्रत्येक फ्रेम (समय बिंदु) में कण निर्देशांक रिकॉर्ड करें। समय-अंतराल अनुक्रम में अन्य फ्लोरोसेंट कणों के लिए निर्देशांक की समान रिकॉर्डिंग करें।
    3. क्लस्टर आकार को उनकी उपस्थिति के पहले फ्रेम में सभी जांच किए गए Cin8-GFP कणों को असाइन करें, जैसा कि चरण 4.2 में वर्णित है।
  2. माध्य विस्थापन (MD) और माध्य वर्ग विस्थापन (MSD) विश्लेषण
    1. चरण 4.4 में निर्धारित Cin8-GFP आंदोलनों के निर्देशांक से, दिए गए निर्देशांक के साथ दो बिंदुओं के बीच दूरी की गणना के लिए समीकरण का उपयोग करते हुए, प्रारंभिक निर्देशांक के संबंध में प्रत्येक समय बिंदु पर Cin8-GFP के विस्थापन की गणना करें:
      Equation 1
      जहां, dt, उस समय Cin8-GFP के विस्थापन हैं, xt और yt समय t पर संबंधित निर्देशांक हैं। x0 और y 0 t =0 पर Cin8-GFP के संबंधित निर्देशांक हैं।
    2. इन विस्थापन मानों से एक विशिष्ट Cin8-GFP कण के लिए सभी संभव समय अंतराल के लिए विस्थापन की गणना करें। सभी की जांच की Cin8-GFP कणों के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।
    3. सभी जांच किए गए Cin8-GFP कणों बनाम समय अंतराल के माध्य विस्थापन (MD) को प्लॉट करें और एक रैखिक फिट के अधीन, MD = v x t + c। इस फिट (v) की ढलान motile Cin8-GFP कणों के माध्य वेग का प्रतिनिधित्व करती है।
      नोट:: इस तरह से, प्रत्येक क्लस्टर आकार से संबंधित सभी Cin8-GFP अणुओं के औसत वेग अलग-अलग क्लस्टर आकारों की गतिशीलता की विशेषता अलग से गणना की जा सकती है। एमडी विश्लेषण के अलावा, माध्य वर्ग विस्थापन (MSD) विश्लेषण भी चरण 4.5.1 और 4.5.2 में परिकलित विस्थापन मानों squaring द्वारा किया जा सकता है। MSD मानों को समय अंतराल बनाम प्लॉट किया जाता है और बहुपद वक्र MSD = v 2 x t2 + 2D x t + c में फिट किया जाता है, जो अतिरिक्त पैरामीटर D देता है, जो Cin8-GFP आंदोलन का प्रसार गुणांक है। एमडी विश्लेषण को 8,10 एमटी चिह्नित ध्रुवीयता पर किया जाना चाहिए, जबकि एमएसडी विश्लेषण के लिए एमटी ध्रुवीयता का ज्ञान आवश्यक नहीं है।

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Representative Results

प्रयोग का उद्देश्य एकल MTs पर विभिन्न क्लस्टर आकारों के द्वि-दिशात्मक मोटर प्रोटीन Cin8 की गतिशीलता विशेषताओं की जांच करना है। Cin8-GFP की प्रतिनिधि गतिशीलता चित्र 5A में kymographs से भी स्पष्ट है, जहां समय के साथ मोटर की स्थानिक स्थिति दिखाई जाती है।

Cin8-GFP के गतिशील गुणों के विश्लेषण के लिए, सबसे पहले, क्लस्टर आकार (चरण 4.3) प्रत्येक MT-संलग्न motile Cin8-GFP कण को सौंपा जाता है, और फिर जांच किए गए Cin8 कणों की स्थिति को समय के एक फ़ंक्शन (चरण 4.4) के रूप में ट्रैक किया जाता है। प्रत्येक क्लस्टर आकार श्रेणी के लिए, व्यक्तिगत Cin8-GFP के >40 trajectories रिकॉर्डिंग (चित्रा 5B) से निकाले गए थे। ट्रैकिंग विश्लेषण से प्राप्त निर्देशांक का उपयोग करते हुए, एमडी और एमएसडी विश्लेषण प्रत्येक क्लस्टर आकार की आबादी के लिए अलग-अलग किया जाता है। वेग ों को एमडी के लिए रैखिक फिट से प्राप्त किया जाता है जैसा कि चित्र 5 सी में प्रस्तुत किया गया है। यह पाया गया कि एकल Cin8-GFP अणु उच्च वेग के साथ एक यूनिडायरेक्शनल, माइनस-एंड निर्देशित तरीके से चलते हैं, जबकि Cin8 क्लस्टर द्वि-दिशात्मक गतिशीलता (चित्रा 5B, C) के लिए एक उच्च प्रवृत्ति के साथ काफी कम वेग प्रदर्शित करते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: Cin8-GFP गतिशीलता. (A) MTs पर Cin8-GFP मोटर्स की गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करने वाले Kymographs. X- और Y-अक्ष क्रमशः MT जाली और समय का प्रतिनिधित्व करते हैं। पीले तीर एमटी की माइनस-एंड दिशा की ओर एकल Cin8-GFP कणों की तेज गतिशीलता को चिह्नित करते हैं, जबकि नीले तीर एमटी की प्लस-एंड दिशा में Cin8 समूहों की धीमी गतिशीलता को चिह्नित करते हैं। एमटी की ध्रुवीयता प्रत्येक काइमोग्राफ (+/-) के नीचे इंगित की जाती है। क्षैतिज पट्टी: 4 μm, ऊर्ध्वाधर पट्टी: 20 s. (B) एकल मोटर्स (बाएं) और Cin8-GFP मोटर्स के क्लस्टर (दाएं) के विस्थापन निशान। विस्थापन के निशान को व्यक्तिगत Cin8-GFP मोटर्स को ट्रैक करने के बाद प्राप्त निर्देशांक का उपयोग करके प्लॉट किया गया था जैसा कि चरण 4.4 में समझाया गया है। विस्थापन के नकारात्मक और धनात्मक मान क्रमशः एमटी के माइनस-एंड और प्लस-एंड दिशाओं में आंदोलन को इंगित करते हैं। ध्यान दें कि एक ही परख के तहत, Cin8 समूहों की गतिशीलता धीमी है और Cin8 के एकल अणुओं की तुलना में द्वि-दिशात्मक है। (C) समय अंतराल के एक समारोह के रूप में Cin8 मोटर्स के एकल अणुओं (बाएं) और क्लस्टर (दाएं) के SEM ± माध्य विस्थापन (एमडी) के भूखंड। काली रेखाएं प्लॉट के रैखिक फिट का प्रतिनिधित्व करती हैं (MD = v xt + c, जहां v माध्य वेग है, t समय अंतराल है और c अवरोधन का प्रतिनिधित्व करता है)। फिटिंग से, यह स्पष्ट है कि एकल मोटर्स और Cin8 के समूहों के लिए माध्य वेग क्रमशः -265 ± 20 nm / s और -48 ± 5 nm / s है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस काम में, द्वि-दिशात्मक kinesin-5 Cin8 और गतिशीलता विश्लेषण के साथ एकल-अणु गतिशीलता परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। सी-टर्मिनल पर देशी परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) सहित पूर्ण लंबाईCin8 18 मूल मेजबान एस cerevisiae से शुद्ध किया गया है। चूंकि Cin8 एक परमाणु मोटर प्रोटीन है, तरल नाइट्रोजन के तहत एस सेरेविसिया कोशिकाओं को पीसना सेल लाइसिस के लिए सबसे कुशल तरीका पाया जाता है। लाइसिस के बाद, धातु आत्मीयता और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के संयोजन से, अत्यधिक शुद्ध Cin8 प्राप्त किया जाता है, जो एकल-अणु गतिशीलता assays के लिए महत्वपूर्ण है। यह पहले बताया गया है कि कच्चे अर्क और शुद्ध नमूनों में Cin8 के गतिशील गुणों के बीच अंतरहैं। इसके अलावा, यह भी बताया गया है कि मोटर और गैर-मोटर प्रोटीन के साथ एमटी भीड़ द्वि-दिशात्मक किनेसिन -5 कट 722 की दिशात्मकता को प्रभावित करती है। इस प्रकार, विश्वसनीय गतिशीलता विश्लेषण और जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती मोटर व्यवहार के बारे में निष्कर्ष के लिए मोटर की उच्च शुद्धता की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित तकनीकों को आसानी से उचित बफर समायोजन के साथ खमीर से अन्य परमाणु प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

यहाँ वर्णित एक अत्यधिक मजबूत और संवेदनशील एकल अणु गतिशीलता जीएफपी के साथ परख टैग की गई Cin8 है. इस परख की सफलता उचित एमटी polymerization और सतह के लिए immobilization पर भारी निर्भर करता है. मजबूत एविडिन-बायोटिन इंटरैक्शन का उपयोग एमटी को हाइड्रोफोबिक ग्लास सतह पर स्थिर करने के लिए किया जाता है, जो अपरिवर्तनीय रूप से एमटी को जोड़ता है। GFP लेबल Cin8 का उपयोग कर इन immobilized MTs पर, Cin8 गतिशीलता मज़बूती से11,12,19 ट्रैक किया जा सकता है.

Cin8 को एक से अधिक टेट्रामेरिक मोटर10,12 वाले क्लस्टर बनाने की सूचना दी गई है, जिसमें इन समूहों की गतिशीलता एकल Cin8 अणुओं से अलग है। अपने आकार के एक समारोह के रूप में Cin8 गतिशीलता को सही ढंग से चिह्नित करने के लिए, प्रत्येक Cin8 कण12 के क्लस्टर आकार की पहचान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति तीव्रता-आधारित विधि विकसित की गई है। इस आकार वर्गीकरण के आधार पर, गतिशीलता का विश्लेषण प्रत्येक आकार श्रेणी में अलग-अलग किया जाता है। इस आकार-आधारित विश्लेषण के बाद, व्यावहारिक विवरण प्रदान किए जाते हैं, जिनका उपयोग एक ही अणु11,12,19 के ओलिगोमर्स के विभिन्न व्यवहार को समझने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित क्लस्टर आकार निर्धारण प्रक्रिया को विभिन्न प्रकार के फ्लोरोसेंटली लेबल अणुओं के आकार को निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति-आधारित आकार निर्धारण करते समय, ब्लीचिंग के प्रभाव से बचने के लिए उपस्थिति के पहले फ्रेम में Cin8-GFP कणों के क्लस्टर आकार को निर्धारित करने के लिए सावधान रहना चाहिए, क्योंकि बड़े क्लस्टर फोटोब्लीचिंग के बाद छोटे लोगों के रूप में दिखाई दे सकते हैं।

गतिशीलता लक्षण वर्णन एमडी और / या एमएसडी विश्लेषण द्वारा किया जाता है। यदि यह केवल मोटर वेग निर्धारित करने के लिए ब्याज का है, तो एमडी विश्लेषण पर्याप्त है। हालांकि, यदि मोटर गतिशीलता में सक्रिय और निष्क्रिय दोनों घटक होते हैं और प्रसार गुणांक का निर्धारण भी आवश्यक है, तो एमएसडी विश्लेषण 20,23,24,25 किया जाना चाहिए। एमडी और एमएसडी दोनों विश्लेषणों के लिए, हर समय बिंदु के लिए मोटर के निर्देशांक को निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। कुशल ट्रैकिंग के लिए, मोटर एकाग्रता को इष्टतम रखना महत्वपूर्ण है। एमटी मोटर्स के साथ बहुत भीड़ नहीं होनी चाहिए; आदर्श रूप से, ~ 10 μm के एमटी पर एक समय में 3-4 Cin8-GFP मोटर्स / कण होने चाहिए। इमेजजे-फिजी में "KymoButler" या "TrackMate" प्लगइन जैसे स्वचालित उपकरण ों का उपयोग मोटिल मोटर्स26,27 को ट्रैक करने के लिए भी किया जा सकता है। ये स्वचालित उपकरण समय बचाते हैं और काम करते हैं, लेकिन उनकी कुछ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, यदि कुछ कणों की गतिशीलता बहुत धीमी है, तो ये उपकरण उन्हें गैर-गतिशील कणों के रूप में पढ़ सकते हैं। इसके अलावा, इन उपकरणों में कम तीव्रता वाले अणुओं को पहचानने में सीमाएं हैं। इसलिए, वे एक उच्च तीव्रता पूर्वाग्रह प्रदर्शित कर सकते हैं। दूसरी ओर, मैन्युअल ट्रैकिंग (हालांकि समय लेने वाली) ट्रैकिंग त्रुटियों के प्रति कम संवेदनशील है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल, एस cerevisiae में अतिरंजित Cin8 के शुद्धिकरण से शुरू होता है, व्यापक रूप से एकल-अणु गतिशीलता परख और इस द्वि-दिशात्मक किनेसिन -5 के बाद के गतिशीलता विश्लेषण की व्याख्या करता है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से शुद्ध करने और Cin8 जैसे मोटर प्रोटीन की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए पालन किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल के विभिन्न भागों को खमीर से प्रोटीन को शुद्ध करने या विभिन्न मोटर प्रोटीन और उनकी गतिशीलता लक्षण वर्णन के लिए एकल-अणु गतिशीलता assays विकसित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को इज़राइल साइंस फाउंडेशन अनुदान (आईएसएफ -386/18) और इज़राइल द्विराष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (बीएसएफ -2019008) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, जो एलजी को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine FORMEDIUM DOC0230
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA Sigma A8549
Casein Sigma C7078
Catalase (C40) Sigma C40
Creatine-Kinase Sigma C3755
Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
EDTA Sigma E5134
EGTA Sigma E4378
Fluorescence filter set for GFP Chroma 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine Chroma 49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope Zeiss Axiovert 200M
Galactose Tivan Biotech GAL02
Glucose Sigma G8270
Glucose Oxidase Sigma G7141
Glycerol Sigma G5516
GlycylGlycine Merck G0674
GMPCPP Jana Bioscience Nu-405L
GTB Cytoskeleton BST01-010
GTP Sigma G8877
Histidine Duchefa Biochemie H0710.0100
ImageJ-FIJI software https://imagej.net/plugins/trackmate/ version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole Sigma I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcam ab119211
Lens Zeiss 100x/1.4 oil DIC objective
Lysine FORMEDIUM DOC0161
Magnesium Chloride Sigma M8266
Methionine Duchefa Biochemie M0715.0100
Neo Andor Technologies sCMOS camera
NeutraAvidin Life A2666
Ni-NTA Agarose Invitrogen R901-15
Phospho-Creatine Sigma P1937
Pipes Sigma P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer) Sigma P2443
Potassium Chloride Sigma P9541
Raffinose Tivan Biotech RAF01
Size Exclusion chromatography instument GE Healthcare AKTA Pure
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop
Superose-6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
Tris Roshe 10708976001
Triton X-100 Sigma T8787
Tryptophan Duchefa Biochemie T0720.0100
Tubulin protein Cytoskeleton T240
Tubulin, biotinylated Cytoskeleton T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine Cytoskeleton TL530M
Uracil Sigma U0750-100G
Yeast nitrogen base FORMEDIUM CYN0401S
α-GFP antibody Santa Cruz Biotechnology SC8036
β-mercaptoethanol Sigma M3148

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References

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जैव रसायन अंक 180 kinesin Cin8 एकल अणु गतिशीलता सूक्ष्मनलिकाएं द्वि-दिशात्मक गतिशीलता

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Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022. Citeable Link.

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Roy Abraham

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Roy Avraham

एकल अणुओं की गतिशीलता और द्वि-दिशात्मक किनेसिन -5 Cin8 <em>के समूहों को एस सेरेविसिया</em> कोशिकाओं से शुद्ध किया गया
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Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov,… More

Pandey, H., Zvagelsky, T., Popov, M., Sadan, M., Yanir, N., Goldstein-Levitin, A., Siegler, N., Hershfinkel, S., Abraham, Y., Avraham, R., Gheber, L. A., Gheber, L. Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. J. Vis. Exp. (180), e63425, doi:10.3791/63425 (2022).

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