Summary
Her beskriver vi to modifikationer af DNA-fiberassayet for at undersøge enkeltstrengede DNA-huller i replikerende DNA efter induktion af læsioner. S1-fiberassayet muliggør detektion af postreplikative huller ved hjælp af den ssDNA-specifikke S1-endonuklease, mens gap-filling-analysen muliggør visualisering og kvantificering af gap-reparation.
Abstract
DNA-fiberassayet er en enkel og robust metode til analyse af replikationsgaffeldynamik baseret på immundetektion af nukleotidanaloger, der inkorporeres under DNA-syntese i humane celler. Denne teknik har dog en begrænset opløsning på et par tusinde kilobaser. Følgelig kan postreplikative enkeltstrengede DNA-huller (ssDNA) så små som et par hundrede baser ikke påvises ved standardassayet. Her beskriver vi en modificeret version af DNA-fiberassayet, der bruger S1-nukleasen, et enzym, der specifikt spalter ssDNA. I nærværelse af postreplikative ssDNA-huller vil S1-nukleasen målrette og spalte hullerne og generere kortere kanaler, der kan bruges som udlæsning for ssDNA-huller på igangværende gafler. Disse postreplikative ssDNA-huller dannes, når beskadiget DNA replikeres diskontinuerligt. De kan repareres via mekanismer, der er afkoblet fra genomreplikation, i en proces kendt som hulfyldning eller postreplikativ reparation. Fordi hulfyldningsmekanismer involverer DNA-syntese uafhængigt af S-fasen, kan ændringer i DNA-fibermærkningsskemaet også anvendes til at overvåge hulfyldningshændelser. Alt i alt er disse modifikationer af DNA-fiberassayet kraftfulde strategier til at forstå, hvordan postreplikative huller dannes og udfyldes i genomet af humane celler.
Introduction
Skelsættende værker har givet bevis for akkumulering af postreplikationelle enkeltstrengede (ssDNA) huller ved behandling med DNA-skadelige stoffer i bakterier1 og humane celler 2,3. Under replikation af beskadigede DNA-skabeloner kan DNA-syntesemaskineriet omgå læsionerne ved at anvende specifikke translesionsyntese DNA-polymeraser eller gennem skabelonskiftmekanismer. Alternativt kan replikaen også blot springe læsionen over og efterlade et ssDNA-hul, der skal repareres senere. For nylig viste en undersøgelse tydeligt, at behandling med genotoksiske midler fører til ssDNA-huller i eukaryoter ved at anvende elektronmikroskopi til at visualisere den specifikke struktur af replikationsmellemprodukter4. Dannelsen af disse regioner af postreplikative huller blev oprindeligt foreslået at være et simpelt resultat af den semi-diskontinuerlige tilstand af DNA-replikation2. I dette tilfælde kan en læsion på den forsinkede streng blokere forlængelsen af et Okazaki-fragment, men gaffelprogression reddes naturligt af det følgende Okazaki-fragment og efterlader et ssDNA-hul. Yderligere undersøgelser viste imidlertid, at dannelsen af huller på den førende streng også er mulig, som først vist i bakterier5. I eukaryoter blev PRIMPOL, en unik DNA-polymerase med primaseaktivitet, vist at være i stand til at genstarte DNA-syntese nedstrøms en replikationsblokerende læsion gennem sin reprimingsaktivitet 6,7,8,9,10,11. Således kan PRIMPOL-primaseaktiviteten forklare dannelsen af postreplikative ssDNA-huller i den ledende streng ved behandling med et DNA-skadeligt middel i humane celler12. Ikke desto mindre krævede påvisning af disse huller såvel som gapreparation indtil for nylig indirekte eller tidskrævende tilgange såsom elektronmikroskopi4 eller plasmidbaserede assays13. Anvendelsen af den ssDNA-specifikke S1-nuklease til påvisning af huller i humane celler blev pioneret af tidlige undersøgelser for mere end fyrre år siden ved hjælp af saccharosegradientteknikker 2,3. For nylig anvendte vores gruppe brugen af denne nuklease til at detektere ssDNA i replikerende DNA (postreplikative huller) ved hjælp af andre metoder såsom DNA-fiber og kometassays14. Disse nye tilgange banede vejen for den nuværende bølge af undersøgelser af postreplikative huller. Her beskriver vi en strategi for at bruge S1-nuklease til at detektere postreplikative ssDNA-huller ved DNA-fiberassay og forklare, hvordan et differentielt mærkningsskema i DNA-fiberprotokollen kan muliggøre undersøgelsen af reparationen af disse huller.
DNA-fiberassayet er en kraftfuld teknik, der er blevet brugt af et stigende antal laboratorier og har givet værdifuld indsigt i replikationsgaffeldynamik og replikationsstressresponsmekanismer. Kort fortalt er denne teknik baseret på den sekventielle inkorporering af nukleotidanaloger (såsom CldU-5-chlor-2'-deoxyuridin- og IdU-5-iodo-2'-deoxyuridin) i det replikerende DNA. Efter høst lyses celler, og DNA-molekyler spredes på et positivt belagt glasglas. CldU og IdU detekteres derefter af specifikke antistoffer, som kan visualiseres i et fluorescerende mikroskop som tofarvede fibre. Endelig måles længden af IdU- og CldU-kanalerne for at identificere eventuelle ændringer i DNA-replikationsdynamikken som følge af INDUKTION AF DNA-SKADER. Denne teknik kan bruges til at undersøge forskellige fænomener, såsom gaffelstop, gaffelbremsning, spirende DNA-nedbrydning og variationer i hyppigheden af oprindelsesaffyring15,16.
En begrænsning af DNA-fiberassayet er dets opløsning af et par kilobaser. Fordi postreplikative ssDNA-huller kan være i området for hundredvis af baser, er det umuligt at visualisere disse huller direkte ved hjælp af standard DNA-fiberprotokollen. Tilstedeværelsen af ssDNA-huller på replikerende DNA i humane celler behandlet med genotoksiske midler har været indirekte impliceret før. For eksempel observation af ssDNA som vurderet ved rekruttering af det ssDNA-bindende protein, replikationsprotein A (RPA), i celler uden for S-fasen eller dannelsen af ssDNA som påvist ved alkalisk DNA-afvikling kombineret med fraværet af langvarig gaffelstopning ved DNA-fiberassay 12,17,18,19,20,21 blev tilskrevet akkumuleringen af ssDNA-huller. Derudover inducerer postreplikative ssDNA-huller et ATR-afhængigt G2 / M-fasekontrolpunkt og arresterer celler behandlet med replikationsgiftstoffer 18,19,20,21,22.
S1-nukleasen nedbryder enkeltstrengede nukleinsyrer, der frigiver 5'-phosphorylmono- eller oligonukleotider og har en 5 gange højere affinitet til ssDNA sammenlignet med RNA. Dobbeltstrengede nukleinsyrer (DNA: DNA, DNA: RNA eller RNA: RNA) er resistente over for S1-nukleasen, undtagen når de anvendes i ekstremt høje koncentrationer. S1-nukleasen spalter også dobbeltstrenget DNA i det enkeltstrengede område forårsaget af et nick, gap, mismatch eller loop. S1-nukleasen er således en ssDNA-specifik endonuklease, der er i stand til at spalte ssDNA-huller og i sidste ende generere dobbeltstrengede brud23,24. Tilføjelse af trin til S1-nukleasefordøjelse til DNA-fiberprotokollen muliggør således indirekte påvisning af postreplikative ssDNA-huller. I nærvær af huller vil behandling af eksponerede kerner med S1-nukleasen før DNA-spredning generere kortere kanaler som følge af S1-spaltning af ssDNA, der i sagens natur er til stede ved huller14. Følgelig er kanalforkortelse aflæsningen for ssDNA-huller ved hjælp af denne tilgang. Sammenlignet med standard DNA-fiberprotokollen kræver DNA-fiberen med S1-nukleasen kun to ekstra trin: kerneeksponering (cellepermeabilisering) og behandling med S1-nukleasen. Det er vigtigt at bemærke, at passende kontroller er obligatoriske, såsom prøver behandlet med det genotoksiske middel, men uden S1-nukleasen, og prøver behandlet med S1-nukleasen uden det genotoksiske middel. Selve protokollen, herunder inkorporering af analoger, S1-behandling og spredning, kan udføres på en dag og kræver ikke ekstraordinært materiale. Det kræver kun thymidinanalogerne, den rensede S1-nuklease, de passende primære og sekundære antistoffer og et fluorescerende mikroskop. Samlet set registrerer DNA-fiberen, der anvender S1-nukleasen, ssDNA-huller på igangværende replikationsgafler ved hjælp af en relativt enkel tilgang.
De postreplikative ssDNA-huller, der dannes som en konsekvens af replikationsspændingsmekanismer, kan repareres (eller udfyldes) af forskellige mekanismer, herunder translesion-DNA-syntese eller skabelonskift, i en proces kaldet gap-filling eller post-replication repair (PRR)25. Disse processer forekommer bag de fremadskridende gafler, der involverer replikationsuafhængig DNA-syntese 14,26,27. Baseret på disse fund kan et mærkningsskema, der adskiller sig fra standard DNA-fiberassayet, udføres for at visualisere hulfyldningshændelser i G2-fasen direkte 14,16,26,28. Specifikt kan en thymidinanalog bruges til at mærke replikationsgaflen på tidspunktet for genotoksisk behandling og postreplikativ ssDNA-huldannelse, mens en anden thymidinanalog kan bruges til at mærke mellemrumsfyldningshændelser. I denne protokol mærkes celler med en første thymidinanalog (IdU, for eksempel) umiddelbart efter eller samtidig med genotoksisk behandling i 1 time, således at det spirende DNA mærkes på tidspunktet for spaltedannelse. Nocodazol tilsættes ved behandling i alt mellem 12-24 timer for at arrestere celler i G2 / M, hvilket forhindrer den følgende S-fase. I de sidste 4 timer af nocodazolbehandling tilsættes en anden thymidinanalog (CldU, for eksempel) til mediet, der skal inkorporeres under hulfyldning. Det er vigtigt, at dette assay kun kan bruges til at detektere mellemrumsfyldningshændelser i G2, fordi hulfyldningssignalet fra CldU ikke kan skelnes fra et signal på grund af CldU-inkorporering i replikerende DNA i S-fasen. For at minimere baggrundssignalet bør timingen af CldU-inkorporering efter skadeinduktion derfor falde sammen med, når det meste af cellepopulationen går ind i G2-fase14. Derfor vil denne timing variere afhængigt af cellelinje og behandlingsforhold. Optimering af cellecyklusprogression inden anvendelse af dette assay anbefales. Co-farvning af disse thymidinanaloger muliggør visualisering af gap-filling (PRR) kanaler (CldU-patches) oven på spirende DNA (IdU-kanaler), der syntetiseres under den genotoksiske behandling, når ssDNA-huller blev genereret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Da undersøgelsen bruger humane celler, blev arbejdet godkendt af den etiske komité ved Institut for Biomedicinsk Videnskab ved University of São Paulo (ICB-USP, godkendelsesnummer #48347515.3.00005467) til forskning med humane prøver.
BEMÆRK: De protokoller, der er beskrevet her, blev brugt i tidligere publikationer med mindre ændringer 14,16,28. Her er fokus på brugen af ultraviolet lys C (UVC) som ET DNA-skadeligt middel. Imidlertid er andre DNA-skadelige stoffer som cisplatin og hydroxyurea også blevet anvendt med succes28. Denne protokol kan udføres i en række cellelinjer, herunder U2OS, HEK293T, humane fibroblaster og andre 14,28,29. Det er vigtigt at bestemme det eksperimentelle spørgsmål, før du udfører denne protokol. DNA-fiberassayet med S1-nukleasen (kaldet S1 Fiber herefter) bruges til at detektere tilstedeværelsen af postreplikative ssDNA-huller, mens gap-filling (eller PRR) -analysen udføres for at kvantificere gap-filling-begivenheder i G2-fasen. Hvis man analyserer tilstedeværelsen af postreplikative ssDNA-huller, skal investigator således udføre afsnit 2 (S1 Fiber eksperimentel opsætning) og fortsætte direkte til afsnit 4 (DNA-fiberforberedelse ved spredning) i protokollen. Hvis der analyseres hullers hændelser, skal investigator gå direkte til afsnit 3 (Gap-filling (PRR) eksperimentel opsætning).
1. Reagenser og opsætning
- Thymidinanaloger: Resuspend 5-Iodo-2'-deoxyuridin (IdU) og 5-Chloro-2'-deoxyuridin (CldU) i 1 NNH4OH til en endelig koncentration på 100 mM. Analogerne filtreres gennem et sterilt sprøjtefilter (0,2 μm), aliquot, og opbevar dem ved -20 C.
- Antistoffer: Primærretter - anti-BrdU rotte (Biorad) og anti-BrdU mus (BD); Secondaries - anti-rotte Alexa Fluor 488 og anti-mus Alexa Fluor 594.
- Cellulær permeabilisering CSK100 buffer til S1 Fiber: Tilsæt 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7,2], 300 mM saccharose og 0,5% Triton X-100 i destilleret H2O.
- S1-nukleasebuffer [pH 4,6]: Der tilsættes 30 mM natriumacetat [pH 4,6], 10 mM zinkacetat, 50 mM NaCl og 5% glycerol iH2O.
BEMÆRK: S1-nukleasebufferen skal have en endelig pH-værdi på 4,6, da S1-aktiviteten falder 50 % ved pH-> 4,9. - Aliquot og opbevar ved -20 °C S1-nukleasen renset fra A. oryzae forfortyndet i S1-nukleasefortyndingsbuffer leveret af fabrikanten.
- Nocodazolen rekonstitueres i DMSO til en slutkoncentration på 2 mM til udfyldning af huller. Undersøgelse.
- Lysisbuffer: Tilsæt 200 mM Tris-HCi [pH 7,5], 50 mM EDTA og 0,5 % SDS i H2O.
- Forbered fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Forbered PBS-T ved at tilføje 0,1 % Tween-20 i PBS.
- Forbered 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
- Forbered 0,1% BSA i PBS.
- Forbered PBS-T-BSA ved at tilføje 1 % BSA i PBS-T.
BEMÆRK: Brug et epifluorescerende mikroskop med en kviksølv- eller xenonlampe med en 510 nm bølgelængde og 42 nm båndbredde GFP (FITC, Alexa Fluor 488) emissionsfilter og en 624 nm bølgelængde og 40 nm båndbredde Texas Red (Alexa Fluor 594) emissionsfilter eller et konfokalt mikroskop med en 488 nm linje (blå) laser til at detektere grøn fluorescens (detekteret mellem 510 og 560 nm) og en 561 nm linje (gul) laser til at detektere rød fluorescens ( detekteret mellem 575 og 680 nm). Nedsænkningsmål (40x, 63x eller 100x).
2. S1 Fiber eksperimentel opsætning (2 dage)
- Dag 1: Plade 4 huller for hver cellelinje: ± UVC og ± S1-nuklease med celler ved 70-90% sammenløb.
BEMÆRK: Eksperimentet kan udføres i et format så lille som en 12-brønds plade. I dette tilfælde anvendes alle løsninger ved 0,5 ml/brønd. - Dag 2: Forbered frisk IdU ved 20 μM og CldU ved 200 μM i forvarmede (37 °C) cellekulturmedier.
- Opsuge kulturmediet og tilsæt straks mediet med 20 μM IdU og inkuber cellerne ved 37 °C, 5% CO2 (celleinkubator) i præcis 20 min.
- Cellerne vaskes hurtigt med forvarmet PBS (37 °C) to gange.
- Cellerne bestråles med 20 J/m2 UVC. Brug ubehandlede celler som kontroller.
- Tilsæt straks mediet med 200 μM CldU og inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 (celleinkubator) i nøjagtigt 60 minutter.
BEMÆRK: IdU- og CldU-mærkning kan udskiftes, men koncentrationen af den anden analog skal være 5-10 gange højere end den første analog. Tidspunktet for den analoge inkubation kan tilpasses det anvendte genotoksiske middel, men tidspunktet for den anden analoge inkubation bør være lang nok til at sikre tilstrækkelig tid til spaltedannelse14,16. Hvis du bruger et DNA-skadeligt lægemiddel, tilsættes lægemidlet sammen med CldU 28,29,30. - Cellerne vaskes med forvarmet PBS (37 °C) to gange.
- Permeabiliser cellerne med CSK100-bufferen i 8-10 minutter ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Vellykket permeabilisering kan kontrolleres under et brightfieldmikroskop, hvor kun kerner skal kunne observeres - Vask forsigtigt kernerne med PBS (hæld 0,5 ml ned ad siden af hver brønd, bare i et par sekunder).
- Vask forsigtigt kernerne med S1-buffer (hæld 0,5 ml ned ad siden af hver brønd, bare i et par sekunder).
- Kernerne inkuberes med S1-buffer med S1-nuklease (20 U/ml) eller uden (som kontrol) i 30 minutter ved 37 °C (celleinkubator).
- S1-bufferen aspireres, og der tilsættes 0,1 % BSA i PBS.
- Skrab kernerne og overfør dem til et passende kommenteret 1,5 ml rør. Hold rør på is hele tiden.
BEMÆRK: Vellykket løsrivelse af kerner kan kontrolleres under et brightfieldmikroskop. - Pellet kernerne: centrifuge ved ~ 4600 x g i 5 minutter, ved 4 ° C.
BEMÆRK: Forskellig fra standard DNA-fiberassayet kan kernerne ikke tælles, så overvej det oprindelige antal celler belagt. Alternativt kan en ekstra brønd, der ikke blev udsat for permeabilisering, bruges til at estimere celletallet ved hjælp af et hæmocytometer eller en celletæller. - Resuspender pelletsbrønden i PBS i en koncentration på ~ 1500 celler / μL, læg rørene på is og fortsæt til DNA-fiberforberedelse ved straks at sprede (afsnit 4) protokol
3. Eksperimentel opsætning af gap-filling (PRR) (3 dage)
- Dag 1: Plade 2 brønde for hver cellelinje: ± UVC med celler ved ~ 70% sammenløb.
- Dag 2: Forbered frisk IdU ved 20 μM i forvarmede (37 °C) cellekulturmedier.
- Cellerne bestråles med 20 J/m2 UVC.
- Tilsæt straks mediet med 20 μM IdU og inkuber cellerne ved 37 °C, 5% CO2 (celleinkubator) i præcis 60 min.
- Cellerne vaskes med forvarmet PBS (37 °C) to gange.
- Tilfør straks mediet med 200 ng/ml nocodazol, og cellerne inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 (celleinkubator) i 12-24 timer (tidspunktet for dette trin skal holdes konsistent mellem forsøgene).
BEMÆRK: Koncentrationen af nocodazol skal muligvis tilpasses i henhold til den anvendte cellelinje. Hvis du bruger et genotoksisk lægemiddel, inkuberes cellerne med IdU ± lægemiddel28. - Dag 3: Aspirer kulturmediet, tilsæt mediet med 20 μM CldU + nocodazol, og inkuber i de sidste 4 timer af nocodazolbehandling ved 37 ° C, 5% CO2 (celleinkubator).
- Cellerne vaskes med forvarvarmet PBS (37 °C).
- Tilsæt trypsin og inkuber i 1-2 min ved 37 °C, 5% CO2 (celleinkubator) for at løsne celler.
- Tilsæt det samme volumen cellekulturmedier og saml celler (media + trypsin) i et passende kommenteret 1,5 ml rør. Hold rørene på is hele tiden.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller en celletæller.
- Pellet cellerne: centrifuger ved ~ 350 x g i 5 minutter, ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspend cellerne i PBS ved ~ 1500 celler / μL. Hold cellerne på is og start DNA-fiberforberedelse ved at sprede protokollen med det samme (dag 3 eller 4).
4. DNA-fiberforberedelse ved spredning (~ 1 time til 12 dias)
- Anmærk mikroskopets dias med en kulstofblyant og læg dem fladt på en bakke.
- Tryk på bunden af røret for at sikre homogenisering.
- Tilsæt 2 μL celler øverst på det tilsvarende dias.
BEMÆRK: Der kan tilføjes to dråber, en øverst på diaset og en anden midt på diaset. - Tilsæt 6 μL af lysisbufferen og lys cellerne ved at pipettere op og ned ca. 5 gange (undgå at lave bobler).
- Træk dråben lidt mod bunden af diaset med pipettespidsen (for at styre dråbespredningens vej).
- Inkuberes i 5 minutter ved RT for at lyse kernerne.
BEMÆRK: Volumenet af lysisbuffer og lysistiden kan justeres, hvis lysatet tørrer for hurtigt eller alternativt ikke tørrer nok. Lysis buffervolumen kan variere fra 5-7 μL, og timingen kan falde mellem 4-10 min. - Vip glidet ved omkring 20-40 °, og lad dråben sprede sig til bunden af diaset ved en konstant, lav hastighed.
- Lad rutsjebanen tørre ved RT i mørke (10-15 min).
- Frisk forberede fikseringsopløsningen: Bland methanol: iseddike i forholdet 3: 1.
- Nedsænk diasene i en krukke, der indeholder fikseringsopløsningen, og inkuberes i 5 minutter ved RT for at fastgøre DNA på diasene.
FORSIGTIG: Methanol er meget giftigt og bør opbevares under en kemisk hætte. Kassér i en passende beholder. - Tør rutsjebanerne ved RT i mørke og opbevar dem ved 4 °C beskyttet mod lys indtil farvning.
5. Immunostaining af DNA-fibre (~ 6 timer)
- Vask slides med PBS to gange i 5 min.
- Denaturer DNA'et med frisklavet 2,5 M HCI i 40-60 min ved RT.
FORSIGTIG: For at forberede 2,5 M HCI hældes syre i vand og aldrig det modsatte. Dette er en eksoterm reaktion, så den vil varme lidt op. - Vask slides med PBS tre gange i 5 min.
- Blok med 5% BSA (kan opbevares ved 20 °C til op til tre anvendelser) tidligere opvarmet ved 37 °C i 30-60 min ved 37 °C.
- Fjern overskydende væske fra glider ved forsigtigt at banke på et papir.
- Der tilsættes 30 μL primære antistoffer (muse-anti-BrdU 1/20 (for IdU) og rotte-anti-BrdU 1/100 (for CldU) fortyndet i PBS-T-BSA) til lysbillederne dråbevis, og læg en dækslip ovenpå. Inkuberes i 1-1,5 time ved RT i et mørkt, fugtigt kammer.
- Læg diasene i en krukke med PBS i 1-2 min, og fjern derefter dækslerne forsigtigt.
- Vask med PBS-T i en krukke tre gange i 5 minutter, og læg derefter diasene i PBS.
- Fjern overskydende væske ved forsigtigt at banke på et papir.
- Tilsæt 30 μL sekundære antistoffer (anti-mus Alexa Fluor 594 og anti-rotte Alexa Fluor 488 fortyndet ved 1/75 i PBS-T-BSA.) til diasene dråbevis og læg en dækslip ovenpå. Inkuberes i 45-60 min ved RT i et mørkt, fugtigt kammer.
- Læg diasene i en krukke med PBS i 1-2 min, og fjern derefter dækslerne forsigtigt.
- Vask med PBS-T i en krukke tre gange i 5 minutter, og læg derefter diasene i PBS.
- Fjern overskydende væske ved forsigtigt at banke på et papir.
- Der tilsættes 20 μL monteringsreagens dråbevis til lysglassene, og der anbringes en dækslip ovenpå. Undgå bobler.
- Lad gliderne tørre ved RT i mørke, og opbevar derefter ved 4 ° C (eller -20 ° C for længere opbevaring).
6. Billedoptagelse og analyse (~ 1 time pr. Prøve)
BEMÆRK: Et epifluorescensmikroskop kan bruges til begge protokoller. Til gap-filling (PRR) assay anbefales det dog stærkt at bruge et konfokalt mikroskop til øget opløsning af billederne.
- Placer en dråbe nedsænkningsolie (mikroskopspecifik) nær toppen af diaset, hvor cellerne blev lyset, og find fokus ved hjælp af den grønne kanal ved at søge grønne prikker i baggrunden (40x, 63x og 100x mål kan bruges).
- Find hovedkoncentrationen af fibre, og flyt til kanterne for at finde godt spredte ikke-overlappende individuelle fibre ved kun at bruge en kanal til at vælge regionerne til billederne og undgå potentiel bias.
- Tag omkring 15-20 billeder pr. dias langs hele diaset ved de grønne og røde kanaler og flet de to kanaler for at opnå tofarvede DNA-fibre.
BEMÆRK: Hvis du bruger et konfokalt mikroskop, skal du tage billeder i høj opløsning (1024 x 1024 pixels) og bruge pinhole-værdier tæt på 1 for både rød og grøn fluorescens. - Brug ImageJ (gratis software leveret af NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) til IdU- og CldU-kanallængdemålinger.
- Åbn et billede ved at trække det ind i feltet ImageJ.
- Brug skalabjælken genereret af mikroskopsoftwaren (korrekt kalibreret) til at konvertere længden til mikrometer. Brug værktøjet Lige linje ved at vælge det 5. ikon fra venstre mod højre i ImageJ-boksen til at måle skalalinjen i det medfølgende billede mikrometer og opnå en måling i pixels. Klik på Analyser > Indstil skala og erstat "afstand i pixels" med det relevante tal og "længdeenhed" til μm.
- I feltet ImageJ skal du vælge værktøjet Segmenteret linje ved at venstreklikke på det 5. ikon fra venstre mod højre og derefter vælge den anden mulighed fra top til bund.
- Tegn den nøjagtige sti for den røde (IdU) eller grønne (CldU) kanal ved at venstreklikke, og stop tegningen ved at højreklikke. Tryk på M-knappen på tastaturet for at måle længden.
- For S1-fiberen skal du kun analysere rødgrønne (tofarvede fibre)16. Mål røde og grønne kanallængder fra mindst 150 fibre fra forskellige billeder ved at holde styr på de røde og grønne kanalmålinger for hver enkelt fiber.
- Til gap-filling assay skal du kun måle længden af IdU (røde) kanaler, der indeholder mindst 1 CldU (grøn) plaster, men ingen kontinuerlig CldU-farvning. Score mindst 10-15 IdU-kanaler fra forskellige billeder med mindst 1 CldU-patch.
BEMÆRK: Anden software kan bruges til analyserne, såsom Zeiss LSM Image Browser.
- For S1-fibrene skal du plotte IdU-kanalernes længde, CldU-kanalernes længde og forhold (CldU / IdU eller omvendt) i separat grafik som scatter-prikdiagrammer med medianer.
- Mål mellemrumsfyldningshændelser som enheder af "per-kilobasetæthed", divider det samlede antal CldU (PRR, grøn) pletter på en given længde af IdU (rød) kanal med den samlede længde af den røde kanal i kilobaser (i betragtning af 1 μm = 2,59 kilobaser31). Plot derefter dataene som scatter dot plots med medianer.
- I begge eksperimenter skal du udføre statistisk analyse mellem to prøver ved hjælp af Mann-Whitney (ikke-parametrisk test) og mellem mere end to prøver ved hjælp af Kruskal-Wallis efterfulgt af Dunns test med flere sammenligninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I S1 Fiber-analysen, hvis behandling med et genotoksisk middel fører til postreplikative ssDNA-huller, vil den samlede længde af DNA-fibre fra S1-behandlede kerner være kortere ved behandling med DNA-skade sammenlignet med ubehandlede prøver såvel som med prøver, der blev behandlet med det genotoksiske middel, men ikke blev underkastet S1-spaltning (figur 1).
Alternativt, hvis behandling med S1-nukleasen ikke signifikant påvirker længden af DNA-fibre sammenlignet med ubehandlede celler, er forskellige fortolkninger mulige: (1) Der er ingen dannelse af postreplikative ssDNA-huller ved behandling med det anvendte genotoksiske middel og / eller i den specifikke genetiske baggrund, der undersøges. Faktisk har vi tidligere vist, at UV-inducerede 6-4 fotoprodukter (6-4PP), men ikke cyclobutanpyrimidindimere (CPD), fører til dannelse af ssDNA-huller i celler, der mangler til reparation af nukleotidudskæring (NER, XP-C-celler)14. (2) SSDNA-hullerne blev repareret og kan ikke længere detekteres. (3) Den forkortelse, der fremkaldes ved behandling med det genotoksiske middel alene, er for udtalt til, at det kan påvises, at der kan påvises en yderligere afkortning via S1-spaltning.
Navnlig kan den manglende virkning af S1 også afspejle tekniske problemer såsom forringede forhold for S1-aktiviteten, herunder uhensigtsmæssig pH i S1-bufferen eller begrænset mængde zink.
Figur 1: Påvisning af postreplikative ssDNA-huller på igangværende gafler ved S1 Fiber-assay. (A) Skematisk repræsentation af DNA-fiberassays med ssDNA-specifik S1-nuklease (S1 Fiber). Fremadskridende replikationsgafler er mærket med thymidinanaloger (IdU, CldU) og kan måles efter DNA-spredning og immunstaining. Venstre, standard fremadskridende gafler uden huller er ikke modtagelige for spaltning af S1-nukleasen. Højre, huller i spirende DNA, der er konventionelt uopdagelige, vil blive målrettet af S1-nuklease og vil blive visualiseret som kortere CldU-kanaler. (B) Skema for S1 Fiber-protokollen. (C) Repræsentative billeder af S1 Fiber. Top, kontrol spirende DNA-kanal uden huller, uigennemtrængelig for spaltning af S1-nukleasen. Bund, DNA-kanal positiv for huller spaltet af S1-nukleasen, hvilket resulterer i en kortere CldU (grøn) kanallængde. Klik her for at se en større version af denne figur.
I GAP-filling (PRR) assay er en signifikant stigning i tætheden af korte CldU-patches på IdU-kanaler tegn på øgede gap-filling-hændelser (figur 2). En høj tæthed af PRR-hændelser kan afspejles ved 1 PRR-hændelse (grøn/CldU-patch) i en kort IdU-kanal samt ved flere PRR-hændelser i en lang kanal (se repræsentative billeder figur 2C). Analysen skal udføres strengt ved kun at score CldU-patches, der er oven på IdU-kanaler i betragtning af, at CldU-patches er små og let kan forveksles med farvning af baggrund (se repræsentative billeder figur 2C).
Figur 2: Påvisning af postreplikativ reparation ved udfyldning af huller. (A) Skema med rød (IdU) kanal med grøn (CldU) patch, der indikerer en hulfyldningshændelse. (B) Skema for den protokol, der anvendes til at detektere udfyldning af huller. (C) Repræsentative billeder fra GAP-filling (PRR) assay. Venstre, længere IdU-kanaler med mindst en CldU-patch og /eller færre CldU-patches i alt svarer til lav gap-filling-tæthed (færre gap-filling-hændelser). Højre, kortere IdU-kanaler med mindst en CldU-patch og længere IdU-kanaler med flere CldU-patches i alt svarer til høj gap-filling-tæthed (flere gap-filling events). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i standard DNA-fiberassayprotokollen blev diskuteret i en tidligere publikation32. Her beskriver vi modificerede versioner af standard DNA-fiberassayet for at undersøge tilstedeværelsen af postreplikative ssDNA-huller samt deres reparation ved hulfyldning, oprindeligt beskrevet i14. I forbindelse med postreplikativ ssDNA-gap-tilstedeværelse vil brugen af S1-nukleasen i S1-fiberprotokollen sandsynligvis være egnet efter eksponering af et genotoksisk middel i mindst 1 time for at give tid til spaltedannelse og efterfølgende påvisning. Det er dog vigtigt at bemærke, at brugen af S1-nukleasen i nogle cellelinjer eller genetiske baggrunde kan generere kortere kanaler, selv uden yderligere behandling med genotoksiske midler 33,34. Derfor er det afgørende at medtage alle kontroller for at sikre en korrekt konklusion om, hvorvidt behandling med et genotoksisk middel fører til akkumulering af huller. Derudover er det vigtigt at validere S1 Fiber-resultatet yderligere ved at gentage analysen under forhold, hvor ssDNA-huller ikke længere dannes eller repareres.
Med hensyn til GAP-filling (PRR) assay er det vigtigt at optimere en UVC-dosis / lægemiddelkoncentration, der ikke påvirker den samlede længde af DNA-fibrene, da resultaterne beregnes som en per-kilobasetæthed. Hvis der anvendes en koncentration, der inducerer kanalforkortelse, kan resultaterne kunstigt skæves mod en øget mellemrumsfyldningstæthed, hvilket gør datafortolkning vanskelig. For at modvirke denne begrænsning kan mellemrumsfyldningshændelser visualiseres oven på ikke-mærket DNA ved at farve totalt DNA ved hjælp af et anti-ssDNA-antistof, som tidligere beskrevet14,16. Desuden kan der udføres et kinetisk eksperiment for at sikre maksimal påvisning af mellemrumsfyldningshændelser.
Bemærk, at mellemrumsfyldningshændelser også kan overvåges ved hjælp af S1 Fiber-analysen, når celler får lov til at komme sig før behandling med S1-nukleasen. Specifikt, når postreplikative huller udfyldes, bliver DNA-fibre ufølsomme over for spaltning af S1-nukleasen, og DNA-fiberlængde kan derfor bruges som udlæsning til hulfyldning i denne sammenhæng28. Denne tilgang kan således bruges til at studere hulfyldning gennem hele cellecyklussen, forskelligt fra PRR-analysen, der er begrænset til undersøgelsen af hulfyldning i G2 / M.
Endelig blev data opnået med PRR-assayet valideret ved hjælp af S1 Fiber28, hvilket tyder på, at nocodazol og kunstig blokering af celler i G2 / M under PRR-analysen ikke påvirker hulfyldning. Andre midler, der inducerer G2 / M-faseblokering, kan potentielt anvendes i dette assay
S1 Fiber er i stigende grad blevet brugt af laboratorier over hele verden, hvilket giver ny indsigt i mekanismerne for dannelse af ssDNA-huller og afslører tidligere ikke-værdsatte forhold, hvor disse huller kan dannes 14,29,34,35,36. For fremtidige undersøgelser ville det være interessant at kombinere disse modificerede protokoller med kvantepunktmetoden, der muliggør direkte visualisering af DNA-læsionen37 for at belyse krydssamtalen mellem postreplikativ ssDNA-gapdannelse og DNA-reparation samt hvordan skadens art definerer mekanismen for replikationsstressresponset. Som et alternativ til S1 Fiber-analysen kan S1-nukleasen også bruges til at studere hulfyldningsprocessen i et modificeret neutralt kometassay. Kort sagt, hvis der er huller, fører behandling af kometer med S1-nukleasen til dannelse af dobbeltstrengede pauser, der kan påvises ved neutral kometassay. Protokoller for neutral kometassay samt enzymmodificeret kometassay blev tidligere offentliggjort38,39. Denne tilgang muliggør især ssDNA-gapdetektion i alle faser af cellecyklussen uden behov for at arrestere celler i G2-fase. Ved hjælp af denne tilgang kombineret med S1 Fiber and gap-filling (PRR) protokollerne beskrevet her, fandt vi, at REV3L (DNA polymerase zeta katalytisk enhed) er ansvarlig for at udfylde huller dannet, når UV-induceret 6-4PP er til stede i det humane genom14.
Med den begrænsede tilgængelige tekniske tilgang er postreplikativ ssDNA-huldannelse og især mellemrumsfyldningshændelser stort set forblevet uudforskede i humane celler. Alt i alt giver disse modificerede teknikker (S1 Fiber, gap-filling (PRR) assay og S1 Comet) nye strategier til undersøgelse af tilstedeværelsen af ssDNA-huller, og hvordan disse huller i sidste ende udfyldes i det menneskelige genom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet i C.F.M.M.-laboratoriet er støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasilien, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 og 2017/05680-0) under International Collaboration Research fra FAPESP og Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO, Holland); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasilien, Grants # 308868/2018-8] og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasilien, finanskode 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
- Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
- Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
- Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
- García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
- Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
- Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
- Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
- Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
- Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
- Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
- Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
- Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
- Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
- Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
- Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
- Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
- Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
- Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
- Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
- Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
- Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
- Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).
