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Biology

Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna ist ein fadenförmiges Cyanobakterium, das aus marinen Felsbecken isoliert wurde. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Filamenten aus natürlichen Quellen, DNA-Extraktion, Genomsequenzierung, natürliche Transformation, Expression von sfGFP, Kryokonservierung und Motilitätsmethoden.

Abstract

Cyanobakterien stehen im Mittelpunkt der Grundlagenforschung und biotechnologischer Projekte, in denen Sonnenenergie für die Biomasseproduktion genutzt wird. Phormidium lacuna ist ein neu isoliertes filamentöses Cyanobakterium. Dieses Papier beschreibt, wie neue filamentöse Cyanobakterien aus marinen Gesteinsbecken isoliert werden können. Es beschreibt auch, wie DNA aus Filamenten extrahiert werden kann und wie die Genome sequenziert werden können. Obwohl die Transformation für viele einzellige Arten etabliert ist, wird sie für filamentöse Cyanobakterien seltener berichtet. Eine vereinfachte Methode zur natürlichen Umwandlung von P. lacuna wird hier beschrieben. P. lacuna ist das einzige Mitglied der Ordnung Oscillatoriales, für das eine natürliche Transformation etabliert ist. Dieses Papier zeigt auch, wie die natürliche Transformation verwendet wird, um Superfolder Green Fluorescent Protein (sfGFP) zu exprimieren. Ein endogener cpcB-Promotor induzierte eine etwa 5-mal stärkere Expression als cpc560-, A2813- oder psbA2-Promotoren von Synechocystis sp. PCC6803. Weiterhin wurde ein Verfahren zur Kryokonservierung von P. lacuna und Synechocystis sp.CPP 6803 etabliert und Verfahren zur Beurteilung der Motilität in einem flüssigen Medium und auf Agar- und Kunststoffoberflächen beschrieben.

Introduction

Cyanobakterien sind prokaryotische Organismen, die die Photosynthese als Energiequelle nutzen 1,2. Die Forschung konzentriert sich zunehmend auf Cyanobakterienarten. Mehrere Cyanobakterien können mit DNA3 transformiert werden. Gene können bei diesen Arten ausgeschaltet oder überexprimiert werden. Die Transformation ist jedoch auf einige Arten beschränkt 4,5,6,7,8,9,10,11, und es kann schwierig sein, die Transformation in Stämmen aus Kultursammlungen oder der Wildnis 8 festzustellen. Stämme der fadenförmigen Art Phormidium lacuna (Abbildung 1) wurden aus marinen Gesteinsbecken isoliert, in denen die Umweltbedingungen wie Salzkonzentrationen oder Temperatur im Laufe der Zeit schwanken. Diese fadenförmigen Cyanobakterien können als Modellorganismen für die Ordnung Oscillatoriales12 verwendet werden, zu der sie gehören.

Während Versuchen, den Gentransfer durch Elektroporation zu testen 13,14, wurde festgestellt, dass P. lacuna durch natürliche Transformationtransformiert werden kann15. Dabei wird DNA auf natürliche Weise von einigen Zellen aufgenommen. Im Vergleich zu anderen Transformationsmethoden16,17 hat die natürliche Transformation den Vorteil, dass keine zusätzlichen Werkzeuge erforderlich sind, die das Verfahren erschweren könnten. Zum Beispiel erfordert die Elektroporation richtige Küvetten, intakte Drähte und die Auswahl der richtigen Spannung. P. lacuna ist derzeit das einzige Oscillatoriales-Mitglied, das anfällig für natürliche Transformation ist. Da das ursprüngliche Protokoll auf Elektroporationsprotokollen basiert, enthielt es immer noch mehrere Waschschritte, die möglicherweise unnötig sind. Verschiedene Ansätze wurden getestet, um das Protokoll zu vereinfachen, was zu dem hier vorgestellten Transformationsprotokoll führte.

Die Genomsequenz ist essentiell für weitere molekulare Studien, die auf Gen-Knockout oder Überexpression basieren. Obwohl Genomsequenzen mit Next-Generation-Sequenziermaschinen innerhalb kurzer Zeit erhalten werden können, kann die Extraktion von DNA schwierig sein und hängt von der Spezies ab. Mit P. lacuna wurden mehrere Protokolle getestet. Eine modifizierte Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-basierte Methode wurde dann etabliert, was zu einer akzeptablen Reinheit der DNA und DNA-Ausbeuten jedes Reinigungszyklus für die weitere Arbeit im Labor führte. Das Genom von fünf Stämmen könnte mit diesem Protokoll sequenziert werden. Der nächste logische Transformationsschritt bestand darin, die Proteinexpression in P. lacuna zu etablieren.

Das in diesem Protokoll als Markerprotein verwendete sfGFP kann mit jedem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden. Alle getesteten Promotoren konnten für den P. lacuna sfGFP-Ausdruck verwendet werden. Die zunehmende Anzahl von Belastungen, die sich aus der Transformation ergeben, hat dazu geführt, dass eine Methode zur Speicherung der Kulturen erforderlich ist. Solche Methoden sind für Escherichia coli und viele andere Bakterienetabliert 18. In Standardprotokollen werden Glycerinkulturen hergestellt, in flüssigem Stickstoff übertragen und bei -80 °C gelagert. Diese Methode erfordert nur wenige Schritte und ist für die Arten, für die sie etabliert ist, sehr zuverlässig. Das Standardprotokoll war für P. lacuna nicht durchführbar, da lebende Zellen nicht in allen Fällen wiederhergestellt werden konnten. Als jedoch Glycerin nach dem Auftauen entfernt wurde, überlebten die Zellen aller Studien. Für die Analyse der Motilität von P. lacuna werden einfache Methoden vorgestellt, die mit der Knockout-Mutagenese kombiniert werden können, um Typ-IV-Pili oder die Rolle von Photorezeptoren zu untersuchen. Diese Assays unterscheiden sich von denen der einzelligen Cyanobakterien 19,20,21 und können auch für andere Oszillatorien nützlich sein.

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Protocol

1. Isolierung von der natürlichen Umwelt

HINWEIS: Grünalgen, Kieselalgen, fadenförmige Cyanobakterien und andere Mikroalgen können isoliert werden. Das Protokoll kann für alle Mikroalgenarten aus Gesteinsbecken verwendet werden, die unter Laborbedingungen wachsen. Filamentöse Cyanobakterien, die zu Oscillatoriales gehören, sind leicht an ihrer Bewegung und filamentösen Form zu erkennen. Die Spezies kann in einem halbreinen Zustand durch Genomsequenzierung oder 16S rRNA-Sequenzierung identifiziert werden.

  1. Transfer von flüssigen Meerwasserproben aus marinen Felsbecken (d. H. Hohlräumen in der felsigen Küste) in 50-ml-Kolben. Notieren Sie sich für jeden Kolben den genauen Ort oder die genauen Koordinaten der natürlichen Quelle. Wenn möglich, filtern Sie den Inhalt durch 50 μm Netze, um die Mengen an Zooplankton zu reduzieren. Lagern Sie die Proben bei 4 °C, bis sie subkulturiert werden können.
  2. 1 ml Kulturen auf 10 cm Petrischalen mit 3% Bacto-Agar in f/2 medium22,23 (siehe Materialtabelle) geben. Bereiten Sie bis zu 20 Teller vor. Kultivieren unter weißem Licht von 50 μmol m-2 s-1.
    HINWEIS: Für die Kultivierung können höhere Lichtintensitäten verwendet werden. Eine Intensität von bis zu 400 μmol m-2 s-1 kann für P. lacuna verwendet werden, obwohl andere Arten lichtempfindlicher sein könnten.
  3. Nach einer Woche die gewünschten Zellen mit steriler Pinzette auf frische Agarplatten übertragen. Isolieren Sie die Zellen unter einem binokularen Mikroskop unter sterilen Bedingungen. Lagern Sie die alte Agarplatte bei 4 °C, bis Zellen auf der neuen Agarplatte erscheinen und wachsen.
  4. Wiederholen Sie diesen Übertragungsschritt jede Woche, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie das bloße Auge zur Erkennung starker Verunreinigungen und ein Mikroskop mit 400-facher Vergrößerung für zusätzliche Kontrollen auf Kontamination.
  5. Wenn eine Probe frei von Kontamination zu sein scheint, testen Sie auf bakterielle oder pilzliche Kontamination auf Agarplatten. Übertragen Sie einen Bruchteil der Kultur mit einer Impfschleife auf eine LB 24-Agarplatte (10 cm Durchmesser), halten Sie die Platte bei Raumtemperatur und überprüfen Sie das Wachstum von Verunreinigungen über1-3 Tage.
  6. Wenn eine sterile filamentöse Cyanobakterienspezies erhalten wird, verwenden Sie sie für weitere Kulturarbeiten. P. lacuna in Flüssigkeit oder auf Bacto-Agar-Platten kultivieren. Verwenden Sie 250-ml-Kolben mit 50 ml f/2-Medium oder f/2+- Medium für die Flüssigkultur.

2. DNA-Extraktion

ANMERKUNG: Diese Methode ist vom 25 26 

  1. Bereiten Sie zwei Kolben mit 50 ml f/2 Medium vor. Beimpfen Sie jeden mit ~ 1 ml P. lacuna-Filamenten aus anderen Anbaukulturen. Halten Sie die Kulturen für 7 Tage oder länger unter Bewegung (horizontale Drehung) bei 50 U / min unter weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) bei 25 °C.
  2. Behandeln Sie die Kultur mit Ultraschall (siehe Tabelle der Materialien) für 2 min mit voller Energie. OD bei 750 nm messen; Überprüfen Sie, ob es ~ 0,5 ist. Bauen Sie die Kulturen weiter aus, wenn die OD zu niedrig ist.
  3. Sammeln Sie die Filamente um 5.000 × g, 20 min Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand. Die Filamente mit Restflüssigkeit in die Kammer einer French Press27 geben. Stellen Sie den Druck der French Press auf 20.000 psi ein und extrahieren Sie die Zellen.
    HINWEIS: Die französische Presse wird alle Zellen lysieren und die DNA freisetzen; starke Scherkräfte erzeugen 1.500 bp DNA-Fragmente.
  4. Die Probe wird 10 min lang bei 10.000 × g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
  5. 400 μL Lysepuffer (4 M Harnstoff, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) und 50 μL Proteinase K (10 mg/ml) in das Pellet geben. Erhitzen Sie die Probe 60 min lang auf 55 °C mit Schütteln bei 550 U/min.
  6. 1 ml DNA-Extraktionspuffer (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) zugeben und 60 min bei 55 °C und 550 U/min inkubieren. Übertragen Sie die Lösungen in Zentrifugationsröhrchen und fügen Sie zwei Volumina Chloroform/Isoamylalkohol hinzu (24/1).
  7. Nach dem Schütteln zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 9.000 × g. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in Reaktionsfläschchen und fügen Sie 1 ml eiskaltes Ethanol und 50 μL 3 M Natriumacetat hinzu.
  8. Wirbeln Sie die Probe vor und legen Sie sie für 1 h oder länger bei -20 °C.
  9. 5 min bei 10.000 × g (4 °C) zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Waschen Sie das Pellet mit 70% Ethanol.
  10. Zentrifugieren Sie die Probe erneut. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet über Nacht. Lösen Sie die DNA in nukleasefreiem Wasser auf. Messen Sie das DNA-Spektrum, um zu überprüfen, ob das OD 260 nm/OD 280 nm zwischen 1,6 und 1,9 liegt.
  11. Analysieren Sie die Größe der DNA auf einem Agarose-Elektrophorese-Gel28.
  12. Sequenzieren Sie die genomische DNA durch Next-Generation-Sequenzierung für 300 Zyklen, mit einer paarigen Endeinstellung und einer Leselänge von 150 Basen (siehe Materialtabellen).
  13. Führen Sie die Assemblierung mit dem entsprechenden Computerprogramm durch. siehe das Beispiel in der Materialtabelle.
  14. Senden Sie den Genomentwurf zur Annotation an den RAST-Server.
    HINWEIS: Laden Sie DNA-Sequenzen hoch, um innerhalb weniger Minuten eine vollständige Annotation zu erhalten.

3. Natürliche Transformation und GFP-Ausdruck

HINWEIS: Die Transformation basiert auf einem Plasmidvektor, der sich in E. coli ausbreitet; pGEM-T oder pUC19 können als Backbone-Vektoren verwendet werden. Klonierungstechniken sind in vielen Laboratorien etabliert; siehe auch Standardprotokolle28 und die Artikel zu Transformationsvektoren für P. lacuna 15,29. Beispiele für Vektoren für den sfGFP-Ausdruck werden im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschrieben. Details zu vier noch unveröffentlichten Vektoren finden Sie in der Ergänzungsdatei 1.

  1. Führen Sie alle Schritte mit sterilem Material unter sterilen Laborbedingungen durch (saubere Bank, sterile Glaswaren).
  2. Beimpfen Sie 2 x 50 ml f/2 flüssiges Medium in zwei 250 ml Kolben mit 2 x 1 ml P. lacuna Filamenten aus einer Laufkultur. In weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) unter Bewegung (horizontale Rotation, 50 U/min) für ~5 Tage bei 25 °C kultivieren.
  3. Bereiten Sie ~ 200 μg der Transformationsvektor-DNA mit einem Midi-Prep-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  4. Homogenisieren Sie 100 ml P. lacuna-Zellsuspension (siehe Materialtabelle) bei 10.000 U/min für 3 min. OD bei 750 nm messen (gewünschter Wert = 0,35).
  5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 15 min bei 6.000 × g. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 800 μL (Gesamtvolumen einschließlich Restflüssigkeit und Filamente) der verbleibenden Flüssigkeit und des zusätzlichen f / 2 + -Mediums.
  6. Nehmen Sie acht f/2+ Bacto-Agar-Platten (10 cm Durchmesser) mit 120 μg/ml Kanamycin. Pipette 10 μg DNA in die Mitte jeder Agarplatte. Pipettieren Sie sofort 100 μL Zellsuspension in die Mitte jeder Agarplatte (oben auf der DNA).
  7. Bewahren Sie die Agarplatte ohne Deckel auf der sauberen Bank auf, damit die überschüssige Flüssigkeit verdunsten kann. Schließen Sie den Teller und kultivieren Sie ihn 2 Tage lang in weißem Licht bei 25 °C.
  8. Verteilen Sie die Filamente jeder Agarplatte mit einer Impfschleife auf mehrere frische f/2+ Bacto-Agar-Platten mit 120 μg/ml Kanamycin. Die Platten bei 25 °C in weißem Licht kultivieren und die Kulturen regelmäßig unter dem Mikroskop überprüfen.
  9. Identifizieren Sie lebende, transformierte Filamente nach 7-28 Tagen unter dem Mikroskop. Suchen Sie nach gesunden, grünen Filamenten (Abbildung 2), die sich von anderen Filamenten unterscheiden. Wenn diese grünen Filamente identifiziert werden können, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort; Andernfalls bewahren Sie die Platte für weitere 7 Tage auf.
  10. Verwenden Sie eine Pinzette, um diese identifizierten lebenden Filamente in 50 ml flüssiges f / 2 + - Medium mit 250 μg / ml Kanamycin zu übertragen. Bei weißem Licht bei 25 °C auf einem Shaker kultivieren (horizontale Drehung, 50 U/min). Beobachten Sie das Wachstum bis zu vier Wochen lang.
  11. Übertragen Sie die Filamente zurück auf Agarmedium, das 250 μg/ml Kanamycin enthält, und warten Sie, bis die Filamente wachsen. Nach einigen Tagen einzelne Filamente auf eine frische Agarplatte mit einer höheren Konzentration an Kanamycin, z. B. 500 μg/ml, übertragen. Behalten Sie die Originalplatte bei.
  12. Stellen Sie sicher, dass die Filamente in einer hohen Konzentration von Kanamycin in flüssiger Kultur oder auf Agar vermehrt werden. Erhöhen Sie die Kanamycinkonzentration erneut, um die Segregation zu beschleunigen.
    HINWEIS: Transformierte P. lacuna wächst in bis zu 10.000 μg/ml Kanamycin. Andere Arten tolerieren solche hohen Konzentrationen möglicherweise nicht.
  13. Wenn resistente Zellen gezüchtet und breit über eine Platte verteilt werden, testen Sie die Integration des Inserts in das Genom von P. lacuna , indem Sie eine PCR mit äußeren und inneren Primern durchführen.
    1. Verwenden Sie Primer, die für das Klonen der Einfügung als innere Primer entwickelt wurden.
    2. Für das Design der äußeren Primer wählen Sie Sequenzen, die 5' und 3' der vorgeschlagenen Insertionsstelle auf dem Genom von P. lacuna , aber außerhalb der Insertion sind.
    3. Verwenden Sie für PCR-Reaktionen innere Primer und äußere Primer. Verwenden Sie die resistenten Stämme und den Wildtyp.
      HINWEIS: Innere Primer zeigen an, dass der Einsatz vorhanden ist. Äußere Primer zeigen, dass der Einsatz am richtigen Ort eingesetzt wird.
  14. Geben Sie für jede PCR-Reaktion ~ 10 mg der Filamente direkt in die PCR-Röhrchen und führen Sie eine PCR gemäß den Standardprotokollen24 durch. Wenn kein Produkt erhalten wird, variieren Sie die Glühtemperatur und waschen Sie die Filamente mit Wasser.
    HINWEIS: Viele verschiedene Polymerasen können in der PCR verwendet werden. Standardpolymerasen wie die Taq-Polymerase haben eine höhere Fehlerrate als fehlerprüfende Polymerasen, die teurer sind. Diese analytische PCR erfordert keine fehlerprüfende Polymerase. Die Fehlerprüfung der Polymerase sollte jedoch getestet werden, wenn kein PCR-Produkt mit einer Standardpolymerase erhalten wird.
  15. Analysieren Sie die PCR-Produkte der resistenten Linie auf Agaroseelektrophorese24.
    1. Vergleichen Sie die Bandpositionen mit dem Marker und vergleichen Sie den Wildtyp und das Transformant. Suchen Sie bei inneren und äußeren Primern nach einem größeren Band für den Transformator als der Wildtyp (aufgrund des Einsetzens der Widerstandskassette) oder nach zwei Bändern für den Transformator: eines mit der Größe des Wildtypbandes und ein größeres. Da der letztere Fall auf eine unvollständige Segregation hinweist, setzen Sie die Kultivierung mit hohen Kanamycinkonzentrationen fort.
      HINWEIS: Weitere Informationen zu PCR und Elektrophorese finden Sie in 15,24 oder anderer Standardliteratur.
  16. Für die GFP-Expression: Beobachten Sie einzelne Filamente mit einem Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) bei einer Vergrößerung des auf 40x oder 63x eingestellten Objektivs. Nehmen Sie ein Hellfeldübertragungsbild und ein Fluoreszenzbild auf. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für GFP: 470-nm-Bandpass für Anregung, 525-nm-Bandpass für Emissionen und einen 495-nm-Strahlteiler, anfängliche Belichtungszeit von 500 ms.
  17. Passen Sie die Belichtungszeit für klare Fluoreszenzsignale an, um Sättigungsintensitäten zu vermeiden. Versuchen Sie, für alle Beispiele dieselbe Einstellung zu verwenden.
  18. Da die Wildtyp-Filamente auch Fluoreszenz anzeigen, nehmen Sie Bilder mit den gleichen Einstellungen wie oben für diese Hintergrundfluoreszenz auf.
    HINWEIS: Die Dehnung, die GFP ausdrückt, muss ein höheres Signal haben; Andernfalls drückt es nicht GFP aus.
  19. Anhand der Belichtungszeiten und der Pixelintensitäten der Fluoreszenzbilder wird der GFP-Gehalt der verschiedenen Filamente berechnet und verglichen.

4. Kryokonservierung

HINWEIS: P. lacuna und das einzellige Cyanobakterium Synechocystis sp. Zum Einsatz kommen PCC 6803. Die vorliegende Methode funktioniert besser für P. lacuna.

  1. P. lacuna oder Synechocystissp PCC 6803 mindestens 10 Tage lang in 10 ml f/2+ bzw. BG-11 Medium unter weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) bei 25 °C unter Bewegung (horizontale Umdrehungen, 50 U/min) kultivieren.
  2. Homogenisieren Sie die P. lacuna-Kultur (siehe Materialtabelle) bei 10.000 U/min für 3 min oder mit einem Ultraschallgerät (siehe Materialtabelle) für 2 min bei voller Energie. Bestimmen Sie OD 750 nm einer der Kulturen, um zu überprüfen, ob der Wert zwischen 1 und 7 liegt.
  3. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 15 min. Entfernen Sie den Überstand.
  4. Suspensionieren Sie das Zellpellet in 800 μL f/2+ oder BG-11 Medium (Endvolumen) und übertragen Sie es auf ein 2 ml Kryo. Geben Sie 800 μL einer 50% igen Glycerinlösung in die Zellsuspension. Schließen Sie die Durchstechflasche und mischen Sie sie durch wiederholtes Umdrehen.
  5. Überführen Sie das Kryoöl in flüssigen Stickstoff und lagern Sie es in einer Kryobox in einem -80 °C Gefrierschrank. Notieren Sie sich die Position der Box im Gefrierschrank und die Koordinaten der Probe innerhalb der Box.
  6. Zur Wiederherstellung der Zellen nehmen Sie das Kryo heraus und tauen Sie den Inhalt bei Raumtemperatur auf. Den Inhalt in ein 2 ml Reaktionsrohr überführen.
  7. Waschen Sie die Probe zweimal. Für die 1.Wäsche 5 min bei 6.000 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 2 ml f/2+ oder BG-11 Medium. Für die 2. Wäsche 5 min bei 6.000 × g rezentrifugieren, den Überstand entfernen und das Pellet in 2 ml f/2+ oder BG-11 Medium suspendieren.
  8. Um die Integrität dieser kultivierungsbereiten Zellen zu überprüfen, übertragen Sie das Pellet auf 9 ml Medium und kultivieren Sie es in weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) unter Bewegung (55 U / min). Vergleichen Sie die OD 750 nm der Kultur am ersten Tag und nach 1 Woche.

5. Motilität von Phormidium lacuna

HINWEIS: Es werden drei verschiedene Assays beschrieben. In allen Fällen wird die gleiche Kultur verwendet.

  1. P. lacuna in f/2 Medium unter horizontaler Bewegung (50 U/min) in weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) für ~5 Tage kultivieren, bis die geschätzte OD 750 nm 0,35 beträgt. Lagern Sie die Probe bis zum Gebrauch bei 4 °C.
  2. Homogenisieren Sie die Filamente (siehe Materialtabelle) bei 10.000 U/min für 3 min oder mit Ultraschall (siehe Materialtabelle) für 1 min bei maximaler Leistung und Zyklus von 1. Messen Sie OD 750 nm. Bei über 0,35 wird der Anteil mit f/2-Medium verdünnt. Verwenden Sie diese Lösung in Motilitätsassays in den Schritten 5.3, 5.4 und 5.5.
  3. Assay für Bewegung in flüssigem Medium
    1. Zur direkten Beobachtung der Motilität werden 8 ml P. lacuna enthaltendes Medium (ab Schritt 5.2) in eine 6 cm große Petrischale überführt. Warten Sie einige Minuten, bis die Probe Raumtemperatur erreicht hat. Die Petrischale mit Zellophanfolie bedecken.
    2. Legen Sie einen Objektträger auf den x-y-Tisch eines Standardmikroskops mit einer Kamera. Schalten Sie das Mikroskoplicht ein. Verwenden Sie idealerweise immer die gleichen elektrischen und optischen Einstellungen für die Beleuchtung. Bewegen Sie ein 4- oder 10-faches Ziel in den Weg des Lichts.
    3. Legen Sie die Petrischale auf die Rutsche. Passen Sie einzelne Filamente oder Filamentbündel durch x-, y- und z-Bewegungen des Tisches an.
      HINWEIS: Aufgrund der dreidimensionalen Anordnung kann nur ein Teil des relevanten Abschnitts im Fokus stehen. Die Zellophanfolie ermöglicht es, den Fokus uneingeschränkt einzustellen.
    4. Beobachten Sie Bewegungen einzelner Filamente oder Bündel. Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse die Flüssigkeit nicht berührt. Zeichnen Sie die Bewegungen von Filamenten mit einer Standard-Mikroskopkamera auf (siehe Supplemental Video S1).
  4. Assay für Bewegung auf der Oberfläche
    1. Zur Beobachtung der Filamentmotilität auf Agaroberflächen 6 cm Petrischalen mit f/2 Bacto-Agar zubereiten. Stellen Sie sicher, dass das Agar hoch genug ist, damit sich das Objektiv der Agaroberfläche nähert. Alternativ können Sie eine ~ 3 mm dicke Agarschicht herstellen und die Filamente durch das Agar aufzeichnen (halten Sie die Platte auf dem Kopf oder verwenden Sie ein inverses Mikroskop).
    2. Pipette 0,5 ml einer Lösung, die P. lacuna (aus Schritt 5.2) auf der Bacto-Agar-Oberfläche einer 6 cm großen Petrischale enthält. Lassen Sie die Flüssigkeit in die Oberfläche eindringen. Schließen Sie die Petrischale und beobachten Sie die Bewegung der Filamente auf der Oberfläche mit einem 4x- oder 10x-Objektiv.
    3. Stellen Sie sicher, dass während der gesamten Aufnahme und bei nachfolgenden Aufnahmen die gleichen elektrischen und optischen Einstellungen des Mikroskops verwendet werden.
    4. Nehmen Sie Zeitrafferaufnahmen mit einer Augenkamera und einem Minicomputersystem auf. Stellen Sie sicher, dass das Zeitintervall zwischen den nachfolgenden Bildern 5 s-1 min beträgt. Programmieren Sie das Linux-Skript des Minicomputers, um die Zeitrafferaufzeichnung zu steuern. Siehe Supplemental File 2 für ein Beispielskript und Supplemental Video S2 als Beispiel.
  5. Assay für Phototaxis
    1. Für Phototaxis-Experimente bereiten Sie Leuchtdiodenhalter (LED) (hier mit einem 3D-Drucker) vor, in denen die ausgewählten 5-mm-LEDs montiert sind, um eine Fläche von 20 mm 2 von unten nach oben abzustrahlen (Abbildung 3). Verwenden Sie bei Bedarf viele LED-Halter parallel und verbinden Sie jede LED elektrisch über einen Widerstand und ein Potentiometer mit einer einstellbaren Stromversorgung. Messen und justieren Sie je nach Experiment die LED-Intensitäten. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Einstellung in einem dunklen Raum oder einem geschlossenen dunklen Behälter befindet.
    2. 8 ml des Mediums, das P. lacuna enthält (ab Schritt 5.2), in eine 6 cm große Petrischale geben. Stellen Sie die Lichtintensität der LED ein. Schließen Sie die Petrischale mit dem Deckel und legen Sie sie auf einen LED-Halter, so dass sich die LED in der Mitte der Petrischale befindet.
    3. Nehmen Sie nach der gewünschten Dauer (in der Regel 2 Tage) ein Bild der Petrischale mit einer Smartphone-Kamera auf, die direkt auf die Position der Lichtbehandlung gerichtet ist. Verwenden Sie ein weißes LED-Panel für die Bestrahlung der Probe. Verwenden Sie die manuellen Einstellungen der Kamera; Lichtreflexionen vermeiden; Passen Sie sich immer an, um den gleichen Abstand zwischen dem Kameraobjektiv und der Probe zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Belichtungseinstellungen ein Bild liefern, das für spätere Analysen mit ImageJ geeignet ist.
    4. Quantifizieren Sie den Durchmesser des zentralen Kreises von Filamenten mit der ImageJ-Software.
      1. Öffnen Sie ImageJ, klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie, wählen Sie die gewünschte Datei aus, und klicken Sie auf die EINGABETASTE.
      2. Wählen Sie die Schaltfläche Gerade (mit einer geraden Linie) aus. Drücken Sie die linke Maustaste, um eine Linie von einem Ende der Petrischale zum gegenüberliegenden Ende zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass die Leitung durch die Mitte des Kreises der Filamente verläuft.
      3. Drücken Sie Strg-K auf der Tastatur oder klicken Sie auf | analysieren Plotprofil im Menü ImageJ Suchen Sie nach einem x-y-Fenster mit Pixelintensitäten, die im Vergleich zur Entfernung dargestellt werden - ein 1D-Profil der Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die niedrigste Pixelintensität leicht über 0 und der höchste Wert unter 255 liegt.
      4. Schätzen Sie einen Durchschnittswert für die Pixelintensität außerhalb des Kreises und einen weiteren Durchschnittswert für die Pixelintensität im Kreis. Schätzen Sie an der y-Position zwischen diesen Werten die x-Werte beider Seiten des Kreises, indem Sie mit der Maus auf diese Positionen zeigen. Notieren Sie sich beide Werte und berechnen Sie die Differenz.
      5. Ermitteln Sie den höchsten x-Wert, indem Sie mit der Maus auf die y-Achse rechts zeigen. Beachten Sie, dass dieser Wert e den Durchmesser der Petrischale darstellt. Wenn dieser Durchmesser 5 cm beträgt, berechnen Sie den Durchmesser des zentralen Filamentkreises als d/e × 5 cm.

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Representative Results

Nach den oben genannten Methoden wurden 5 verschiedene Stämme von P. lacuna aus Gesteinsbecken isoliert und sequenziert (Abbildung 1 und Tabelle 1). Alle Kulturen waren nach ~ 1 Jahr Subkulturation steril, mit Ausnahme von P. lacuna HE10JO. Dieser Stamm ist immer noch mit Marivirga atlantica, einem Meeresbakterium, kontaminiert. Bei anschließenden Helgoland-Exkursionen wurden weitere fadenförmige Cyanobakterien aus Gesteinsbecken isoliert, die sich von P. lacuna unterscheiden und charakterisiert werden müssen.

Mehrere DNA-Extraktions- und Aufreinigungsmethoden wurden auf P. lacuna getestet. Die besten Ergebnisse wurden mit einer optimierten CTAB-Methode wie oben beschrieben erzielt. Die DNA-Ausbeuten betrugen 310 ± 50 μg/ml, OD 260 nm/OD 280 nm 1,7 ± 0,03 und OD 260 nm/OD 230 nm 0,78 ± 0,04 (n = 17). Die Genomsequenzierung zeigte, dass die DNA aller Stämme wie erwartet leicht unterschiedlich war (Tabelle 1). Kernproteinsequenzen zeigten eine maximale Differenz von 0,04% (Tabelle 2). Obwohl alle Genomentwürfe unvollständig waren, kann man davon ausgehen, dass >98% des Genoms von HE10JO30 sequenziert wurden. Diese Schätzung basiert auf der Anzahl unvollständiger offener Leseframes. Partielle Proteinsequenzen konnten nach der RAST-Annotation von HE10DO und HE10JO leicht identifiziert werden. In HE10JO hatten 60 Proteine von ~4.500 eine fehlende N- oder C-terminale Sequenz. Die Genomsequenzen befinden sich in der Ergänzung (Supplemental File 3, Supplemental File 4, Supplemental File 5, Supplemental File 6 und Supplemental File 7).

Interessanterweise wurden Stämme der gleichen Art von zwei Inseln, Helgoland und Giglio, isoliert. Die lineare Entfernung zwischen beiden Inseln beträgt 1.400 km. Zwischen beiden Orten muss eine Verbindung bestehen, z.B. durch Schiffe über das Meer oder, was wahrscheinlicher ist, durch Zugvögel. Viele Vogelarten können auf beiden Inseln gefunden werden, und viele von ihnen sind Zugvögel. Die Vielfalt innerhalb der P. lacuna-Stämme einer Insel war größer als zwischen den nächstgelegenen Helgoland- und Giglio-Stämmen (Tabelle 2). Dies deutet auf einen intensiven Austausch zwischen beiden Orten hin.

Die natürliche Umwandlung wurde mit HE10DO als Hauptstamm und mit HE10JO getestet. Das vorliegende Protokoll ist aufgrund der reduzierten Anzahl von Waschschritten und weniger Transferschritten nach der Umwandlung einfacher als das zuvorbeschriebene Protokoll 12. Diese neue Methode wird kontinuierlich im Labor eingesetzt; ~15 erfolgreiche Transformationen wurden erreicht.

Die KanR-Widerstandskassette wurde üblicherweise in die homologe Stelle integriert, die durch die angrenzenden Bereiche definiert wurde, wie die PCR unter Verwendung von inneren und äußeren Grundierungen zeigt. Wie die meisten Cyanobakterien ist P. lacuna polyploid. Es kann mehr als 100 Chromosomen pro Zelle12 haben. Ein PCR-Test mit äußeren Primern ~ 1 Woche nach der Transformation hat typischerweise 2 Bänder auf dem Elektrophoresegel, eine mit der Größe der Wildtyp-Band und eine langsamer wandernde Bande, die das Einsetzen der Widerstandskassette anzeigt (Abbildung 4). Das Doppelband zeigt an, dass nur ein Unterbruch der Chromosomen die Insertion enthält. Nach 4 Wochen Selektion unter Kanamycin ist die Segregation in der Regel abgeschlossen und nur eine große PCR-Bande erscheint auf Gelen. Bei der Transformation mit pMH1 (siehe unten) war die Segregation jedoch nach mehr als 3 Monaten abgeschlossen.

Die Vektoren pAK1, pAK2, pAK3 und pMH1 wurden für Tests des sfGFP-Ausdrucks konstruiert. In pAK1, pAK2 und pAK3 steht das sfGFP-Gen unter der Kontrolle der Promotoren cpc560, A2813 bzw. psbA2. Diese Promotoren stammen von Synechocystis sp. PCC 6803 oder Synechococcus sp. PCC 700231. Für die Konstruktion dieser Vektoren wurden die sfGFP-Promotor- und Terminatorsequenzen aus Vektoren entnommen, die für die Transformation von Synechococcus sp. PCC 700231 verwendet wurden. Die relevanten Sequenzen wurden in die homologe chwA (sc_7_37)-Stelle von pFN1 (oder pFN_7_37_KanR15) integriert. Der pMH1-Expressionsvektor wurde durch DNA-Synthese unter Verwendung von P. lacuna-Sequenzen als Vorlagen konstruiert (Supplemental File 6). Die cpcB-cpcA-Sequenzen (Phycocyanin ß und Phycocyanin α) von P. lacuna sind seriell angeordnet. Ein intergener Bereich von 100 bp trennt beide Codierungsbereiche. Die synthetische Sequenz enthielt diese endogene cpcB-cpcA-Sequenz und den cpcB-Promotor. Die sfGFP- und KanR-Kassette wird nur 3' des cpcB-Stoppcodons (5' von cpcA) platziert. Die gesamte synthetische Sequenz mit cpcB-Promotor, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' bis 3') wird in pUC19 geklont. Eine Karte ist in Abbildung 5 dargestellt. Weitere Einzelheiten zum Klonen von pAK1, pAK2 und pAK3 sowie zur vollständigen Sequenz von pMH1 finden Sie in der Ergänzungsdatei 1.

Alle 4 Transformatoren (mit pAK1, pAK2, pAK3 und pMH1) drückten GFP aus; alle Fluoreszenzwerte lagen über der Hintergrundfluoreszenz von Wildtyp-Filamenten (Abbildung 6). Die pMH1-Transformatoren mit unvollständiger Entmischung zeigten ein GFP-Signal, das zwischen den Filamenten sehr variabel war. Das Fluoreszenzsignal war gleichmäßig verteilt, wenn die Seigerung abgeschlossen war (Abbildung 6E). Die Mikroskopsignale der Transformatoren pAK1, pAK2 und pAK3 waren ähnlich, aber ~5x schwächer als die von pMH1 (Abbildung 6E).

Die etablierte Kryokonservierungsmethode basiert auf einer Methode, die für E. coli etabliert wurde. Als 2 Waschschritte zur Glycerinentfernung nach dem Auftauen durchgeführt wurden, überlebten 15 von 15 P. lacuna-Proben (Tabelle 3). Dieses Protokoll könnte auch für Synechocystis PCC 6803 verwendet werden, jedoch nur mit 2 Waschschritten und nicht mit 1 (Tabelle 3).

Ein weiteres Merkmal von Oscillatoriales-Filamenten ist ihre Motilität: P. lacuna-Filamente bewegen sich kontinuierlich auf Oberflächen (Abbildung 7) und in einem flüssigen Medium (Abbildung 8). Beide Bewegungsarten lassen sich problemlos in Petrischalen ohne oder mit Agarmedium studieren. Zeitrafferaufzeichnung ist erforderlich, da die Bewegung auf Agar langsam ist. Filamente bewegen sich in Richtung Lichtkegel, wenn ein Lichtstrahl von unten kommt (Abbildung 3). Die Auswirkungen von Lichtintensität, Wellenlänge und Zeit können mit einem einfachen Setup leicht untersucht werden. Die Photorezeptoren dieses Effekts sind noch nicht klar. Mögliche Kandidaten können mit Knockout-Mutanten angesprochen werden. Der Mechanismus, der zugrunde liegt, wie die Filamente das Licht finden, ist ebenfalls unklar. Für diese Frage ist ein Infrarotsystem erforderlich, um die Filamente während ihrer Bewegung von der Dunkelheit zum Licht aufzuzeichnen.

Figure 1
Abbildung 1: Stämme von Phormidium lacuna , die aus Helgoland und Giglio gesammelt wurden. Filamente werden 11 Tage lang auf f/2 Agar in 6 cm Petrischalen vermehrt. a) Stamm GI08AO; B) Stamm GI08IO; C) Stamm GI09CO; (D) Belastung HE10DO; (E) HE10JO abseihen; (F) Stamm HE15M2G1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Phormidium lacuna Filamente 5 Wochen nach der Transformation. Es wurde der sfGFP-Ausdrucksvektor pMH1 verwendet; Die Selektion erfolgte auf f/2+ Medium mit 120 μg/ml Kanamycin. Die grünlichen Filamente sind widerstandsfähig und lebendig; andere Filamente sind gestorben. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Phototaxis-Experiment. Links: LED-Halter mit 4 roten LEDs, angeschlossen an ein einstellbares Netzteil. Auf jeder LED befindet sich eine 6 cm große Petrischale mit 8 ml einer Phormidium-Lacuna-Kultur. Rechts: Petrischale mit P. lacuna nach 2 Tagen auf der roten LED (15 μmol m-2 s-1). Abkürzung: LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Integration und Segregation des Einsatzes nach Transformation von Phormidium lacuna mit pAK1. PCR mit äußeren Primern. Die erwarteten Größen des Produkts ohne und mit Einsatz betragen 2371 bzw. 5016 bp. Linke Spur: Marker, Bahnen 1, 2, 3, 4: PCR-Produkte von Filamenten 7 Tage, 11 Tage, 14 Tage bzw. 17 Tage nach der Isolierung eines resistenten Filaments (4 Wochen nach der Transformation). Lane 5: PCR-Produkt des Wildtyps (aus einem anderen Gel). In der 7-Tage-Probe ist der Einsatz in einem kleinen Bruchteil der Chromosomen vorhanden. Dieser Anteil erhöht sich bis zu 17 Tagen, an denen kein Wildtypband sichtbar ist, d.h. die Segregation abgeschlossen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Vektor für die sfGFP-Expression unter Kontrolle des endogenen cpcB-Promotors . Orange: Phormidium lacuna homologe Sequenz, violett/blau: pUC-19 Vektor-Backbone, grün: insert mit sfGFP und KanR. Abkürzungen: sfGFP = superfolder green fluorescent protein; KanR = Kanamycin-Resistenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Expression von sfGFP in Phormidum lacuna. Fluoreszenzbilder von P. lacuna-Wildtyp-Filamenten (A) und nach Transformation mit pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) und pMH1 (E). In pMH1 wird das sfGFP-Gen 3' des Phycocyanin-ß-Gens platziert und daher vom endogenen cpcß-Promotor angetrieben; In den anderen Fällen wird sfGFP von cpc560, A2813 oder psbA2s Promotoren von Synechocystis PCC 6803 angetrieben. Die Fluoreszenzeinstellungen sind spezifisch für GFP; Alle Bilder wurden mit der gleichen Integrationszeit und den gleichen optischen Einstellungen aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Zusammengeführtes Bild von Phormidium lacuna auf Agaroberfläche bei 4-facher Vergrößerung. Das erste Bild wird in Rot dargestellt, das zweite (1 Minute später aufgenommen) in Grün. Beachten Sie auch die Spuren auf dem Agar. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Zusammengeführtes Bild von Phormidium lacuna in flüssigem Medium. Das Zeitintervall zwischen beiden Bildern betrug 10 s. Das erste Bild ist in Rot gedruckt; Die zweite ist grün gedruckt. Der Vergleich beider Farben zeigt die Bewegung innerhalb von 10 s. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Dehnung HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Contigs 104 174 218 102 154
BIP insgesamt 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tabelle 1: Phormidium-Lacuna-Stämme

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

Tabelle 2. Aminosäureunterschiede zwischen Stämmen in Sequenzen von 20 Kernproteinen mit 10.876 Aminosäuren.

Zelldichte OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Wäscht 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis PCC 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Phormidium lacuna HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tabelle 3: Kryokonservierungsversuche mit Synechocystis PCC 6803 und Phormidium lacuna HE10DO-Cyanobakterien . Die erste Zahl zeigt die Anzahl der Kulturen, die nach dem Einfrieren/Auftauen überlebt haben; Die zweite Zahl zeigt die Gesamtzahl der Studien.

Ergänzendes Video S1: Bewegung von Phormidium lacuna-Filamenten in flüssiger Lösung, ohne Zeitraffer. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video S2: Bewegung von Phormidium lacuna Filamenten auf Agaroberfläche, mit Zeitraffer. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Klonen von Vektoren zur Transformation von Phormidium lacuna. Liste der Transformationsvektoren; Liste der Primer zum Klonen; Sequenz von pMH1 im GB-Format. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Shell-Skripte (sh) für Raspberry Pi Minicomputer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: DNA-Sequenz von HE152G1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: DNA-Sequenz von GI08AO. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 5: DNA-Sequenz von GI09CO. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 6: DNA-Sequenz von HE10DO. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 7: DNA-Sequenz von HE10JO. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Obwohl viele Stämme von Cyanobakterien aus den Kultursammlungen 32,33,34,35,36 verfügbar sind, besteht immer noch eine Nachfrage nach neuen Cyanobakterien aus der Wildnis, da diese Arten an bestimmte Eigenschaften angepasst sind. P. lacuna wurde aus Felsenbecken gesammelt und ist an Variationen der Salzkonzentrationen und der Temperatur30 angepasst. Stämme dieser Art wurden bei Exkursionen in den Jahren 2008, 2009 und 2010 gefunden. Mit dem hier beschriebenen Verfahren wurden 5 Stämme von P. lacuna isoliert und 4 dieser Stämme waren steril. Der Stamm P. lacuna HE10JO ist dauerhaft mit dem Bakterium Marivirga atlantica kontaminiert, einem marinen Bakterium, das durch rRNA- und Genomsequenzierung identifiziert wurde. Dieses Bakterium konnte trotz der Anwendung der mechanischen Trennung, des Wachstums bei verschiedenen Temperaturen, Behandlungen mit Antibiotika oder chemischer Behandlungen nicht vom Cyanobakterium getrennt werden. Trotz der Kontamination kann P. lacuna HE10JO ähnlich wie die anderen Sorten kultiviert werden. Bei späteren Exkursionen wurden weitere Mitglieder von Oscillatoriales gefunden, die noch nicht im Detail analysiert werden. P. lacuna wurde nicht wiedergefunden. Es ist nicht klar, warum P. lacuna in den folgenden Jahren und an zwei verschiedenen Orten isoliert wurde, aber später nicht gefunden wurde. Seine Häufigkeit hängt sicherlich von unvorhersehbaren Bedingungen ab. Temperatur, Salzkonzentrationen und anorganische oder organische Nährstoffe sind in Gesteinsbecken sehr unterschiedlich. Daher könnte die Artenzusammensetzung im Laufe der Zeit auf unvorhersehbare Weise schwanken.

Die natürliche Transformation wird für verschiedene Cyanobakterien, meist einzellige Arten, etabliert. Die fadenförmige P. lacuna ist die einzige Art der Ordnung Oscillatoriales, für die eine natürliche Transformation etabliert wurde. Die Transformation war mit dem vorliegenden Protokoll fast immer erfolgreich. Im Allgemeinen variiert die Anzahl der resistenten Filamente nach einem Transformationsversuch erheblich, und manchmal schlägt die Transformation fehl, was zum Verlust wertvoller Zeit führt. Es empfiehlt sich daher, mehrere Transformationsprojekte parallel durchzuführen. Die Zeit für die vollständige Seigerung, in der Regel 4 Wochen nach Isolierung des resistenten Stammes, kann ebenfalls variieren. Da es keine Garantie für eine vollständige Segregation nach dem Wachstum von Kanamycin gibt, ist es wichtig, die PCR-Tests mit äußeren und inneren Primern durchzuführen.

Jeder Vektor muss 2 x 500-1.000 bp homologe Sequenzen enthalten, z.B. vom Wirt durch PCR verstärkt und durch eine Widerstandskassette unterbrochen (z.B. die hier verwendete Kanamycin-Kassette KanR)37,38. Für den Ausdruck müssen ein Promotor, eine Kodierungssequenz (z. B. für sfGFP39), ein Terminator und eine Widerstandskassette zwischen den homologen Sequenzen geklont werden. Die Klonstrategien sind artspezifisch und hängen vom Ziel des Experiments ab.

Diese Transformationsmethode könnte auch mit anderen Oscillatoriales-Stämmen oder anderen Cyanobakterien möglich sein: Die natürliche Transformation basiert auf Typ-IV-Pili, die in fast jedem anderen cyanobakteriellen Genom 3,15,40 vorhanden sind. Daher könnte die derzeitige Methode neue Versuche mit anderen Arten anregen. Da Typ-IV-Pili auch für die Motilität relevant sind, ist es wichtig, nach Bedingungen zu suchen, unter denen Cyanobakterien beweglich sind.

Die Geninsertion basiert auf homologer Rekombination und führt zu einer Störung der homologen Stellen. Daher wird die Transformation oft für Gen-Knockout verwendet. Die Expression des eingefügten Gens wird induziert, wenn ein aktiver Promotor und eine kodierende Sequenz in die homologe Stelle integriert werden. Bei P. lacuna war die Promotoraktivität von der Art abhängig. Die Promotoren cpc560, A2813 und psbA2 von Synechocystis PCC sp 6803 oder Synechococcus sp. PCC 7002 31 und der cpcB-Promotor von P. lacuna könnten die sfGFP-Expression antreiben. Von diesen Konstrukten induzierte der endogene cpcB-Promotor die stärkste Expression, obwohl sich das sfGFP-Gen 3' des Phycocyanin-ß-Gens befindet. Dies deutet auf eine allgemeinere Verwendung von endogenen Promotoren in der Cyanobakterienexpression hin.

Die Kombination von Gen-Knockout- und Bewegungsstudien wird Aufschluss über molekulare Mechanismen von Motilität und Phototaxis geben. LED-Lichtquellen können Licht für Phototaxis-Experimente liefern. Fast jede Wellenlänge ist verfügbar, und die Lichtintensität kann durch eine einstellbare Stromversorgung und Potentiometer moduliert werden. LED-Halter können von 3D-Druckern gebaut werden, um Kombinationen verschiedener LEDs einfach zu realisieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Unterstützt wurde die Arbeit vom Karlsruher Institut für Technologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

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References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

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Biologie Ausgabe 180
Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums <em>Phormidium lacuna</em>
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Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

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