Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

Abstract

ציאנובקטריה הם המוקד של מחקר בסיסי ופרויקטים ביוטכנולוגיים שבהם אנרגיה סולארית מנוצלת לייצור ביומסה. פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד לאחרונה. מאמר זה מתאר כיצד ניתן לבודד ציאנובקטריה נימה חדשה מבורות סלעים ימיים. הוא גם מתאר כיצד ניתן לחלץ דנ"א מחוטים וכיצד ניתן לרצף את הגנומים. אף על פי שהטרנספורמציה נוצרת עבור מינים חד-תאיים רבים, היא מדווחת בתדירות נמוכה יותר על ציאנובקטריה נימה. שיטה פשוטה לטרנספורמציה הטבעית של P. lacuna מתוארת כאן. P. lacuna הוא החבר היחיד במסדר מתנדים שעבורו נוצרת טרנספורמציה טבעית. מאמר זה גם מראה כיצד טרנספורמציה טבעית משמשת לביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בעל קיפול יתר (sfGFP). מקדם cpcB אנדוגני גרם לביטוי חזק בערך פי 5 מאשר מקדמי cpc560, A2813 או psbA2 מ- Synechocystis sp. PCC6803. יתר על כן, הוקמה שיטה לשמירת ההקפאה של P. lacuna ו - Synechocystis sp.CPP 6803, ותוארו שיטות להערכת תנועתיות בתווך נוזלי ועל משטחי אגר ופלסטיק.

Introduction

ציאנובקטריה הם אורגניזמים פרוקריוטים המשתמשים בפוטוסינתזה כמקור אנרגיה 1,2. המחקר מתמקד יותר ויותר במינים ציאנובקטריאליים. ניתן לשנות מספר ציאנובקטריה באמצעות DNA3. גנים יכולים להיות מופלים או ביטוי יתר במינים אלה. עם זאת, השינוי מוגבל למינים בודדים 4,5,6,7,8,9,10,11, וזה יכול להיות קשה לבסס טרנספורמציה בזנים מאוספי תרבויות או 8 בטבע. זנים של המין הנימה Phormidium lacuna (איור 1) בודדו מבורות סלעים ימיים, שבהם התנאים הסביבתיים, כגון ריכוזי מלחים או טמפרטורה, משתנים עם הזמן. ציאנובקטריה נימה זו יכולה לשמש כאורגניזמים לדוגמה לסדר Oscillatoriales12 שאליו הם שייכים.

במהלך ניסויים שבדקו העברת גנים על ידי אלקטרופורציה13,14 נמצא כי P. lacuna יכול להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית15. בתהליך זה, הדנ"א נקלט באופן טבעי על ידי תאים מסוימים. בהשוואה לשיטות אחרות של טרנספורמציה16,17, לטרנספורמציה טבעית יש יתרון בכך שאינה דורשת כלים נוספים שעלולים לסבך את ההליך. לדוגמה, אלקטרופורציה דורשת cuvettes תקין, חוטים שלמים, ובחירת המתח הנכון. P. lacuna הוא כיום חבר המתנדים היחיד הרגיש לטרנספורמציה טבעית. מכיוון שהפרוטוקול המקורי מבוסס על פרוטוקולי אלקטרופורציה, הוא עדיין כלל מספר שלבי כביסה שעשויים להיות מיותרים. גישות שונות נבדקו כדי לפשט את הפרוטוקול, מה שהוביל לפרוטוקול הטרנספורמציה שהוצג כאן.

רצף הגנום חיוני למחקרים מולקולריים נוספים המבוססים על נוקאאוט גנים או ביטוי יתר. למרות שניתן להשיג רצפי גנום עם מכונות ריצוף מהדור הבא תוך תקופות קצרות, מיצוי הדנ"א יכול להיות קשה ותלוי במין. עם P. lacuna נבדקו מספר פרוטוקולים. לאחר מכן הוקמה שיטה שונה המבוססת על צטיל טרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB), וכתוצאה מכך נוצרה טוהר מקובל של דנ"א ותפוקות DNA של כל מחזור טיהור להמשך העבודה במעבדה. ניתן לרצף את הגנום של חמישה זנים באמצעות פרוטוקול זה. שלב הטרנספורמציה ההגיונית הבא היה לבסס ביטוי חלבונים ב-P. lacuna.

ניתן לזהות את ה-sfGFP המשמש כחלבון סמן בפרוטוקול זה באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל היזמים שנבדקו יכלו לשמש לביטוי P. lacuna sfGFP. המספר ההולך וגדל של זנים הנובעים מטרנספורמציה הביא לצורך בשיטה לאחסון התרבויות. שיטות כאלה הוקמו עבור Escherichia coli וחיידקים רבים אחרים18. בפרוטוקולים סטנדרטיים, תרביות גליצרול מוכנות, מועברות בחנקן נוזלי ומאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. שיטה זו דורשת רק כמה צעדים והיא אמינה מאוד עבור אותם מינים שעבורם היא הוקמה. הפרוטוקול הסטנדרטי לא היה אפשרי עבור P. lacuna מכיוון שלא ניתן היה לשחזר תאים חיים בכל המקרים. עם זאת, כאשר הגליצרול הוסר לאחר ההפשרה, תאים של כל הניסויים שרדו. שיטות פשוטות מוצגות לניתוח תנועתיות של P. lacuna, אשר ניתן לשלב עם מוטגנזה נוקאאוט כדי לחקור סוג IV pili או את התפקיד של photoreceptors. מבחנים אלה שונים מאלו של ציאנובקטריה חד-תאית 19,20,21 ויכולים להיות שימושיים גם עבור תנודות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד מהסביבה הטבעית

הערה: ניתן לבודד אצות ירוקות, דיאטומים, ציאנובקטריה נימה ומיקרו-אצות אחרות. הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל מיני מיקרו-אלגה מבורות סלעים הגדלים בתנאי מעבדה. ציאנובקטריה נימה השייכת לתנודות ניתן לזהות בקלות על ידי תנועתם וצורתם החוטית. ניתן לזהות את המין במצב חצי-פורה על ידי ריצוף גנום או ריצוף 16S rRNA.

  1. העברת דגימות מי ים נוזליים מבורות סלע ימיים (כלומר, חללים בחוף הסלעי) לצלוחיות של 50 מ"ל. עבור כל בקבוקון, שים לב למיקום המדויק או לקואורדינטות של המקור הטבעי. במידת האפשר, סנן את התוכן דרך רשתות של 50 מיקרומטר כדי להפחית את כמויות הזואופלנקטון. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לאחסן אותן בתת-תרבות.
  2. מעבירים תרביות של 1 מ"ל ל-10 ס"מ צלחות פטרי המכילות 3% בקט-אגר ב-f/2 בינוני 22,23 (ראו טבלת החומרים). הכן עד 20 צלחות. מטפחים תחת אור לבן של 50 מיקרומול m-2 s-1.
    הערה: ניתן להשתמש בעוצמות אור גבוהות יותר לטיפוח. עוצמה של עד 400 מיקרומול m-2 s-1 יכולה לשמש עבור P. lacuna, אם כי מינים אחרים עשויים להיות רגישים יותר לאור.
  3. לאחר שבוע, מעבירים את התאים הרצויים לצלחות אגר טריות באמצעות מלקחיים סטריליים. לבודד את התאים תחת מיקרוסקופ דו-עיני בתנאים סטריליים. אחסנו את צלחת האגר הישנה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהתאים יופיעו ויגדלו על צלחת האגר החדשה.
  4. חזור על שלב העברה זה מדי שבוע כדי למנוע זיהום. השתמש בעין בלתי לאיתור זיהום כבד ובמיקרוסקופ עם הגדלה של פי 400 לבדיקות נוספות לזיהום.
  5. אם דגימה נראית נקייה מזיהום, בדוק זיהום חיידקי או פטרייתי על צלחות אגר. מעבירים שבריר מהתרבית עם לולאת חיסון ללוח אגר LB24 (קוטר 10 ס"מ), שומרים על הצלחת בטמפרטורת החדר, ובודקים את צמיחת המזהמים במשך 1-3 ימים.
  6. אם מתקבל מין ציאנובקטריאלי נימה סטרילי, השתמש בו לעבודת תרבית נוספת. טפחו P. lacuna בנוזל או על צלחות בקטו-אגר. השתמש בצלוחיות של 250 מ"ל עם 50 מ"ל של f/2 בינוני או f/2+ בינוני לתרבית נוזלית.

2. מיצוי DNA

הערה: שיטה זו מאומצת מ - 25 26

  1. הכן שני צלוחיות עם 50 מ"ל של f /2 בינוני. חסן כל אחד עם ~ 1 מ"ל של חוטי P. lacuna מתרבויות צומחות אחרות. שמור את התרביות במשך 7 ימים או יותר תחת תסיסה (סיבוב אופקי) ב 50 סל"ד תחת אור לבן (50 μmol m-2 s-1) ב 25 °C (74 °F).
  2. טפלו בתרבית באמצעות אולטרסאונד (ראו את טבלת החומרים) למשך 2 דקות באנרגיה מלאה. מדוד OD ב- 750 ננומטר; בדוק כדי לוודא שזה ~ 0.5. המשך להגדיל את התרבויות אם ה- OD נמוך מדי.
  3. לאסוף את החוטים על ידי 5,000 × גרם, 20 דקות צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant. העבר את החוטים עם שאריות נוזלים לחדר של מכבש צרפתי27. הגדר את הלחץ של העיתונות הצרפתית ל-20,000 psi וחלץ את התאים.
    הערה: העיתונות הצרפתית תשקר את כל התאים ותשחרר את הדנ"א; כוחות גזירה חזקים ייצרו 1,500 שברי דנ"א של bp.
  4. צנטריפוגה הדגימה במשך 10 דקות ב 10,000 × g ולהסיר את supernatant.
  5. הוסיפו לכדור 400 μL של מאגר ליזיס (4 M אוריאה, 0.1 M Tris/Cl, pH 7.4) ו-50 μL של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל). מחממים את הדגימה ל-55 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות עם רעידות ב-550 סל"ד.
  6. הוסף 1 מ"ל של מאגר מיצוי DNA (3% CTAB, 1.4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0.1 M DTT, pH 8) ודגירה במשך 60 דקות ב 55 °C ו 550 סל"ד. העבר את הפתרונות לצינורות צנטריפוגה, והוסף שני נפחים של כלורופורם/איזואמילקוהול (24/1).
  7. לאחר הרעידות, צנטריפוגה הדגימה במשך 5 דקות ב 9,000 × גרם. מעבירים את השלב העליון והמימי לבקבוקוני התגובה ומוסיפים 1 מ"ל של אתנול קר כקרח ו-50 μL של 3 M נתרן אצטט.
  8. סובבו את הדגימה והניחו אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת או יותר.
  9. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 × גרם (4 ° C) ולהשליך את supernatant. לשטוף את הכדור עם 70% אתנול.
  10. צנטריפוגה שוב את המדגם. מוציאים את הסופרנטנט ומייבשים את הכדור למשך הלילה. ממיסים את הדנ"א במים נטולי נוקלאזות. מדוד את ספקטרום הדנ"א כדי לבדוק אם OD 260 ננומטר/OD 280 ננומטר הוא בין 1.6 ל-1.9.
  11. לנתח את גודל הדנ"א על ג'ל אלקטרופורזה אגרוז28.
  12. רוצחו את הדנ"א הגנומי לפי ריצוף הדור הבא במשך 300 מחזורים, עם הגדרת קצה מזווגת ואורך קריאה של 150 בסיסים (ראו טבלאות חומרים).
  13. בצע את ההרכבה עם תוכנית המחשב המתאימה; ראה את הדוגמה שניתנה בטבלת החומרים.
  14. שלח את טיוטת הגנום לשרת RAST לביאור.
    הערה: העלה רצפי דנ"א כדי לקבל ביאור מלא תוך מספר דקות.

3. טרנספורמציה טבעית וביטוי GFP

הערה: הטרנספורמציה מבוססת על וקטור פלסמיד המופץ ב- E. coli; pGEM-T או pUC19 עשויים לשמש כווקטורים של עמוד שדרה. טכניקות שיבוט מבוססות במעבדות רבות; ראה גם פרוטוקולים סטנדרטיים28 והמאמרים על וקטורי טרנספורמציה עבור P. lacuna15,29. דוגמאות לווקטורים לביטוי sfGFP מתוארות בסעיף התוצאות הייצוגיות. פרטים על ארבעה וקטורים שטרם פורסמו מופיעים בקובץ משלים 1.

  1. בצע את כל השלבים באמצעות חומר סטרילי בתנאי מעבדה סטריליים (ספסל נקי, כלי זכוכית סטריליים).
  2. חסן 2 x 50 מ"ל של f/2 תווך נוזלי בשני צלוחיות 250 מ"ל עם 2 x 1 מ"ל של חוטי P. lacuna מתרבות ריצה. יש לטפח באור לבן (50 μmol m-2 s-1) תחת תסיסה (סיבוב אופקי, 50 סל"ד) במשך כ-5 ימים ב-25 מעלות צלזיוס.
  3. הכן כ-200 מיקרוגרם של הדנ"א וקטורי של הטרנספורמציה באמצעות ערכת הכנה של midi (ראה טבלת החומרים) בהתאם להוראות היצרן.
  4. הומוגניזציה של 100 מ"ל של תרחיף תא P. lacuna (ראה טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות. מדוד OD ב- 750 ננומטר (ערך רצוי = 0.35).
  5. צנטריפוגה של תרחיף התא למשך 15 דקות ב-6,000 × גרם. הסר את הסופרנטנט, והשעה את הכדור ב- 800 μL (נפח כולל שאריות נוזלים וחוטים) של הנוזל הנותר ושל מדיום f/2+ נוסף.
  6. קח שמונה לוחות f/2+ בקט-אגר (קוטר 10 ס"מ) המכילים 120 מיקרוגרם /מ"ל קנאמיצין. פיפטה 10 מיקרוגרם של דנ"א באמצע כל צלחת אגר. מיד פיפטה 100 μL של תרחיף התא לאמצע כל צלחת אגר (על גבי הדנ"א).
  7. שמור את צלחת האגר ללא מכסה על הספסל הנקי כדי לאפשר לנוזל העודף להתאדות. סגרו את הצלחת וטפחו אותה באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
  8. פזרו את החוטים של כל צלחת אגר עם לולאת חיסון על מספר צלחות בקט-אגר טריות המכילות 120 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין. טפחו את הצלחות באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ובדקו את התרביות באופן קבוע תחת מיקרוסקופ.
  9. זהה חוטים חיים שעברו טרנספורמציה לאחר 7-28 ימים מתחת למיקרוסקופ. חפשו חוטים ירוקים ובריאים (איור 2) השונים מחוטים אחרים. אם ניתן לזהות את החוטים הירוקים האלה, המשך עם השלב הבא; אחרת, שמור את הצלחת עוד 7 ימים.
  10. השתמשו במלקחיים כדי להעביר את החוטים החיים המזוהים האלה ל-50 מ"ל של מדיום f/2+ נוזלי עם קנאמיצין של 250 מיקרוגרם/מ"ל. יש לטפח באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על שייקר (סיבוב אופקי, 50 סל"ד). צפו בצמיחה עד ארבעה שבועות.
  11. מעבירים את החוטים בחזרה למדיום אגר המכיל 250 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין ומחכים שהחוטים יגדלו. לאחר מספר ימים, העבירו חוטים בודדים לצלחת אגר טרייה עם ריכוז גבוה יותר של קנאמיצין, למשל, 500 מיקרוגרם/מ"ל. שמור על הצלחת המקורית.
  12. ודא כי החוטים מופצים בריכוז גבוה של kanamycin בתרבית נוזלית או על אגר. הגדל שוב את ריכוז הקנאמיצין כדי להאיץ את ההפרדה.
    הערה: P. lacuna שעבר טרנספורמציה גדל עד 10,000 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin. ייתכן שמינים אחרים לא יסבלו ריכוזים כה גבוהים.
  13. אם תאים עמידים גדלים ומופצים באופן נרחב על פני צלחת, בדקו את השילוב של התוסף בגנום של P. lacuna על ידי ביצוע PCR עם פריימרים חיצוניים ופנימיים.
    1. השתמש בפריימרים שנועדו לשיבוט ההחדרה כפריימרים פנימיים.
    2. לתכנון הפריימרים החיצוניים, בחרו רצפים שהם 5' ו-3' מאתר ההחדרה המוצע על הגנום של P. lacuna אך מחוץ להחדרה.
    3. לתגובות PCR, השתמשו בפריימרים פנימיים ובפריימרים חיצוניים. השתמשו בזנים העמידים ובסוג הפראי.
      הערה: פריימרים פנימיים מציינים שהתוספת קיימת; פריימרים חיצוניים מראים שהתוספת מוכנסת במוקד הנכון.
  14. עבור כל תגובת PCR, יש להניח כ-10 מ"ג מהחוטים ישירות בצינורות ה-PCR ולבצע PCR בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים24. אם לא מתקבל מוצר, לשנות את טמפרטורת החישול ולשטוף את החוטים עם מים.
    הערה: ניתן להשתמש בפולימראזות רבות ושונות ב-PCR. לפולימראזות סטנדרטיות, כגון Taq polymerase, יש שיעור שגיאה גבוה יותר מאשר פולימראזות לבדיקת שגיאות, שהן יקרות יותר. PCR אנליטי זה אינו דורש פולימראז לבדיקת שגיאות. עם זאת, יש לבדוק פולימראז לבדיקת שגיאות אם לא מתקבל מוצר PCR עם פולימראז סטנדרטי.
  15. לנתח את תוצרי ה- PCR של הקו העמיד על אלקטרופורזה אגרוזה24.
    1. השווה את מיקומי הפסים עם סמן והשווה את הסוג הפראי ואת הטרנספורמציה. עם פריימרים פנימיים וחיצוניים , חפשו רצועה גדולה יותר עבור הטרנספורמט מאשר הסוג הפראי (עקב החדרת קלטת ההתנגדות) או שתי רצועות עבור הטרנספורמט: אחת בגודל של רצועה מסוג פרא ואחת גדולה יותר. כפי שהמקרה האחרון מצביע על הפרדה לא שלמה, המשך טיפוח עם ריכוזי קנאמיצין גבוהים.
      הערה: לפרטים נוספים על PCR ואלקטרופורזה, ראה 15,24 או ספרות סטנדרטית אחרת.
  16. לביטוי GFP: שימו לב לחוטים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת החומרים) בהגדלה של המטרה שנקבעה על פי 40 או 63x. צלם תמונת שידור בשדה בהיר ותמונת פלואורסצנציה. השתמש בהגדרות הבאות עבור GFP: פס פס של 470 ננומטר לעירור, פס פס של 525 ננומטר לפליטה ומפצל קרן של 495 ננומטר, זמן חשיפה ראשוני של 500 אלפיות השנייה.
  17. התאם את זמן החשיפה לאותות פלואורסצנטיים ברורים, תוך הימנעות מעוצמות רוויות. נסה להשתמש באותה הגדרה עבור כל הדוגמאות.
  18. מכיוון שהחוטים מסוג פרא יציגו גם פלואורסצנציה, צלם תמונות עם אותן הגדרות כמו לעיל עבור פלואורסצנציה ברקע זה.
    הערה: המתח המבטא GFP חייב להיות בעל אות גבוה יותר; אחרת, הוא אינו מבטא GFP.
  19. בהתבסס על זמני החשיפה ועל עוצמות הפיקסלים של תמונות הפלואורסצנציה, חישבו והשוו את תוכן ה-GFP של החוטים השונים.

4. שימור קריו-קונסרבציה

הערה: P. lacuna והציאנובקטריום החד-תאי Synechocystis sp. PCC 6803 משמשים. השיטה הנוכחית עובדת טוב יותר עבור P. lacuna.

  1. טפח P. lacuna או Synechocystissp PCC 6803 במשך 10 ימים לפחות ב-10 מ"ל של f/2+ או BG-11 בינוני, בהתאמה, תחת אור לבן (50 μmol m-2 s-1) ב-25 °C תחת תסיסה (סיבובים אופקיים, 50 סל"ד).
  2. הומוגניזציה של תרבית P. lacuna (ראו טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות או עם מכשיר אולטרסאונד (ראו טבלת החומרים) למשך 2 דקות באנרגיה מלאה. קבע OD 750 ננומטר של כל אחת מהתרביות כדי לבדוק אם הערך הוא בין 1 ל- 7.
  3. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 × גרם במשך 15 דקות. הסר את ה-supernatant.
  4. השעו את גלולת התא ב-800 μL של מדיום f/2+ או BG-11 (נפח סופי) והעבירו לקריוביטל של 2 מ"ל. הוסף 800 μL של תמיסת 50% גליצרול לתרחיף התא. סגור את הבקבוקון וערבב על ידי היפוך חוזר ונשנה.
  5. מעבירים את הקריוביה לחנקן נוזלי ומאחסנים אותו בקופסת קריובוקס במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. שימו לב למיקום הקופסה בתוך המקפיא ולקואורדינטות של הדגימה בתוך הקופסה.
  6. להתאוששות התאים, מוציאים את הקריוביה ומפשירים את התוכן בטמפרטורת החדר. העבר את התוכן לצינור תגובה של 2 מ"ל.
  7. שטפו את הדגימה פעמיים. עבור שטיפה 1st , צנטריפוגה ב 6,000 × גרם במשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט, והחזיר את הכדור ב-2 מ"ל של f/2+ או BG-11 בינוני. עבור שטיפה2 nd , recentrifuge ב 6,000 × גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשאיל את הכדור ב 2 מ"ל של f/2+ או BG-11 בינוני.
  8. כדי לבדוק את שלמותם של תאים אלה המוכנים לטיפוח, העבירו את הכדור ל-9 מ"ל של מדיום וטיפחו אותם באור לבן (50 מיקרומול m-2 s-1) תחת תסיסה (55 סל"ד). השווה את OD 750 ננומטר של התרבות ביום הראשון ואחרי שבוע אחד.

5. תנועתיות של פורמידיום לקונה

הערה: יתוארו שלושה מבחנים שונים. אותה תרבות משמשת בכל המקרים.

  1. יש לטפח את P. lacuna במדיום f/2 תחת תסיסה אופקית (50 סל"ד) באור לבן (50 μmol m-2 s-1) במשך כ-5 ימים עד שה-OD המשוער של 750 ננומטר הוא 0.35. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. הומוגניזציה של החוטים (ראו טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות או באמצעות אולטרסאונד (ראו טבלת החומרים) למשך דקה אחת בעוצמה ובמחזור מרביים של 1. מדוד OD 750 ננומטר. אם מעל 0.35, דיללו את השבר עם תווך f/2. השתמש בפתרון זה במבחני תנועתיות בשלבים 5.3, 5.4 ו- 5.5.
  3. בדיקה לתנועה במדיום נוזלי
    1. לתצפית ישירה על תנועתיות, העבירו 8 מ"ל של מדיום המכיל P. lacuna (משלב 5.2) לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ. יש להמתין מספר דקות עד שהדגימה תגיע לטמפרטורת החדר. מכסים את צלחת הפטרי בנייר כסף צלופן.
    2. מקם שקופית מיקרוסקופ על שולחן x-y של מיקרוסקופ סטנדרטי עם מצלמה. הפעילו את אור המיקרוסקופ. באופן אידיאלי, השתמש תמיד באותן הגדרות חשמליות ואופטיות עבור התאורה. הזז מטרה של פי 4 או 10x לנתיב האור.
    3. הניחו את צלחת הפטרי על גבי המגלשה. התאם חוטים בודדים או צרורות נימה בתנועות x, y ו-z של הטבלה.
      הערה: בשל הסידור התלת-ממדי, רק חלק מהחלק הרלוונטי יכול להיות בפוקוס. רדיד הצלופן מאפשר להתאים את המיקוד ללא הגבלה.
    4. שימו לב לתנועות של חוטים בודדים או צרורות. ודא שהעדשה האובייקטיבית אינה נוגעת בנוזל. תעדו את תנועות החוטים באמצעות מצלמת מיקרוסקופ סטנדרטית (ראו סרטון משלים S1).
  4. בדיקה לתנועה על פני השטח
    1. לתצפית על תנועתיות נימה על משטחי אגר, הכינו צלחות פטרי 6 ס"מ עם f/2 bacto-agar. ודא שהאגר גבוה מספיק כדי שהעדשה האובייקטיבית תתקרב למשטח האגר. לחלופין, הכינו שכבת אגר בעובי של כ-3 מ"מ ותעדו את החוטים דרך האגר (שמרו על הצלחת הפוכה או השתמשו במיקרוסקופ הפוך).
    2. פיפטה 0.5 מ"ל של תמיסה המכילה P. lacuna (משלב 5.2) על משטח הבקטו-אגר של צלחת פטרי 6 ס"מ. אפשרו לנוזל להיכנס לפני השטח. סגור את צלחת הפטרי והתבונן בתנועת החוטים על פני השטח באמצעות מטרה של 4x או 10x.
    3. ודא שאותן הגדרות חשמליות ואופטיות של המיקרוסקופ משמשות לאורך כל ההקלטה ובהקלטות הבאות.
    4. צלם הקלטות של קיטועי זמן באמצעות מצלמת עיניים ומערכת מיני-מחשב. ודא שמרווח הזמן בין התמונות הבאות הוא 5 s-1 דקות. תכנת את סקריפט הלינוקס של המיני-מחשב כדי לשלוט בהקלטת קיטועי הזמן. ראה קובץ משלים 2 לדוגמה סקריפט ווידאו משלים S2 כדוגמה.
  5. בדיקה לפוטוטקסיס
    1. לניסויים בפוטוטקסיס, הכינו מחזיקי דיודה פולטת אור (LED) (כאן, עם מדפסת תלת-ממד) שבה נוריות ה-LED הנבחרות בקוטר 5 מ"מ מותקנות כדי להקרין שטח של 20 מ"מ2 מלמטה למעלה (איור 3). במידת הצורך, השתמש במחזיקי LED רבים במקביל, תוך חיבור כל נורית LED חשמלית דרך נגד ופוטנציומטר לאספקת חשמל מתכווננת. מדדו והתאימו את עוצמות ה-LED, בהתאם לניסוי. ודאו שהתפאורה כולה נמצאת בחדר חשוך או במיכל חשוך סגור.
    2. מניחים 8 מ"ל של המדיום המכיל P. lacuna (משלב 5.2) לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ. התאם את עוצמת האור של נורית ה- LED. סגרו את צלחת הפטרי עם המכסה והניחו אותה על מחזיק LED כך שהנורית תהיה במרכז צלחת הפטרי.
    3. לאחר משך הזמן הרצוי (בדרך כלל יומיים), צלם תמונה של צלחת פטרי עם מצלמת סמארטפון המכוונת ישירות למיקום הטיפול באור. השתמש בלוח LED לבן להקרנה של הדגימה. השתמש בהגדרות הידניות של המצלמה; להימנע מהשתקפויות של אור; התאימו תמיד כדי לקבל את אותו המרחק בין עדשת המצלמה לדגימה. ודא שהגדרות החשיפה מספקות תמונה המתאימה לניתוחים מאוחרים יותר באמצעות ImageJ.
    4. לכמת את הקוטר של המעגל המרכזי של חוטים באמצעות תוכנת ImageJ.
      1. פתח את ImageJ, לחץ על קובץ | פתח, בחר את הקובץ הרצוי ולחץ על Enter.
      2. בחר בלחצן ישר (עם קו ישר). לחץ על לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו מקצה אחד של צלחת פטרי לקצה הנגדי. ודא שהקו עובר דרך מרכז מעגל החוטים.
      3. הקש Ctrl-K בלוח המקשים או לחץ על נתח | פרופיל העלילה בתפריט ImageJ. חפשו חלון x-y עם עוצמות פיקסלים משורטטות לעומת מרחק - פרופיל חד-ממדי של צלחת פטרי. ודא שעוצמת הפיקסלים הנמוכה ביותר היא מעט מעל 0 והערך הגבוה ביותר נמוך מ- 255.
      4. הערך ממוצע עבור עוצמת הפיקסלים מחוץ למעגל וערך ממוצע נוסף עבור עוצמת הפיקסלים במעגל. במיקום y- בין ערכים אלה, הערך את ערכי x של שני צידי המעגל על ידי הצבעה עם העכבר על מיקומים אלה. שים לב לשני הערכים וחשב את ההפרש.
      5. השג את ערך ה- x הגבוה ביותר על-ידי הפניית העכבר לציר y בצד ימין. שים לב שערך זה e מייצג את הקוטר של צלחת פטרי. אם קוטר זה הוא 5 ס"מ, חשב את קוטר מעגל החוטים המרכזי כ - d/e × 5 ס"מ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות השיטות הנ"ל, 5 זנים שונים של P. lacuna בודדו מבורות סלעים ורוצפו (איור 1 וטבלה 1). כל התרבויות היו סטריליות לאחר ~ שנה אחת של תת-תרבות למעט P. lacuna HE10JO. זן זה עדיין מזוהם ב-Marivirga atlantica, חיידק ימי. במהלך טיולי הלגולנד הבאים, ציאנובקטריה נימה אחרים בודדו מבריכות סלעים, השונות מ- P. lacuna ויש לאפיין אותן.

מספר שיטות מיצוי וטיהור דנ"א נבדקו עבור P. lacuna. התוצאות הטובות ביותר התקבלו בשיטת CTAB אופטימלית כמתואר לעיל. תפוקת הדנ"א הייתה 310 ± 50 מיקרוגרם/מ"ל, OD 260 ננומטר/OD 280 ננומטר היה 1.7 ± 0.03, ו-OD 260 ננומטר/OD 230 ננומטר היה 0.78 ± 0.04 (n = 17). ריצוף הגנום הראה כי הדנ"א של כל הזנים היה שונה במקצת, כצפוי (טבלה 1). רצפי חלבוני הליבה הראו הפרש מרבי של 0.04% (טבלה 2). למרות שכל הגנומים של הטיוטה לא היו שלמים, ניתן להניח כי >98% מהגנום של HE10JO30 רוצף. הערכה זו מבוססת על מספר מסגרות הקריאה הפתוחות הלא שלמות. ניתן לזהות בקלות רצפי חלבונים חלקיים לאחר ביאור RAST של HE10DO ו- HE10JO. ב-HE10JO, ל-60 חלבונים מתוך כ-4,500 היה רצף חסר של N או C-terminal. את רצפי הגנום ניתן למצוא בתוסף (קובץ משלים 3, קובץ משלים 4, תיק משלים 5, קובץ משלים 6 וקובץ משלים 7).

באופן מעניין, זנים מאותו המין בודדו משני איים, הלגולנד וג'יליו. המרחק הליניארי בין שני האיים הוא 1,400 ק"מ. חייב להיות קשר בין שני המקומות, למשל על ידי ספינות דרך הים או, סביר יותר, על ידי ציפורים נודדות. ניתן למצוא מיני ציפורים רבים בשני האיים, ורבים מהם הם ציפורים נודדות. המגוון בתוך זני P. lacuna של אי אחד היה גדול יותר מאשר בין זני ההלגולנד והג'יליו הקרובים ביותר (טבלה 2). זה מצביע על חילופי דברים אינטנסיביים בין שני המקומות.

הטרנספורמציה הטבעית נבחנה עם HE10DO כזן העיקרי ועם HE10JO. הפרוטוקול הנוכחי פשוט יותר מהפרוטוקול שתואר קודם לכן12 בגלל המספר המופחת של שלבי הכביסה ופחות שלבי העברה לאחר הטרנספורמציה. שיטה חדשה זו משמשת ברציפות במעבדה; ~ 15 טרנספורמציות מוצלחות הושגו.

קלטת ההתנגדות של KanR שולבה בדרך כלל באתר ההומולוגי שהוגדר על ידי האזורים הסמוכים, כפי שמוצג על ידי PCR באמצעות פריימרים פנימיים וחיצוניים. כמו רוב הציאנובקטריה, P. lacuna הוא פוליפלואיד. זה יכול להיות יותר מ 100 כרומוזומים לכל תא12. בדיקת PCR עם פריימרים חיצוניים כשבוע לאחר הטרנספורמציה כוללת בדרך כלל 2 רצועות על ג'ל האלקטרופורזה, אחת עם גודל של רצועה מסוג פראי ורצועה נודדת איטית יותר אחת שמצביעה על החדרת קלטת ההתנגדות (איור 4). הפס הכפול מציין שרק תת-מקטע של הכרומוזומים מכיל את ההחדרה. לאחר 4 שבועות של בחירה על kanamycin, ההפרדה הושלמה בדרך כלל, ורק רצועת PCR אחת גדולה מופיעה על ג'לים. עם זאת, במקרה של השינוי עם pMH1 (ראה להלן), ההפרדה הושלמה לאחר יותר משלושה חודשים.

הווקטורים pAK1, pAK2, pAK3 ו-pMH1 נבנו לצורך בדיקות על ביטוי sfGFP. ב-pAK1, pAK2 ו-pAK3, הגן sfGFP נמצא תחת שליטה של מקדמי cpc560, A2813 ו-psbA2, בהתאמה. מקדמים אלה הם מ- Synechocystis sp. PCC 6803 או Synechococcus sp. PCC 700231. לצורך בניית וקטורים אלה, רצפי מקדם ה- sfGFP והטרימינטורים נלקחו מווקטורים ששימשו לטרנספורמציה של Synechococcus sp. PCC 700231. הרצפים הרלוונטיים שולבו באתר chwA ההומולוגי (sc_7_37) של pFN1 (או pFN_7_37_KanR15). וקטור הביטוי pMH1 נבנה על ידי סינתזת דנ"א תוך שימוש ברצפי P. lacuna כתבניות (קובץ משלים 6). רצפי ה-cpcB-cpcA (פיקוציאנין ß ופיקוסיאנין α) של P. lacuna מסודרים באופן סדרתי. אזור אינטרגני של 100 bp מפריד בין שני אזורי הקידוד. הרצף הסינתטי הכיל את רצף ה-cpcB-cpcA האנדוגני הזה ואת מקדם ה-cpcB. קלטת ה-sfGFP וה-KanR ממוקמת רק ב-3 אינץ' של קודון העצירה cpcB (5' של cpcA). כל הרצף הסינתטי עם מקדם cpcB, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' עד 3') משובט ל-pUC19. מפה מוצגת באיור 5. פרטים נוספים על השיבוט של pAK1, pAK2 ו-pAK3 והרצף המלא של pMH1 מובאים בקובץ משלים 1.

כל ארבעת השנואים (עם pAK1, pAK2, pAK3 ו-pMH1) ביטאו GFP; כל רמות הפלואורסצנציה היו מעל הפלואורסצנטיות ברקע של חוטים מסוג פראי (איור 6). השנאים pMH1 עם הפרדה לא שלמה חשפו אות GFP שהיה משתנה מאוד בין החוטים. האות הפלואורסצנטי התפלג באופן שווה כאשר ההפרדה הושלמה (איור 6E). אותות המיקרוסקופ של השנאים pAK1, pAK2 ו-pAK3 היו דומים, אך חלשים פי 5 מאלה של pMH1 (איור 6E).

שיטת הקריו-קונסרבציה שהוקמה מבוססת על שיטה שהוקמה עבור E. coli. כאשר בוצעו 2 שלבי שטיפה להסרת גליצרול לאחר ההפשרה, שרדו 15 מתוך 15 דגימות P. lacuna (טבלה 3). פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור Synechocystis PCC 6803, אך רק עם 2 שלבי כביסה ולא עם 1 (טבלה 3).

תכונה נוספת של חוטי Oscillatoriales היא תנועתיותם: חוטי P. lacuna נעים ברציפות על משטחים (איור 7) ובמווך נוזלי (איור 8). את שני סוגי התנועה ניתן ללמוד בקלות בצלחות פטרי ללא או עם מדיום אגר. נדרשת הקלטה בהילוך מהיר מכיוון שהתנועה על אגר איטית. חוטים נעים לעבר חרוט האור אם קרן אור מגיעה מלמטה (איור 3). ניתן ללמוד בקלות את ההשפעות של עוצמת האור, אורך הגל והזמן באמצעות הגדרה פשוטה. הפוטורצפטורים של אפקט זה עדיין אינם ברורים. ניתן לטפל במועמדים אפשריים באמצעות מוטציות נוקאאוט. גם המנגנון העומד בבסיס האופן שבו החוטים מוצאים את האור אינו ברור. עבור שאלה זו, מערכת אינפרא אדום נדרשת כדי לתעד את החוטים במהלך תנועתם מחושך לאור.

Figure 1
איור 1: זנים של פורמידיום לקונה שנאספו מהלגולנד וג'יליו. חוטים מופצים במשך 11 ימים על f/2 אגר בכלי פטרי 6 ס"מ. (A) זן GI08AO; (B) זן GI08IO; (C) זן GI09CO; (ד) זן HE10DO; (E) זן HE10JO; (F) זן HE15M2G1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: נימי הפורמידיום לקונה נימים 5 שבועות לאחר הטרנספורמציה. נעשה שימוש בביטוי sfGFP וקטור pMH1; הבחירה התרחשה במדיום f/2+ עם 120 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין. החוטים הירקרקים עמידים וחיים; חוטים אחרים מתו. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניסוי פוטוטקסיס. משמאל: מחזיק LED עם 4 נורות LED אדומות, המחובר לספק כוח מתכוונן. בנוסף לכל נורית LED, יש צלחת פטרי 6 ס"מ עם 8 מ"ל של תרבית Phormidium lacuna . מימין: צלחת פטרי עם P. lacuna לאחר יומיים על הלד האדום (15 μmol m-2 s-1). קיצור: LED = דיודה פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אינטגרציה והפרדה של הוספה לאחר טרנספורמציה של Phormidium lacuna עם pAK1. PCR עם פריימרים חיצוניים. הגדלים הצפויים של המוצר ללא ועם הוספה הם 2371 ו- 5016 bp, בהתאמה. נתיב שמאלי: סמן, נתיבים 1, 2, 3, 4: מוצרי PCR של חוטים 7 ימים, 11 ימים, 14 ימים ו -17 ימים לאחר בידוד של נימה עמידה (4 שבועות לאחר הטרנספורמציה), בהתאמה. נתיב 5: תוצר PCR מסוג פראי (מג'ל אחר). במדגם של 7 ימים, התוספת נמצאת בחלק קטן של הכרומוזומים. חלק זה גדל עד 17 יום, כאשר לא נראה להקה מסוג פראי, כלומר ההפרדה הושלמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: וקטור לביטוי sfGFP בשליטת מקדם cpcB אנדוגני. כתום: Phormidium lacuna רצף הומולוגי, סגול/כחול: עמוד שדרה וקטורי pUC-19, ירוק: הכנס עם sfGFP ו- KanR. קיצורים: sfGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר-פולח; KanR = עמידות kanamycin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ביטוי של sfGFP ב-Phormidum lacuna. תמונות פלואורסצנטיות של חוטי בר מסוג P. lacuna (A) ולאחר טרנספורמציה עם pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) ו-pMH1 (E). ב-pMH1, הגן sfGFP ממוקם 3' של הגן phycocyanin ß ולכן מונע על ידי מקדם cpcß האנדוגני; במקרים האחרים, sfGFP מונע על ידי מקדמי cpc560, A2813, או psbA2מ- Synechocystis PCC 6803, בהתאמה. הגדרות הפלואורסצנציה הן ספציפיות ל-GFP; כל התמונות הוקלטו עם אותו זמן אינטגרציה והגדרות אופטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: תמונה ממוזגת של פורמידיום לקונה על משטח אגר בהגדלה של פי 4. התמונה הראשונה מוצגת באדום, השנייה (צולמה כעבור דקה) בירוק. שימו לב גם לעקבות על האגר. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: תמונה ממוזגת של פורמידיום לקונה בתווך נוזלי. מרווח הזמן בין שתי התמונות היה 10 שניות. התמונה הראשונה מודפסת באדום; השני מודפס בירוק. השוואת שני הצבעים מראה את התנועה בתוך 10 שניות. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

זן HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Contigs 104 174 218 102 154
סה"כ bp 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

טבלה 1: זני פורמידיום לקונה.

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

טבלה 2. הבדלי חומצות אמינו בין זנים ברצף של 20 חלבוני ליבה עם 10,876 חומצות אמינו.

צפיפות תא OD 750 ננומטר 1 1 3 3 5 5 7 7
שוטף 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis PCC 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
פורמידיום לקונה HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

טבלה 3: ניסויי שימור קריו-קונסרבציה עם Synechocystis PCC 6803 ו-Phormidium lacuna HE10DO cyanobacteria. המספר הראשון מראה את מספר התרבויות ששרדו לאחר הקפאה/הפשרה; המספר השני מציג את סך כל הניסויים.

סרטון משלים S1: תנועה של חוטי Phormidium lacuna בתמיסה נוזלית, ללא חלוף זמן. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרטון משלים S2: תנועה של חוטי Phormidium lacuna על משטח אגר, עם קיטועי זמן. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

קובץ משלים 1: שיבוט של וקטורים לטרנספורמציה של פורמידיום לקונה. רשימת וקטורי טרנספורמציה; רשימת פריימרים לשיבוט; רצף של pMH1 בפורמט gb. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: תסריטי מעטפת (sh) עבור מיני-מחשב Raspberry Pi. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: רצף דנ"א של HE152G1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: רצף דנ"א של GI08AO. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 5: רצף דנ"א של GI09CO. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 6: רצף דנ"א של HE10DO. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 7: רצף דנ"א של HE10JO. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שזנים רבים של ציאנובקטריה זמינים מאוספי תרביות 32,33,34,35,36, עדיין יש ביקוש לציאנובקטריה חדשה מהטבע מכיוון שמינים אלה מותאמים לתכונות ספציפיות. P. lacuna נאסף מבורות סלעים והוא מותאם לווריאציות של ריכוזי מלח וטמפרטורה30. זנים של מין זה נמצאו במהלך טיולים בשנים 2008, 2009 ו-2010. עם ההליך המתואר כאן, 5 זנים של P. lacuna בודדו, ו -4 מהזנים האלה היו סטריליים. הזן P. lacuna HE10JO מזוהם לצמיתות בחיידק Marivirga atlantica, חיידק ימי שזוהה על ידי rRNA וריצוף הגנום. לא ניתן היה להפריד חיידק זה מהציאנובקטריום למרות היישום של הפרדה מכנית, צמיחה בטמפרטורות שונות, טיפולים באנטיביוטיקה או טיפולים כימיים. למרות הזיהום, P. lacuna HE10JO ניתן לטפח בדומה לזנים האחרים. בטיולים מאוחרים יותר נמצאו חברים אחרים של מתנדים, שעדיין לא נותחו בפירוט. פ. לקונה לא נמצאה שוב. לא ברור מדוע פ' לקונה בודד בשנים שלאחר מכן ובשני מקומות שונים, אך לא נמצא מאוחר יותר. השפע שלה בהחלט תלוי בתנאים בלתי צפויים. הטמפרטורה, ריכוזי המלח וחומרים מזינים אנאורגניים או אורגניים משתנים מאוד בבורות סלעים. לכן, הרכב המינים יכול להשתנות עם הזמן באופן בלתי צפוי.

טרנספורמציה טבעית נוצרת עבור ציאנובקטריה שונים, בעיקר מינים חד-תאיים. P. lacuna החוט הוא המין היחיד בסדרת המתנדים שעבורם הוקמה טרנספורמציה טבעית. השינוי היה כמעט תמיד מוצלח עם הפרוטוקול הנוכחי. באופן כללי, מספר החוטים העמידים לאחר ניסוי טרנספורמציה משתנה במידה ניכרת, ולעיתים הטרנספורמציה נכשלת, וכתוצאה מכך אובדן זמן יקר. לכן מומלץ לבצע מספר פרויקטים של טרנספורמציה במקביל. גם הזמן להפרדה מוחלטת, בדרך כלל 4 שבועות לאחר בידוד הזן העמיד, יכול להשתנות. מכיוון שאין ערובה להפרדה מוחלטת לאחר הגידול בקנאמיצין, חיוני לבצע את בדיקות ה-PCR באמצעות פריימרים חיצוניים ופנימיים.

כל וקטור חייב להכיל 2 x 500-1,000 bp רצפים הומולוגיים, למשל, מוגברים מהמארח על ידי PCR ומופרעים על ידי קלטת התנגדות (למשל, קלטת kanamycin KanR המשמשת כאן)37,38. עבור ביטוי, יש לשבט מקדם, רצף קידוד (לדוגמה, עבור sfGFP39), שליחות קטלנית וקלת התנגדות בין הרצפים ההומולוגיים. אסטרטגיות השיבוט הן ספציפיות למינים ותלויות במטרת הניסוי.

שיטת טרנספורמציה זו יכולה להיות אפשרית גם עם זנים אחרים של Oscillatoriales או ציאנובקטריה אחרים: טרנספורמציה טבעית מבוססת על פילי מסוג IV, שנמצאים כמעט בכל גנום ציאנובקטריאלי אחר 3,15,40. לכן, השיטה הנוכחית יכולה לעורר ניסויים חדשים עם מינים אחרים. מכיוון שפילים מסוג IV רלוונטיים גם לתנועתיות, חשוב לבדוק אם יש מצבים שבהם ציאנובקטריה הם תנועתיים.

החדרת גנים מבוססת על רקומבינציה הומולוגית ומביאה לשיבוש של האתרים ההומולוגיים. לכן, טרנספורמציה משמשת לעתים קרובות לנוקאאוט גנים. הביטוי של הגן המוחדר יושרה אם מקדם פעיל ורצף קידוד ישולבו באתר ההומולוגי. ב-P. lacuna, פעילות היזם הייתה תלויה במין. מקדמי cpc560, A2813 ו - psbA2 של Synechocystis PCC sp 6803 או Synechococcus sp. PCC 7002 31 ומקדם cpcB של P. lacuna יכול להניע ביטוי sfGFP . מבין המבנים האלה, מקדם ה-cpcB האנדוגני גרם לביטוי החזק ביותר, אם כי הגן sfGFP ממוקם 3' של הגן phycocyanin ß. זה מצביע על שימוש כללי יותר של מקדמים אנדוגניים בביטוי ציאנובקטריאלי.

השילוב של נוקאאוט גנים ומחקרי תנועה ישפוך אור על מנגנונים מולקולריים של תנועתיות ופוטוטקסיס. מקורות אור LED יכולים לספק אור לניסויים בפוטוטקסיס. כמעט כל אורך גל זמין, וניתן לווסת את עוצמת האור על ידי ספק כוח מתכוונן ופוטנציומטרים. ניתן לבנות מחזיקי LED על-ידי מדפסות תלת-ממד כדי לממש בקלות שילובים של נורות LED שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

העבודה נתמכה על ידי המכון הטכנולוגי של קרלסרוהר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 180
טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום <em>הנימה פורמידיום לקונה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter