Summary
ホルミジウムラクナは、 海洋の岩溜まりから単離された糸状シアノバクテリウムである。この記事では、天然源からのフィラメントの単離、DNA抽出、ゲノムシーケンシング、自然形質転換、sfGFPの発現、凍結保存、および運動性法について説明します。
Abstract
シアノバクテリアは、太陽エネルギーをバイオマス生産に利用する基礎研究およびバイオテクノロジープロジェクトの焦点です。ホルミジウムラクナは、新たに単離された糸状シアノバクテリウムである。この論文では、新しい糸状シアノバクテリアを海洋の岩盤プールから単離する方法について説明します。また、フィラメントからDNAを抽出する方法と、ゲノムを配列決定する方法についても説明します。形質転換は多くの単細胞種で確立されているが、糸状シアノバクテリアについてはあまり報告されていない。P. lacunaの自然な変換のための単純化された方法がここで説明されています。P. lacunaは、自然変換が確立されているオシラトリアルの秩序の唯一のメンバーです。この論文はまた、スーパーフォルダ緑色蛍光タンパク質(sfGFP)を発現するために自然形質転換がどのように使用されるかを示す。内因性cpcBプロモーターは、シネコシスティス・エスピーPCC6803由来のcpc560、A2813、またはpsbA2プロモーターよりも約5倍強い発現を誘導した。さらに、P. lacunaおよびSynechocystis sp.CPP 6803の凍結保存のための方法が確立され、液体培地中および寒天およびプラスチック表面上の運動性を評価するための方法が記載されている。
Introduction
シアノバクテリアは、光合成をエネルギー源として利用する原核生物である1,2。研究はますますシアノバクテリア種に焦点を当てています。いくつかのシアノバクテリアをDNA3で形質転換することができる。遺伝子は、これらの種においてノックアウトまたは過剰発現され得る。しかしながら、形質転換は、数種4、5、6、7、8、9、10、11に限定されており、培養コレクションまたは野生8からの系統において形質転換を確立することは困難であり得る。糸状種Phormidium lacuna(図1)の菌株は、塩濃度や温度などの環境条件が経時的に変動する海洋岩溜まりから単離された。これらの糸状シアノバクテリアは、それらが属する秩序振動子12のモデル生物として用いることができる。
エレクトロポレーションによる遺伝子導入を試験する試験中13、14は、P.ラクナが天然形質転換によって形質転換され得ることを見出した15。このプロセスでは、DNAはいくつかの細胞によって自然に取り込まれます。変換の他の方法16,17と比較して、自然な変換は、手順を複雑にする可能性のある追加のツールを必要としないという利点を有する。たとえば、エレクトロポレーションには、適切なキュベット、無傷のワイヤ、および適切な電圧の選択が必要です。P. lacunaは現在、自然変換の影響を受けやすい唯一のオシラトリアルメンバーです。元のプロトコルはエレクトロポレーションプロトコルに基づいているため、不要な洗浄ステップがいくつか含まれていました。プロトコルを簡素化するためにさまざまなアプローチがテストされ、ここで紹介する変換プロトコルが導かれました。
ゲノム配列は、遺伝子ノックアウトまたは過剰発現に基づくさらなる分子研究に不可欠である。ゲノム配列は次世代のシーケンシングマシンで短期間で取得できますが、DNAの抽出は難しく、種によっても異なります。 P. lacunaでは、いくつかのプロトコルがテストされました。その後、修飾セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTAB)ベースの方法が確立され、実験室での継続的な作業のために、各精製サイクルのDNAおよびDNA収率の許容可能な純度が得られました。5つの株のゲノムをこのプロトコールで配列決定することができた。次の論理変換ステップは、 P. lacunaにおけるタンパク質発現を確立することでした。
このプロトコールにおいてマーカータンパク質として使用されるsfGFPは、任意の蛍光顕微鏡で検出することができる。試験された全てのプロモーターは、P. lacuna sfGFP発現に使用できた。形質転換から生じる株数の増加は、培養物を保存する方法の必要性をもたらした。このような方法は、大腸菌および他の多くの細菌について確立されている18。標準的なプロトコールでは、グリセロール培養物を調製し、液体窒素中で移し、−80°Cで保存する。 この方法はほんの数ステップしか必要とせず、それが確立された種にとって高い信頼性があります。P. lacunaでは、生細胞をすべてのケースで回収できなかったため、標準プロトコルは実現不可能でした。しかしながら、融解後にグリセロールを除去した場合、全ての試験の細胞は生存した。P. lacunaの運動性の分析のために簡単な方法が提示され、これはIV型ピリまたは光受容体の役割を調査するためにノックアウト突然変異誘発と組み合わせることができる。これらのアッセイは、単細胞シアノバクテリア19、20、21のアッセイとは異なり、他の発振器にも有用であり得る。
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Protocol
1. 自然環境からの隔離
注:緑藻、珪藻、糸状シアノバクテリア、および他の微細藻類を単離することができる。このプロトコルは、実験室条件下で成長するロックプールからの任意の微細藻類種に使用することができる。オシラトリアル属に属する糸状シアノバクテリアは、その動きや糸状形状によって容易に認識することができる。種は、ゲノムシーケンシングまたは16S rRNAシーケンシングによって半純粋な状態で同定することができる。
- 海洋ロックプール(すなわち、岩の多い海岸の空洞)からの液体海水サンプルを50mLフラスコに移す。各フラスコについて、天然源の正確な場所または座標を書き留めます。可能であれば、動物プランクトンの量を減らすために50μmの網を通して内容物をろ過してください。継代培養できるようになるまでサンプルを4°Cで保存する。
- 1mL培養物をf/2培地中の3%バクト寒天を含む10cmペトリ皿に移す22,23(材料表を参照)。プレートを20枚まで用意します。50μmol m-2 s-1の白色光下で栽培する。
注:より高い光強度を栽培に使用することができる。P. lacunaには最大400 μmol m-2 s-1の強度を使用できますが、他の種はより光に敏感である可能性があります。 - 1週間後、滅菌鉗子を用いて所望の細胞を新鮮な寒天プレートに移す。無菌条件下で両眼顕微鏡下で細胞を単離する。細胞が現れ、新しい寒天プレート上で成長するまで、古い寒天プレートを4°Cで保存する。
- 汚染を排除するために、この移送ステップを毎週繰り返します。重い汚染を検出するには肉眼を使用し、汚染の追加チェックには倍率400倍の顕微鏡を使用してください。
- サンプルに汚染がないと思われる場合は、寒天プレートで細菌または真菌の汚染をテストします。接種ループで培養物の一部をLB24 寒天プレート(直径10cm)に移し、プレートを室温に保ち、1〜3日間にわたって汚染物質の増殖を確認した。
- 無菌の糸状シアノバクテリア種が得られた場合は、さらなる培養作業に使用してください。 P. lacunaを 液体またはバクト寒天プレートで栽培する。液体培養には、50 mL の f/2 培地または f/2+ 培地を含む 250 mL フラスコを使用してください。
2. DNA抽出
注:この方法は25 26から採用されています
- 50mLのf/2培地を入れたフラスコを2枚用意する。それぞれに、他の生育培養物由来の〜1mLのP.ラクナフィラメントを接種する。培養物を白色光下(50μmol m-2 s-1)で25°Cで50rpmで攪拌(水平回転)下で7日以上保持する。
- 培養物を超音波( 材料表を参照)で2分間全エネルギーで処理する。750nmでODを測定する。それが〜0.5であることを確認してください。ODが低すぎる場合は、文化を成長させ続ける。
- フィラメントを5,000 × g、20分間遠心分離により回収する。上清を取り除きます。残液とともにフィラメントをフレンチプレス27のチャンバーに移す。フレンチプレスの圧力を20,000psiに設定し、細胞を抽出する。
注:フレンチプレスはすべての細胞を溶解し、DNAを放出します。強いせん断力は1,500 bp DNA断片を生成する。 - サンプルを10,000 × g で10分間遠心分離し、上清を除去した。
- 400 μL の溶解バッファー (4 M 尿素、0.1 M トリス/Cl、pH 7.4) および 50 μL のプロテイナーゼ K (10 mg/mL) をペレットに加えます。試料を550rpmで振とうしながら60分間55°Cに加熱する。
- 1 mL の DNA 抽出バッファー (3% CTAB、1.4 M NaCl、10 mM EDTA、0.1 M Tris/Cl、1% サルコシル、0.1 M DTT、pH 8) を加え、55 °C、550 rpm で 60 分間インキュベートします。溶液を遠沈管に移し、2倍量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24/1)を加える。
- 振とう後、試料を9,000×gで5分間遠心分離 する。上部の水相を反応バイアルに移し、1mLの氷冷エタノールおよび50μLの3M酢酸ナトリウムを加える。
- サンプルを渦巻きにし、-20°Cで1時間以上置きます。
- 10,000 × g (4°C)で5分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを70%エタノールで洗浄する。
- サンプルを再度遠心分離します。上清を除去し、ペレットを一晩乾燥させる。DNAをヌクレアーゼを含まない水に溶かす。DNAスペクトルを測定して、OD 260 nm/OD 280 nmが1.6~1.9の範囲にあるかどうかを確認します。
- アガロース電気泳動ゲル28上のDNAの大きさを分析する。
- ゲノムDNAを次世代シーケンシングにより300サイクル、ペアエンド設定、150塩基のリード長で配列決定します( 材料表を参照)。
- 適切なコンピュータプログラムでアセンブリを実行します。 材料表の例を参照してください。
- ゲノムのドラフトをRASTサーバーに提出してアノテーションを受ける。
注:DNA配列をアップロードして、数分以内に完全な注釈を取得します。
3. 自然形質転換とGFP発現
注:形質転換は、大腸菌で増殖したプラスミドベクターに基づいています。pGEM-TまたはpUC19は、骨格ベクターとして使用され得る。クローニング技術は多くの研究室で確立されています。標準プロトコル28およびP. lacuna15,29の変換ベクトルに関する記事も参照してください。sfGFP発現のためのベクターの例は、代表的な結果の節に記載されている。まだ公開されていない4つのベクトルの詳細は、補足ファイル1に記載されています。
- 滅菌実験室条件(クリーンベンチ、滅菌ガラス製品)下で滅菌材料を使用してすべてのステップを実行します。
- 2 x 50 mL の f/2 液体培地を 2 つの 250 mL フラスコに接種し、ランニング培養物から 2 x 1 mL の P. ラクナフィラメントを接種します。白色光(50 μmol m-2 s-1)下で撹拌(水平回転、50rpm)下で25°Cで約5日間栽培する。
- 製造元の指示に従って、midi 分取キット ( 材料表を参照) を使用して、約 200 μg の形質転換ベクター DNA を調製します。
- 100mLの P. lacuna 細胞懸濁液( 材料表を参照)を10,000rpmで3分間ホモジナイズする。750nmでODを測定します(所望の値= 0.35)。
- 細胞懸濁液を6,000×gで15分間遠心分離 する。上清を除去し、ペレットを残りの液体の800μL(残留液体およびフィラメントを含む総量)および追加のf / 2+ 培地に懸濁する。
- 120μg/mLカナマイシンを含む8枚のf / 2 + バクト寒天プレート(直径10 cm)を取ります。10μgのDNAを各寒天プレートの中央にピペットで送る。直ちに100 μLの細胞懸濁液を各寒天プレートの中央(DNAの上に)にピペットで移した。
- 余分な液体が蒸発するのを許すために、クリーンベンチに蓋なしで寒天プレートを保管してください。プレートを閉じ、白色光の中で25°Cで2日間栽培する。
- 接種ループを備えた各寒天プレートのフィラメントを、120μg/mLカナマイシンを含むいくつかの新鮮なf/2+ バクト寒天プレートに分配する。プレートを25°Cの白色光で培養し、顕微鏡下で定期的に培養物を確認する。
- 顕微鏡下で7〜28日後に生きた形質転換フィラメントを同定する。他のフィラメントとは異なる、健康で緑色のフィラメント(図2)を探します。これらの緑色のフィラメントが識別できたら、次のステップに進みます。それ以外の場合は、プレートをさらに7日間保管してください。
- 鉗子を使用して、これらの同定された生きたフィラメントを、250μg/mLカナマイシンを含む50mLの液体f/2+ 培地に移す。シェーカー(水平回転、50rpm)上で25°Cの白色光中で栽培する。最大4週間成長を観察します。
- フィラメントを250μg/mLカナマイシンを含む寒天培地に戻し、フィラメントが成長するのを待ちます。数日後、単一フィラメントを、より高濃度のカナマイシン(例えば、500μg/mL)を含む新鮮な寒天プレートに移す。元のプレートを保管してください。
- フィラメントが液体培養中または寒天上で高濃度のカナマイシン中で増殖していることを確認してください。分離をスピードアップするために再びカナマイシン濃度を増加させます.
注:形質転換 されたP. lacunaは、 最大10,000μg/mLのカナマイシンで増殖する。他の種はそのような高濃度を許容しないかもしれません。 - 耐性細胞が増殖し、プレート上に広く分布している場合は、外側および内側のプライマーでPCRを行うことにより、 P. lacuna のゲノムへのインサートの組み込みをテストします。
- 挿入のクローニング用に設計されたプライマーをインナープライマーとして使用する。
- 外側プライマーの設計のために、 P. lacuna のゲノム上の提案された挿入部位の5'および3'であるが、挿入の外側にある配列を選択する。
- PCR反応には、インナープライマーとアウタープライマーを使用します。耐性株と野生型を使用してください。
注:内側プライマーは、インサートが存在することを示す。外側プライマーは、インサートが正しい遺伝子座に挿入されていることを示す。
- 各 PCR 反応について、約 10 mg のフィラメントを PCR チューブに直接入れ、標準プロトコル24 に従って PCR を実行します。製品が得られない場合は、アニール温度を変化させ、フィラメントを水で洗浄してください。
注: PCR では、多くの異なるポリメラーゼを使用できます。Taqポリメラーゼなどの標準的なポリメラーゼは、より高価なエラーチェックポリメラーゼよりもエラー率が高い。この分析 PCR では、エラーチェックポリメラーゼは必要ありません。ただし、標準ポリメラーゼでPCR産物が得られない場合は、エラーチェックポリメラーゼをテストする必要があります。 - アガロース電気泳動24で耐性ラインのPCR産物を分析する。
- バンド位置をマーカーと比較し、野生型と形質転換体を比較します。内側と外側のプライマーでは、(抵抗カセットの挿入による)野生型よりも大きなバンド、または形質転換体の2つのバンド(野生型バンドのサイズを持つバンド と 大きいバンド)を探します。後者の場合、不完全な分離を示すので、高いカナマイシン濃度で培養を続ける。
注: PCR および電気泳動の詳細については、15、24 またはその他の標準文献を参照してください。
- バンド位置をマーカーと比較し、野生型と形質転換体を比較します。内側と外側のプライマーでは、(抵抗カセットの挿入による)野生型よりも大きなバンド、または形質転換体の2つのバンド(野生型バンドのサイズを持つバンド と 大きいバンド)を探します。後者の場合、不完全な分離を示すので、高いカナマイシン濃度で培養を続ける。
- GFP発現の場合:1本のフィラメントを蛍光顕微鏡( 材料表参照)で、40倍または63倍に設定した対物レンズの倍率で観察する。明視野透過画像と蛍光画像を撮像する。GFP には、励起に 470 nm バンドパス、発光に 525 nm バンドパス、および 495 nm ビームスプリッタ (初期露光時間 500 ms) の設定を使用します。
- 露出時間を調整して、蛍光シグナルが明瞭になるように調整し、飽和強度を避けます。すべてのサンプルに同じ設定を使用してみてください。
- 野生型フィラメントも蛍光を表示するため、この背景蛍光について上記と同じ設定で画像をキャプチャします。
注:GFPを発現する株は、より高いシグナルを持っていなければならない。それ以外の場合、GFP は表現されません。 - 蛍光画像の露光時間およびピクセル強度に基づいて、異なるフィラメントのGFP含有量を計算して比較する。
4. 凍結保全
注: P. lacuna および単細胞シアノバクテリウム ・シネコシスチス属PCC 6803 が使用されます。現在の方法は、 P. lacunaにとってより効果的です。
- P. lacunaまたはSynechocystissp PCC 6803を、それぞれ10mLのf/2+培地またはBG-11培地中で、白色光(50μmol m-2 s-1)下で攪拌下(水平回転、50rpm)で少なくとも10日間培養する。
- P. lacuna培養物(材料表を参照)を10,000rpmで3分間、または超音波装置(材料表を参照)で全エネルギーで2分間均質化する。いずれかの培養物のOD 750nmを決定し、値が1〜7の間であるかどうかをチェックする。
- 6,000 × g で15分間遠心分離して細胞を回収する。上清を取り除きます。
- 細胞ペレットを800 μLのf/2+ またはBG-11培地(最終容量)に懸濁し、2mLクライオバイアルに移す。細胞懸濁液に800μLの50%グリセロール溶液を加える。バイアルを閉じ、反転を繰り返して混合する。
- クライオビアを液体窒素に移し、-80°Cの冷凍庫内のクライオボックスに保管する。冷凍庫内の箱の位置と箱内のサンプルの座標に注意してください。
- 細胞の回収のために、クライオビアルを取り出し、内容物を室温で解凍する。内容物を2mL反応管に移す。
- サンプルを2回洗浄する。1回目の 洗浄では、6,000 × g で5分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを2mLのf/2+ またはBG-11培地に再懸濁する。2回目の 洗浄では、6,000 × g で5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを2 mLのf / 2+ またはBG-11培地に懸濁する。
- 培養の準備ができているこれらの細胞の完全性を確認するには、ペレットを9mLの培地に移し、攪拌(55rpm)下で白色光(50μmol m-2 s-1)で培養する。培養1日目と1週間後のOD 750 nmを比較する。
5. ホルミジウムラクナの運動性
注:3つの異なるアッセイについて説明する。すべてのケースで同じカルチャが使用されます。
- P. lacuna を f/2 培地で白色光 (50 μmol m-2 s-1) で水平攪拌 (50 rpm) 下、推定 OD 750 nm が 0.35 になるまで約 5 日間培養します。使用時まで4°Cでサンプルを保管する。
- フィラメント(材料表を参照)を10,000rpmで3分間、または超音波(材料表を参照)で最大出力1サイクルで1分間均質化します。OD 750 nmを測定します。0.35を超える場合は、フラクションをf / 2培地で希釈する。この溶液は、ステップ5.3、5.4、および5.5の運動性アッセイで使用します。
- 液体培地中での移動アッセイ
- 運動性を直接観察するために、 P. lacuna を含む培地8mLを(ステップ5.2から)6cmのペトリ皿に移す。サンプルが室温に達するまで数分待ちます。ペトリ皿をセロハンホイルで覆います。
- カメラ付きの標準顕微鏡のx-yテーブルの上に顕微鏡スライドを置きます。顕微鏡のライトをオンにします。理想的には、照明には常に同じ電気的および光学的設定を使用します。4 倍または 10 倍の対物レンズをライトのパスに移動します。
- スライドの上にペトリ皿を置きます。単一フィラメントまたはフィラメントバンドルを、テーブルの x、y、z の動きで調整します。
注:3次元配置のため、関連するセクションの一部のみに焦点を合わせることができます。セロハン箔は、制限なしに焦点を調整することができます。 - 単一のフィラメントまたはバンドルの動きを観察します。対物レンズが液体に触れていないことを確認します。フィラメントの動きを標準の顕微鏡カメラで記録します( 補足ビデオS1を参照)。
- 表面上の移動のためのアッセイ
- 寒天表面上のフィラメント運動性の観察のために、f / 2バクト寒天を含む6cmのペトリ皿を準備する。寒天が、対物レンズが寒天表面に近づくのに十分な高さであることを確認します。あるいは、厚さ約3mmの寒天層を作製し、寒天を通してフィラメントを記録する(プレートを逆さまに保つか、倒立顕微鏡を使用する)。
- P.ラクナを含む溶液0.5mLのピペット(ステップ5.2から)を6cmのペトリ皿のバクト寒天表面上に。液体がサーフェスに入るのを待ちます。ペトリ皿を閉じ、4倍または10倍の対物レンズを使用して表面上のフィラメントの動きを観察します。
- 顕微鏡の電気的および光学的設定が、記録中およびその後の記録で使用されていることを確認します。
- 眼カメラとミニコンピュータシステムを使用してタイムラプス録画をキャプチャします。後続の画像間の時間間隔が 5 秒から 1 分であることを確認します。ミニコンピュータのLinuxスクリプトをプログラムして、タイムラプス記録を制御します。スクリプトの例については 補足ファイル 2 を、例として 補足ビデオ S2 を参照してください。
- フォトタクシーのアッセイ
- フォトタキシスの実験では、選択した5mmのLEDを装着した発光ダイオード(LED)ホルダー(ここでは3Dプリンター付き)を用意し、下から上へ20mm2 の領域を照射します(図3)。必要に応じて、多数のLEDホルダを並列に使用し、各LEDを抵抗とポテンショメータを介して調整可能な電源に電気的に接続します。実験に応じて、LEDの強度を測定および調整します。設定全体が暗い部屋または閉じた暗い容器にあることを確認します。
- P. lacunaを含む培地8 mL(ステップ5.2から)を6 cmのシャーレに入れる。LEDの光の強度を調整します。蓋でペトリ皿を閉じ、LEDがペトリ皿の中央に来るようにLEDホルダーの上に置きます。
- 所望の期間(典型的には2日間)の後、光処理の位置に直接向けられたスマートフォンカメラでペトリ皿の画像をキャプチャする。試料の照射には白色LEDパネルを使用してください。カメラの手動設定を使用します。光の反射を避ける。カメラレンズと試料の間の距離が同じになるように常に調整してください。露出設定で、ImageJ を使用した後の解析に適したイメージが得られることを確認します。
- ImageJソフトウェアを使用してフィラメントの中央円の直径を定量化します。
- ImageJを開き、[ファイル|]をクリックします。 開き、目的のファイルを選択して、[ Enter] をクリックします。
- [直線] ボタン (直線付き) を選択します。マウスの左ボタンを押して、ペトリ皿の一端から反対側の端まで線を引きます。線がフィラメントの円の中心を通ることを確認します。
- キーボードの Ctrl-K キーを押すか、[ |の分析] をクリックします。 ImageJ メニューのプロファイルをプロットします。ピクセル強度が距離に対してプロットされたx-yウィンドウ(ペトリ皿の1Dプロファイル)を探します。最小ピクセル強度が 0 をわずかに上回り、最高値が 255 を下回っていることを確認します。
- 円の外側のピクセル強度の平均値と、円内のピクセル強度の別の平均値を推定します。これらの値の間の y 位置で、これらの位置をマウスでポイントして、円の両側の x 値を推定します。両方の値をメモし、差を計算します。
- 右の Y 軸にマウスをポイントして、最も高い x 値を取得します。なお、この値 e はシャーレの直径を表す。この直径が 5 cm の場合、 中央フィラメント円の直径を d/e として計算し、5 cm ×します。
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Representative Results
上記の方法に従って、 P. lacuna の5つの異なる株を岩溜まりから単離し、配列決定した(図 1および 表1)。全ての培養物は、 P. lacuna HE10JOを除く継代培養の〜1年後に無菌であった。この株はまだ海洋細菌である マリビルガ・アトランティカで汚染されています。その後のヘルゴランド遠足の間に、他の糸状シアノバクテリアが岩のプールから単離されたが、これは P. lacuna とは異なり、特徴付けられる必要がある。
いくつかのDNA抽出および精製方法をP. lacunaについて試験した。最良の結果は、上記のように最適化されたCTAB法で得られた。DNA収率は310 ± 50 μg/mL、OD 260 nm/OD 280 nmは1.7 ± 0.03、OD 260 nm/OD 230 nmは0.78 ± 0.04 (n = 17)であった。ゲノムシーケンシングは、予想通り、すべての株のDNAがわずかに異なることを示した(表1)。コアタンパク質配列は0.04%の最大差を示した(表2)。すべてのドラフトゲノムは不完全であったが、HE10JO30のゲノムの>98%が配列決定されたと推測できる。この推定は、不完全なオープン読み取りフレームの数に基づいています。部分タンパク質配列は、HE10DOおよびHE10JOのRASTアノテーション後に容易に同定することができた。HE10JOでは、〜4,500個のうち60個のタンパク質がN末端またはC末端配列を欠損していた。ゲノム配列は、補足(補足ファイル3、補足ファイル4、補足ファイル5、補足ファイル6、および補足ファイル 7)に記載されています。
興味深いことに、同じ種の株がヘルゴランド島とジリオ島の2つの島から分離されました。両島間の直線距離は1,400 kmです。両方の場所の間には、例えば、海を経由する船や、おそらく渡り鳥によるリンクがなければなりません。両方の島で多くの鳥類が見つかり、その多くは渡り鳥です。ある島の P. lacuna 系統内の多様性は、最も近いヘルゴランド株とジリオ株の間よりも大きかった(表2)。これは、両方の場所間の激しい交換を示しています。
自然形質転換は、HE10DOを主要株として、HE10JOを用いて試験した。本プロトコルは、変換後の洗浄ステップの数が減少し、転写ステップが少ないため、前述のプロトコル12 よりも単純である。この新しい方法は実験室で継続的に使用されています。~15回の変換が成功しました。
KanR耐性カセットは、通常、内側および外側のプライマーを用いたPCRによって示されるように、隣接する領域によって定義される相同部位に組み込まれた。ほとんどのシアノバクテリアと同様に、 P. lacuna は倍数体です。それは細胞12あたり100以上の染色体を有することができる。形質転換から約1週間後のアウタープライマーを用いたPCR試験では、通常、電気泳動ゲル上に2つのバンドがあり、1つは野生型バンドのサイズで、もう1つは耐性カセットの挿入を示す遅い移行バンドです(図4)。二重バンドは、染色体の亜分画のみが挿入を含むことを示す。カナマイシンの選択の4週間後、分離は通常完了し、ゲル上に1つの大きなPCRバンドのみが現れる。しかし、pMH1による形質転換(下記参照)の場合、偏析は3ヶ月以上経過して完了した。
ベクターpAK1、pAK2、pAK3、およびpMH1を、sfGFP発現に関する試験のために構築した。pAK1、pAK2、およびpAK3において、sfGFP遺伝子は、それぞれcpc560、A2813、およびpsbA2プロモーターの制御下にある。これらのプロモーターは、Synechocystis sp. PCC 6803またはSynechococcus sp. PCC 700231由来である。これらのベクターの構築のために、sfGFPプロモーターおよびターミネーター配列を、Synechococcus sp. PCC 700231の形質転換に用いたベクターから採取した。関連する配列を、pFN1(またはsc_7_3715)の相同なchwA(pFN_7_37_KanR)部位に組み込んだ。pMH1発現ベクターを鋳型としてP.ラクナ配列を用いたDNA合成により構築した(補足ファイル6)。P. lacunaのcpcB-cpcA(フィコシアニンßおよびフィコシアニンα)配列は、直列に配置されている。100 bpの遺伝子間領域は、両方のコード領域を分離する。合成配列には、この内因性cpcB-cpcA配列とcpcBプロモーターが含まれていた。 sfGFPおよびKanRカセットには、cpcB終止コドンのわずか3'(cpcAの5')が配置される。cpcBプロモーター、cpcB、sfGFP、KanR、cpcA(5 '〜3')を有する合成配列全体をpUC19にクローニングする。マップを図 5 に示します。pAK1、pAK2、およびpAK3のクローニングおよびpMH1の完全な配列の詳細については、補足ファイル1を参照してください。
4つの形質転換体(pAK1、pAK2、pAK3、およびpMH1を含む)はすべてGFPを発現した。全ての蛍光レベルは、野生型フィラメントのバックグラウンド蛍光を上回っていた(図6)。不完全な分離を有するpMH1形質転換体は、フィラメント間で非常に可変であったGFPシグナルを明らかにした。蛍光シグナルは、偏析が完了したときに均等に分布していた(図6E)。pAK1、pAK2、およびpAK3形質転換体の顕微鏡シグナルは類似していたが、pMH1のそれよりも約5倍弱かった(図6E)。
確立された凍結保存方法は、 大腸菌について確立された方法に基づいている。解凍後のグリセロール除去のために2つの洗浄ステップを行ったところ、15個の P.ラクナ サンプルのうち15個が生存した(表3)。このプロトコルは 、Synechocystis PCC 6803にも使用できますが、洗浄ステップは2回のみで、1回では使用できません(表3)。
オシラトリアルフィラメントのもう1つの特徴は、その運動性です: P.ラクナ フィラメントは、表面上(図7)および液体媒体中(図8)で連続的に移動します。両方の種類の動きは、寒天培地なしで、または寒天培地を用いてペトリ皿で容易に研究することができる。寒天上での動きが遅いため、タイムラプス記録が必要です。フィラメントは、光ビームが下から来ると光円錐に向かって移動します(図3)。光の強度、波長、時間の影響は、簡単な設定で簡単に調べることができます。この効果の感光体はまだ明らかではない。可能な候補は、ノックアウトミュータントで対処できます。フィラメントが光を見つける方法の根底にあるメカニズムも不明です。この質問では、暗闇から光への移動中のフィラメントを記録するために赤外線システムが必要です。
図1:ヘルゴランドとジリオから採取された ホルミジウム・ラクナ の株。 フィラメントは、6cmのペトリ皿中のf / 2寒天上で11日間増殖する。(a)GI08AO株;(b)GI08IO株;(c)GI09CO株;(d)株HE10DO;(e)株HE10JO;(f)株HE15M2G1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:形質転換後5週間 のホルミジウムラク ナフィラメント。 sfGFP発現ベクターにはpMH1が用いられた;選択は、120μg/mLカナマイシンを含むf/2+ 培地で起こった。緑がかったフィラメントは耐性があり、生きています。他のフィラメントは死んだ。スケール バー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フォトタキシスの実験左:調整可能な電源に接続された4つの赤色LEDを備えたLEDホルダー。各LEDの上には、8mLのホルミジウムラクナ培養物が入った6cmのペトリ皿があります。右:赤色LEDに2日後にP.ラクナを入れたペトリ皿(15μmol m-2 s-1)。略称:LED =発光ダイオード。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:pAK1による ホルミジウムラクナ の形質転換後のインサートの集積と分離。 アウタープライマーを用いたPCR。インサートなしおよびインサート付き製品の予想されるサイズは、それぞれ2371および5016 bpです。左レーン:マーカー、レーン1、2、3、4:耐性フィラメントの単離後7日、11日、14日、および17日後(形質転換後4週間)のフィラメントのPCR産物。レーン5:野生型のPCR産物(別のゲルから)。7日間のサンプルにおいて、インサートは染色体のごく一部に存在する。この画分は17日まで増加し、野生型バンドは見えない、すなわち分離が完了する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:内因性 cpcB プロモーターの制御下でのsfGFP発現のためのベクター。 オレンジ: ホルミジウムラクナ 相同配列、バイオレット/ブルー:pUC-19ベクター骨格、緑:sfGFPおよびKanRで挿入する。略語: sfGFP = スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質;KanR=カナマイシン耐性。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ホルミダム・ラクナにおけるsfGFPの発現。P.ラクナ野生型フィラメント(A)およびpAK1(B)、pAK2(C)、pAK3(D)、およびpMH1(E)による形質転換後の蛍光画像。pMH1において、sfGFP遺伝子はフィコシアニンß遺伝子の3'に配置され、したがって内因性cpcßプロモーターによって駆動される。他の場合において、sfGFPは、それぞれ、シネコシスチスPCC 6803由来のcpc560、A2813、またはpsbA2sプロモーターによって駆動される。蛍光設定はGFPに特異的です。すべての画像は、同じ積分時間と光学設定で記録されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:寒天表面上の ホルミジウムラクナを 4倍の倍率でマージした画像。 最初の画像は赤で、2番目の画像(1分後に撮影)は緑で表示されます。寒天の痕跡にも注意してください。スケール バー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:液体培地中の ホルミジウムラクナの マージ画像。 両画像間の時間間隔は10秒であった。最初の画像は赤で印刷されます。2 番目は緑色で印刷されます。両方の色を比較すると、10秒以内の動きが表示されます。スケール バー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 濾す | HE10JO | HE10DO | GI08AO | GI09CO | HE15M2G1 · |
| コンティグ | 104 | 174 | 218 | 102 | 154 |
| 合計 bp | 48,19,017 | 47,88,491 | 47,78,775 | 36,69,922 | 45,98,395 |
表1: ホルミジウムラクナ 株。
| ギ09コ | HE10DO | HE10JO | HE15M2G1 · | |
| Gi08AO | 42 | 40 | 0 | 42 |
| ギ09コ | 2 | 42 | 0 | |
| HE10DO | 40 | 2 | ||
| HE10JO | 42 |
表 2.10,876個のアミノ酸を有する20個のコアタンパク質の配列における株間のアミノ酸差。
| セル密度 OD 750 nm | 1 | 1 | 3 | 3 | 5 | 5 | 7 | 7 |
| 洗浄 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| シネコシスチス PCC 6803 | 2/5 | 5/5 | 1/4 | 4/4 | 0/4 | 4/4 | 0/4 | 3/4 |
| ホルミジウムラクナ HE10DO | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 3/ 4 | 4/4 | 3/3 | 3/3 |
表3:シネコシスチスPCC 6803およびホルミジウムラクナHE10DOシアノバクテリアによる凍結保存試験。最初の数字は、凍結/解凍後に生き残った培養物の数を示しています。2番目の数字は、試行回数の合計を示します。
補足ビデオ S1: 液体溶液中のホルミジウム ラクナ フィラメントのタイムラプスなしの動き。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ S2: 寒天表面でのホルミジウム ラクナ フィラメントのタイムラプスによる移動。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:ホルミジウムラクナ の形質転換のためのベクターのクローニング。変換ベクトルのリスト;クローニングのためのプライマーのリスト;gb形式のpMH1のシーケンス。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2: ラズベリーパイミニコンピュータ用のシェルスクリプト (sh)このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3:HE152G1のDNA配列。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4:GI08AOのDNA配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル5:GI09COのDNA配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル6:HE10DOのDNA配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル7:HE10JOのDNA配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
シアノバクテリアの多くの株が培養コレクション32、33、34、35、36から入手可能であるが、これらの種は特定の特性に適応しているため、野生からの新しいシアノバクテリアの需要が依然としてある。P. lacunaは岩溜まりから採取され、塩濃度および温度30の変動に適合している。この種の株は、2008年、2009年、および2010年の遠足中に発見されました。ここに記載した手順により、P. lacunaの5株を単離し、これらの株のうち4株を滅菌した。P. lacuna HE10JO株は、rRNAおよびゲノムシーケンシングによって同定された海洋細菌である細菌Marivirga atlanticaで永久に汚染されています。この細菌は、機械的分離、異なる温度での成長、抗生物質による処理、または化学的処理の適用にもかかわらず、シアノバクテリウムから分離することができなかった。汚染にもかかわらず、P. lacuna HE10JOは、他の株と同様に栽培することができる。後の遠足では、オシレーターの他のメンバーが見つかりましたが、まだ詳細には分析されていません。P. lacunaは再び見つからなかった。 P. lacunaがその後の数年間と2つの異なる場所で孤立していたのに、後に発見されなかった理由は明らかではありません。その豊富さは確かに予測不可能な条件に依存しています。温度、塩分濃度、無機または有機栄養素は、ロックプールでは非常に変動します。したがって、種の組成は、予測不可能な方法で時間の経過とともに変動する可能性があります。
自然形質転換は、異なるシアノバクテリア、主に単細胞種に対して確立される。糸状の P. lacuna は、自然の変容が確立されたオシラトリア目(Oscillatoriales)の唯一の種である。変換は、ほとんどの場合、現在のプロトコルで成功しました。一般に、形質転換試行後の耐性フィラメントの数はかなり異なり、時には形質転換が失敗し、貴重な時間の損失につながります。したがって、複数の変換プロジェクトを並行して実行することをお勧めします。完全な分離のための時間は、通常、耐性株の単離後4週間、変化し得る。カナマイシンの増殖後の完全な分離の保証はないため、外側および内側のプライマーを使用してPCR検査を行うことが重要です。
すべてのベクターは、2 x 500〜1,000 bpの相同配列を含んでいなければならず、例えば、PCRによって宿主から増幅され、耐性カセット(例えば、ここで使用されるカナマイシンカセットKanR)によって中断されなければならない37,38。発現のためには、プロモーター、コード配列(例えば、sfGFP39について)、ターミネーター、および耐性カセットを、相同配列間でクローニングしなければならない。クローニング戦略は種特異的であり、実験の目的に依存します。
この形質転換方法は、他のオシラトリアレス株または他のシアノバクテリアでも可能である可能性があり、自然形質転換は、他のすべてのシアノバクテリアゲノム3,15,40に存在するIV型ピリに基づいている。したがって、本方法は、他の種との新たな試みを刺激する可能性がある。IV型ピリは運動性にも関連しているため、シアノバクテリアが運動性である条件をチェックすることが重要です。
遺伝子挿入は相同組換えに基づいており、相同部位の破壊をもたらす。したがって、形質転換は遺伝子ノックアウトにしばしば使用される。挿入された遺伝子の発現は、活性プロモーターおよびコード配列が相同部位に組み込まれている場合に誘導される。P. lacunaにおいて、プロモーター活性は種に依存していた。Synechocystis PCC sp 6803またはSynechococcus sp. PCC 7002 31のcpc560、A2813、およびpsbA2プロモーター、ならびにP. lacunaのcpcBプロモーターは、sfGFP発現を駆動することができた。これらの構築物のうち、内因性cpcBプロモーターは最も強い発現を誘導したが、sfGFP遺伝子はフィコシアニンß遺伝子の3'に位置する。これは、シアノバクテリア発現における内因性プロモーターのより一般的な使用を示す。
遺伝子ノックアウトと運動研究の組み合わせは、運動性と光タクシーの分子メカニズムに光を当てるでしょう。LED光源は、フォトタクシー実験のための光を提供することができます。ほぼすべての波長が利用可能で、光強度は調整可能な電源とポテンショメータによって変調することができます。LEDホルダーは、3Dプリンタで構築でき、さまざまなLEDの組み合わせを簡単に実現できます。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究はカールスルーハー工科大学の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
| Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
| BG-11 Freshwater Solution | Sigma Aldrich | C3061 | |
| BG-11 medium | Merck | 73816-250ML | |
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
| Centrifuge LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | and rotor |
| Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | for up to 13,000 rpm |
| Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
| Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 |
|
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Merck | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
| Copper(II) sulphate pentahydrate | Merck | 7758-99-8 | CuSO4 · 5 H2O |
| D(+)-Biotin | Carl Roth | 58-85-5 | C10H16N2O3S |
| DNA ladder 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
| DNA ladder 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
| Electrical pipetting help accujet-pro S | Brand GmbH | 26360 | for pipetting 1-25 mL |
| Ethanol | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
| Fluorescence microscope ApoTome | Zeiss | ||
| Fluorescence microscope Axio Imager 2 | Zeiss | ||
| French Pressure Cell Press | American Instrument Company | N/A | |
| Gel documation System Saffe Image | Invitrogen | ||
| Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu | ADVANCED | ||
| Glassware, different | |||
| Glycerol | Carl Roth | 56-81-5 | C3H8O3 |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Merck | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
| Kanamycin sulphate | Carl Roth | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
| Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) | Sigma Aldrich | 137-16-6 | C15H28NO3 · Na |
| LB Broth (Lennox) | Carl Roth | X964.4 | |
| Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight | OSRAM | cultivation of cyanobacteria | |
| Light source, LED panel XL 6500K 140 W | Bloom Star | N/A | cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Serva | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
| Microscope DM750 | Zeiss | ||
| Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
| Minicomputer Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | for time-lapse recording |
| Ocular camera EC3 | Leica | for continuous recording up to 30 s | |
| Ocular camera MikrOkular Full HD | Bresser | for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer | |
| Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm | Merck | P5606-400EA | |
| Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm | Merck | P5481-500EA | |
| Photometer Nanodrop ND-1000 | Peqlab Biotechnologie | ||
| Photometer Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
| Pipetman 100-1,000 µL | Gilson | SKU: FA10006M | |
| Pipetman 10-100 µL | Gilson | SKU: FA10004M | |
| Plastic pipettes 10 mL, sterile | Greiner | 607107 | |
| Plastic tube, sterile, 15 mL | Greiner | 188271 | |
| Plastic tube, sterile, 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Potassium bromide | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
| Potassium chloride | Carl Roth | 7447-40-7 | KCl |
| Power supply Statron 3252-1 | Statron Gerätetechnik GmbH | ||
| Power supply Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | for LED | |
| Proteinase K | Promega | MC500C | from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470 |
| Q5 polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
| Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph Instruments | for cultivation | |
| Sodium acetate | Carl Roth | 127-09-3 | NaCH3COO |
| Sodium chloride | Carl Roth | 7647-14-5 | NaCl |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
| Sodium fluoride | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
| Sodium hydrogen carbonate | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
| Sodium molybdate dihydrate | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
| Sodium nitrate | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
| Sodium sulphate | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
| Strontium chloride hexahydrate | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
| Thiamine hydrochloride | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
| TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | C4H11NO3 |
| Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 | Hielscher Ultrasound Technology | UP100H | |
| Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | homogenizer | |
| Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
| Vitamin B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin | ||
| Water Stills, Water treatment | VEOLIA water technologies | ELGA_21001 | |
| Zinc sulphate heptahydrate | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
| software, URL | |||
| gatb-minia program for DNA assembly | https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based | |
| ImageJ | software for immage processing (pixel intensities, circle diameter) | ||
| RAST annotation server | https://rast.nmpdr.org | input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions | |
| Culture media | |||
| Artificial seawater | 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF | ||
| f/2 -liquid medium | artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+ liquid medium | f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4 | ||
| f/2-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| Trace element solution | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2 | ||
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin |
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