Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Naturlig transformation, proteinuttryck och kryokonservering av den trådformiga cyanobakterien Phormidium lacuna

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna är en trådformig cyanobakterie som isolerades från marina stenpooler. Denna artikel beskriver isolering av filament från naturliga källor, DNA-extraktion, genomsekvensering, naturlig transformation, uttryck av sfGFP, kryokonservation och motilitetsmetoder.

Abstract

Cyanobakterier är i fokus för grundforskning och biotekniska projekt där solenergi används för produktion av biomassa. Phormidium lacuna är en nyligen isolerad trådformig cyanobakterie. Denna uppsats beskriver hur nya trådformiga cyanobakterier kan isoleras från marina stenpooler. Den beskriver också hur DNA kan extraheras från filament och hur genomerna kan sekvenseras. Även om omvandling är etablerad för många encelliga arter, rapporteras det mindre ofta för trådformiga cyanobakterier. En förenklad metod för den naturliga omvandlingen av P. lacuna beskrivs här. P. lacuna är den enda medlemmen i ordningen Oscillatoriales för vilken naturlig omvandling är etablerad. Detta dokument visar också hur naturlig omvandling används för att uttrycka superfolder grönt fluorescerande protein (sfGFP). En endogen cpcB-promotor inducerade cirka 5 gånger starkare uttryck än cpc560, A2813 eller psbA2-promotorer från Synechocystis sp. Vidare fastställdes en metod för kryokonservering av P. lacuna och Synechocystis sp.CPP 6803, och metoder för att bedöma motilitet i ett flytande medium och på agar- och plastytor beskrivs.

Introduction

Cyanobakterier är prokaryota organismer som använder fotosyntes som energikälla 1,2. Forskningen är alltmer inriktad på cyanobakteriella arter. Flera cyanobakterier kan transformeras med DNA3. Gener kan slås ut eller överuttryckas hos dessa arter. Omvandlingen är dock begränsad till ett fåtal arter 4,5,6,7,8,9,10,11, och det kan vara svårt att fastställa omvandling i stammar från kultursamlingar eller det vilda 8. Stammar av den trådformiga arten Phormidium lacuna (figur 1) isolerades från marina stenpooler, där miljöförhållanden, såsom saltkoncentrationer eller temperatur, fluktuerar över tiden. Dessa trådformiga cyanobakterier kan användas som modellorganismer för den ordning Oscillatoriales12 som de tillhör.

Under försök som testade genöverföring genom elektroporering13,14 fann man att P. lacuna kan transformeras genom naturlig transformation15. I denna process tas DNA upp naturligt av vissa celler. Jämfört med andra omvandlingsmetoder16,17 har naturlig omvandling fördelen att det inte krävs ytterligare verktyg som kan komplicera proceduren. Till exempel kräver elektroporering korrekta kyvetter, intakta ledningar och val av rätt spänning. P. lacuna är för närvarande den enda Oscillatoriales-medlemmen som är mottaglig för naturlig omvandling. Eftersom det ursprungliga protokollet är baserat på elektroporeringsprotokoll inkluderade det fortfarande flera tvättsteg som kan vara onödiga. Olika tillvägagångssätt testades för att förenkla protokollet, vilket ledde till transformationsprotokollet som presenteras här.

Genomsekvensen är avgörande för ytterligare molekylära studier baserade på genknockout eller överuttryck. Även om genomsekvenser kan erhållas med nästa generations sekvenseringsmaskiner inom korta perioder, kan extraktionen av DNA vara svår och beror på arten. Med P. lacuna testades flera protokoll. En modifierad cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB)-baserad metod fastställdes sedan, vilket resulterade i acceptabel renhet av DNA och DNA-utbyten för varje reningscykel för fortsatt arbete i laboratoriet. Genomet av fem stammar kan sekvenseras med detta protokoll. Nästa logiska transformationssteg var att etablera proteinuttryck i P. lacuna.

SFGFP som används som markörprotein i detta protokoll kan detekteras med vilket fluorescensmikroskop som helst. Alla promotorer som testades kunde användas för P. lacuna sfGFP-uttryck. Det ökande antalet stammar som uppstår genom omvandling har resulterat i behovet av en metod för lagring av kulturerna. Sådana metoder är etablerade för Escherichia coli och många andra bakterier18. I standardprotokoll framställs glycerolkulturer, överförs i flytande kväve och lagras vid -80 °C. Denna metod kräver bara några steg och är mycket tillförlitlig för de arter för vilka den är etablerad. Standardprotokollet var inte genomförbart för P. lacuna eftersom levande celler inte kunde återvinnas i alla fall. Men när glycerol avlägsnades efter upptining överlevde celler från alla försök. Enkla metoder presenteras för analys av rörligheten hos P. lacuna, som kan kombineras med knockout-mutagenes för att undersöka typ IV pili eller fotoreceptorernas roll. Dessa analyser skiljer sig från de hos encelliga cyanobakterier 19,20,21 och kan också vara användbara för andra Oscillatoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering från den naturliga miljön

OBS: Gröna alger, kiselalger, trådformiga cyanobakterier och andra mikroalger kan isoleras. Protokollet kan användas för alla mikroalgerter från stenpooler som växer under laboratorieförhållanden. Filamentösa cyanobakterier som tillhör Oscillatoriales kan lätt kännas igen av deras rörelse och trådformiga form. Arten kan identifieras i ett halvrent tillstånd genom genomsekvensering eller 16S rRNA-sekvensering.

  1. Överför flytande havsvattenprover från marina stenpooler (dvs. håligheter i den steniga kusten) till 50 ml kolvar. För varje kolv, notera den exakta platsen eller koordinaterna för den naturliga källan. Om möjligt, filtrera innehållet genom 50 μm nät för att minska mängden zooplankton. Förvara proverna vid 4 °C tills de kan subkultureras.
  2. Överför 1 ml kulturer till 10 cm petriskålar innehållande 3 % bacto-agar i f/2 medium22,23 (se materialförteckningen). Förbered upp till 20 plattor. Odla under vitt ljus på 50 μmol m-2 s-1.
    OBS: Högre ljusintensiteter kan användas för odling. Intensitet upp till 400 μmol m-2 s-1 kan användas för P. lacuna, även om andra arter kan vara mer ljuskänsliga.
  3. Efter en vecka, överför de önskade cellerna till färska agarplattor med sterila pincett. Isolera cellerna under ett kikarmikroskop under sterila förhållanden. Förvara den gamla agarplattan vid 4 °C tills cellerna dyker upp och växer på den nya agarplattan.
  4. Upprepa detta överföringssteg varje vecka för att eliminera kontaminering. Använd blotta ögat för att upptäcka kraftig kontaminering och ett mikroskop med 400x förstoring för ytterligare kontroller av kontaminering.
  5. Om ett prov verkar fritt från kontaminering, testa för bakteriell eller svampkontaminering på agarplattor. Överför en bråkdel av kulturen med en ympningsslinga till en LB24 agarplatta (10 cm diameter), håll plattan vid rumstemperatur och kontrollera tillväxten av föroreningar under 1-3 dagar.
  6. Om en steril trådformig cyanobakteriell art erhålls, använd den för ytterligare odlingsarbete. Odla P. lacuna i vätska eller på bacto-agarplattor. Använd 250 ml kolvar med 50 ml f/2 medium eller f/2+ medium för flytande odling.

2. DNA-extraktion

OBS: Denna metod antas från 25 26

  1. Förbered två kolvar med 50 ml f/2 medium. Inokulera var och en med ~ 1 ml P. lacuna filament från andra växande kulturer. Håll odlingarna i 7 dagar eller längre under omrörning (horisontell rotation) vid 50 rpm under vitt ljus (50 μmol m-2 s-1) vid 25 °C.
  2. Behandla kulturen med ultraljud (se materialtabellen) i 2 minuter med full energi. Mät OD vid 750 nm; kontrollera att den är ~ 0,5. Fortsätt att odla kulturerna om OD är för låg.
  3. Samla filamenten med 5000 × g, 20 min centrifugering. Ta bort supernatanten. Överför filamenten med restvätska till kammaren i en fransk press27. Ställ in trycket från den franska pressen till 20 000 psi och extrahera cellerna.
    OBS: Den franska pressen kommer att lysa alla celler och släppa DNA; starka skjuvkrafter kommer att producera 1 500 bp DNA-fragment.
  4. Centrifugera provet i 10 min vid 10 000 × g och ta bort supernatanten.
  5. Tillsätt 400 μL lysbuffert (4 M urea, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) och 50 μL proteinas K (10 mg/ml) till pelleten. Värm provet till 55 °C i 60 min med skakningar vid 550 rpm.
  6. Tillsätt 1 ml DNA-extraktionsbuffert (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris / Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) och inkubera i 60 min vid 55 ° C och 550 rpm. Överför lösningarna till centrifugeringsrör och tillsätt två volymer kloroform/isoamylalkohol (24/1).
  7. Efter skakning centrifugera provet i 5 minuter vid 9 000 × g. Överför den övre, vattenhaltiga fasen till reaktionsflaskor och tillsätt 1 ml iskall etanol och 50 μL 3 M natriumacetat.
  8. Virvla provet och placera det vid -20 ° C i 1 timme eller längre.
  9. Centrifug i 5 min vid 10 000 × g (4 °C) och kassera supernatanten. Tvätta pelletsen med 70% etanol.
  10. Centrifugera provet igen. Ta bort supernatanten och torka pelletsen över natten. Lös upp DNA i nukleasfritt vatten. Mät DNA-spektrumet för att kontrollera om OD 260 nm / OD 280 nm är mellan 1,6 och 1,9.
  11. Analysera storleken på DNA på en agaroselektroforesgel28.
  12. Sekvensera det genomiska DNA: t genom nästa generations sekvensering i 300 cykler, med en parad ändinställning och läslängd på 150 baser (se materialtabellerna).
  13. Utför monteringen med lämpligt datorprogram; se exemplet i materialförteckningen.
  14. Skicka utkastet till genomet till RAST-servern för anteckningar.
    OBS: Ladda upp DNA-sekvenser för att få fullständig kommentar inom några minuter.

3. Naturlig transformation och GFP-uttryck

OBS: Transformationen är baserad på en plasmidvektor förökad i E. coli; pGEM-T eller pUC19 kan användas som ryggradsvektorer. Kloningstekniker är etablerade i många laboratorier; se även standardprotokoll28 och artiklarna om transformationsvektorer för P. lacuna15,29. Exempel på vektorer för sfGFP-uttryck beskrivs i avsnittet representativa resultat. Detaljer om fyra ännu opublicerade vektorer finns i tilläggsfil 1.

  1. Utför alla steg med sterilt material under sterila laboratorieförhållanden (ren bänk, sterilt glas).
  2. Inokulera 2 x 50 ml f/2 flytande medium i två 250 ml kolvar med 2 x 1 ml P. lacuna filament från en löpande kultur. Odla i vitt ljus (50 μmol m-2 s-1) under omrörning (horisontell rotation, 50 rpm) i ~ 5 dagar vid 25 °C.
  3. Förbered ~ 200 μg av transformationsvektor-DNA med hjälp av ett midi prep-kit (se materialförteckningen) enligt tillverkarens instruktioner.
  4. Homogenisera 100 ml P. lacuna-cellsuspension (se materialförteckningen) vid 10 000 rpm i 3 minuter. Mät OD vid 750 nm (önskat värde = 0,35).
  5. Centrifugera cellsuspensionen i 15 min vid 6 000 × g. Ta bort supernatanten och suspendera pelleten i 800 μL (total volym inklusive restvätska och filament) av den återstående vätskan och ytterligare f/2+ medium.
  6. Ta åtta f / 2 + bacto-agarplattor (10 cm diameter) innehållande 120 μg / ml kanamycin. Pipettera 10 μg DNA i mitten av varje agarplatta. Pipettera omedelbart 100 μL cellsuspension i mitten av varje agarplatta (ovanpå DNA).
  7. Förvara agarplattan utan lock på den rena bänken så att överskottsvätskan avdunstar. Stäng plattan och odla den i vitt ljus vid 25 °C i 2 dagar.
  8. Fördela filamenten på varje agarplatta med en ympningsslinga på flera färska f/2+ bacto-agarplattor innehållande 120 μg/ml kanamycin. Odla plattorna i vitt ljus vid 25 °C och kontrollera odlingarna regelbundet under mikroskop.
  9. Identifiera levande, transformerade filament efter 7-28 dagar under mikroskopet. Leta efter friska, gröna trådar (figur 2) som skiljer sig från andra filament. Om dessa gröna filament kan identifieras, fortsätt med nästa steg; annars, behåll plattan i ytterligare 7 dagar.
  10. Använd pincett för att överföra dessa identifierade levande filament till 50 ml flytande f / 2 + medium med 250 μg / ml kanamycin. Odla i vitt ljus vid 25 °C på en shaker (horisontell rotation, 50 rpm). Observera tillväxten i upp till fyra veckor.
  11. Överför filamenten tillbaka till agarmediet innehållande 250 μg /ml kanamycin och vänta tills filamenten växer. Efter flera dagar, överför enstaka filament till en färsk agarplatta med en högre koncentration av kanamycin, t.ex. 500 μg / ml. Behåll originalplattan.
  12. Se till att filamenten förökas i en hög koncentration av kanamycin i flytande kultur eller på agar. Öka kanamycinkoncentrationen igen för att påskynda segregeringen.
    OBS: Transformerad P. lacuna växer i upp till 10 000 μg / ml kanamycin. Andra arter kanske inte tolererar så höga koncentrationer.
  13. Om resistenta celler odlas och fördelas brett över en platta, testa integreringen av insatsen i genomet av P. lacuna genom att utföra PCR med yttre och inre primers.
    1. Använd primers som var konstruerade för kloning av insättningen som inre primers.
    2. För utformning av de yttre primrar, välj sekvenser som är 5 'och 3' av det föreslagna införingsstället på genomet av P. lacuna men utanför insättningen.
    3. För PCR-reaktioner, använd inre primers och yttre primers. Använd den eller de resistenta stammarna och den vilda typen.
      OBS: Inre primers indikerar att insatsen är närvarande; yttre primers visar att skäret sätts in vid rätt plats.
  14. För varje PCR-reaktion, placera ~ 10 mg av filamenten direkt i PCR-rören och utför PCR enligt standardprotokoll24. Om ingen produkt erhålls, variera glödgningstemperaturen och tvätta filamenten med vatten.
    OBS: Många olika polymeraser kan användas i PCR. Standardpolymeraser, såsom Taq-polymeras, har en högre felfrekvens än felkontrollpolymeraser, som är dyrare. Denna analytiska PCR kräver inget felkontrollpolymeras. Felkontrollpolymeras bör dock testas om ingen PCR-produkt erhålls med ett standardpolymeras.
  15. Analysera PCR-produkterna i den resistenta linjen på agaroselektrofores24.
    1. Jämför bandpositioner med markör och jämför vildtyp och transformant. Med inre och yttre primers, leta efter ett större band för transformanten än den vilda typen (på grund av införandet av motståndskassetten) eller två band för transformanten: ett med storleken på vildtypsbandet och ett större. Eftersom det senare fallet indikerar ofullständig segregering, fortsätt odlingen med höga kanamycinkoncentrationer.
      OBS: För mer information om PCR och elektrofores, se15,24 eller annan standardlitteratur.
  16. För GFP-uttryck: observera enstaka filament med ett fluorescensmikroskop (se materialförteckningen) vid en förstoring av målet som är satt till 40x eller 63x. Ta en ljusfältsöverföringsbild och en fluorescensbild. Använd följande inställningar för GFP: 470 nm bandpass för excitation, 525 nm bandpass för utsläpp och en 495 nm stråldelare, initial exponeringstid på 500 ms.
  17. Justera exponeringstiden för tydliga fluorescenssignaler och undvik mättande intensiteter. Försök att använda samma inställning för alla exempel.
  18. Eftersom filamenten av vild typ också kommer att visa fluorescens, ta bilder med samma inställningar som ovan för denna bakgrundsfluorescens.
    OBS: Belastningen som uttrycker GFP måste ha en högre signal; annars uttrycker det inte GFP.
  19. Baserat på exponeringstider och pixelintensiteterna i fluorescensbilderna, beräkna och jämför GFP-innehållet i de olika filamenten.

4. Kryokonservering

OBS: P. lacuna och den encelliga cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803 används. Den nuvarande metoden fungerar bättre för P. lacuna.

  1. Odla P. lacuna eller Synechocystissp PCC 6803 i minst 10 dagar i 10 ml f/2+ respektive BG-11 medium under vitt ljus (50 μmol m-2 s-1) vid 25 °C under omrörning (horisontella rotationer, 50 varv/min).
  2. Homogenisera P. lacuna-kulturen (se materialtabellen) vid 10 000 rpm i 3 min eller med en ultraljudsanordning (se materialtabellen) i 2 minuter vid full energi. Bestäm OD 750 nm för endera kulturen för att kontrollera om värdet är mellan 1 och 7.
  3. Samla cellerna genom centrifugering vid 6000 × g i 15 min. Ta bort supernatanten.
  4. Suspendera cellpelleten i 800 μL f/2+ eller BG-11 medium (slutlig volym) och överför till en 2 ml kryovial. Tillsätt 800 μL av en 50% glycerollösning till cellsuspensionen. Stäng injektionsflaskan och blanda genom upprepad invertering.
  5. Överför kryovialen till flytande kväve och förvara den i en kryobox i en frys på -80 °C. Notera lådans position i frysen och koordinaterna för provet i lådan.
  6. För återhämtning av cellerna, ta ut kryovialen och tina innehållet vid rumstemperatur. Överför innehållet till ett 2 ml reaktionsrör.
  7. Tvätta provet två gånger. För denförsta tvätten , centrifugen vid 6000 × g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen i 2 ml f/2+ eller BG-11 medium. För denandra tvätten, nyligenrifugera vid 6000 × g i 5 min, ta bort supernatanten och suspendera pelletsen i 2 ml f / 2 + eller BG-11 medium.
  8. För att kontrollera integriteten hos dessa celler som är klara för odling, överför pelletsen till 9 ml medium och odla dem i vitt ljus (50 μmol m-2 s-1) under omrörning (55 rpm). Jämför OD 750 nm av kulturen den första dagen och efter 1 vecka.

5. Motilitet av Phormidium lacuna

OBS: Tre olika analyser kommer att beskrivas. Samma kultur används i alla fall.

  1. Odla P. lacuna i f/2 medium under horisontell omrörning (50 rpm) i vitt ljus (50 μmol m-2 s-1) i ~5 dagar tills den uppskattade OD 750 nm är 0,35. Förvara provet vid 4 °C tills det används.
  2. Homogenisera filamenten (se materialförteckningen) vid 10 000 rpm i 3 min eller med ultraljud (se materialförteckningen) i 1 min vid maximal effekt och cykel på 1. Mät OD 750 nm. Om det är över 0,35, späd fraktionen med f/2-medium. Använd denna lösning i motilitetsanalyser i steg 5.3, 5.4 och 5.5.
  3. Analys för rörelse i flytande medium
    1. För direkt observation av motilitet, överför 8 ml medium innehållande P. lacuna (från steg 5.2) till en 6 cm petriskål. Vänta några minuter tills provet når rumstemperatur. Täck petriskålen med cellofanfolie.
    2. Placera en mikroskopbild på x-y-bordet i ett standardmikroskop med en kamera. Slå på mikroskoplampan. Använd helst alltid samma elektriska och optiska inställningar för belysningen. Flytta ett 4x eller 10x mål in i ljusets väg.
    3. Lägg petriskålen ovanpå bilden. Justera enkla filament eller filamentbuntar med x-, y- och z-rörelser i tabellen.
      OBS: På grund av det tredimensionella arrangemanget kan endast en del av det relevanta avsnittet vara i fokus. Cellofanfolien gör det möjligt att justera fokus utan begränsning.
    4. Observera rörelser av enskilda filament eller buntar. Se till att objektivlinsen inte vidrör vätskan. Spela in filamentens rörelser med en vanlig mikroskopkamera (se Kompletterande video S1).
  4. Analys för rörelse på ytan
    1. För observation av filamentmotilitet på agarytor, förbered 6 cm petriskålar med f / 2 bacto-agar. Se till att agaren är tillräckligt hög för att objektivlinsen ska komma nära agarytan. Alternativt kan du förbereda ett ~ 3 mm tjockt agarskikt och spela in filamenten genom agar (håll plattan upp och ner eller använd ett inverterat mikroskop).
    2. Pipett 0,5 ml av en lösning innehållande P. lacuna (från steg 5.2) på bacto-agarytan på en 6 cm petriskål. Låt vätskan komma in i ytan. Stäng petriskålen och observera filamentens rörelse på ytan med ett 4x eller 10x mål.
    3. Se till att samma elektriska och optiska inställningar för mikroskopet används under hela inspelningen och i efterföljande inspelningar.
    4. Spela in timelapse-inspelningar med hjälp av en okulär kamera och minidatorsystem. Se till att tidsintervallet mellan efterföljande bilder är 5 s-1 min. Programmera Linux-skriptet på minidatorn för att styra time-lapse-inspelningen. Se Tilläggsfil 2 för ett exempelskript och Kompletterande video S2 som ett exempel.
  5. Analys för fototaxis
    1. För fototaxiexperiment, förbered ljusdiodhållare (LED) (här med en 3D-skrivare) där de valda 5 mm lysdioderna är monterade för att bestråla ett område på 20 mm2 från under till ovan (Figur 3). Om det behövs, använd många LED-hållare parallellt, anslut varje LED elektriskt genom ett motstånd och potentiometer till en justerbar strömförsörjning. Mät och justera LED-intensiteterna, beroende på experimentet. Se till att hela inställningen är i ett mörkt rum eller en sluten mörk behållare.
    2. Placera 8 ml av mediet som innehåller P. lacuna (från steg 5.2) i en 6 cm petriskål. Justera lysdiodens ljusintensitet. Stäng petriskålen med locket och placera den på en LED-hållare så att lysdioden är i mitten av petriskålen.
    3. Efter önskad varaktighet (vanligtvis 2 dagar), ta en bild av petriskålen med en smartphone-kamera riktad direkt mot ljusbehandlingens position. Använd en vit LED-panel för bestrålning av provet. Använd kamerans manuella inställningar; undvik reflektioner av ljus; Justera alltid för att få samma avstånd mellan kameralinsen och provet. Se till att exponeringsinställningarna ger en bild som är lämplig för senare analyser med ImageJ.
    4. Kvantifiera diametern på den centrala cirkeln av filament med hjälp av ImageJ-programvaran.
      1. Öppna ImageJ, klicka på Arkiv | Öppna, välj önskad fil och klicka på Enter.
      2. Välj knappen Rak (med en rak linje). Tryck på vänster musknapp för att rita en linje från ena änden av petriskålen till motsatt ände. Se till att linjen passerar genom mitten av cirkeln av filament.
      3. Tryck på Ctrl-K på tangentbordet eller klicka på Analysera | Rita profil i ImageJ-menyn. Leta efter ett x-y-fönster med pixelintensiteter ritade kontra avstånd - en 1D-profil för petriskålen. Kontrollera att den lägsta pixelintensiteten är något över 0 och det högsta värdet under 255.
      4. Uppskatta ett medelvärde för pixelintensiteten utanför cirkeln och ett annat medelvärde för pixelintensiteten i cirkeln. Vid y-positionen mellan dessa värden, uppskatta x-värdena på båda sidor av cirkeln genom att peka med musen på dessa positioner. Notera båda värdena och beräkna skillnaden.
      5. Få det högsta x-värdet genom att peka musen mot y-axeln till höger. Observera att detta värde e representerar petriskålens diameter. Om denna diameter är 5 cm, beräkna diametern på den centrala filamentcirkeln som d/e × 5 cm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enligt ovan nämnda metoder isolerades 5 olika stammar av P. lacuna från stenpooler och sekvenserades (figur 1 och tabell 1). Alla kulturer var sterila efter ~ 1 års subkulturering utom P. lacuna HE10JO. Denna stam är fortfarande förorenad med Marivirga atlantica, en marin bakterie. Under efterföljande Helgoland-utflykter isolerades andra trådformiga cyanobakterier från bergpooler, som skiljer sig från P. lacuna och måste karakteriseras.

Flera DNA-extraktions- och reningsmetoder testades för P. lacuna. De bästa resultaten erhölls med en optimerad CTAB-metod enligt beskrivningen ovan. DNA-utbytena var 310 ± 50 μg/ml, OD 260 nm/OD 280 nm var 1,7 ± 0,03 och OD 260 nm/OD 230 nm var 0,78 ± 0,04 (n = 17). Genomsekvensering visade att DNA från alla stammar var något annorlunda, som förväntat (tabell 1). Kärnproteinsekvenser visade en maximal skillnad på 0,04% (tabell 2). Även om alla utkast till genom var ofullständiga kan man anta att >98% av genomet för HE10JO30 sekvenserades. Denna uppskattning baseras på antalet ofullständiga öppna läsramar. Partiella proteinsekvenser kunde lätt identifieras efter RAST-annotering av HE10DO och HE10JO. I HE10JO hade 60 proteiner av ~ 4 500 en saknad N- eller C-terminalsekvens. Genomsekvenserna finns i tillägget (Supplemental File 3, Supplemental File 4, Supplemental File 5, Supplemental File 6 och Supplemental File 7).

Intressant nog isolerades stammar av samma art från två öar, Helgoland och Giglio. Det linjära avståndet mellan båda öarna är 1 400 km. Det måste finnas en koppling mellan båda platserna, t.ex. med fartyg via havet eller, mer sannolikt, med flyttfåglar. Många fågelarter finns på båda öarna, och många av dem är flyttfåglar. Mångfalden inom P. lacuna-stammarna på en ö var större än mellan de närmaste Helgoland- och Giglio-stammarna (tabell 2). Detta indikerar ett intensivt utbyte mellan båda platserna.

Den naturliga omvandlingen testades med HE10DO som den största stammen och med HE10JO. Det nuvarande protokollet är enklare än det protokoll som beskrivits tidigare12 på grund av det minskade antalet tvättsteg och färre överföringssteg efter transformation. Denna nya metod används kontinuerligt i laboratoriet; ~ 15 framgångsrika omvandlingar uppnåddes.

KanR-resistenskassetten integrerades vanligtvis i den homologa platsen definierad av de intilliggande regionerna, vilket visas av PCR med hjälp av inre och yttre primers. Liksom de flesta cyanobakterier är P. lacuna polyploid. Det kan ha mer än 100 kromosomer per cell12. Ett PCR-test med yttre primers ~ 1 vecka efter transformationen har vanligtvis 2 band på elektroforesgelen, ett med storleken på vildtypsbandet och ett långsammare migrationsband som indikerar införandet av motståndskassetten (Figur 4). Dubbelbandet indikerar att endast en subfraktion av kromosomerna innehåller införandet. Efter 4 veckors urval på kanamycin är segregeringen vanligtvis fullständig, och endast ett stort PCR-band visas på geler. När det gäller omvandlingen med pMH1 (se nedan) var segregeringen dock fullständig efter mer än 3 månader.

Vektorerna pAK1, pAK2, pAK3 och pMH1 konstruerades för tester av sfGFP-uttryck. I pAK1, pAK2 och pAK3 kontrolleras sfGFP-genen av cpc560-, A2813- respektive psbA2-promotorerna. Dessa promotorer är från Synechocystis sp. För konstruktionen av dessa vektorer togs sfGFP-promotorn och terminatorsekvenserna från vektorer som användes för transformation av Synechococcus sp. De relevanta sekvenserna integrerades i det homologa chwA-stället (sc_7_37) för pFN1 (eller pFN_7_37_KanR15). PMH1-uttrycksvektorn konstruerades genom DNA-syntes med användning av P. lacuna-sekvenser som mallar (tilläggsfil 6). CpcB-cpcA (phycocyanin ß och phycocyanin α) sekvenser av P. lacuna är seriellt anordnade. En 100 bp intergen region separerar båda kodande regionerna. Den syntetiska sekvensen innehöll denna endogena cpcB-cpcA-sekvens och cpcB-promotorn. SFGFP- och KanR-kassetten placeras bara 3 'av cpcB-stoppkodonet (5' cpcA). Hela den syntetiska sekvensen med cpcB-promotor, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' till 3') klonas till pUC19. En karta visas i figur 5. Mer information om kloning av pAK1, pAK2 och pAK3 och den fullständiga sekvensen av pMH1 ges i tilläggsfil 1.

Alla fyra transformanter (med pAK1, pAK2, pAK3 och pMH1) uttryckte GFP; alla fluorescensnivåer var över bakgrundsfluorescensen hos glödtrådar av vild typ (figur 6). PMH1-transformanterna med ofullständig segregering avslöjade en GFP-signal som var mycket variabel mellan filamenten. Fluorescenssignalen fördelades jämnt när segregeringen var klar (figur 6E). Mikroskopsignalerna för pAK1-, pAK2- och pAK3-transformanter var likartade men ~ 5x svagare än för pMH1 (figur 6E).

Den etablerade kryokonservationsmetoden är baserad på en metod som fastställdes för E. coli. När 2 tvättsteg utfördes för glycerolavlägsnande efter upptining överlevde 15 av 15 P. lacunaprover (tabell 3). Detta protokoll kan också användas för Synechocystis PCC 6803, men endast med 2 tvättsteg och inte med 1 (tabell 3).

En annan egenskap hos Oscillatoriales filament är deras rörlighet: P. lacuna filament rör sig kontinuerligt på ytor (Figur 7) och i ett flytande medium (Figur 8). Båda typerna av rörelse kan enkelt studeras i petriskålar utan eller med agarmedium. Time-lapse-inspelning krävs eftersom rörelsen på agar är långsam. Filament rör sig mot ljuskonen om en ljusstråle kommer underifrån (figur 3). Effekterna av ljusintensitet, våglängd och tid kan enkelt studeras med en enkel inställning. Fotoreceptorerna för denna effekt är ännu inte klara. Möjliga kandidater kan adresseras med knockout-mutanter. Mekanismen bakom hur filamenten hittar ljuset är också oklart. För denna fråga krävs ett infrarött system för att registrera filamenten under deras rörelse från mörker till ljus.

Figure 1
Figur 1: Stammar av Phormidium lacuna som samlats in från Helgoland och Giglio. Filament förökas i 11 dagar på f / 2 agar i 6 cm petriskålar. A) Stam GI08AO. B) Stam GI08IO. C) Stam GI09CO. D) stam HE10DO, E) stam HE10JO, F) stam HE15M2G1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Phormidium lacuna filament 5 veckor efter transformation. sfGFP-uttrycksvektorn pMH1 användes; selektion skedde på f/2+ medium med 120 μg/ml kanamycin. De grönaktiga filamenten är resistenta och levande; andra filament har dött. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Fototaxiexperiment. Vänster: LED-hållare med 4 röda lysdioder, ansluten till en justerbar strömförsörjning. Ovanpå varje LED finns en 6 cm petriskål med 8 ml av en Phormidium lacuna-kultur . Höger: Petriskål med P. lacuna efter 2 dagar på den röda lysdioden (15 μmol m-2 s-1). Förkortning: LED = ljusdiod. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Integration och segregering av insats efter transformation av Phormidium lacuna med pAK1. PCR med yttre primers. De förväntade storlekarna på produkten utan och med insats är 2371 respektive 5016 bp. Vänster körfält: markör, körfält 1, 2, 3, 4: PCR-produkter av filament 7 dagar, 11 dagar, 14 dagar och 17 dagar efter isolering av ett resistent filament (4 veckor efter transformation). Lane 5: PCR-produkt av vild typ (från en annan gel). I 7-dagarsprovet är insatsen närvarande i en liten bråkdel av kromosomerna. Denna fraktion ökar till 17 dagar, där inget vildtypsband är synligt, dvs segregeringen är fullständig. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Vektor för sfGFP-uttryck under kontroll av endogen cpcB-promotor . Orange: Phormidium lacuna homolog sekvens, violett/blå: pUC-19 vektor ryggrad, grön: infoga med sfGFP och KanR. Förkortningar: sfGFP = superfolder grönt fluorescerande protein; KanR = kanamycinresistens. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Uttryck av sfGFP i Phormidum lacuna. Fluorescensbilder av P. lacuna vildtypsfilament (A) och efter transformation med pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) och pMH1 (E). I pMH1 placeras sfGFP-genen 3' av fykocyanin ß-genen och drivs därför av den endogena cpcß-promotorn ; i de andra fallen drivs sfGFP av cpc560, A2813 eller psbA2s promotorer från Synechocystis PCC 6803. Fluorescensinställningarna är specifika för GFP; alla bilder spelades in med samma integrationstid och optiska inställningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Sammanslagen bild av Phormidium lacuna på agarytan vid 4x förstoring. Den första bilden presenteras i rött, den andra (tagen 1 min senare) i grönt. Notera också spåren på agaren. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Sammanslagen bild av Phormidium lacuna i flytande medium. Tidsintervallet mellan båda bilderna var 10 s. Den första bilden är tryckt i rött; den andra är tryckt i grönt. Att jämföra båda färgerna visar rörelsen inom 10 s. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

anstränga HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Contigs 104 174 218 102 154
totalt bp 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tabell 1: Phormidium lacuna stammar.

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

Tabell 2. Aminosyraskillnader mellan stammar i sekvenser av 20 kärnproteiner med 10 876 aminosyror.

Celldensitet OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Tvättar 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis DATOR 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Phormidium lacuna HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tabell 3: Kryokonservationsförsök med Synechocystis PCC 6803 och Phormidium lacuna HE10DO cyanobakterier. Den första siffran visar antalet kulturer som överlevde efter frysning / upptining; det andra numret visar det totala antalet försök.

Kompletterande video S1: Rörelse av Phormidium lacuna filament i flytande lösning, utan time-lapse. Vänligen klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video S2: Rörelse av Phormidium lacuna filament på agar yta, med time-lapse. Vänligen klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande fil 1: Kloning av vektorer för transformation av Phormidium lacuna. Lista över transformationsvektorer; lista över primers för kloning; sekvens av pMH1 i gb-format. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Shell-skript (sh) för Raspberry Pi minidator. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: DNA-sekvens av HE152G1. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 4: DNA-sekvens av GI08AO. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 5: DNA-sekvens av GI09CO. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 6: DNA-sekvens av HE10DO. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 7: DNA-sekvens av HE10JO. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om många stammar av cyanobakterier finns tillgängliga från odlingssamlingar 32,33,34,35,36, finns det fortfarande en efterfrågan på nya cyanobakterier från naturen eftersom dessa arter är anpassade till specifika egenskaper. P. lacuna samlades in från stenpooler och är anpassad till variationer av saltkoncentrationer och temperatur30. Stammar av denna art hittades under utflykter 2008, 2009 och 2010. Med det förfarande som beskrivs här isolerades 5 stammar av P. lacuna och 4 av dessa stammar var sterila. Stammen P. lacuna HE10JO är permanent förorenad med bakterien Marivirga atlantica, en marin bakterie som identifieras genom rRNA och genomsekvensering. Denna bakterie kunde inte separeras från cyanobakterien trots tillämpningen av mekanisk separation, tillväxt vid olika temperaturer, behandlingar med antibiotika eller kemiska behandlingar. Trots föroreningen kan P. lacuna HE10JO odlas på samma sätt som de andra stammarna. I senare utflykter hittades andra medlemmar av Oscillatoriales, som ännu inte analyseras i detalj. P. lacuna hittades inte igen. Det är oklart varför P. lacuna isolerades under de följande åren och två olika platser men inte hittades senare. Dess överflöd är verkligen beroende av oförutsägbara förhållanden. Temperatur, saltkoncentrationer och oorganiska eller organiska näringsämnen är mycket varierande i rockpooler. Därför kan artsammansättningen fluktuera över tiden på ett oförutsägbart sätt.

Naturlig omvandling är etablerad för olika cyanobakterier, mestadels encelliga arter. Den trådformiga P. lacuna är den enda arten av ordningen Oscillatoriales för vilken naturlig omvandling har etablerats. Omvandlingen var nästan alltid framgångsrik med det nuvarande protokollet. I allmänhet varierar antalet resistenta filament efter en transformationsstudie avsevärt, och ibland misslyckas transformationen, vilket resulterar i förlust av värdefull tid. Det är därför lämpligt att utföra flera transformationsprojekt parallellt. Tiden för fullständig segregering, vanligtvis 4 veckor efter isolering av den resistenta stammen, kan också variera. Eftersom det inte finns någon garanti för fullständig segregering efter tillväxt på kanamycin är det viktigt att utföra PCR-testerna med hjälp av yttre och inre primers.

Varje vektor måste innehålla 2 x 500-1000 bp homologa sekvenser, t.ex. förstärkta från värden med PCR och avbrutna av en resistanskassett (t.ex. kanamycinkassetten KanR som används här)37,38. För uttryck måste en promotor, kodningssekvens (t.ex. för sfGFP39), terminator och resistenskassett klonas mellan de homologa sekvenserna. Kloningsstrategierna är artspecifika och beror på syftet med experimentet.

Denna transformationsmetod kan också vara möjlig med andra Oscillatoriales-stammar eller andra cyanobakterier: naturlig omvandling är baserad på typ IV pili, som finns i nästan alla andra cyanobakteriella genom 3,15,40. Därför skulle den nuvarande metoden kunna stimulera nya försök med andra arter. Eftersom typ IV pili också är relevant för rörlighet är det viktigt att kontrollera om cyanobakterier är rörliga.

Geninsättning baseras på homolog rekombination och resulterar i en störning av de homologa platserna. Därför används transformation ofta för genknockout. Uttrycket av den infogade genen kommer att induceras om en aktiv promotor och en kodningssekvens integreras i det homologa stället. I P. lacuna var promotoraktiviteten beroende av arten. Cpc560-, A2813 - och psbA2-promotorerna för Synechocystis PCC sp 6803 eller Synechococcus sp. PCC 7002 31 och cpcB-promotorn för P. lacuna kan driva sfGFP-uttryck . Av dessa konstruktioner inducerade den endogena cpcB-promotorn det starkaste uttrycket, även om sfGFP-genen ligger 3 'av fykocyanin ß-genen. Detta indikerar en mer allmän användning av endogena promotorer i cyanobakteriellt uttryck.

Kombinationen av genknockout och rörelsestudier kommer att belysa molekylära mekanismer för rörlighet och fototaxi. LED-ljuskällor kan ge ljus för fototaxisexperiment. Nästan vilken våglängd som helst är tillgänglig, och ljusintensiteten kan moduleras av en justerbar strömförsörjning och potentiometrar. LED-hållare kan byggas av 3D-skrivare för att enkelt realisera kombinationer av olika lysdioder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Arbetet stöddes av Karlsruher Institute of Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

Tags

Biologi utgåva 180
Naturlig transformation, proteinuttryck och kryokonservering av den trådformiga cyanobakterien <em>Phormidium lacuna</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter