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Biology

Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la filamentosa Cyanobacterium Phormidium lacuna

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna es una cianobacteria filamentosa que se aisló de las piscinas de rocas marinas. Este artículo describe el aislamiento de filamentos de fuentes naturales, la extracción de ADN, la secuenciación del genoma, la transformación natural, la expresión de sfGFP, la crioconservación y los métodos de motilidad.

Abstract

Las cianobacterias son el foco de la investigación básica y los proyectos biotecnológicos en los que la energía solar se utiliza para la producción de biomasa. Phormidium lacuna es una cianobacteria filamentosa recién aislada. Este artículo describe cómo se pueden aislar nuevas cianobacterias filamentosas de las piscinas de rocas marinas. También describe cómo se puede extraer el ADN de los filamentos y cómo se pueden secuenciar los genomas. Aunque la transformación se establece para muchas especies unicelulares, se informa con menos frecuencia para las cianobacterias filamentosas. Aquí se describe un método simplificado para la transformación natural de P. lacuna. P. lacuna es el único miembro del orden Oscillatoriales para el que se establece la transformación natural. Este artículo también muestra cómo se utiliza la transformación natural para expresar la proteína fluorescente verde supercarpeta (sfGFP). Un promotor endógeno de cpcB indujo aproximadamente 5 veces más fuerte la expresión que los promotores cpc560, A2813 o psbA2 de Synechocystis sp. PCC6803. Además, se estableció un método para la criopreservación de P. lacuna y Synechocystis sp.CPP 6803, y se describen métodos para evaluar la motilidad en un medio líquido y en superficies de agar y plástico.

Introduction

Las cianobacterias son organismos procariotas que utilizan la fotosíntesis como fuente de energía 1,2. La investigación se centra cada vez más en las especies de cianobacterias. Varias cianobacterias se pueden transformar con ADN3. Los genes pueden ser eliminados o sobreexpresados en estas especies. Sin embargo, la transformación está restringida a unas pocas especies 4,5,6,7,8,9,10,11, y puede ser difícil establecer la transformación en cepas de colecciones de cultivo o silvestres 8. Las cepas de la especie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) se aislaron de piscinas de rocas marinas, en las que las condiciones ambientales, como las concentraciones de sal o la temperatura, fluctúan con el tiempo. Estas cianobacterias filamentosas pueden ser utilizadas como organismos modelo para el orden Oscillatoriales12 al que pertenecen.

Durante los ensayos que probaron la transferenciade genes por electroporación 13,14 se encontró que P. lacuna puede ser transformada por transformación natural15. En este proceso, el ADN es absorbido naturalmente por algunas células. En comparación con otros métodos de transformación16,17, la transformación natural tiene la ventaja de no requerir herramientas adicionales que podrían complicar el procedimiento. Por ejemplo, la electroporación requiere cubetas adecuadas, cables intactos y selección del voltaje adecuado. P. lacuna es actualmente el único miembro de Oscillatoriales susceptible a la transformación natural. Debido a que el protocolo original se basa en protocolos de electroporación, todavía incluía varios pasos de lavado que podrían ser innecesarios. Se probaron diferentes enfoques para simplificar el protocolo, lo que llevó al protocolo de transformación que se presenta aquí.

La secuencia del genoma es esencial para futuros estudios moleculares basados en la eliminación o sobreexpresión de genes. Aunque las secuencias del genoma se pueden obtener con máquinas de secuenciación de próxima generación en períodos cortos, la extracción de ADN puede ser difícil y depende de la especie. Con P. lacuna, se probaron varios protocolos. Luego se estableció un método basado en bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) modificado, lo que resultó en una pureza aceptable de los rendimientos de ADN y ADN de cada ciclo de purificación para el trabajo continuo en el laboratorio. El genoma de cinco cepas podría secuenciarse con este protocolo. El siguiente paso lógico de transformación fue establecer la expresión de proteínas en P. lacuna.

El sfGFP utilizado como proteína marcador en este protocolo se puede detectar con cualquier microscopio de fluorescencia. Todos los promotores que se probaron se pudieron utilizar para la expresión de P. lacuna sfGFP. El creciente número de cepas derivadas de la transformación ha dado lugar a la necesidad de un método para almacenar los cultivos. Tales métodos se establecen para Escherichia coli y muchas otras bacterias18. En los protocolos estándar, los cultivos de glicerol se preparan, se transfieren en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C. Este método requiere solo unos pocos pasos y es altamente confiable para aquellas especies para las que está establecido. El protocolo estándar no era factible para P. lacuna porque las células vivas no podían recuperarse en todos los casos. Sin embargo, cuando se eliminó el glicerol después de la descongelación, las células de todos los ensayos sobrevivieron. Se presentan métodos simples para el análisis de la motilidad de P. lacuna, que se pueden combinar con mutagénesis knockout para investigar el pili tipo IV o el papel de los fotorreceptores. Estos ensayos son diferentes de los de las cianobacterias unicelulares 19,20,21 y también pueden ser útiles para otros oscilatorios.

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Protocol

1. Aislamiento del medio natural

NOTA: Se pueden aislar algas verdes, diatomeas, cianobacterias filamentosas y otras microalgas. El protocolo se puede utilizar para cualquier especie de microalga de piscinas de roca que crecen en condiciones de laboratorio. Las cianobacterias filamentosas que pertenecen a Oscillatoriales se pueden reconocer fácilmente por su movimiento y forma filamentosa. La especie se puede identificar en un estado semipuro mediante secuenciación del genoma o secuenciación de ARNr 16S.

  1. Transfiera muestras líquidas de agua de mar de piscinas de rocas marinas (es decir, cavidades en la costa rocosa) a matraces de 50 ml. Para cada matraz, anote el lugar exacto o las coordenadas de la fuente natural. Si es posible, filtre el contenido a través de redes de 50 μm para reducir las cantidades de zooplancton. Conservar las muestras a 4 °C hasta que puedan ser subcultivadas.
  2. Transferir 1 ml de cultivos a placas de Petri de 10 cm que contengan bactoa-agar al 3% en f/2 medio22,23 (ver la Tabla de Materiales). Preparar hasta 20 platos. Cultivar bajo luz blanca de 50 μmol m-2 s-1.
    NOTA: Se pueden utilizar intensidades de luz más altas para el cultivo. La intensidad de hasta 400 μmol m-2 s-1 se puede utilizar para P. lacuna, aunque otras especies podrían ser más sensibles a la luz.
  3. Después de una semana, transfiera las células deseadas a placas de agar fresco usando fórceps estériles. Aislar las células bajo un microscopio binocular en condiciones estériles. Guarde la placa de agar vieja a 4 °C hasta que aparezcan las células y crezcan en la nueva placa de agar.
  4. Repita este paso de transferencia cada semana para eliminar la contaminación. Utilice el ojo desnudo para detectar una gran contaminación y un microscopio con aumento de 400x para comprobaciones adicionales de contaminación.
  5. Si una muestra parece libre de contaminación, analice la contaminación bacteriana o fúngica en las placas de agar. Transfiera una fracción del cultivo con un lazo de inoculación a una placa de agar LB24 (10 cm de diámetro), mantenga la placa a temperatura ambiente y verifique el crecimiento de contaminantes durante 1-3 días.
  6. Si se obtiene una especie de cianobacteria filamentosa estéril, úsela para trabajos de cultivo adicionales. Cultive P. lacuna en líquido o en placas de bacto-agar. Utilice matraces de 250 ml con 50 ml de medio f/2 o medio f/2+ para el cultivo líquido.

2. Extracción de ADN

NOTA: Este método se adopta del 25 al 26

  1. Preparar dos matraces con 50 mL de f/2 medio. Inocular cada uno con ~1 mL de filamentos de P. lacuna de otros cultivos en crecimiento. Mantenga los cultivos durante 7 días o más bajo agitación (rotación horizontal) a 50 rpm bajo luz blanca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C.
  2. Tratar el cultivo con ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 2 min con plena energía. Medir OD a 750 nm; verifique que sea ~ 0.5. Continúe cultivando las culturas si el OD es demasiado bajo.
  3. Recoger los filamentos mediante centrifugación de 5.000 × g, 20 min. Retire el sobrenadante. Transfiera los filamentos con líquido residual a la cámara de una prensa francesa27. Ajuste la presión de la prensa francesa a 20.000 psi y extraiga las células.
    NOTA: La prensa francesa lisará todas las células y liberará el ADN; fuertes fuerzas de cizallamiento producirán fragmentos de ADN de 1.500 pb.
  4. Centrifugar la muestra durante 10 min a 10.000 × g y retirar el sobrenadante.
  5. Añadir 400 μL de tampón de lisis (4 M de urea, 0,1 M de Tris/Cl, pH 7,4) y 50 μL de proteinasa K (10 mg/ml) al pellet. Calentar la muestra a 55 °C durante 60 min con agitación a 550 rpm.
  6. Añadir 1 mL de tampón de extracción de ADN (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M TDT, pH 8) e incubar durante 60 min a 55 °C y 550 rpm. Transfiera las soluciones a los tubos de centrifugación y agregue dos volúmenes de cloroformo/isoamilalcohol (24/1).
  7. Después de agitar, centrífugue la muestra durante 5 min a 9.000 × g. Transfiera la fase acuosa superior a viales de reacción y agregue 1 ml de etanol helado y 50 μL de acetato de sodio 3 M.
  8. Vórtice la muestra y colóquela a -20 °C durante 1 h o más.
  9. Centrifugar durante 5 min a 10.000 × g (4 °C) y desechar el sobrenadante. Lavar el pellet con etanol al 70%.
  10. Centrifugar la muestra de nuevo. Retire el sobrenadante y seque el pellet durante la noche. Disolver el ADN en agua libre de nucleasas. Mida el espectro de ADN para comprobar si el OD 260 nm/OD 280 nm está entre 1,6 y 1,9.
  11. Analizar el tamaño del ADN en un gel de electroforesis de agarosa28.
  12. Secuenciar el ADN genómico mediante secuenciación de próxima generación durante 300 ciclos, con un ajuste de extremo pareado y una longitud de lectura de 150 bases (consulte las Tablas de materiales).
  13. Realizar el montaje con el programa informático adecuado; véase el ejemplo que figura en la Tabla de materiales.
  14. Envíe el borrador del genoma al servidor RAST para su anotación.
    NOTA: Cargue secuencias de ADN para obtener una anotación completa en unos minutos.

3. Transformación natural y expresión GFP

NOTA: La transformación se basa en un vector plásmido propagado en E. coli; pGEM-T o pUC19 se pueden utilizar como vectores troncales. Las técnicas de clonación se establecen en muchos laboratorios; véanse también los protocolos estándar28 y los artículos sobre vectores de transformación para P. lacuna15,29. Los ejemplos de vectores para la expresión sfGFP se describen en la sección de resultados representativos. Los detalles de cuatro vectores aún no publicados se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

  1. Realice todos los pasos utilizando material estéril en condiciones de laboratorio estériles (banco limpio, cristalería estéril).
  2. Inocular 2 x 50 mL de medio líquido f/2 en dos matraces de 250 mL con 2 x 1 mL de filamentos de P. lacuna de un cultivo en funcionamiento. Cultivar en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) bajo agitación (rotación horizontal, 50 rpm) durante ~5 días a 25 °C.
  3. Prepare ~ 200 μg del ADN del vector de transformación utilizando un kit de preparación midi (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Homogeneizar 100 mL de suspensión de células de P. lacuna (ver tabla de materiales) a 10.000 rpm durante 3 min. Mida OD a 750 nm (valor deseado = 0,35).
  5. Centrifugar la suspensión celular durante 15 min a 6.000 × g. Retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 800 μL (volumen total, incluido el líquido residual y los filamentos) del líquido restante y el medio f/2+ adicional.
  6. Tomar ocho placas de bacto-agar f/2+ (10 cm de diámetro) que contengan 120 μg/ml de kanamicina. Pipetear 10 μg de ADN en el centro de cada placa de agar. Pipetee inmediatamente 100 μL de suspensión celular en el centro de cada placa de agar (en la parte superior del ADN).
  7. Mantenga la placa de agar sin tapa en el banco limpio para permitir que el exceso de líquido se evapore. Cierre la placa y cultive en luz blanca a 25 °C durante 2 días.
  8. Distribuya los filamentos de cada placa de agar con un lazo de inoculación en varias placas frescas de bacto-agar f/2+ que contengan 120 μg/ml de kanamicina. Cultive las placas en luz blanca a 25 °C y revise los cultivos regularmente bajo un microscopio.
  9. Identifique filamentos vivos y transformados después de 7-28 días bajo el microscopio. Busque filamentos verdes sanos (Figura 2) que sean diferentes de otros filamentos. Si se pueden identificar estos filamentos verdes, continúe con el siguiente paso; de lo contrario, mantenga el plato durante otros 7 días.
  10. Use fórceps para transferir estos filamentos vivos identificados a 50 ml de medio líquido f/2+ con 250 μg/ml de kanamicina. Cultivar en luz blanca a 25 °C en un agitador (rotación horizontal, 50 rpm). Observe el crecimiento hasta por cuatro semanas.
  11. Transfiera los filamentos de nuevo al medio de agar que contiene 250 μg/ml de kanamicina y espere a que los filamentos crezcan. Después de varios días, transfiera filamentos individuales a una placa de agar fresco con una mayor concentración de kanamicina, por ejemplo, 500 μg / ml. Mantenga la placa original.
  12. Asegúrese de que los filamentos se propaguen en una alta concentración de kanamicina en cultivo líquido o en agar. Aumentar la concentración de kanamicina de nuevo para acelerar la segregación.
    NOTA: P. lacuna transformada crece en hasta 10.000 μg/ml de kanamicina. Otras especies podrían no tolerar concentraciones tan altas.
  13. Si las células resistentes se cultivan y distribuyen ampliamente sobre una placa, pruebe la integración del inserto en el genoma de P. lacuna mediante la realización de PCR con cebadores externos e internos.
    1. Utilice cebadores que fueron diseñados para la clonación de la inserción como cebadores internos.
    2. Para el diseño de los cebadores externos, seleccione secuencias que sean 5' y 3' del sitio de inserción propuesto en el genoma de P. lacuna pero fuera de la inserción.
    3. Para las reacciones de PCR, use imprimaciones internas y cebadores externos. Utilice la(s) cepa(s) resistente(s) y el tipo salvaje.
      NOTA: Los cebadores internos indican que el inserto está presente; Los cebadores externos muestran que el inserto se inserta en el locus correcto.
  14. Para cada reacción de PCR, coloque ~ 10 mg de los filamentos directamente en los tubos de PCR y realice PCR de acuerdo con los protocolos estándar24. Si no se obtiene ningún producto, varíe la temperatura de recocido y lave los filamentos con agua.
    NOTA: Se pueden usar muchas polimerasas diferentes en la PCR. Las polimerasas estándar, como la polimerasa Taq, tienen una tasa de error más alta que las polimerasas de comprobación de errores, que son más caras. Esta PCR analítica no requiere ninguna polimerasa de comprobación de errores. Sin embargo, se debe probar la polimerasa de comprobación de errores si no se obtiene ningún producto de PCR con una polimerasa estándar.
  15. Analizar los productos de PCR de la línea resistente sobre electroforesis de agarosa24.
    1. Compare las posiciones de la banda con el marcador y compare el tipo salvaje y el transformante. Con imprimaciones internas y externas, busque una banda más grande para el transformador que el tipo salvaje (debido a la inserción del cassette de resistencia) o dos bandas para el transformador: una con el tamaño de la banda de tipo salvaje y otra más grande. Como este último caso indica una segregación incompleta, continúe el cultivo con altas concentraciones de kanamicina.
      NOTA: Para obtener más detalles sobre la PCR y la electroforesis, consulte15,24 u otra literatura estándar.
  16. Para la expresión de GFP: observe filamentos individuales con un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales) a un aumento del objetivo establecido en 40x o 63x. Capture una imagen de transmisión de campo brillante y una imagen de fluorescencia. Utilice los siguientes ajustes para GFP: paso de banda de 470 nm para la excitación, paso de banda de 525 nm para la emisión y un divisor de haz de 495 nm, tiempo de exposición inicial de 500 ms.
  17. Ajuste el tiempo de exposición para obtener señales de fluorescencia claras, evitando intensidades de saturación. Intente utilizar la misma configuración para todas las muestras.
  18. Como los filamentos de tipo salvaje también mostrarán fluorescencia, capture imágenes con la misma configuración que la anterior para esta fluorescencia de fondo.
    NOTA: La cepa que expresa GFP debe tener una señal más alta; de lo contrario, no está expresando GFP.
  19. En función de los tiempos de exposición y las intensidades de píxeles de las imágenes de fluorescencia, calcule y compare el contenido de GFP de los diferentes filamentos.

4. Crioconservación

NOTA: P. lacuna y la cianobacteria unicelular Synechocystis sp. Se utiliza PCC 6803. El método actual funciona mejor para P. lacuna.

  1. Cultivar P. lacuna o Synechocystissp PCC 6803 durante al menos 10 días en 10 mL de medio f/2+ o BG-11, respectivamente, bajo luz blanca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C bajo agitación (rotaciones horizontales, 50 rpm).
  2. Homogeneizar el cultivo de P. lacuna (ver la Tabla de Materiales) a 10.000 rpm durante 3 min o con un dispositivo de ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 2 min a plena energía. Determine OD 750 nm de cualquiera de las referencias culturales para comprobar si el valor está entre 1 y 7.
  3. Recoger las células por centrifugación a 6.000 × g durante 15 min. Retire el sobrenadante.
  4. Suspender el pellet celular en 800 μL de medio f/2+ o BG-11 (volumen final) y transferirlo a un criovial de 2 mL. Añadir 800 μL de una solución de glicerol al 50% a la suspensión celular. Cierre el vial y mezcle invirtiendo repetidamente.
  5. Transfiera el criovial al nitrógeno líquido y guárdelo en un criobox en un congelador de -80 °C. Anote la posición de la caja dentro del congelador y las coordenadas de la muestra dentro de la caja.
  6. Para la recuperación de las células, saque el criovial y descongele el contenido a temperatura ambiente. Transfiera el contenido a un tubo de reacción de 2 ml.
  7. Lave la muestra dos veces. Para el1er lavado, centrifugar a 6.000 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de medio f/2+ o BG-11. Para elsegundo lavado, recentrífugo a 6.000 × g durante 5 min, retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 2 ml de medio f/2+ o BG-11.
  8. Para comprobar la integridad de estas células que están listas para el cultivo, transfiera el pellet a 9 mL de medio y cultivarlos en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) bajo agitación (55 rpm). Compare los OD 750 nm del cultivo el primer día y después de 1 semana.

5. Motilidad de Phormidium lacuna

NOTA: Se describirán tres ensayos diferentes. La misma cultura se utiliza en todos los casos.

  1. Cultive P. lacuna en medio f/2 bajo agitación horizontal (50 rpm) en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) durante ~5 días hasta que el OD estimado de 750 nm sea de 0.35. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso.
  2. Homogeneizar los filamentos (ver la Tabla de Materiales) a 10.000 rpm durante 3 min o con ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 1 min a potencia máxima y ciclo de 1. Medida OD 750 nm. Si está por encima de 0,35, diluya la fracción con f/2 medio. Utilice esta solución en ensayos de motilidad en los pasos 5.3, 5.4 y 5.5.
  3. Ensayo para el movimiento en medio líquido
    1. Para la observación directa de la motilidad, transfiera 8 ml de medio que contenga P. lacuna (a partir del paso 5.2) a una placa de Petri de 6 cm. Espere unos minutos hasta que la muestra alcance la temperatura ambiente. Cubra la placa de Petri con papel de celofán.
    2. Coloque un portaobjetos de microscopio en la mesa x-y de un microscopio estándar con una cámara. Encienda la luz del microscopio. Idealmente, siempre use la misma configuración eléctrica y óptica para la iluminación. Mueva un objetivo 4x o 10x en el camino de la luz.
    3. Coloque la placa de Petri en la parte superior de la diapositiva. Ajuste filamentos individuales o haces de filamentos por los movimientos x, y y z de la mesa.
      NOTA: Debido a la disposición tridimensional, solo una parte de la sección relevante puede estar enfocada. La lámina de celofán permite ajustar el enfoque sin restricciones.
    4. Observe los movimientos de filamentos individuales o haces. Asegúrese de que la lente del objetivo no toque el líquido. Grabe los movimientos de los filamentos con una cámara de microscopio estándar (consulte el video suplementario S1).
  4. Ensayo para el movimiento en la superficie
    1. Para la observación de la motilidad del filamento en superficies de agar, prepare placas de Petri de 6 cm con f/2 bacto-agar. Asegúrese de que el agar sea lo suficientemente alto como para que la lente del objetivo se acerque a la superficie del agar. Alternativamente, prepare una capa de agar de ~ 3 mm de espesor y registre los filamentos a través del agar (mantenga la placa boca abajo o use un microscopio invertido).
    2. Pipetear 0,5 ml de una solución que contenga P. lacuna (a partir del paso 5.2) sobre la superficie de bacto-agar de una placa de Petri de 6 cm. Permita que el líquido entre en la superficie. Cierre la placa de Petri y observe el movimiento de los filamentos en la superficie utilizando un objetivo de 4x o 10x.
    3. Asegúrese de que se utilizan los mismos ajustes eléctricos y ópticos del microscopio durante toda la grabación y en las grabaciones posteriores.
    4. Capture grabaciones de lapso de tiempo utilizando una cámara ocular y un sistema de minicomputadora. Asegúrese de que el intervalo de tiempo entre las imágenes posteriores sea de 5 s-1 min. Programe el script Linux de la minicomputadora para controlar la grabación de lapso de tiempo. Consulte el archivo complementario 2 para ver un script de ejemplo y el vídeo suplementario S2 como ejemplo.
  5. Ensayo para fototaxis
    1. Para experimentos de fototaxis, prepare soportes de diodos emisores de luz (LED) (aquí, con una impresora 3D) en los que se montan los LED de 5 mm seleccionados para irradiar un área de 20 mm2 de abajo hacia arriba (Figura 3). Si es necesario, use muchos soportes LED en paralelo, conectando cada LED eléctricamente a través de una resistencia y potenciómetro a una fuente de alimentación ajustable. Mida y ajuste las intensidades del LED, dependiendo del experimento. Asegúrese de que toda la configuración esté en una habitación oscura o en un recipiente oscuro cerrado.
    2. Coloque 8 ml del medio que contiene P. lacuna (a partir del paso 5.2) en una placa de Petri de 6 cm. Ajuste la intensidad de la luz del LED. Cierre la placa de Petri con la tapa y colóquela en un soporte LED para que el LED esté en el centro de la placa de Petri.
    3. Después de la duración deseada (generalmente 2 días), capture una imagen de la placa de Petri con una cámara de teléfono inteligente dirigida directamente a la posición del tratamiento de luz. Utilice un panel LED blanco para la irradiación de la muestra. Utilice la configuración manual de la cámara; evitar los reflejos de la luz; ajuste siempre para obtener la misma distancia entre la lente de la cámara y la muestra. Asegúrese de que la configuración de exposición proporcione una imagen adecuada para análisis posteriores utilizando ImageJ.
    4. Cuantifique el diámetro del círculo central de filamentos utilizando el software ImageJ.
      1. Abra ImageJ, haga clic en archivo | Abrir, seleccione el archivo deseado y haga clic en Entrar.
      2. Seleccione el botón Recto (con una línea recta). Pulse el botón izquierdo del ratón para dibujar una línea desde un extremo de la placa de Petri hasta el extremo opuesto. Asegúrese de que la línea pase a través del centro del círculo de filamentos.
      3. Presione Ctrl-K en el teclado o haga clic en Analizar | Trazar perfil en el menú ImageJ. Busque una ventana x-y con intensidades de píxeles trazadas frente a distancia: un perfil 1D de la placa de Petri. Asegúrese de que la intensidad de píxeles más baja esté ligeramente por encima de 0 y el valor más alto por debajo de 255.
      4. Calcule un valor promedio para la intensidad de píxeles fuera del círculo y otro valor promedio para la intensidad de píxeles en el círculo. En la posición y- entre estos valores, calcule los valores x de ambos lados del círculo apuntando con el ratón a estas posiciones. Anote ambos valores y calcule la diferencia.
      5. Obtenga el valor x más alto apuntando el ratón al eje y de la derecha. Nótese que este valor e representa el diámetro de la placa de Petri. Si este diámetro es de 5 cm, calcule el diámetro del círculo central del filamento como d/e × 5 cm.

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Representative Results

Siguiendo los métodos mencionados anteriormente, se aislaron 5 cepas diferentes de P. lacuna de los pozos de rocas y se secuenciaron (Figura 1 y Tabla 1). Todos los cultivos fueron estériles después de ~ 1 año de subcultivo excepto P. lacuna HE10JO. Esta cepa todavía está contaminada con Marivirga atlantica, una bacteria marina. Durante las excursiones posteriores a Helgoland, otras cianobacterias filamentosas se aislaron de piscinas de roca, que son diferentes de P. lacuna y deben caracterizarse.

Se probaron varios métodos de extracción y purificación de ADN para detectar P. lacuna. Los mejores resultados se obtuvieron con un método CTAB optimizado como se describió anteriormente. Los rendimientos de ADN fueron de 310 ± 50 μg/mL, OD 260 nm/OD 280 nm fue de 1,7 ± 0,03, y OD 260 nm/OD 230 nm fue de 0,78 ± 0,04 (n = 17). La secuenciación del genoma mostró que el ADN de todas las cepas era ligeramente diferente, como se esperaba (Tabla 1). Las secuencias de proteínas centrales mostraron una diferencia máxima de 0,04% (Tabla 2). Aunque todos los genomas preliminares estaban incompletos, se puede suponer que >98% del genoma de HE10JO30 fue secuenciado. Esta estimación se basa en el número de marcos de lectura abiertos incompletos. Las secuencias parciales de proteínas podrían identificarse fácilmente después de la anotación RAST de HE10DO y HE10JO. En HE10JO, 60 proteínas de ~ 4,500 tenían una secuencia N- o C-terminal faltante. Las secuencias del genoma se pueden encontrar en el suplemento (Archivo Suplementario 3, Archivo Suplementario 4, Archivo Suplementario 5, Archivo Suplementario 6 y Archivo Suplementario 7).

Curiosamente, las cepas de la misma especie fueron aisladas de dos islas, Helgoland y Giglio. La distancia lineal entre ambas islas es de 1.400 km. Debe haber un vínculo entre ambos lugares, por ejemplo, por barcos a través del mar o, más probablemente, por aves migratorias. Muchas especies de aves se pueden encontrar en ambas islas, y muchas de ellas son aves migratorias. La diversidad dentro de las cepas de P. lacuna de una isla fue mayor que entre las cepas helgoland y Giglio más cercanas (Tabla 2). Esto indica un intenso intercambio entre ambos lugares.

La transformación natural se probó con HE10DO como la cepa principal y con HE10JO. El protocolo actual es más sencillo que el protocolo descrito anteriormente12 debido al número reducido de pasos de lavado y menos pasos de transferencia después de la transformación. Este nuevo método se utiliza continuamente en el laboratorio; ~ Se lograron 15 transformaciones exitosas.

El cassette de resistencia KanR generalmente se integraba en el sitio homólogo definido por las regiones adyacentes, como lo muestra la PCR utilizando cebadores internos y externos. Como la mayoría de las cianobacterias, P. lacuna es poliploide. Puede tener más de 100 cromosomas por célula12. Una prueba de PCR con cebadores externos ~ 1 semana después de la transformación generalmente tiene 2 bandas en el gel de electroforesis, una con el tamaño de la banda de tipo salvaje y una banda de migración más lenta que indica la inserción del cassette de resistencia (Figura 4). La doble banda indica que sólo una subfracción de los cromosomas contiene la inserción. Después de 4 semanas de selección en kanamicina, la segregación suele ser completa, y solo aparece una banda pcr grande en los geles. Sin embargo, en el caso de la transformación con pMH1 (ver más abajo), la segregación se completó después de más de 3 meses.

Los vectores pAK1, pAK2, pAK3 y pMH1 fueron construidos para pruebas de expresión sfGFP. En pAK1, pAK2 y pAK3, el gen sfGFP está bajo el control de los promotores cpc560, A2813 y psbA2, respectivamente. Estos promotores son de Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus sp. PCC 700231. Para la construcción de estos vectores, se tomaron las secuencias promotora y terminadora sfGFP de vectores utilizados para la transformación de Synechococcus sp. PCC 700231. Las secuencias relevantes se integraron en el sitio homólogo chwA (sc_7_37) de pFN1 (o pFN_7_37_KanR15). El vector de expresión pMH1 se construyó mediante síntesis de ADN utilizando secuencias de P. lacuna como plantillas (Archivo suplementario 6). Las secuencias cpcB-cpcA (ficocianina ß y ficocianina α) de P. lacuna están dispuestas en serie. Una región intergénica de 100 pb separa ambas regiones codificantes. La secuencia sintética contenía esta secuencia endógena cpcB-cpcA y el promotor cpcB. El casete sfGFP y KanR se coloca a solo 3' del codón de parada cpcB (5' de cpcA). Toda la secuencia sintética con promotor cpcB, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' a 3') se clona en pUC19. En la figura 5 se muestra un mapa. Más detalles sobre la clonación de pAK1, pAK2 y pAK3 y la secuencia completa de pMH1 se dan en el Archivo Suplementario 1.

Los 4 transformadores (con pAK1, pAK2, pAK3 y pMH1) expresaron GFP; todos los niveles de fluorescencia estaban por encima de la fluorescencia de fondo de los filamentos de tipo salvaje (Figura 6). Los transformadores pMH1 con segregación incompleta revelaron una señal GFP muy variable entre los filamentos. La señal de fluorescencia se distribuyó uniformemente cuando se completó la segregación (Figura 6E). Las señales de microscopio de los transformadores pAK1, pAK2 y pAK3 fueron similares pero ~5 veces más débiles que las de pMH1 (Figura 6E).

El método de crioconservación establecido se basa en un método que se estableció para E. coli. Cuando se realizaron 2 pasos de lavado para la eliminación de glicerol después de la descongelación, 15 de las 15 muestras de P. lacuna sobrevivieron (Tabla 3). Este protocolo también podría usarse para Synechocystis PCC 6803, pero solo con 2 pasos de lavado y no con 1 (Tabla 3).

Otra característica de los filamentos Oscillatoriales es su motilidad: los filamentos de P. lacuna se mueven continuamente sobre superficies (Figura 7) y en un medio líquido (Figura 8). Ambos tipos de movimiento se pueden estudiar fácilmente en placas de Petri sin o con medio de agar. Se requiere grabación de lapso de tiempo porque el movimiento en el agar es lento. Los filamentos se mueven hacia el cono de luz si un haz de luz proviene de abajo (Figura 3). Los efectos de la intensidad de la luz, la longitud de onda y el tiempo se pueden estudiar fácilmente con una configuración simple. Los fotorreceptores de este efecto aún no están claros. Los posibles candidatos se pueden abordar con mutantes noqueados. El mecanismo subyacente a cómo los filamentos encuentran la luz tampoco está claro. Para esta pregunta, se requiere un sistema infrarrojo para registrar los filamentos durante su movimiento de la oscuridad a la luz.

Figure 1
Figura 1: Cepas de Phormidium lacuna recogidas de Helgoland y Giglio. Los filamentos se propagan durante 11 días en agar f/2 en placas de Petri de 6 cm. (A) cepa GI08AO; (B) cepa GI08IO; (C) cepa GI09CO; (D) cepa HE10DO; (E) cepa HE10JO; (F) cepa HE15M2G1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Filamentos de Phormidium lacuna 5 semanas después de la transformación. Se utilizó el vector de expresión sfGFP pMH1; la selección ocurrió en medio f/2+ con 120 μg/mL de kanamicina. Los filamentos verdosos son resistentes y vivos; otros filamentos han muerto. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Experimento de Phototaxis. Izquierda: Soporte LED con 4 LEDs rojos, conectado a una fuente de alimentación ajustable. En la parte superior de cada LED, hay una placa de Petri de 6 cm con 8 ml de un cultivo de Phormidium lacuna . Derecha: Placa de Petri con P. lacuna después de 2 días en el LED rojo (15 μmol m-2 s-1). Abreviatura: LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Integración y segregación del inserto tras la transformación de Phormidium lacuna con pAK1. PCR con imprimaciones externas. Los tamaños esperados del producto sin y con inserto son 2371 y 5016 pb, respectivamente. Carril izquierdo: marcador, carriles 1, 2, 3, 4: productos PCR de filamentos 7 días, 11 días, 14 días y 17 días después del aislamiento de un filamento resistente (4 semanas después de la transformación), respectivamente. Carril 5: Producto de PCR de tipo salvaje (de un gel diferente). En la muestra de 7 días, el inserto está presente en una pequeña fracción de los cromosomas. Esta fracción aumenta hasta los 17 días, donde no se ve ninguna banda de tipo salvaje, es decir, la segregación es completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Vector para la expresión sfGFP bajo el control del promotor endógeno cpcB . Naranja: Secuencia homóloga de Phormidium lacuna , violeta/azul: columna vertebral vectorial pUC-19, verde: insertar con sfGFP y KanR. Abreviaturas: sfGFP = proteína fluorescente verde supercarpeta; KanR = resistencia a la kanamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Expresión de sfGFP en Phormidum lacuna. Imágenes de fluorescencia de filamentos de tipo salvaje de P. lacuna (A) y después de la transformación con pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) y pMH1 (E). En pMH1, el gen sfGFP se coloca 3' del gen ß de la ficocianina y, por lo tanto, es impulsado por el promotor endógeno cpcß ; en los otros casos, sfGFP es impulsado por los promotores cpc560, A2813 o psbA2s de Synechocystis PCC 6803, respectivamente. Los ajustes de fluorescencia son específicos para GFP; todas las imágenes se grabaron con el mismo tiempo de integración y ajustes ópticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Imagen combinada de Phormidium lacuna en superficie de agar a 4x de aumento. La primera imagen se presenta en rojo, la segunda (tomada 1 minuto después) en verde. Tenga en cuenta también los rastros en el agar. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Imagen combinada de Phormidium lacuna en medio líquido. El intervalo de tiempo entre ambas imágenes fue de 10 s. La primera imagen está impresa en rojo; el segundo está impreso en verde. La comparación de ambos colores muestra el movimiento dentro de 10 s. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

colar HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Contigs 104 174 218 102 154
pb total 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tabla 1: Cepas de Phormidium lacuna .

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

Tabla 2. Diferencias de aminoácidos entre cepas en secuencias de 20 proteínas centrales con 10.876 aminoácidos.

Densidad celular OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Lava 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis PCC 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Phormidium lacuna HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tabla 3: Ensayos de crioconservación con cianobacterias Synechocystis PCC 6803 y Phormidium lacuna HE10DO. El primer número muestra el número de cultivos que sobrevivieron después de la congelación/descongelación; el segundo número muestra el total de ensayos.

Video suplementario S1: Movimiento de filamentos de Phormidium lacuna en solución líquida, sin lapso de tiempo. Haga clic aquí para descargar este video.

Video suplementario S2: Movimiento de filamentos de Phormidium lacuna en la superficie de agar, con lapso de tiempo. Haga clic aquí para descargar este video.

Expediente Complementario 1: Clonación de vectores para la transformación de Phormidium lacuna. Lista de vectores de transformación; lista de cebadores para clonación; secuencia de pMH1 en formato gb. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Scripts de shell (sh) para el miniordenador Raspberry Pi. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 3: Secuencia de ADN de HE152G1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 4: Secuencia de ADN de GI08AO. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 5: Secuencia de ADN de GI09CO. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 6: Secuencia de ADN de HE10DO. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 7: Secuencia de ADN de HE10JO. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Aunque muchas cepas de cianobacterias están disponibles en colecciones de cultivo 32,33,34,35,36, todavía hay una demanda de nuevas cianobacterias de la naturaleza porque estas especies están adaptadas a propiedades específicas. P. lacuna se recogió de los pozos de roca y se adapta a las variaciones de las concentraciones de sal y la temperatura30. Se encontraron cepas de esta especie durante las excursiones en 2008, 2009 y 2010. Con el procedimiento descrito aquí, se aislaron 5 cepas de P. lacuna, y 4 de estas cepas fueron estériles. La cepa P. lacuna HE10JO está permanentemente contaminada con la bacteria Marivirga atlantica, una bacteria marina identificada por ARNr y secuenciación del genoma. Esta bacteria no pudo separarse de la cianobacteria a pesar de la aplicación de separación mecánica, crecimiento a diferentes temperaturas, tratamientos con antibióticos o tratamientos químicos. A pesar de la contaminación, P. lacuna HE10JO se puede cultivar de manera similar a las otras cepas. En excursiones posteriores, se encontraron otros miembros de Oscillatoriales, que aún no se analizan en detalle. P. lacuna no fue encontrado de nuevo. No está claro por qué P. lacuna fue aislada en años posteriores y en dos lugares diferentes, pero no se encontró más tarde. Su abundancia depende ciertamente de condiciones impredecibles. La temperatura, las concentraciones de sal y los nutrientes inorgánicos u orgánicos son muy variables en las piscinas de rocas. Por lo tanto, la composición de la especie podría fluctuar con el tiempo de una manera impredecible.

La transformación natural se establece para diferentes cianobacterias, en su mayoría especies unicelulares. La filamentosa P. lacuna es la única especie del orden Oscillatoriales para la que se ha establecido la transformación natural. La transformación casi siempre fue exitosa con el protocolo actual. En general, el número de filamentos resistentes después de una prueba de transformación varía considerablemente, y a veces la transformación falla, lo que resulta en la pérdida de un tiempo valioso. Por lo tanto, es recomendable realizar varios proyectos de transformación en paralelo. El tiempo para la segregación completa, generalmente 4 semanas después del aislamiento de la cepa resistente, también puede variar. Debido a que no hay garantía de segregación completa después del crecimiento con kanamicina, es crucial realizar las pruebas de PCR utilizando cebadores externos e internos.

Cada vector debe contener 2 secuencias homólogas de 500-1.000 pb, por ejemplo, amplificadas desde el huésped por PCR e interrumpidas por un cassette de resistencia (por ejemplo, el cassette kanamicina KanR utilizado aquí)37,38. Para la expresión, un promotor, una secuencia de codificación (por ejemplo, para sfGFP39), un terminador y un casete de resistencia deben clonarse entre las secuencias homólogas. Las estrategias de clonación son específicas de cada especie y dependen del objetivo del experimento.

Este método de transformación podría ser posible con otras cepas oscillatoriales u otras cianobacterias también: la transformación natural se basa en el tipo IV pili, que están presentes en casi todos los demás genomasde cianobacterias 3,15,40. Por lo tanto, el método actual podría estimular nuevos ensayos con otras especies. Debido a que los pili de tipo IV también son relevantes para la motilidad, es importante verificar las condiciones en las que las cianobacterias son móviles.

La inserción de genes se basa en la recombinación homóloga y da como resultado una interrupción de los sitios homólogos. Por lo tanto, la transformación se utiliza a menudo para la eliminación de genes. La expresión del gen insertado se inducirá si un promotor activo y una secuencia codificante se integran en el sitio homólogo. En P. lacuna, la actividad promotora dependía de la especie. Los promotores cpc560, A2813 y psbA2 de Synechocystis PCC sp 6803 o Synechococcus sp. PCC 7002 31 y el promotor cpcB de P. lacuna podrían impulsar la expresión sfGFP . De estos constructos, el promotor endógeno cpcB indujo la expresión más fuerte, aunque el gen sfGFP se encuentra a 3' del gen ß de la ficocianina. Esto indica un uso más general de promotores endógenos en la expresión de cianobacterias.

La combinación de estudios de eliminación de genes y movimiento arrojará luz sobre los mecanismos moleculares de la motilidad y la fototaxis. Las fuentes de luz LED pueden proporcionar luz para experimentos de fototaxis. Casi cualquier longitud de onda está disponible, y la intensidad de la luz puede ser modulada por una fuente de alimentación ajustable y potenciómetros. Los soportes LED pueden ser construidos por impresoras 3D para realizar fácilmente combinaciones de diferentes LED.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

El trabajo fue apoyado por el Instituto de Tecnología de Karlsruher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

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Biología Número 180
Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la filamentosa Cyanobacterium <em>Phormidium lacuna</em>
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Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

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