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Biology

Transformação Natural, Expressão proteica e Crioconservação da Cicocrias Cianobacterium Phormidium lacuna

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna é um cianobacterium filamentoso que foi isolado de piscinas marinhas. Este artigo descreve o isolamento de filamentos de fontes naturais, extração de DNA, sequenciamento de genomas, transformação natural, expressão de sfGFP, crioconservação e motilidade.

Abstract

As cianobactérias são o foco de pesquisas básicas e projetos biotecnológicos nos quais a energia solar é utilizada para a produção de biomassa. Phormidium lacuna é um recém-isolado cianobacterium filamentous. Este artigo descreve como novas cianobactérias filamentosas podem ser isoladas das piscinas marinhas. Também descreve como o DNA pode ser extraído de filamentos e como os genomas podem ser sequenciados. Embora a transformação seja estabelecida para muitas espécies unicelulares, é menos frequentemente relatada para cianobactérias filamentosas. Um método simplificado para a transformação natural de P. lacuna é descrito aqui. P. lacuna é o único membro da ordem Oscillatoriales para o qual a transformação natural é estabelecida. Este artigo também mostra como a transformação natural é usada para expressar proteína fluorescente verde superpatos (sfGFP). Um promotor endógeno do CPCB induziu aproximadamente 5 vezes mais expressão do que os promotores do CPC560, A2813 ou psbA2 do Synechocystis sp. PCC6803. Além disso, foi estabelecido um método para a criopreservação de P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803, e são descritos métodos para avaliação da motilidade em meio líquido e em superfícies de ágar e plástico.

Introduction

Cianobactérias são organismos procarióticos que utilizam a fotossíntese como fonte de energia 1,2. A pesquisa está cada vez mais focada em espécies cianobacterianas. Várias cianobactérias podem ser transformadas com DNA3. Genes podem ser eliminados ou superexpressos nestas espécies. No entanto, a transformação é restrita a algumas espécies 4,5,6,7,8,9,10,11, e pode ser difícil estabelecer transformação em cepas de coleções culturais ou selvagens 8. Cepas da espécie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) foram isoladas de piscinas marinhas, nas quais as condições ambientais, como concentrações de sal ou temperatura, flutuam ao longo do tempo. Estas cianobactérias filamentosas podem ser usadas como organismos modelo para a ordem Oscillatoriales12 a que pertencem.

Durante os testes testando a transferência de genes por eletroporação13,14, descobriu-se que a P. lacuna pode ser transformada pela transformação natural15. Nesse processo, o DNA é tomado naturalmente por algumas células. Em comparação com outros métodos de transformação16,17, a transformação natural tem a vantagem de não exigir ferramentas adicionais que possam complicar o procedimento. Por exemplo, a eletroporação requer cuvetas adequadas, fios intactos e seleção da tensão adequada. P. lacuna é atualmente o único membro oscillatoriales suscetível à transformação natural. Como o protocolo original é baseado em protocolos de eletroporação, ele ainda incluía várias etapas de lavagem que podem ser desnecessárias. Diferentes abordagens foram testadas para simplificar o protocolo, levando ao protocolo de transformação aqui apresentado.

A sequência do genoma é essencial para outros estudos moleculares baseados em nocaute genético ou superexpressão. Embora as sequências de genoma possam ser obtidas com máquinas de sequenciamento de última geração em curtos períodos, a extração do DNA pode ser difícil e depende da espécie. Com P. lacuna, vários protocolos foram testados. Um método modificado de cetil trimethyl amônio (CTAB) foi então estabelecido, resultando em pureza aceitável dos rendimentos de DNA e DNA de cada ciclo de purificação para o trabalho contínuo em laboratório. O genoma de cinco cepas pode ser sequenciado com este protocolo. O próximo passo de transformação lógica foi estabelecer expressão proteica em P. lacuna.

O sfGFP usado como proteína marcadora neste protocolo pode ser detectado com qualquer microscópio de fluorescência. Todos os promotores que foram testados poderiam ser usados para a expressão P. lacuna sfGFP. O aumento do número de cepas decorrentes da transformação resultou na necessidade de um método para armazenar as culturas. Tais métodos são estabelecidos para Escherichia coli e muitas outras bactérias18. Nos protocolos padrão, culturas de glicerol são preparadas, transferidas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C. Este método requer apenas alguns passos e é altamente confiável para as espécies para as quais é estabelecido. O protocolo padrão não era viável para P. lacuna porque as células vivas não podiam ser recuperadas em todos os casos. No entanto, quando o glicerol foi removido após o descongelamento, células de todos os ensaios sobreviveram. Métodos simples são apresentados para a análise da motilidade de P. lacuna, que pode ser combinada com mutagênese nocaute para investigar pili tipo IV ou o papel dos fotorreceptores. Estes ensaios são diferentes dos de cianobactériasunicelulares 19,20,21 e também podem ser úteis para outras Oscillatoria.

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Protocol

1. Isolamento do ambiente natural

NOTA: Algas verdes, diatomas, cianobactérias filamentosas e outras microalgas podem ser isoladas. O protocolo pode ser usado para qualquer espécie de microalga de piscinas de rochas que crescem em condições laboratoriais. Cianobactérias filamentosas que pertencem aos Oscillatoriales podem ser facilmente reconhecidas por seu movimento e forma filamentosa. A espécie pode ser identificada em um estado semiuso por sequenciamento de genoma ou sequenciamento de rRNA 16S.

  1. Transfira amostras líquidas de água do mar de piscinas marinhas (ou seja, cavidades na costa rochosa) em frascos de 50 mL. Para cada frasco, observe o local exato ou as coordenadas da fonte natural. Se possível, filtre o conteúdo através de redes de 50 μm para reduzir as quantidades de zooplâncton. Armazene as amostras a 4 °C até que possam ser subculturadas.
  2. Transfira culturas de 1 mL para pratos Petri de 10 cm contendo 3% de bacto-ágar em f/2 médio22,23 (ver a Tabela de Materiais). Prepare até 20 pratos. Cultive sob luz branca de 50 μmol m-2 s-1.
    NOTA: Podem ser utilizadas maiores intensidades de luz para o cultivo. A intensidade de até 400 μmol m-2 s-1 pode ser usada para P. lacuna, embora outras espécies possam ser mais sensíveis à luz.
  3. Após uma semana, transfira as células desejadas para placas frescas de ágar usando fórceps estéreis. Isole as células sob um microscópio binóculo sob condições estéreis. Armazene a placa de ágar velha a 4 °C até que as células apareçam e cresçam na nova placa de ágar.
  4. Repita esta etapa de transferência toda semana para eliminar a contaminação. Use o olho nu para detectar contaminação pesada e um microscópio com ampliação de 400x para verificações adicionais para contaminação.
  5. Se uma amostra parece livre de contaminação, teste para contaminação bacteriana ou fúngica em placas de ágar. Transfira uma fração da cultura com uma alça de inoculação para uma placa de ágar lb24 (10 cm de diâmetro), mantenha a placa em temperatura ambiente e verifique o crescimento de contaminantes ao longo de 1-3 dias.
  6. Se uma espécie cianobacteriana fiotoner estéril for obtida, use-a para mais trabalhos culturais. Cultivar P. lacuna em líquido ou em placas de bacto-ágar. Use frascos de 250 mL com 50 mL de meio f/2 ou f/2+ para cultura líquida.

2. Extração de DNA

NOTA: Este método é adotado a partir de 25 26

  1. Prepare dois frascos com 50 mL de meio f/2. Inocular cada um com ~1 mL de filamentos p. lacuna de outras culturas em crescimento. Mantenha as culturas por 7 dias ou mais sob agitação (rotação horizontal) a 50 rpm sob luz branca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C.
  2. Trate a cultura com ultrassom (veja a Tabela de Materiais) por 2 minutos com energia total. Medir OD a 750 nm; verificar para garantir que é ~0,5. Continue a crescer as culturas se o OD for muito baixo.
  3. Colete os filamentos em 5.000 × g, centrifugação de 20 min. Remova o supernatante. Transfira os filamentos com líquido residual para a câmara de uma Imprensa Francesa27. Coloque a pressão da imprensa francesa em 20.000 psi e extraia as células.
    NOTA: A imprensa francesa vai lise todas as células e liberar o DNA; forças de tesoura fortes produzirão fragmentos de DNA de 1.500 bp.
  4. Centrifugar a amostra por 10 minutos a 10.000 × g e remover o sobrenante.
  5. Adicione 400 μL de tampão de lise (4 M de ureia, 0,1 M Tris/Cl, pH 7.4) e 50 μL de proteinase K (10 mg/mL) à pelota. Aqueça a amostra a 55 °C por 60 min com agitação a 550 rpm.
  6. Adicione 1 mL de tampão de extração de DNA (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) e incubar por 60 min a 55 °C e 550 rpm. Transfira as soluções para tubos de centrifugação e adicione dois volumes de clorofórmio/isoamylalcohol (24/1).
  7. Depois de tremer, centrifugar a amostra por 5 min a 9.000 × g. Transfira a fase superior e aquosa em frascos de reação e adicione 1 mL de etanol gelado e 50 μL de acetato de sódio de 3 M.
  8. Vórtice da amostra e coloque-a a -20 °C por 1h ou mais.
  9. Centrifugar por 5 min a 10.000 × g (4 °C) e descartar o supernatante. Lave a pelota com 70% de etanol.
  10. Centrifugar a amostra novamente. Retire o supernatante e seque a pelota durante a noite. Dissolva o DNA em água sem nuclease. Meça o espectro de DNA para verificar se o OD 260 nm/OD 280 nm está entre 1,6 e 1,9.
  11. Analise o tamanho do DNA em um gel de eletroforeseagarose 28.
  12. Sequencia o DNA genômico por sequenciamento de última geração para 300 ciclos, com uma configuração de extremidade emparelhada e comprimento de leitura de 150 bases (ver as Tabelas de Materiais).
  13. Executar o conjunto com o programa de computador apropriado; veja o exemplo dado na Tabela de Materiais.
  14. Envie o genoma do rascunho ao servidor RAST para anotação.
    NOTA: Carregue sequências de DNA para obter anotações completas em poucos minutos.

3. Transformação natural e expressão GFP

NOTA: A transformação é baseada em um vetor plasmídeo propagado em E. coli; pGEM-T ou pUC19 podem ser usados como vetores de espinha dorsal. As técnicas de clonagem são estabelecidas em muitos laboratórios; veja também os protocolos padrão28 e os artigos sobre vetores de transformação para P. lacuna15,29. Exemplos de vetores para expressão sfGFP são descritos na seção de resultados representativos. Detalhes de quatro vetores ainda não publicados são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

  1. Realize todas as etapas utilizando material estéril em condições de laboratório estéreis (banco limpo, vidros estéreis).
  2. Inoculação 2 x 50 mL de meio líquido f/2 em dois frascos de 250 mL com filamentos de 2 x 1 mL de P. lacuna de uma cultura em execução. Cultivar em luz branca (50 μmol m-2 s-1) sob agitação (rotação horizontal, 50 rpm) por ~5 dias a 25 °C.
  3. Prepare ~200 μg do DNA vetorial de transformação usando um kit de preparação midi (veja a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Homogeneize 100 mL de suspensão celular P. lacuna (ver a Tabela de Materiais) a 10.000 rpm por 3 min. Medir OD em 750 nm (valor desejado = 0,35).
  5. Centrifugar a suspensão celular por 15 min a 6.000 × g. Remova o supernatante e suspenda a pelota em 800 μL (volume total, incluindo líquido residual e filamentos) do líquido restante e do meio adicional f/2+ .
  6. Pegue oito placas de bato-ágar f/2+ (10 cm de diâmetro) contendo kanamycina de 120 μg/mL. Pipeta 10 μg de DNA no meio de cada placa de ágar. Imediatamente pipeta 100 μL de suspensão celular no meio de cada placa de ágar (em cima do DNA).
  7. Mantenha a placa de ágar sem tampa no banco limpo para permitir que o excesso de líquido evapore. Feche a placa e cultive-a em luz branca a 25 °C durante 2 dias.
  8. Distribua os filamentos de cada placa de ágar com um laço de inoculação em várias placas frescas de bato-ágar contendo 120 μg/mL kanamycin. Cultive as placas em luz branca a 25 °C e verifique as culturas regularmente sob um microscópio.
  9. Identificar filamentos vivos e transformados após 7-28 dias sob o microscópio. Procure filamentos verdes saudáveis (Figura 2) diferentes de outros filamentos. Se esses filamentos verdes puderem ser identificados, continue com o próximo passo; caso contrário, mantenha a placa por mais 7 dias.
  10. Use fórceps para transferir esses filamentos vivos identificados para 50 mL de meio líquido f/2+ com kanamycina de 250 μg/mL. Cultive em luz branca a 25 °C em um agitador (rotação horizontal, 50 rpm). Observe o crescimento por até quatro semanas.
  11. Transfira os filamentos de volta para o meio ágar contendo kanamycina de 250 μg/mL e aguarde que os filamentos cresçam. Após vários dias, transfira filamentos únicos para uma placa de ágar fresco com maior concentração de kanamicina, por exemplo, 500 μg/mL. Fique com a placa original.
  12. Certifique-se de que os filamentos são propagados em uma alta concentração de kanamicina na cultura líquida ou no ágar. Aumente novamente a concentração de kanamicina para acelerar a segregação.
    NOTA: A lacuna P. transformada cresce em até 10.000 μg/mL kanamycin. Outras espécies podem não tolerar concentrações tão altas.
  13. Se as células resistentes forem cultivadas e distribuídas amplamente sobre uma placa, teste a integração da inserção no genoma de P. lacuna realizando PCR com primers externos e internos.
    1. Use primers que foram projetados para clonagem da inserção como primers internos.
    2. Para o desenho dos primers externos, selecione sequências que são de 5' e 3' do local de inserção proposto no genoma de P. lacuna, mas fora da inserção.
    3. Para reações pcr, use primers internos e primers externos. Use a cepa resistente e o tipo selvagem.
      NOTA: Os primers internos indicam que a inserção está presente; Primers externos mostram que a inserção é inserida no lócus correto.
  14. Para cada reação pcr, coloque ~10 mg dos filamentos diretamente nos tubos PCR e realize PCR de acordo com os protocolos padrão24. Se nenhum produto for obtido, varie a temperatura de ressarcido e lave os filamentos com água.
    NOTA: Muitas polimeras diferentes podem ser usadas em PCR. Polimerases padrão, como a polimerase Taq, têm uma taxa de erro maior do que polímeras de verificação de erros, que são mais caras. Este PCR analítico não requer nenhuma polimerase de verificação de erros. No entanto, a polimerase de verificação de erros deve ser testada se nenhum produto PCR for obtido com uma polimerase padrão.
  15. Analise os produtos PCR da linha resistente na eletroforeseagarose 24.
    1. Compare as posições da banda com o marcador e compare o tipo selvagem e o transformador. Com primers internos e externos, procure uma banda maior para o transformador do que o tipo selvagem (devido à inserção do de resistência) ou duas bandas para o transformador: uma com o tamanho da banda do tipo selvagem e uma maior. Como este último caso indica segregação incompleta, continue o cultivo com altas concentrações de kanammicina.
      NOTA: Para obter mais detalhes sobre PCR e eletroforese, consulte15,24 ou outra literatura padrão.
  16. Para expressão GFP: observe filamentos únicos com um microscópio de fluorescência (ver a Tabela de Materiais) em uma ampliação do conjunto objetivo em 40x ou 63x. Capture uma imagem de transmissão de brightfield e uma imagem de fluorescência. Use as seguintes configurações para GFP: bandpass de 470 nm para excitação, bandpass de 525 nm para emissão e um divisor de feixe de 495 nm, tempo inicial de exposição de 500 ms.
  17. Ajuste o tempo de exposição para sinais claros de fluorescência, evitando intensidades saturadas. Tente usar a mesma configuração para todas as amostras.
  18. Como os filamentos do tipo selvagem também exibirão fluorescência, capture imagens com as mesmas configurações acima para esta fluorescência de fundo.
    NOTA: A tensão que expressa gfp deve ter um sinal mais alto; caso contrário, não está expressando GFP.
  19. Com base nos tempos de exposição e nas intensidades dos pixels das imagens de fluorescência, calcule e compare o conteúdo GFP dos diferentes filamentos.

4. Crioconservação

NOTA: P. lacuna e o cianobacterium de células únicas Synechocystis sp. O PCC 6803 é usado. O presente método funciona melhor para P. lacuna.

  1. Cultivar P. lacuna ou Synechocystissp PCC 6803 por pelo menos 10 dias em 10 mL de f/2+ ou meio BG-11, respectivamente, sob luz branca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C sob agitação (rotações horizontais, 50 rpm).
  2. Homogeneize a cultura P. lacuna (ver a Tabela de Materiais) a 10.000 rpm por 3 min ou com um dispositivo de ultrassom (ver a Tabela de Materiais) por 2 min de energia total. Determine OD 750 nm de qualquer cultura para verificar se o valor está entre 1 e 7.
  3. Recolher as células por centrifugação a 6.000 × g por 15 min. Remova o supernatante.
  4. Suspenda a pelota de celular em 800 μL de f/2+ ou bg-11 médio (volume final) e transfira para um criovial de 2 mL. Adicione 800 μL de uma solução de 50% de glicerol à suspensão da célula. Feche o frasco e misture invertendo repetidamente.
  5. Transfira o criovial para nitrogênio líquido e armazene-o em uma caixa criobox em um congelador de -80 °C. Observe a posição da caixa dentro do congelador e as coordenadas da amostra dentro da caixa.
  6. Para a recuperação das células, tire o criovial e descongele o conteúdo à temperatura ambiente. Transfira o conteúdo para um tubo de reação de 2 mL.
  7. Lave a amostra duas vezes. Para a1ª lavagem, centrífuga a 6.000 × g por 5 min. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 2 mL de f/2+ ou meio BG-11. Para a2ª lavagem, recentemente orifuge a 6.000 × g por 5 min, remova o supernasce e suspenda a pelota em 2 mL de f/2+ ou meio BG-11.
  8. Para verificar a integridade dessas células prontas para cultivo, transfira a pelota para 9 mL de média e cultive-as em luz branca (50 μmol m-2 s-1) sob agitação (55 rpm). Compare o OD 750 nm da cultura no primeiro dia e depois de 1 semana.

5. Motilidade da lacuna phormidium

NOTA: Serão descritos três ensaios diferentes. A mesma cultura é usada em todos os casos.

  1. Cultivar P. lacuna em f/2 médio sob agitação horizontal (50 rpm) em luz branca (50 μmol m-2 s-1) por ~5 dias até que o OD estimado 750 nm seja 0,35. Armazene a amostra a 4 °C até o uso.
  2. Homogeneize os filamentos (ver a Tabela de Materiais) a 10.000 rpm por 3 min ou com ultrassom (ver a Tabela de Materiais) por 1 min de potência máxima e ciclo de 1. Medida OD 750 nm. Se acima de 0,35, dilua a fração com o meio f/2. Use esta solução em ensaios de motilidade nas etapas 5.3, 5.4 e 5.5.
  3. Ensaio para o movimento em meio líquido
    1. Para observação direta da motilidade, transfira 8 mL de meio contendo P. lacuna (a partir da etapa 5.2) para uma placa de Petri de 6 cm. Espere alguns minutos até que a amostra atinja a temperatura ambiente. Cubra a placa de Petri com papel alumínio.
    2. Coloque um slide de microscópio na tabela x-y de um microscópio padrão com uma câmera. Ligue a luz do microscópio. O ideal é sempre usar as mesmas configurações elétricas e ópticas para a iluminação. Mova um objetivo de 4x ou 10x para o caminho da luz.
    3. Coloque a placa de Petri em cima do slide. Ajuste os movimentos de filamentos ou filamentos únicos por x, y e z movimentos da tabela.
      NOTA: Devido ao arranjo tridimensional, apenas uma parte da seção relevante pode estar em foco. A folha de celofane permite ajustar o foco sem restrições.
    4. Observe movimentos de filamentos ou feixes únicos. Certifique-se de que a lente objetiva não toque no líquido. Registo os movimentos dos filamentos com uma câmera de microscópio padrão (ver Vídeo Suplementar S1).
  4. Ensaio para o movimento na superfície
    1. Para a observação da motilidade de filamento nas superfícies do ágar, prepare pratos petri de 6 cm com f/2 bacto-ágar. Certifique-se de que o ágar é alto o suficiente para que a lente objetiva se aproxime da superfície do ágar. Alternativamente, prepare uma camada de ágar de ~3 mm de espessura e grave os filamentos através do ágar (mantenha a placa de cabeça para baixo ou use um microscópio invertido).
    2. Pipeta 0,5 mL de uma solução contendo P. lacuna (a partir do passo 5.2) na superfície bacto-ágar de uma placa de Petri de 6 cm. Deixe o líquido entrar na superfície. Feche a placa de Petri e observe o movimento dos filamentos na superfície usando um objetivo de 4x ou 10x.
    3. Certifique-se de que as mesmas configurações elétricas e ópticas do microscópio sejam usadas durante toda a gravação e em gravações subsequentes.
    4. Capture gravações de lapso de tempo usando uma câmera ocular e um sistema de minicomputador. Certifique-se de que o intervalo de tempo entre as imagens subsequentes é de 5 s-1 min. Programe o script Linux do minicomputador para controlar a gravação de lapso de tempo. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para um script de exemplo e vídeo suplementar S2 como exemplo.
  5. Ensaio para fototaxis
    1. Para experimentos com fototaxis, prepare os suportes de diodo emissor de luz (LED) (aqui, com uma impressora 3D) em que os LEDs selecionados de 5 mm são montados para irradiar uma área de 20 mm2 de baixo para cima (Figura 3). Se necessário, use muitos suportes led em paralelo, conectando cada LED eletricamente através de um resistor e potencialiômetro a uma fonte de alimentação ajustável. Meça e ajuste as intensidades do LED, dependendo do experimento. Certifique-se de que toda a configuração esteja em uma sala escura ou em um recipiente escuro fechado.
    2. Coloque 8 mL do meio contendo P. lacuna (a partir do passo 5.2) em uma placa de Petri de 6 cm. Ajuste a intensidade da luz do LED. Feche a placa de Petri com a tampa e coloque-a em um suporte de LED para que o LED fique no centro da placa de Petri.
    3. Após a duração desejada (tipicamente 2 dias), capture uma imagem da placa de Petri com uma câmera de smartphone voltada diretamente para a posição do tratamento de luz. Use um painel LED branco para irradiação da amostra. Use as configurações manuais da câmera; evitar reflexos de luz; sempre se ajuste para obter a mesma distância entre a lente da câmera e o espécime. Certifique-se de que as configurações de exposição dão uma imagem adequada para análises posteriores usando ImageJ.
    4. Quantifique o diâmetro do círculo central dos filamentos usando o software ImageJ.
      1. Abra ImageJ, clique em Arquivo | Abra, selecione o arquivo desejado e clique em Enter.
      2. Selecione o botão Reto (com uma linha reta). Pressione o botão do mouse esquerdo para desenhar uma linha de uma extremidade da placa de Petri até a extremidade oposta. Certifique-se de que a linha passe pelo centro do círculo de filamentos.
      3. Pressione Ctrl-K no teclado ou clique em Analisar | Plot Profile no menu ImageJ. Procure por uma janela x-y com intensidades de pixels plotadas versus distância-a 1D perfil da placa de Petri. Certifique-se de que a menor intensidade de pixel está ligeiramente acima de 0 e o maior valor abaixo de 255.
      4. Estime um valor médio para a intensidade do pixel fora do círculo e outro valor médio para a intensidade do pixel no círculo. Na posição y entre esses valores, estime os valores x de ambos os lados do círculo apontando com o mouse sobre essas posições. Observe ambos os valores e calcule a diferença.
      5. Obtenha o maior valor x apontando o mouse para o eixo y à direita. Observe que este valor e representa o diâmetro da placa de Petri. Se este diâmetro for de 5 cm, calcule o diâmetro do círculo de filamento central como d/e × 5 cm.

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Representative Results

Seguindo os métodos acima mencionados, 5 cepas diferentes de P. lacuna foram isoladas de balanços e sequenciadas (Figura 1 e Tabela 1). Todas as culturas foram estéreis após ~1 ano de subcultura, exceto P. lacuna HE10JO. Esta cepa ainda está contaminada com Marivirga Atlantica, uma bactéria marinha. Durante as excursões subsequentes de Helgoland, outras cianobactérias filamentosas foram isoladas das piscinas rochosas, que são diferentes de P. lacuna e precisam ser caracterizadas.

Vários métodos de extração e purificação de DNA foram testados para P. lacuna. Os melhores resultados foram obtidos com um método CTAB otimizado como descrito acima. Os rendimentos de DNA foram de 310 ± 50 μg/mL, OD 260 nm/OD 280 nm foi de 1,7 ± 0,03, e OD 260 nm/OD 230 nm foi de 0,78 ± 0,04 (n = 17). O sequenciamento do genoma mostrou que o DNA de todas as cepas era ligeiramente diferente, como esperado (Tabela 1). As sequências proteicas do núcleo apresentaram diferença máxima de 0,04% (Tabela 2). Embora todos os genomas de rascunho estivessem incompletos, pode-se supor que >98% do genoma do HE10JO30 foi sequenciado. Esta estimativa baseia-se no número de quadros de leitura abertos incompletos. Sequências parciais de proteínas poderiam ser facilmente identificadas após a anotação rast de HE10DO e HE10JO. No HE10JO, 60 proteínas de ~4.500 tinham uma sequência terminal N ou C faltando. As sequências de genoma podem ser encontradas no suplemento (Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4, Arquivo Suplementar 5, Arquivo Suplementar 6 e Arquivo Suplementar 7).

Curiosamente, cepas da mesma espécie foram isoladas de duas ilhas, Helgoland e Giglio. A distância linear entre ambas as ilhas é de 1.400 km. Deve haver uma ligação entre ambos os lugares, por exemplo, por navios através do mar ou, mais provavelmente, por aves migratórias. Muitas espécies de aves podem ser encontradas em ambas as ilhas, e muitas delas são aves migratórias. A diversidade dentro de P. lacunas de uma ilha foi maior do que entre as cepas helgoland e giglio mais próximas (Tabela 2). Isso indica uma intensa troca entre os dois lugares.

A transformação natural foi testada com o HE10DO como a maior cepa e com HE10JO. O presente protocolo é mais simples do que o protocolo descrito anteriormente12 devido ao número reduzido de etapas de lavagem e menos passos de transferência após a transformação. Este novo método é continuamente utilizado em laboratório; ~15 transformações bem sucedidas foram alcançadas.

O de resistência KanR foi geralmente integrado ao local homólogo definido pelas regiões adjacentes, como mostrado pelo PCR usando primers internos e externos. Como a maioria das cianobactérias, P. lacuna é poliploide. Pode ter mais de 100 cromossomos por célula12. Um teste pcr com primers externos ~1 semana após a transformação normalmente tem 2 bandas no gel de eletroforese, uma com o tamanho da banda tipo selvagem e uma banda migratória mais lenta que indica a inserção do de resistência (Figura 4). A banda dupla indica que apenas uma subfração dos cromossomos contém a inserção. Após 4 semanas de seleção sobre kanamicina, a segregação geralmente é completa, e apenas uma grande banda PCR aparece em géis. No entanto, no caso da transformação com pMH1 (veja abaixo), a segregação foi completa após mais de 3 meses.

Os vetores pAK1, pAK2, pAK3 e pMH1 foram construídos para testes na expressão sfGFP. No pAK1, pAK2 e pAK3, o gene sfGFP está sob o controle dos promotores cpc560, A2813 e PSBA2, respectivamente. Esses promotores são de Synechocystis sp. PCC 6803 ou Synechococcus sp. PCC 700231. Para a construção desses vetores, as sequências de promotores e terminadores do SFFP foram retiradas de vetores utilizados para a transformação do Synechococcus sp. PCC 700231. As sequências relevantes foram integradas ao sítio homônimo chwA (sc_7_37) de pFN1 (ou pFN_7_37_KanR15). O vetor de expressão pMH1 foi construído pela síntese de DNA usando sequências de lacuna de P. como modelos (Arquivo Suplementar 6). As sequências cpcB-cpcA (phycocyanin ß e ficocyanin α) de P. lacuna são organizadas em série. Uma região intergênica de 100 bp separa ambas as regiões de codificação. A sequência sintética continha essa sequência endógena do CPCB-CPCA e o promotor do CPCB. O sfGFP e KanR é colocado apenas 3' do codon de parada do CPCB (5' do CPCA). Toda a sequência sintética com o promotor do CPCB, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' a 3') é clonada em pUC19. Um mapa é mostrado na Figura 5. Mais detalhes sobre a clonagem de pAK1, pAK2 e pAK3 e a sequência completa de pMH1 são dadas no Arquivo Suplementar 1.

Todos os 4 transformadores (com pAK1, pAK2, pAK3 e pMH1) expressaram GFP; todos os níveis de fluorescência estavam acima da fluorescência de fundo de filamentos do tipo selvagem (Figura 6). Os transformadores pMH1 com segregação incompleta revelaram um sinal GFP muito variável entre os filamentos. O sinal de fluorescência foi distribuído uniformemente quando a segregação foi completa (Figura 6E). Os sinais de microscópio dos transformadores pAK1, pAK2 e pAK3 eram semelhantes, mas ~5x mais fracos que os do pMH1 (Figura 6E).

O método de crioconservação estabelecido baseia-se em um método que foi estabelecido para E. coli. Quando 2 etapas de lavagem foram realizadas para remoção de glicerol após o descongelamento, 15 das 15 amostras de lacunas sobreviveram (Tabela 3). Este protocolo também poderia ser usado para synechocystis PCC 6803, mas apenas com 2 etapas de lavagem e não com 1 (Tabela 3).

Outra característica dos filamentos oscillatoriales é sua motilidade: filamentos p. lacuna se movem continuamente em superfícies (Figura 7) e em meio líquido (Figura 8). Ambos os tipos de movimento podem ser facilmente estudados em pratos de Petri sem ou com meio de ágar. A gravação de lapso de tempo é necessária porque o movimento no ágar é lento. Filamentos se movem em direção ao cone de luz se um feixe de luz vier de baixo (Figura 3). Os efeitos da intensidade da luz, comprimento de onda e tempo podem ser facilmente estudados com uma configuração simples. Os fotorreceptores deste efeito ainda não estão claros. Possíveis candidatos podem ser abordados com mutantes nocauteados. O mecanismo subjacente à forma como os filamentos encontram a luz também não é claro. Para esta pergunta, um sistema infravermelho é necessário para registrar os filamentos durante seu movimento da escuridão para a luz.

Figure 1
Figura 1: Cepas de lacuna phormidium coletadas de Helgoland e Giglio. Filamentos são propagados por 11 dias em f/2 ágar em pratos Petri de 6 cm. (A) cepa GI08AO; (B) cepa GI08IO; (C) cepa GI09CO; (D) tensão HE10DO; (E) tensão HE10JO; (F) tensão HE15M2G1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Filamentos de lacuna phormidium 5 semanas após a transformação. Utilizou-se o vetor de expressão sfGFP pMH1; a seleção ocorreu no meio f/2+ com kanamycina de 120 μg/mL. Os filamentos esverdeado são resistentes e vivos; outros filamentos morreram. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Experimento fototaxis. Esquerda: Suporte de LED com 4 LEDs vermelhos, conectado a uma fonte de alimentação ajustável. Em cima de cada LED, há uma placa de Petri de 6 cm com 8 mL de cultura Phormidium lacuna . Direito: Placa de Petri com P. lacuna após 2 dias no LED vermelho (15 μmol m-2 s-1). Abreviação: LED = diodo emissor de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Integração e segregação da inserção após a transformação da lacuna phormidium com pAK1. PCR com primers externos. Os tamanhos esperados do produto sem e com inserção são de 2371 e 5016 bp, respectivamente. Faixa esquerda: marcador, faixas 1, 2, 3, 4: produtos PCR de filamentos 7 dias, 11 dias, 14 dias e 17 dias após o isolamento de um filamento resistente (4 semanas após a transformação), respectivamente. Pista 5: Produto PCR de tipo selvagem (de um gel diferente). Na amostra de 7 dias, a inserção está presente em uma pequena fração dos cromossomos. Esta fração aumenta até 17 dias, onde nenhuma banda do tipo selvagem é visível, ou seja, a segregação está completa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Vetor para expressão sfGFP sob o controle do promotor endógeno cpcB . Laranja: Phormidium lacuna sequência homólogo, violeta/azul: pUC-19 vetor backbone, verde: inserir com sfGFP e KanR. Abreviaturas: sfGFP = proteína fluorescente verde superpatos; KanR = resistência à kanamicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Expressão de sfGFP em lacuna Phormidum. Imagens de fluorescência de filamentos do tipo selvagem P. lacuna (A) e após a transformação com pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) e pMH1 (E). No pMH1, o gene sfGFP é colocado 3' do gene phycocyanin ß e, portanto, impulsionado pelo promotor de cpcß endógeno; nos outros casos, o SFGFP é conduzido pelos promotores do CPC560, A2813 ou psbA2do Synechocystis PCC 6803, respectivamente. As configurações de fluorescência são específicas para GFP; todas as imagens foram gravadas com o mesmo tempo de integração e configurações ópticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Imagem mesclada de lacuna phormidium na superfície do ágar na ampliação de 4x. A primeira imagem é apresentada em vermelho, a segunda (tirada 1 min depois) em verde. Observe também os traços no ágar. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Imagem mesclada de lacuna phormidium em meio líquido. O intervalo de tempo entre ambas as imagens foi de 10 s. A primeira imagem é impressa em vermelho; o segundo é impresso em verde. Comparar ambas as cores mostra o movimento dentro de 10 s. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

coar HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Contigs 104 174 218 102 154
bp total 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tabela 1: Cepas de lacuna de phormidium .

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

Mesa 2. Diferenças de aminoácidos entre cepas em sequências de 20 proteínas principais com 10.876 aminoácidos.

Densidade celular OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Lava 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis PCC 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Lacuna phormidium HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tabela 3: Ensaios de crioconservação com Synechocystis PCC 6803 e Phormidium lacuna HE10DO cianobactérias. O primeiro número mostra o número de culturas que sobreviveram após o congelamento/descongelamento; o segundo número mostra o total de ensaios.

Vídeo suplementar S1: Movimento de filamentos lacuna Phormidium em solução líquida, sem lapso de tempo. Clique aqui para baixar este Vídeo.

Vídeo Suplementar S2: Movimento de filamentos de lacuna phormidium na superfície do ágar, com lapso de tempo. Por favor clique aqui para baixar este Vídeo.

Arquivo Suplementar 1: Clonagem de vetores para transformação de lacuna phormidium. Lista de vetores de transformação; lista de primers para clonagem; sequência de pMH1 em formato gb. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Scripts shell (sh) para minicomputador Raspberry Pi. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 3: sequência de DNA de HE152G1. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Sequência de DNA de GI08AO. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 5: sequência de DNA de GI09CO. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 6: sequência de DNA de HE10DO. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 7: sequência de DNA de HE10JO. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

Embora muitas cepas de cianobactérias estejam disponíveis a partir de coleções culturais 32,33,34,35,36, ainda há uma demanda por novas cianobactérias da natureza porque essas espécies são adaptadas a propriedades específicas. P. lacuna foi coletado a partir de piscinas rochosas e é adaptado a variações de concentrações de sal e temperatura30. Cepas desta espécie foram encontradas durante excursões em 2008, 2009 e 2010. Com o procedimento descrito aqui, 5 cepas de P. lacuna foram isoladas, e 4 dessas cepas foram estéreis. A cepa P. lacuna HE10JO está permanentemente contaminada com a bactéria Marivirga atlantica, uma bactéria marinha identificada pelo rRNA e sequenciamento do genoma. Esta bactéria não poderia ser separada do cianobacterium, apesar da aplicação de separação mecânica, crescimento em diferentes temperaturas, tratamentos com antibióticos ou tratamentos químicos. Apesar da contaminação, p. lacuna HE10JO pode ser cultivado semelhante às outras cepas. Em excursões posteriores, outros membros dos Oscillatoriales foram encontrados, que ainda não são analisados detalhadamente. P. lacuna não foi encontrado novamente. Não está claro por que P. lacuna foi isolada nos anos seguintes e dois lugares diferentes, mas não encontrado mais tarde. Sua abundância é certamente dependente de condições não precídicas. Temperatura, concentrações de sal e nutrientes inorgânicos ou orgânicos são altamente variáveis em piscinas rochosas. Portanto, a composição da espécie pode flutuar ao longo do tempo de forma imprevisível.

A transformação natural é estabelecida para diferentes cianobactérias, principalmente espécies unicelulares. A fisociásceta P. lacuna é a única espécie da ordem Oscillatoriales para as quais a transformação natural foi estabelecida. A transformação foi quase sempre bem sucedida com o protocolo atual. Em geral, os números de filamentos resistentes após um ensaio de transformação variam consideravelmente, e às vezes a transformação falha, resultando na perda de tempo valioso. Por isso, é aconselhável realizar diversos projetos de transformação em paralelo. O tempo para segregação completa, geralmente 4 semanas após o isolamento da cepa resistente, também pode variar. Como não há garantia de segregação completa após o crescimento da kanamicina, é crucial realizar os testes de PCR usando primers externos e internos.

Cada vetor deve conter sequências homólogos de 2 x 500-1.000 bp, por exemplo, amplificadas do host por PCR e interrompidas por um de resistência (por exemplo, o kanamycin KanR usado aqui)37,38. Para a expressão, um promotor, sequência de codificação (por exemplo, para sfGFP39), exterminador e de resistência devem ser clonados entre as sequências homólogas. As estratégias de clonagem são específicas das espécies e dependem do objetivo do experimento.

Esse método de transformação poderia ser possível com outras cepas de Oscillatorial ou outras cianobactérias também: a transformação natural é baseada no pili tipo IV, que estão presentes em quase todos os outros genomas cianobacterianos 3,15,40. Portanto, o presente método poderia estimular novos ensaios com outras espécies. Como os pili tipo IV também são relevantes para a motilidade, é importante verificar as condições em que as cianobactérias são motile.

A inserção genética é baseada na recombinação homóloga e resulta em uma interrupção dos locais homólogos. Portanto, a transformação é frequentemente usada para nocaute genético. A expressão do gene inserido será induzida se um promotor ativo e uma sequência de codificação forem integrados ao site homólogo. Em P. lacuna, a atividade do promotor dependia da espécie. Os promotores do CPC560, A2813 e PSBA2 do Synechocystis PCC SP 6803 ou Synechococcus sp. PCC 7002 31 e o promotor do CPCB de P. lacuna poderiam impulsionar a expressão sfGFP. Dessas construções, o promotor do CPCB endógeno induziu a expressão mais forte, embora o gene sfGFP esteja localizado a 3' do gene phycocyanin ß. Isso indica um uso mais geral de promotores endógenos na expressão cianobacteriana.

A combinação de estudos de nocaute genético e movimento lançará luz sobre mecanismos moleculares de motilidade e fototaxis. Fontes de luz LED podem fornecer luz para experimentos de fototáxi. Quase todo comprimento de onda está disponível, e a intensidade da luz pode ser modulada por uma fonte de alimentação ajustável e potencialiômetros. Os suportes de LED podem ser construídos por impressoras 3D para realizar facilmente combinações de diferentes LEDs.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

O trabalho contou com o apoio do Instituto de Tecnologia Karlsruher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

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Biologia Edição 180
Transformação Natural, Expressão proteica e Crioconservação da Cicocrias Cianobacterium <em>Phormidium lacuna</em>
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Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

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