Summary
Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso che è stato isolato dalle piscine rocciose marine. Questo articolo descrive l'isolamento dei filamenti da fonti naturali, l'estrazione del DNA, il sequenziamento del genoma, la trasformazione naturale, l'espressione di sfGFP, la crioconservazione e i metodi di motilità.
Abstract
I cianobatteri sono al centro della ricerca di base e dei progetti biotecnologici in cui l'energia solare viene utilizzata per la produzione di biomassa. Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso recentemente isolato. Questo documento descrive come i nuovi cianobatteri filamentosi possono essere isolati dalle piscine rocciose marine. Descrive anche come il DNA può essere estratto dai filamenti e come i genomi possono essere sequenziati. Sebbene la trasformazione sia stabilita per molte specie unicellulari, è meno frequentemente segnalata per i cianobatteri filamentosi. Un metodo semplificato per la trasformazione naturale di P. lacuna è descritto qui. P. lacuna è l'unico membro dell'ordine Oscillatoriales per il quale è stabilita la trasformazione naturale. Questo documento mostra anche come la trasformazione naturale viene utilizzata per esprimere la proteina fluorescente verde superfolder (sfGFP). Un promotore endogeno cpcB ha indotto un'espressione circa 5 volte più forte rispetto ai promotori cpc560, A2813 o psbA2 di Synechocystis sp. PCC6803. Inoltre, è stato stabilito un metodo per la crioconservazione di P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803 e sono descritti metodi per valutare la motilità in un mezzo liquido e su superfici di agar e plastica.
Introduction
I cianobatteri sono organismi procariotici che utilizzano la fotosintesi come fonte di energia 1,2. La ricerca è sempre più focalizzata sulle specie cianobatteriche. Diversi cianobatteri possono essere trasformati con il DNA3. I geni possono essere eliminati o sovraespressi in queste specie. Tuttavia, la trasformazione è limitata a poche specie 4,5,6,7,8,9,10,11, e può essere difficile stabilire la trasformazione in ceppi provenienti da collezioni di colture o dal wild 8. I ceppi della specie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) sono stati isolati dalle cave di roccia marine, in cui le condizioni ambientali, come le concentrazioni di sale o la temperatura, fluttuano nel tempo. Questi cianobatteri filamentosi possono essere utilizzati come organismi modello per l'ordine Oscillatoriales12 a cui appartengono.
Durante gli studi che testano il trasferimento genico mediante elettroporazione 13,14 è stato scoperto che P. lacuna può essere trasformato dalla trasformazione naturale15. In questo processo, il DNA viene assorbito naturalmente da alcune cellule. Rispetto ad altri metodi di trasformazione16,17, la trasformazione naturale ha il vantaggio di non richiedere strumenti aggiuntivi che potrebbero complicare la procedura. Ad esempio, l'elettroporazione richiede cuvette adeguate, fili intatti e selezione della tensione corretta. P. lacuna è attualmente l'unico membro oscillatoriales suscettibile di trasformazione naturale. Poiché il protocollo originale si basa su protocolli di elettroporazione, includeva ancora diverse fasi di lavaggio che potrebbero non essere necessarie. Sono stati testati diversi approcci per semplificare il protocollo, portando al protocollo di trasformazione qui presentato.
La sequenza del genoma è essenziale per ulteriori studi molecolari basati sul knockout genico o sulla sovraespressione. Sebbene le sequenze del genoma possano essere ottenute con macchine di sequenziamento di nuova generazione in brevi periodi, l'estrazione del DNA può essere difficile e dipende dalla specie. Con P. lacuna, sono stati testati diversi protocolli. È stato quindi stabilito un metodo modificato basato sul bromuro di cetilmetil ammonio (CTAB), con conseguente purezza accettabile delle rese di DNA e DNA di ciascun ciclo di purificazione per continuare il lavoro in laboratorio. Il genoma di cinque ceppi potrebbe essere sequenziato con questo protocollo. Il successivo passo logico di trasformazione è stato quello di stabilire l'espressione proteica in P. lacuna.
La sfGFP utilizzata come proteina marcatore in questo protocollo può essere rilevata con qualsiasi microscopio a fluorescenza. Tutti i promotori che sono stati testati potrebbero essere utilizzati per l'espressione di P. lacuna sfGFP. Il crescente numero di ceppi derivanti dalla trasformazione ha portato alla necessità di un metodo per conservare le colture. Tali metodi sono stabiliti per Escherichia coli e molti altri batteri18. Nei protocolli standard, le colture di glicerolo vengono preparate, trasferite in azoto liquido e conservate a -80 °C. Questo metodo richiede solo pochi passaggi ed è altamente affidabile per quelle specie per le quali è stabilito. Il protocollo standard non era fattibile per P. lacuna perché le cellule viventi non potevano essere recuperate in tutti i casi. Tuttavia, quando il glicerolo è stato rimosso dopo lo scongelamento, le cellule di tutti gli studi sono sopravvissute. Vengono presentati metodi semplici per l'analisi della motilità di P. lacuna, che possono essere combinati con la mutagenesi knockout per indagare il pili di tipo IV o il ruolo dei fotorecettori. Questi saggi sono diversi da quelli dei cianobatteri unicellulari 19,20,21 e possono essere utili anche per altre Oscillatorie.
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Protocol
1. Isolamento dall'ambiente naturale
NOTA: Alghe verdi, diatomee, cianobatteri filamentosi e altre microalghe possono essere isolati. Il protocollo può essere utilizzato per qualsiasi specie di microalga da pozze rocciose che crescono in condizioni di laboratorio. I cianobatteri filamentosi che appartengono agli Oscillatoriales possono essere facilmente riconosciuti dal loro movimento e dalla forma filamentosa. La specie può essere identificata in uno stato semipuro mediante sequenziamento del genoma o sequenziamento dell'rRNA 16S.
- Trasferire campioni di acqua di mare liquida da piscine rocciose marine (cioè cavità nella costa rocciosa) in palloni da 50 ml. Per ogni pallone, annotare il luogo esatto o le coordinate della fonte naturale. Se possibile, filtrare il contenuto attraverso reti da 50 μm per ridurre le quantità di zooplancton. Conservare i campioni a 4 °C fino a quando non possono essere sottoposti a sottocoltura.
- Trasferire 1 mL di colture in piastre di Petri da 10 cm contenenti il 3% di bacto-agar in f/2 medium22,23 (vedi tabella dei materiali). Preparare fino a 20 piatti. Coltivare sotto luce bianca di 50 μmol m-2 s-1.
NOTA: per la coltivazione possono essere utilizzate intensità luminose più elevate. Intensità fino a 400 μmol m-2 s-1 può essere utilizzata per P. lacuna, anche se altre specie potrebbero essere più sensibili alla luce. - Dopo una settimana, trasferire le cellule desiderate in piastre di agar fresche usando una pinza sterile. Isolare le cellule al microscopio binoculare in condizioni sterili. Conservare la vecchia piastra di agar a 4 °C fino a quando le cellule appaiono e crescono sulla nuova piastra di agar.
- Ripeti questa fase di trasferimento ogni settimana per eliminare la contaminazione. Utilizzare l'occhio nudo per rilevare la contaminazione pesante e un microscopio con ingrandimento 400x per ulteriori controlli di contaminazione.
- Se un campione sembra privo di contaminazione, testare la contaminazione batterica o fungina su piastre di agar. Trasferire una frazione della coltura con un anello di inoculazione su una piastra lb24 agar (diametro 10 cm), mantenere la piastra a temperatura ambiente e verificare la crescita di contaminanti nell'arco di 1-3 giorni.
- Se si ottiene una specie cianobatterica filamentosa sterile, utilizzarla per ulteriori lavori di coltura. Coltivare P. lacuna in liquido o su piastre di bacto-agar. Utilizzare palloni da 250 mL con 50 mL di terreno f/2 o mezzo f/2+ per la coltura liquida.
2. Estrazione del DNA
NOTA: Questo metodo è adottato da 25 26
- Preparare due boccette con 50 ml di f/2 medio. Inoculare ciascuno con ~ 1 mL di filamenti di P. lacuna da altre colture in crescita. Conservare le colture per 7 giorni o più in agitazione (rotazione orizzontale) a 50 giri/min sotto luce bianca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C.
- Trattare la coltura con ultrasuoni (vedi la Tabella dei materiali) per 2 minuti con piena energia. Misurare OD a 750 nm; verificare che sia ~ 0,5. Continua a far crescere le culture se l'OD è troppo basso.
- Raccogliere i filamenti da 5.000 × g, 20 minuti di centrifugazione. Rimuovere il surnatante. Trasferire i filamenti con liquido residuo nella camera di una French Press27. Impostare la pressione della French Press a 20.000 psi ed estrarre le cellule.
NOTA: La stampa francese lisa tutte le cellule e rilascerà il DNA; forti forze di taglio produrranno frammenti di DNA da 1.500 bp. - Centrifugare il campione per 10 minuti a 10.000 × g e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere al pellet 400 μL di tampone di lisi (4 M urea, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) e 50 μL di proteinasi K (10 mg/mL). Riscaldare il campione a 55 °C per 60 minuti con agitazione a 550 giri/min.
- Aggiungere 1 mL di tampone di estrazione del DNA (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) e incubare per 60 min a 55 °C e 550 rpm. Trasferire le soluzioni in tubi di centrifugazione e aggiungere due volumi di cloroformio/isoamilalcol (24/1).
- Dopo l'agitazione, centrifugare il campione per 5 minuti a 9.000 × g. Trasferire la fase acquosa superiore in flaconcini di reazione e aggiungere 1 mL di etanolo ghiacciato e 50 μL di acetato di sodio 3 M.
- Vorticare il campione e posizionarlo a -20 °C per 1 ora o più.
- Centrifugare per 5 minuti a 10.000 × g (4 °C) ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet con il 70% di etanolo.
- Centrifugare nuovamente il campione. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet durante la notte. Sciogliere il DNA in acqua priva di nucleasi. Misurare lo spettro del DNA per verificare se l'OD 260 nm/OD 280 nm è compreso tra 1,6 e 1,9.
- Analizzare la dimensione del DNA su un gel di elettroforesi di agarosio28.
- Sequenziare il DNA genomico mediante sequenziamento di nuova generazione per 300 cicli, con un'impostazione di fine accoppiata e una lunghezza di lettura di 150 basi (vedi le Tabelle dei materiali).
- Eseguire l'assemblaggio con il programma informatico appropriato; si veda l'esempio riportato nella Tabella dei Materiali.
- Inviare la bozza del genoma al server RAST per l'annotazione.
NOTA: Carica sequenze di DNA per ottenere un'annotazione completa in pochi minuti.
3. Trasformazione naturale ed espressione GFP
NOTA: La trasformazione si basa su un vettore plasmidico propagato in E. coli; pGEM-T o pUC19 possono essere utilizzati come vettori backbone. Le tecniche di clonazione sono stabilite in molti laboratori; vedi anche protocolli standard28 e gli articoli sui vettori di trasformazione per P. lacuna15,29. Esempi di vettori per l'espressione sfGFP sono descritti nella sezione dei risultati rappresentativi. I dettagli di quattro vettori non ancora pubblicati sono forniti nel file supplementare 1.
- Eseguire tutte le fasi utilizzando materiale sterile in condizioni di laboratorio sterili (banco pulito, vetreria sterile).
- Inoculare 2 x 50 mL di terreno liquido f/2 in due palloni da 250 mL con 2 x 1 mL di filamenti di P. lacuna provenienti da una coltura in esecuzione. Coltivare in luce bianca (50 μmol m-2 s-1) sotto agitazione (rotazione orizzontale, 50 rpm) per ~5 giorni a 25 °C.
- Preparare ~ 200 μg del DNA del vettore di trasformazione utilizzando un kit di preparazione midi (vedere la tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Omogeneizzare 100 mL di sospensione cellulare P. lacuna (vedi Tabella dei Materiali) a 10.000 giri/min per 3 min. Misurare OD a 750 nm (valore desiderato = 0,35).
- Centrifugare la sospensione cellulare per 15 min a 6.000 × g. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in 800 μL (volume totale compresi liquido residuo e filamenti) del liquido rimanente e del mezzo f/2+ aggiuntivo.
- Prendi otto piastre di bacto-agar f/2+ (diametro 10 cm) contenenti 120 μg/mL di kanamicina. Pipetta 10 μg di DNA nel mezzo di ogni piastra di agar. Immediatamente pipettare 100 μL di sospensione cellulare nel mezzo di ogni piastra di agar (sopra il DNA).
- Tenere la piastra di agar senza coperchio sul banco pulito per consentire al liquido in eccesso di evaporare. Chiudere il piatto e coltivarlo in luce bianca a 25 °C per 2 giorni.
- Distribuire i filamenti di ciascuna piastra di agar con un anello di inoculazione su diverse piastre fresche di bacto-agar f/2+ contenenti 120 μg/mL di kanamicina. Coltivare le piastre in luce bianca a 25 °C e controllare regolarmente le colture al microscopio.
- Identifica i filamenti viventi trasformati dopo 7-28 giorni al microscopio. Cerca filamenti sani e verdi (Figura 2) diversi dagli altri filamenti. Se questi filamenti verdi possono essere identificati, continuare con il passaggio successivo; altrimenti, conservare il piatto per altri 7 giorni.
- Utilizzare una pinza per trasferire questi filamenti viventi identificati in 50 mL di mezzo liquido f/2+ con kanamicina da 250 μg/mL. Coltivare in bianco chiaro a 25 °C su uno shaker (rotazione orizzontale, 50 giri/min). Osserva la crescita per un massimo di quattro settimane.
- Trasferire i filamenti su un mezzo agar contenente 250 μg/mL di kanamicina e attendere che i filamenti crescano. Dopo diversi giorni, trasferire singoli filamenti in una piastra di agar fresca con una maggiore concentrazione di kanamicina, ad esempio 500 μg / mL. Conservare la piastra originale.
- Assicurarsi che i filamenti siano propagati in un'alta concentrazione di kanamicina in coltura liquida o su agar. Aumentare nuovamente la concentrazione di kanamicina per accelerare la segregazione.
NOTA: P. lacuna trasformata cresce fino a 10.000 μg/mL di kanamicina. Altre specie potrebbero non tollerare concentrazioni così elevate. - Se le cellule resistenti vengono coltivate e distribuite ampiamente su una piastra, testare l'integrazione dell'inserto nel genoma di P. lacuna eseguendo la PCR con primer esterni e interni.
- Utilizzare primer progettati per la clonazione dell'inserzione come primer interni.
- Per la progettazione dei primer esterni, selezionare sequenze che siano 5' e 3' del sito di inserimento proposto sul genoma di P. lacuna ma al di fuori dell'inserzione.
- Per le reazioni PCR, utilizzare primer interni e primer esterni. Utilizzare i ceppi resistenti e il tipo wild.
NOTA: i primer interni indicano che l'inserto è presente; i primer esterni mostrano che l'inserto è inserito nel locus corretto.
- Per ogni reazione PCR, posizionare ~ 10 mg dei filamenti direttamente nei tubi PCR ed eseguire la PCR secondo i protocolli standard24. Se non si ottiene alcun prodotto, variare la temperatura di ricottura e lavare i filamenti con acqua.
NOTA: Molte polimerasi diverse possono essere utilizzate nella PCR. Le polimerasi standard, come la Taq polimerasi, hanno un tasso di errore più elevato rispetto alle polimerasi di controllo degli errori, che sono più costose. Questa PCR analitica non richiede alcuna polimerasi di controllo degli errori. Tuttavia, la polimerasi di controllo degli errori deve essere testata se nessun prodotto PCR è ottenuto con una polimerasi standard. - Analizzare i prodotti PCR della linea resistente sull'elettroforesi dell'agarosio24.
- Confronta le posizioni della banda con il marcatore e confronta il tipo wild e il trasformante. Con i primer interni ed esterni, cerca una banda più grande per il trasformante rispetto al tipo wild (a causa dell'inserimento della cassetta di resistenza) o due bande per il trasformante: una con le dimensioni della banda wild-type e una più grande. Poiché quest'ultimo caso indica una segregazione incompleta, continuare la coltivazione con alte concentrazioni di kanamicina.
NOTA: Per maggiori dettagli sulla PCR e l'elettroforesi, vedere15,24 o altra letteratura standard.
- Confronta le posizioni della banda con il marcatore e confronta il tipo wild e il trasformante. Con i primer interni ed esterni, cerca una banda più grande per il trasformante rispetto al tipo wild (a causa dell'inserimento della cassetta di resistenza) o due bande per il trasformante: una con le dimensioni della banda wild-type e una più grande. Poiché quest'ultimo caso indica una segregazione incompleta, continuare la coltivazione con alte concentrazioni di kanamicina.
- Per l'espressione GFP: osservare singoli filamenti con un microscopio a fluorescenza (vedi la Tabella dei materiali) ad un ingrandimento dell'obiettivo impostato a 40x o 63x. Cattura un'immagine di trasmissione in campo luminoso e un'immagine a fluorescenza. Utilizzare le seguenti impostazioni per GFP: passabanda a 470 nm per l'eccitazione, passaggio di banda a 525 nm per l'emissione e uno splitter del fascio da 495 nm, tempo di esposizione iniziale di 500 ms.
- Regolare il tempo di esposizione per chiari segnali di fluorescenza, evitando intensità di saturazione. Provare a utilizzare la stessa impostazione per tutti gli esempi.
- Poiché anche i filamenti wild-type mostreranno fluorescenza, cattura immagini con le stesse impostazioni di cui sopra per questa fluorescenza di sfondo.
NOTA: la GFP che esprime la deformazione deve avere un segnale più alto; altrimenti, non sta esprimendo GFP. - In base ai tempi di esposizione e alle intensità dei pixel delle immagini a fluorescenza, calcolare e confrontare il contenuto GFP dei diversi filamenti.
4. Crioconservazione
NOTA: P. lacuna e il cianobatterio unicellulare Synechocystis sp. PCC 6803 sono utilizzati. Il metodo attuale funziona meglio per P. lacuna.
- Coltivare P. lacuna o Synechocystissp PCC 6803 per almeno 10 giorni in 10 mL di mezzo f/2+ o BG-11, rispettivamente, sotto luce bianca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C sotto agitazione (rotazioni orizzontali, 50 rpm).
- Omogeneizzare la coltura di P. lacuna (vedi Tabella dei Materiali) a 10.000 giri/min per 3 min o con un dispositivo ad ultrasuoni (vedi tabella dei materiali) per 2 min a piena energia. Determinare OD 750 nm di entrambe le colture per verificare se il valore è compreso tra 1 e 7.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 × g per 15 min. Rimuovere il surnatante.
- Sospendere il pellet cellulare in 800 μL di mezzo f/2+ o BG-11 (volume finale) e trasferirlo in un crioviale da 2 mL. Aggiungere 800 μL di una soluzione di glicerolo al 50% alla sospensione cellulare. Chiudere il flaconcino e mescolare invertendo ripetutamente.
- Trasferire il crioviale in azoto liquido e conservarlo in una criobox in un congelatore a -80 °C. Notare la posizione della scatola all'interno del congelatore e le coordinate del campione all'interno della scatola.
- Per il recupero delle cellule, estrarre la crioviale e scongelare il contenuto a temperatura ambiente. Trasferire il contenuto in un tubo di reazione da 2 ml.
- Lavare il campione due volte. Per il 1° lavaggio, centrifugare a 6.000 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospescere il pellet in 2 mL di mezzo f/2+ o BG-11. Per il 2° lavaggio, rifiltrare a 6.000 × g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in 2 ml di mezzo f/2+ o BG-11.
- Per verificare l'integrità di queste celle pronte per la coltivazione, trasferire il pellet a 9 ml di terreno e coltivarle in luce bianca (50 μmol m-2 s-1) sotto agitazione (55 rpm). Confronta l'OD 750 nm della coltura il primo giorno e dopo 1 settimana.
5. Motilità del Phormidium lacuna
NOTA: Verranno descritti tre diversi saggi. La stessa cultura viene utilizzata in tutti i casi.
- Coltivare P. lacuna in mezzo f/2 sotto agitazione orizzontale (50 rpm) in luce bianca (50 μmol m-2 s-1) per ~5 giorni fino a quando l'OD stimato 750 nm è 0,35. Conservare il campione a 4 °C fino all'uso.
- Omogeneizzare i filamenti (vedi tabella dei materiali) a 10.000 giri/min per 3 min o con ultrasuoni (vedi tabella dei materiali) per 1 min alla massima potenza e ciclo di 1. Misura OD 750 nm. Se superiore a 0,35, diluire la frazione con mezzo f/2. Utilizzare questa soluzione nei saggi di motilità nei passaggi 5.3, 5.4 e 5.5.
- Saggio per il movimento in mezzo liquido
- Per l'osservazione diretta della motilità, trasferire 8 mL di terreno contenente P. lacuna (dal punto 5.2) in una capsula di Petri di 6 cm. Attendere alcuni minuti fino a quando il campione raggiunge la temperatura ambiente. Coprire la capsula di Petri con un foglio di cellophane.
- Posizionare un vetrino per microscopio sul tavolo x-y di un microscopio standard con una fotocamera. Accendere la luce del microscopio. Idealmente, utilizzare sempre le stesse impostazioni elettriche e ottiche per l'illuminazione. Sposta un obiettivo 4x o 10x nel percorso della luce.
- Posizionare la capsula di Petri sopra la diapositiva. Regolare i singoli filamenti o fasci di filamenti in base ai movimenti x, y e z della tabella.
NOTA: a causa della disposizione tridimensionale, solo una parte della sezione pertinente può essere messa a fuoco. La lamina di cellophane consente di regolare la messa a fuoco senza restrizioni. - Osservare i movimenti di singoli filamenti o fasci. Assicurarsi che la lente dell'obiettivo non tocchi il liquido. Registrare i movimenti dei filamenti con una telecamera al microscopio standard (vedere Video supplementare S1).
- Saggio per il movimento sulla superficie
- Per l'osservazione della motilità del filamento sulle superfici dell'agar, preparare piastre di Petri da 6 cm con f/2 bacto-agar. Assicurarsi che l'agar sia abbastanza alto da consentire alla lente dell'obiettivo di avvicinarsi alla superficie dell'agar. In alternativa, preparare uno strato di agar spessore ~ 3 mm e registrare i filamenti attraverso l'agar (tenere la piastra capovolta o utilizzare un microscopio invertito).
- Pipetta 0,5 mL di una soluzione contenente P. lacuna (dal punto 5.2) sulla superficie bacto-agar di una capsula di Petri di 6 cm. Lasciare che il liquido entri nella superficie. Chiudi la capsula di Petri e osserva il movimento dei filamenti sulla superficie usando un obiettivo 4x o 10x.
- Assicurarsi che le stesse impostazioni elettriche e ottiche del microscopio siano utilizzate durante la registrazione e nelle registrazioni successive.
- Cattura registrazioni time-lapse utilizzando una fotocamera oculare e un sistema di minicomputer. Assicurarsi che l'intervallo di tempo tra le immagini successive sia di 5 s-1 min. Programmare lo script Linux del minicomputer per controllare la registrazione time-lapse. Vedere File supplementare 2 per uno script di esempio e Video supplementare S2 come esempio.
- Saggio per fototaxi
- Per gli esperimenti di fototassi, preparare supporti per diodi a emissione luminosa (LED) (qui, con una stampante 3D) in cui sono montati i LED da 5 mm selezionati per irradiare un'area di 20 mm2 dal basso verso l'alto (Figura 3). Se necessario, utilizzare molti supporti LED in parallelo, collegando elettricamente ciascun LED tramite un resistore e un potenziometro a un alimentatore regolabile. Misurare e regolare le intensità dei LED, a seconda dell'esperimento. Assicurarsi che l'intera impostazione si trovi in una stanza buia o in un contenitore buio chiuso.
- Posizionare 8 mL del mezzo contenente P. lacuna (dal punto 5.2) in una capsula di Petri da 6 cm. Regolare l'intensità luminosa del LED. Chiudere la capsula di Petri con il coperchio e posizionarla su un supporto LED in modo che il LED sia al centro della capsula di Petri.
- Dopo la durata desiderata (tipicamente 2 giorni), scatta un'immagine della capsula di Petri con una fotocamera per smartphone puntata direttamente sulla posizione del trattamento della luce. Utilizzare un pannello LED bianco per l'irradiazione del campione. Utilizzare le impostazioni manuali della fotocamera; evitare riflessi di luce; regolare sempre per ottenere la stessa distanza tra l'obiettivo della fotocamera e il campione. Assicurarsi che le impostazioni di esposizione forniscano un'immagine adatta per analisi successive utilizzando ImageJ.
- Quantifica il diametro del cerchio centrale dei filamenti utilizzando il software ImageJ.
- Apri ImageJ, fai clic su File | Aprire, selezionare il file desiderato e fare clic su Invio.
- Selezionare il pulsante Dritto (con una linea retta). Premere il pulsante sinistro del mouse per tracciare una linea da un'estremità della capsula di Petri all'estremità opposta. Assicurarsi che la linea passi attraverso il centro del cerchio di filamenti.
- Premere CTRL-K sulla tastiera o fare clic su Analizza | Traccia profilo nel menu ImmagineJ. Cerca una finestra x-y con intensità di pixel tracciate rispetto alla distanza: un profilo 1D della capsula di Petri. Assicurati che l'intensità di pixel più bassa sia leggermente superiore a 0 e il valore più alto inferiore a 255.
- Stimare un valore medio per l'intensità dei pixel al di fuori del cerchio e un altro valore medio per l'intensità dei pixel nel cerchio. Nella posizione y tra questi valori, stimare i valori x di entrambi i lati del cerchio puntando con il mouse su queste posizioni. Annotare entrambi i valori e calcolare la differenza.
- Ottenete il valore x più alto puntando il mouse sull'asse y a destra. Si noti che questo valore e rappresenta il diametro della capsula di Petri. Se questo diametro è di 5 cm, calcolare il diametro del cerchio centrale del filamento come d/e × 5 cm.
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Representative Results
Seguendo i metodi sopra menzionati, 5 diversi ceppi di P. lacuna sono stati isolati dalle piscine rocciose e sequenziati (Figura 1 e Tabella 1). Tutte le colture erano sterili dopo circa 1 anno di sottocoltura tranne P. lacuna HE10JO. Questo ceppo è ancora contaminato da Marivirga atlantica, un batterio marino. Durante le successive escursioni di Helgoland, altri cianobatteri filamentosi sono stati isolati da pozze rocciose, che sono diverse da P. lacuna e devono essere caratterizzate.
Diversi metodi di estrazione e purificazione del DNA sono stati testati per P. lacuna. I migliori risultati sono stati ottenuti con un metodo CTAB ottimizzato come descritto sopra. Le rese di DNA erano 310 ± 50 μg/mL, OD 260 nm/OD 280 nm era 1,7 ± 0,03 e OD 260 nm/OD 230 nm era 0,78 ± 0,04 (n = 17). Il sequenziamento del genoma ha mostrato che il DNA di tutti i ceppi era leggermente diverso, come previsto (Tabella 1). Le sequenze proteiche del nucleo hanno mostrato una differenza massima dello 0,04% (Tabella 2). Sebbene tutte le bozze di genomi fossero incomplete, si può presumere che >98% del genoma di HE10JO30 sia stato sequenziato. Questa stima si basa sul numero di frame di lettura aperti incompleti. Sequenze proteiche parziali potrebbero essere facilmente identificate dopo l'annotazione RAST di HE10DO e HE10JO. In HE10JO, 60 proteine su ~ 4.500 avevano una sequenza N o C-terminale mancante. Le sequenze del genoma possono essere trovate nel supplemento (File supplementare 3, File supplementare 4, File supplementare 5, File supplementare 6 e File supplementare 7).
È interessante notare che ceppi della stessa specie sono stati isolati da due isole, Helgoland e Giglio. La distanza lineare tra le due isole è di 1.400 km. Deve esistere un collegamento tra i due luoghi, ad esempio dalle navi via mare o, più probabilmente, dagli uccelli migratori. Molte specie di uccelli si possono trovare su entrambe le isole, e molte di loro sono uccelli migratori. La diversità all'interno dei ceppi di P. lacuna di un'isola era maggiore rispetto ai ceppi di Helgoland e Giglio più vicini (Tabella 2). Questo indica un intenso scambio tra i due luoghi.
La trasformazione naturale è stata testata con HE10DO come ceppo principale e con HE10JO. Il protocollo attuale è più semplice del protocollo descritto in precedenza12 a causa del numero ridotto di fasi di lavaggio e del minor numero di passaggi di trasferimento dopo la trasformazione. Questo nuovo metodo viene continuamente utilizzato in laboratorio; Sono state raggiunte ~ 15 trasformazioni di successo.
La cassetta di resistenza KanR è stata solitamente integrata nel sito omologo definito dalle regioni adiacenti, come mostrato dalla PCR utilizzando primer interni ed esterni. Come la maggior parte dei cianobatteri, P. lacuna è poliploide. Può avere più di 100 cromosomi per cellula12. Un test PCR con primer esterni ~ 1 settimana dopo la trasformazione ha tipicamente 2 bande sul gel di elettroforesi, una con la dimensione della banda wild-type e una banda migrante più lenta che indica l'inserimento della cassetta di resistenza (Figura 4). La doppia banda indica che solo una sottofrazione dei cromosomi contiene l'inserzione. Dopo 4 settimane di selezione sulla kanamicina, la segregazione è solitamente completa e solo una grande banda PCR appare sui gel. Tuttavia, nel caso della trasformazione con pMH1 (vedi sotto), la segregazione è stata completata dopo più di 3 mesi.
I vettori pAK1, pAK2, pAK3 e pMH1 sono stati costruiti per test sull'espressione di sfGFP. In pAK1, pAK2 e pAK3, il gene sfGFP è sotto il controllo dei promotori cpc560, A2813 e psbA2, rispettivamente. Questi promotori provengono da Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus sp. PCC 700231. Per la costruzione di questi vettori, le sequenze del promotore sfGFP e del terminatore sono state prese da vettori utilizzati per la trasformazione di Synechococcus sp. PCC 700231. Le sequenze rilevanti sono state integrate nel sito omologo chwA (sc_7_37) di pFN1 (o pFN_7_37_KanR15). Il vettore di espressione pMH1 è stato costruito mediante sintesi del DNA utilizzando sequenze di P. lacuna come modelli (File supplementare 6). Le sequenze cpcB-cpcA (ficocianina ß e ficocianina α) di P. lacuna sono disposte in serie. Una regione intergenica a 100 bp separa entrambe le regioni codificanti. La sequenza sintetica conteneva questa sequenza endogena cpcB-cpcA e il promotore cpcB. La cassetta sfGFP e KanR è posizionata a soli 3' del codone di arresto cpcB (5' di cpcA). L'intera sequenza sintetica con promotore cpcB, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (da 5' a 3') viene clonata in pUC19. Una mappa è mostrata nella Figura 5. Maggiori dettagli sulla clonazione di pAK1, pAK2 e pAK3 e sulla sequenza completa di pMH1 sono forniti nel file supplementare 1.
Tutti e 4 i trasformatori (con pAK1, pAK2, pAK3 e pMH1) hanno espresso GFP; tutti i livelli di fluorescenza erano superiori alla fluorescenza di fondo dei filamenti wild-type (Figura 6). I trasformatori di pMH1 con segregazione incompleta hanno rivelato un segnale GFP molto variabile tra i filamenti. Il segnale di fluorescenza è stato distribuito uniformemente quando la segregazione era completa (Figura 6E). I segnali al microscopio dei trasformatori pAK1, pAK2 e pAK3 erano simili ma ~ 5 volte più deboli di quelli di pMH1 (Figura 6E).
Il metodo di crioconservazione stabilito si basa su un metodo che è stato stabilito per E. coli. Quando sono state eseguite 2 fasi di lavaggio per la rimozione del glicerolo dopo lo scongelamento, sono sopravvissuti 15 campioni di P. lacuna su 15 (Tabella 3). Questo protocollo potrebbe essere utilizzato anche per Synechocystis PCC 6803, ma solo con 2 fasi di lavaggio e non con 1 (Tabella 3).
Un'altra caratteristica dei filamenti Oscillatoriales è la loro motilità: i filamenti di P. lacuna si muovono continuamente sulle superfici (Figura 7) e in un mezzo liquido (Figura 8). Entrambi i tipi di movimento possono essere studiati facilmente nelle piastre di Petri senza o con il mezzo agar. La registrazione time-lapse è necessaria perché il movimento su agar è lento. I filamenti si muovono verso il cono di luce se un fascio di luce proviene dal basso (Figura 3). Gli effetti dell'intensità della luce, della lunghezza d'onda e del tempo possono essere facilmente studiati con una semplice configurazione. I fotorecettori di questo effetto non sono ancora chiari. I possibili candidati possono essere indirizzati con mutanti knockout. Anche il meccanismo alla base del modo in cui i filamenti trovano la luce non è chiaro. Per questa domanda, è necessario un sistema a infrarossi per registrare i filamenti durante il loro movimento dall'oscurità alla luce.
Figura 1: Ceppi di Phormidium lacuna raccolti da Helgoland e Giglio. I filamenti vengono propagati per 11 giorni su f/2 agar in piastre di Petri da 6 cm. A) ceppo GI08AO; B) ceppo GI08IO; C) ceppo GI09CO; D) ceppo HE10DO; E) ceppo HE10JO; F) ceppo HE15M2G1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Filamenti di Phormidium lacuna 5 settimane dopo la trasformazione. È stato utilizzato il vettore di espressione sfGFP pMH1; la selezione è avvenuta su mezzo f/2+ con kanamicina 120 μg/mL. I filamenti verdastri sono resistenti e vivi; altri filamenti sono morti. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esperimento di fototaxi. A sinistra: porta LED con 4 LED rossi, collegato ad un alimentatore regolabile. Sopra ogni LED, c'è una capsula di Petri da 6 cm con 8 ml di una coltura di Phormidium lacuna . A destra: capsula di Petri con P. lacuna dopo 2 giorni sul LED rosso (15 μmol m-2 s-1). Abbreviazione: LED = diodo emettitore di luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Integrazione e segregazione dell'inserto dopo la trasformazione della lacuna di Phormidium con pAK1. PCR con primer esterni. Le dimensioni previste del prodotto senza e con inserto sono rispettivamente 2371 e 5016 bp. Corsia di sinistra: marker, corsie 1, 2, 3, 4: prodotti PCR di filamenti 7 giorni, 11 giorni, 14 giorni e 17 giorni dopo l'isolamento di un filamento resistente (4 settimane dopo la trasformazione), rispettivamente. Corsia 5: prodotto PCR di tipo selvatico (da un gel diverso). Nel campione di 7 giorni, l'inserto è presente in una piccola frazione dei cromosomi. Questa frazione aumenta fino a 17 giorni, dove non è visibile alcuna banda wild-type, cioè la segregazione è completa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Vettore per l'espressione di sfGFP sotto il controllo del promotore cpcB endogeno. Arancione: Phormidium lacuna sequenza omologa , viola/blu: dorsale vettoriale pUC-19, verde: inserto con sfGFP e KanR. Abbreviazioni: sfGFP = superfolder green fluorescent protein; KanR = resistenza alla kanamicina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Espressione di sfGFP nella lacuna di Phormidum. Immagini di fluorescenza di filamenti wild-type di P. lacuna (A) e dopo la trasformazione con pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) e pMH1 (E). In pMH1, il gene sfGFP è posto 3' del gene ficocianina ß e quindi guidato dal promotore endogeno cpcß ; negli altri casi, sfGFP è guidato da promotori cpc560, A2813 o psbA2s di Synechocystis PCC 6803, rispettivamente. Le impostazioni di fluorescenza sono specifiche per GFP; tutte le immagini sono state registrate con lo stesso tempo di integrazione e le stesse impostazioni ottiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagine unita di Phormidium lacuna sulla superficie dell'agar con ingrandimento 4x. La prima immagine è presentata in rosso, la seconda (scattata 1 minuto dopo) in verde. Da notare anche le tracce sull'agar. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagine unita di Phormidium lacuna in mezzo liquido. L'intervallo di tempo tra le due immagini era di 10 s. La prima immagine è stampata in rosso; il secondo è stampato in verde. Confrontando entrambi i colori si mostra il movimento entro 10 s. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| sforzo | HE10JO · | HE10DO · | GI08AO · | GI09CO · | HE15M2G1 · |
| Contigs | 104 | 174 | 218 | 102 | 154 |
| bp totale | 48,19,017 | 47,88,491 | 47,78,775 | 36,69,922 | 45,98,395 |
Tabella 1: Ceppi di Phormidium lacuna .
| Gi09CO · | HE10DO · | HE10JO · | HE15M2G1 · | |
| Gi08AO | 42 | 40 | 0 | 42 |
| Gi09CO · | 2 | 42 | 0 | |
| HE10DO · | 40 | 2 | ||
| HE10JO · | 42 |
Tabella 2. Differenze aminoacidiche tra ceppi in sequenze di 20 proteine core con 10.876 amminoacidi.
| Densità di cella OD 750 nm | 1 | 1 | 3 | 3 | 5 | 5 | 7 | 7 |
| Lava | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| Synechocystis PCC 6803 · | 2/5 | 5/5 | 1/4 | 4/4 | 0/4 | 4/4 | 0/4 | 3/4 |
| Phormidium lacuna HE10DO · | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 3/ 4 | 4/4 | 3/3 | 3/3 |
Tabella 3: Prove di crioconservazione con Synechocystis PCC 6803 e Phormidium lacuna HE10DO cianobatteri. Il primo numero mostra il numero di colture sopravvissute dopo il congelamento / scongelamento; il secondo numero mostra le prove totali.
Video supplementare S1: Movimento dei filamenti di Phormidium lacuna in soluzione liquida, senza time-lapse. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare S2: Movimento dei filamenti di Phormidium lacuna sulla superficie dell'agar, con time-lapse. Clicca qui per scaricare questo video.
File supplementare 1: Clonazione di vettori per la trasformazione di Phormidium lacuna. Elenco dei vettori di trasformazione; elenco dei primer per la clonazione; sequenza di pMH1 in formato gb. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: Script di shell (sh) per minicomputer Raspberry Pi. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: sequenza del DNA di HE152G1. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: sequenza del DNA di GI08AO. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 5: sequenza del DNA di GI09CO. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 6: sequenza di DNA di HE10DO. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 7: sequenza del DNA di HE10JO. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Sebbene molti ceppi di cianobatteri siano disponibili dalle collezionidi colture 32,33,34,35,36, c'è ancora una domanda di nuovi cianobatteri dall'ambiente naturale perché queste specie sono adattate a proprietà specifiche. P. lacuna è stato raccolto da piscine rocciose ed è adattato alle variazioni delle concentrazioni di sale e della temperatura30. Ceppi di questa specie sono stati trovati durante le escursioni nel 2008, 2009 e 2010. Con la procedura qui descritta, 5 ceppi di P. lacuna sono stati isolati e 4 di questi ceppi erano sterili. Il ceppo P. lacuna HE10JO è permanentemente contaminato dal batterio Marivirga atlantica, un batterio marino identificato dal sequenziamento dell'rRNA e del genoma. Questo batterio non poteva essere separato dal cianobatterio nonostante l'applicazione della separazione meccanica, della crescita a temperature diverse, dei trattamenti con antibiotici o dei trattamenti chimici. Nonostante la contaminazione, P. lacuna HE10JO può essere coltivato in modo simile agli altri ceppi. Nelle escursioni successive, sono stati trovati altri membri di Oscillatoriales, che non sono ancora stati analizzati in dettaglio. P. lacuna non è stato ritrovato. Non è chiaro perché P. lacuna sia stato isolato negli anni successivi e due luoghi diversi ma non trovato in seguito. La sua abbondanza dipende certamente da condizioni imprevedibili. La temperatura, le concentrazioni di sale e i nutrienti inorganici o organici sono altamente variabili nelle piscine rocciose. Pertanto, la composizione della specie potrebbe fluttuare nel tempo in modo imprevedibile.
La trasformazione naturale è stabilita per diversi cianobatteri, per lo più specie unicellulari. Il filamentoso P. lacuna è l'unica specie dell'ordine Oscillatoriales per la quale è stata stabilita la trasformazione naturale. La trasformazione ha avuto quasi sempre successo con il protocollo attuale. In generale, il numero di filamenti resistenti dopo una prova di trasformazione varia considerevolmente e talvolta la trasformazione fallisce, con conseguente perdita di tempo prezioso. Si consiglia quindi di eseguire diversi progetti di trasformazione in parallelo. Il tempo per la completa segregazione, di solito 4 settimane dopo l'isolamento del ceppo resistente, può anche variare. Poiché non vi è alcuna garanzia di completa segregazione dopo la crescita con kanamicina, è fondamentale eseguire i test PCR utilizzando primer esterni e interni.
Ogni vettore deve contenere 2 sequenze omologhe da 500-1.000 bp, ad esempio amplificate dall'ospite mediante PCR e interrotte da una cassetta di resistenza (ad esempio, la cassetta di kanamicina KanR usata qui)37,38. Per l'espressione, un promotore, una sequenza di codifica (ad esempio, per sfGFP39), un terminatore e una cassetta di resistenza devono essere clonati tra le sequenze omologhe. Le strategie di clonazione sono specie-specifiche e dipendono dallo scopo dell'esperimento.
Questo metodo di trasformazione potrebbe essere possibile anche con altri ceppi oscillatoriales o altri cianobatteri: la trasformazione naturale si basa sui pili di tipo IV, che sono presenti in quasi tutti gli altri genomi cianobatterici 3,15,40. Pertanto, il presente metodo potrebbe stimolare nuovi studi con altre specie. Poiché i pili di tipo IV sono anche rilevanti per la motilità, è importante verificare le condizioni in cui i cianobatteri sono mobili.
L'inserimento genico si basa sulla ricombinazione omologa e provoca una rottura dei siti omologhi. Pertanto, la trasformazione viene spesso utilizzata per il knockout genico. L'espressione del gene inserito sarà indotta se un promotore attivo e una sequenza codificante sono integrati nel sito omologo. In P. lacuna, l'attività del promotore dipendeva dalla specie. I promotori cpc560, A2813 e psbA2 di Synechocystis PCC sp 6803 o Synechococcus sp. PCC 7002 31 e il promotore cpcB di P. lacuna potrebbero guidare l'espressione di sfGFP . Di questi costrutti, il promotore endogeno cpcB ha indotto l'espressione più forte, sebbene il gene sfGFP si trovi a 3' del gene ficocianina ß. Ciò indica un uso più generale di promotori endogeni nell'espressione cianobatterica.
La combinazione di knockout genico e studi sul movimento farà luce sui meccanismi molecolari della motilità e della fototassi. Le sorgenti luminose a LED possono fornire luce per esperimenti di fototaxi. Quasi tutte le lunghezze d'onda sono disponibili e l'intensità della luce può essere modulata da un alimentatore e potenziometri regolabili. I supporti LED possono essere costruiti da stampanti 3D per realizzare facilmente combinazioni di diversi LED.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto dal Karlsruher Institute of Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
| Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
| BG-11 Freshwater Solution | Sigma Aldrich | C3061 | |
| BG-11 medium | Merck | 73816-250ML | |
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
| Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
| Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
| Centrifuge LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | and rotor |
| Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | for up to 13,000 rpm |
| Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
| Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 |
|
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Merck | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
| Copper(II) sulphate pentahydrate | Merck | 7758-99-8 | CuSO4 · 5 H2O |
| D(+)-Biotin | Carl Roth | 58-85-5 | C10H16N2O3S |
| DNA ladder 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
| DNA ladder 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
| Electrical pipetting help accujet-pro S | Brand GmbH | 26360 | for pipetting 1-25 mL |
| Ethanol | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
| Fluorescence microscope ApoTome | Zeiss | ||
| Fluorescence microscope Axio Imager 2 | Zeiss | ||
| French Pressure Cell Press | American Instrument Company | N/A | |
| Gel documation System Saffe Image | Invitrogen | ||
| Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu | ADVANCED | ||
| Glassware, different | |||
| Glycerol | Carl Roth | 56-81-5 | C3H8O3 |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Merck | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
| Kanamycin sulphate | Carl Roth | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
| Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) | Sigma Aldrich | 137-16-6 | C15H28NO3 · Na |
| LB Broth (Lennox) | Carl Roth | X964.4 | |
| Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight | OSRAM | cultivation of cyanobacteria | |
| Light source, LED panel XL 6500K 140 W | Bloom Star | N/A | cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Serva | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
| Microscope DM750 | Zeiss | ||
| Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
| Minicomputer Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | for time-lapse recording |
| Ocular camera EC3 | Leica | for continuous recording up to 30 s | |
| Ocular camera MikrOkular Full HD | Bresser | for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer | |
| Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm | Merck | P5606-400EA | |
| Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm | Merck | P5481-500EA | |
| Photometer Nanodrop ND-1000 | Peqlab Biotechnologie | ||
| Photometer Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
| Pipetman 100-1,000 µL | Gilson | SKU: FA10006M | |
| Pipetman 10-100 µL | Gilson | SKU: FA10004M | |
| Plastic pipettes 10 mL, sterile | Greiner | 607107 | |
| Plastic tube, sterile, 15 mL | Greiner | 188271 | |
| Plastic tube, sterile, 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Potassium bromide | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
| Potassium chloride | Carl Roth | 7447-40-7 | KCl |
| Power supply Statron 3252-1 | Statron Gerätetechnik GmbH | ||
| Power supply Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | for LED | |
| Proteinase K | Promega | MC500C | from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470 |
| Q5 polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
| Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph Instruments | for cultivation | |
| Sodium acetate | Carl Roth | 127-09-3 | NaCH3COO |
| Sodium chloride | Carl Roth | 7647-14-5 | NaCl |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
| Sodium fluoride | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
| Sodium hydrogen carbonate | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
| Sodium molybdate dihydrate | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
| Sodium nitrate | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
| Sodium sulphate | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
| Strontium chloride hexahydrate | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
| Thiamine hydrochloride | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
| TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | C4H11NO3 |
| Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 | Hielscher Ultrasound Technology | UP100H | |
| Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | homogenizer | |
| Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
| Vitamin B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin | ||
| Water Stills, Water treatment | VEOLIA water technologies | ELGA_21001 | |
| Zinc sulphate heptahydrate | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
| software, URL | |||
| gatb-minia program for DNA assembly | https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based | |
| ImageJ | software for immage processing (pixel intensities, circle diameter) | ||
| RAST annotation server | https://rast.nmpdr.org | input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions | |
| Culture media | |||
| Artificial seawater | 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF | ||
| f/2 -liquid medium | artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+ liquid medium | f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4 | ||
| f/2-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| Trace element solution | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2 | ||
| Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin |
References
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