Summary
ДНК-занавес, высокопроизводительный метод визуализации одной молекулы, обеспечивает платформу для визуализации различных взаимодействий белка и ДНК в режиме реального времени. В настоящем протоколе используется метод ДНК-занавеса для исследования биологической роли и молекулярного механизма Abo1, бромдомен-содержащей ААА+ АТФазы Schizosaccharomyces pombe .
Abstract
Хроматин представляет собой структуру высшего порядка, которая упаковывает эукариотическую ДНК. Хроматин претерпевает динамические изменения в зависимости от фазы клеточного цикла и в ответ на стимулы окружающей среды. Эти изменения необходимы для целостности генома, эпигенетической регуляции и метаболических реакций ДНК, таких как репликация, транскрипция и репарация. Сборка хроматина имеет решающее значение для динамики хроматина и катализируется шаперонами гистонов. Несмотря на обширные исследования, механизмы, с помощью которых шапероны гистонов обеспечивают сборку хроматина, остаются неуловимыми. Более того, глобальные особенности нуклеосом, организованных шаперонами гистонов, плохо изучены. Для решения этих проблем в данной работе описывается уникальный метод визуализации одной молекулы, называемый ДНК-занавесом, который облегчает исследование молекулярных деталей сборки нуклеосом с помощью гистонов-шаперонов. ДНК-занавес — это гибридный метод, который сочетает в себе липидную текучесть, микрофлюидику и флуоресцентную микроскопию с полным внутренним отражением (TIRFM), чтобы обеспечить универсальную платформу для визуализации различных взаимодействий белка и ДНК в режиме реального времени. С помощью ДНК-занавеса исследована функция гистонов-шаперонов Abo1, бромдомен-содержащая ААА+-АТФазу Schizosaccharomyces pombe , а также выявлен молекулярный механизм, лежащий в основе сборки гистонов Abo1. ДНК-занавес обеспечивает уникальный подход к изучению динамики хроматина.
Introduction
Эукариотическая ДНК упакована в структуру более высокого порядка, известную как хроматин 1,2. Нуклеосома является фундаментальной единицей хроматина, которая состоит примерно из 147.н. ДНК, обернутой вокруг гистонов октамерного ядра 3,4. Хроматин играет важнейшую роль в эукариотических клетках; например, компактная структура защищает ДНК от эндогенных факторов и экзогенных угроз5. Структура хроматина динамически изменяется в зависимости от фазы клеточного цикла и стимулов окружающей среды, и эти изменения контролируют доступ к белкам во время транзакций ДНК, таких как репликация, транскрипцияи репарация. Динамика хроматина также важна для стабильности генома и эпигенетической информации.
Хроматин динамически регулируется различными факторами, включая модификации гистонового хвоста и организаторы хроматина, такие как ремоделировщики хроматина, белки поликомбной группы и шапероны гистонов7. Шапероны гистонов координируют сборку и разборку нуклеосом путем осаждения или отрыва основных гистонов 8,9. Дефекты в шаперонах гистонов индуцируют нестабильность генома и вызывают нарушения развития и рак 9,10. Различные шапероны гистонов не нуждаются в химическом потреблении энергии, таком как гидролиз АТФ, для сборки или разборки нуклеосом 9,11,12,13. Недавно исследователи сообщили, что бромдоменсодержащие ААА+ (АТФаза, связанная с разнообразной клеточной активностью) АТФазы играют роль в динамике хроматина в качестве гистонов-шаперонов 14,15,16,17. Человеческий ATAD2 (АТФазный ААА-содержащий белок 2) способствует доступности хроматина для усиления экспрессии генов18. В качестве транскрипционного корегулятора ATAD2 регулирует хроматин онкогенных транскрипционных факторов14, а гиперэкспрессия ATAD2 связана с плохим прогнозом при многих типах рака19. Yta7, гомолог ATAD2 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), снижает плотность нуклеосом в хроматине15. Напротив, Abo1, гомолог ATAD2 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), увеличивает плотность нуклеосом16. Используя уникальный метод визуализации одной молекулы, ДНК-занавеса, решается, способствует ли Abo1 сборке или разборке нуклеосом17,20.
Традиционно биохимические свойства биомолекул изучались с помощью массовых экспериментов, таких как электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA) или коиммунопреципитация (co-IP), в которых исследуется большое количество молекул и характеризуются их средние свойства21,22. В массовых экспериментах молекулярные субсостояния завуалированы эффектом среднего ансамбля, а зондирование биомолекулярных взаимодействий ограничено. В отличие от этого, одномолекулярные методы обходят ограничения массовых экспериментов и позволяют детально охарактеризовать биомолекулярные взаимодействия. В частности, методы одномолекулярной визуализации широко используются для изучения ДНК-белковых и белок-белковых взаимодействий23. Одним из таких методов является ДНК-занавес, уникальный метод визуализации отдельных молекул, основанный на микрофлюидике и флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRFM)24,25. В занавесе ДНК сотни отдельных молекул ДНК прикреплены к липидному бислою, что обеспечивает двумерное движение молекул ДНК за счет липидной текучести. При применении гидродинамического потока молекулы ДНК движутся вдоль потока на бислое и застревают в диффузионном барьере, где они выравниваются и растягиваются. В то время как ДНК окрашивается интеркалирующими агентами, вводятся флуоресцентно меченные белки, а TIRFM используется для визуализации взаимодействий белок-ДНК в режиме реального времени на уровне одной молекулы23. Платформа ДНК-занавеса облегчает наблюдение за перемещениями белков, такими как диффузия, транслокация и столкновение 26,27,28. Кроме того, ДНК-занавес может быть использован для картирования белков на ДНК с определенными позициями, ориентациями и топологиями или применен для изучения фазового разделения белков и нуклеиновых кислот 29,30,31.
В этой работе метод ДНК-занавеса используется для предоставления доказательств функции шаперонов путем прямой визуализации специфических белков. Более того, поскольку ДНК-занавес является платформой с высокой пропускной способностью, он облегчает сбор данных, достаточный для статистической надежности. В данной статье подробно описано, как проводить анализ ДНК-занавеса для изучения молекулярной роли бромдомен-содержащей S. pombe ААА+ АТФазы Abo1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка проточной ячейки
- Подготовьте очищенное предметное стекло из плавленого кремнезема, содержащее нанотраншейные узоры в соответствии с ранее опубликованным отчетом25.
- Просверлите два отверстия диаметром 1 мм в очищенном затворе из плавленого кремнезема (Рисунок 1A) с помощью сверла с алмазным покрытием (см. Таблицу материалов).
- Нанесите 250 нм толстого алюминия (Al) на предметное стекло с помощью распыления постоянного тока32 (см. таблицу материалов) с 10 мТорр газообразного аргона.
- При 4 000 об/мин наносите слой 4% полиметилметакрилата (ПММА) 950K (см. Таблицу материалов) толщиной 310 нм и выпекайте на горячей плите при температуре 180 °C в течение 3 минут.
- Нарисуйте нанотраншеи на слое ПММА между двумя отверстиями с помощью электронно-лучевой литографии33 с током 0,724 нА при напряжении 80 кВ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Архитектура и размеры нанотраншей показаны на рисунке 1А. - Извлеките ПММА, подвергшуюся воздействию луча, замочив предметные стекла в проявочном растворе (соотношение метилизобутилкетона и изопропанола 1:3, см. таблицу материалов) на 2 мин.
- Травление алюминиевых слоев методом индуктивно-связанного плазменно-реактивного ионного травления (ICP-RIE) с использованием хлора (Cl2) и трихлорида бора (BCl3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти два газа могут удалять алюминий из областей, подверженных воздействию луча. - Вырежьте нанотраншеи на предметных стеклах, используя тетрафторид серы (SF4), тетрафторметан (CF4) и кислород (O2) (см. таблицу материалов).
- Удалите оставшийся алюминиевый слой, замочив слайды в протравителе Al (проявитель AZ 300 MIF, см. Таблицу материалов) на 10 минут.
- После изготовления промыть предметные стекла деионизированной водой и провести ультразвуковую обработку в ацетоне в течение 30 мин с помощью ультразвукатора ванного типа.
- Очищают предметные стекла в 2% растворе Hellmanex III (см. Таблицу материалов) не менее 1 суток при магнитном перемешивании.
- Последовательно обрабатывайте предметные стекла ацетоном в течение 30 мин и 1 М NaOH в течение 30 мин.
- Промойте предметные стекла деионизированной водой и высушите газообразным азотом (N2).
- Положите чистую бумагу (5 мм x 35 мм) на центр двустороннего скотча. Прикрепите ленту к предметному стеклу, чтобы закрыть два отверстия и наноузоры бумагой.
- Удалите бумагу чистым лезвием (Рисунок 1A).
- Наложите стеклянный покровный листок поверх двустороннего скотча и потрите его наконечником пипетки, чтобы образовалась микрофлюидная камера (Рисунок 1A).
- Поместите собранную проточную ячейку между двумя предметными стеклами микроскопа и закрепите их.
- Выпекать в вакуумной печи при температуре 120 °C в течение 45 минут.
- Прикрепите жидкостный соединитель (нанопорт) для анализа на основе чипа (см. Таблицу материалов) к каждому открытому отверстию с помощью пистолета для горячего клея и соедините две линии трубок Luer Lock.
- Подсоедините шприц с замком Люэра, содержащий 3 мл деионизированной воды, и промойте камеру.
- Промойте камеру 3 мл липидного буфера (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 и 100 мМ NaCl) по каплевидному соединению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соединение «капля за каплей» связывает все шприцы с проточной ячейкой, чтобы избежать впрыска пузырьков воздуха в камеру. - Ввести 1 мл 0,04-кратного биотинилированного липида в липидном буфере в камеру в два приема с 5-минутной инкубацией на выстрел.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление 1х биотинилированного липидного запаса описано в ранее опубликованном отчете34. - Промойте камеру 3 мл липидного буфера и инкубируйте в течение 20 минут, чтобы липидный бислой созрел на поверхности предметного стекла.
- Добавьте 1 мл буфера BSA (40 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl, 2 мМMgCl2 и 0,2 мг/мл BSA) и инкубируйте в течение 5 мин для пассивации поверхности предметного стекла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап может уменьшить неспецифическое связывание белков с поверхностью предметного стекла. - Вводят 0,025 мг/мл стрептавидина в 1 мл буфера БСА двумя инъекциями и 10-минутной инкубацией на укол.
- Вымойте остатки стрептавидина 3 мл буфера БСА.
- Введите ~300 пМ (30 мкл) биотинилированной лямбда-фаговой ДНК в 1 мл буфера BSA в камеру с двумя выстрелами и 10-минутной инкубацией на выстрел.
ПРИМЕЧАНИЕ: Получение биотинилированной лямбда-ДНК описано в ранее опубликованном отчете34.
2. Подключение проточной ячейки к микрофлюидной системе и загрузка ее в микроскоп
- Приготовьте буфер для визуализации Abo1 (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 1 мМ АТФ, 2 мМ MgCl2, 1,6% глюкозы и 0,1x гликси, см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Gloxy - это система очистки кислорода, которая уменьшает фотообесцвечивание флуоресцентных красителей. Приготовление 100-кратного гликси-буфета с глюкозооксидазой и каталазой описано в ссылке35. - Подсоедините шприц, содержащий 10 мл буфера для визуализации, к шприцевому насосу и удалите пузырьки во всех трубках микрофлюидной системы.
- Соедините подготовленную проточную ячейку с микрожидкостной системой с помощью соединения «капля-капля», чтобы избежать впрыска пузырьков в проточную ячейку (Рисунок 1B).
- Соберите проточную ячейку и держатели проточной ячейки и установите узел на изготовленный по индивидуальному заказу микроскоп TIRF (рис. 1C).
ВНИМАНИЕ: Когда проточная ячейка помещается под микроскоп, осторожно установите высоту линзы объектива. Проточная ячейка не должна касаться линзы объектива. Это может привести к повреждению объектива. - Капля индекса, соответствующего маслу, в центре проточной ячейки и наденьте на каплю масла изготовленную на заказ призму Голубя (см. Таблицу материалов).
3. Сборка гистонов Abo1 с использованием ДНК-занавеса
- Смешайте 5 нМ Abo1 и 12,5 нМ меченого Cy5 димера гистонов H3-H4 (Cy5-H3-H4) (см. таблицу материалов) в 150 мкл буфера визуализации. Все белки были получены в соответствии с ранее опубликованным отчетом17.
- Выдержите смесь на льду в течение 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать фотообесцвечивания Cy5, инкубацию необходимо проводить в темноте. - Введите ~20 пМ (2 мкл) красителя YOYO-1 в буфер для визуализации через петлю образца объемом 100 мкл для окрашивания молекул лямбда-ДНК.
- Запустите программное обеспечение для визуализации (см. таблицу материалов) и включите лазер с длиной волны 488 нм, чтобы проверить, правильно ли сформированы занавески ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если завесы ДНК сформированы правильно, молекулы ДНК, окрашенные YOYO-1, отображаются в виде выровненных линий на барьере в присутствии потока. Растянутые линии отскакивают и диффундируют от барьера при отключении потока. - Введите 2 мл буфера с высоким содержанием соли (200 мМ NaCl и 40 мМ MgCl2), чтобы удалить краситель YOYO-1 из ДНК.
- После удаления красителя YOYO-1 введите предварительно инкубированный образец белка.
- Когда белки достигнут занавеса ДНК, выключите шприцевой насос, закройте запорный клапан и инкубируйте 15 мин для загрузки гистонов Abo1.
- Вымывают несвязанные белки Abo1 и гистоны в течение 5 мин.
- Включите запорный клапан и возобновите впрыск потока.
- Включите лазер с длиной волны 637 нм и визуализируйте флуоресцентные белки при включенном буферном потоке.
- Временно отключите буферный поток, чтобы проверить, загружены ли белки гистонов в ДНК (рис. 2C).
- Соберите изображения ДНК-занавеса с помощью программы получения изображений (см. Таблицу материалов).
Примечание: Когда буферный поток временно прекращается, ДНК выходит из исчезающего поля полного внутреннего отражения, и флуоресцентно меченные белки, связанные с ДНК, исчезают.
4. Анализ данных
- Преобразуйте изображения, сделанные программой получения изображений, в формат TIFF в виде последовательностей изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные были проанализированы с использованием изображения J (NIH), как описано в ссылке20. - Выберите одну молекулу ДНК из последовательностей изображений и нарисуйте кимограф.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кимограф может показать изменение интенсивности флуоресценции каждого белка гистонов, связанного с одной молекулой ДНК, в зависимости от времени. - Создайте профиль интенсивности флуоресценции с помощью кимографа и подгоните его под несколько гауссовых функций.
- Соберите центральные координаты пиков из профиля интенсивности флуоресценции. На этом этапе можно получить минимальную интенсивность флуоресценции гистонов.
- Разделите все пиковые интенсивности, собранные из профилей, на минимальную интенсивность. На этом этапе оценивается количество димеров H3-H4, связанных с ДНК.
- Выполните шаги 4.2-4.5 для других молекул ДНК.
- Постройте гистограмму для распределения связывания димеров H3-H4 с размером ячейки 1 kbp. Количество анализируемых молекул не менее 300.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В данной работе описана процедура подготовки проточных клеток к анализу ДНК-занавески (рис. 1А). Анализ ДНК-шторы способствовал изучению сборки димера гистонов H3-H4 на ДНК с помощью Abo1. Во-первых, формирование ДНК-занавеса было проверено путем окрашивания молекул ДНК интеркалирующим красителем YOYO-1. Зеленые линии были показаны в параллельных массивах, что указывает на то, что YOYO-1 интеркалируется в молекулы ДНК, которые были хорошо выровнены и растянуты на диффузионном барьере под действием гидродинамического потока (рис. 2A). Чтобы исключить возможность того, что YOYO-1 препятствует взаимодействию ДНК и белков-гистонов, YOYO-1 удаляли из ДНК с помощью буфера с высоким содержанием соли перед добавлением белков-гистонов. Когда димеры Cy5-H3-H4 вводились в занавес ДНК в отсутствие Abo1, Cy5-H3-H4 не связывались с ДНК, что указывает на отсутствие спонтанного связывания димеров H3-H4 с ДНК (рис. 2B). Когда Cy5-H3-H4 вводили Abo1, на молекулах ДНК были замечены красные флуоресцентные пункты, что позволяет предположить, что Abo1 загружает димеры H3-H4 на ДНК (рис. 2C). Буферный поток был временно отключен, чтобы гарантировать, что димеры Cy5-H3-H4 не связываются с поверхностью предметного стекла при связывании с ДНК. Когда поток отключался, флуоресцентно меченные белки, связанные с ДНК, исчезали, потому что молекулы ДНК отскакивали от затухающего поля. Напротив, белки, адсорбированные на поверхности, остались прежними. Флуоресцентные сигналы исчезали в отсутствие потока и появлялись вновь, когда поток возобновлялся, что позволяет предположить, что димеры H3-H4 связываются с ДНК (рис. 2C). Связывание димеров H3-H4 с ДНК также было подтверждено кимографом, в котором сигналы флуоресценции исчезали при отключении потока (рис. 2D). Поскольку Abo1 является ААА+ АТФазой, было изучено влияние гидролиза АТФ на активность загрузки гистонов Abo116. В занавесе ДНК появлялось мало флуоресцентных пунктатов либо в отсутствие нуклеотида (Apo), либо в присутствии АДФ (рис. 2E), что указывает на то, что димеры H3-H4 редко связываются с ДНК либо в состоянии Apo, либо в присутствии АДФ. На рисунке 2F показан количественный анализ рисунков 2B, C и 2E, показывающий, что количество димеров H3-H4, связанных с ДНК, увеличивается в присутствии АТФ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гидролиз АТФ необходим для загрузки H3-H4 на ДНК Abo1 (рис. 2E, F).
Затем было проверено, действительно ли Abo1 предпочтительно загружает гистоны в последовательность Widom 601, которая имеет в десять раз более высокое сродство связывания с гистонами, чем случайные последовательности in vitro, даже несмотря на то, что нуклеосомы не имеют специфичности для последовательности Widom 601 in vivo 36,37,38,39,40. Занавес ДНК был образован лямбда-ДНК, содержащей повторы Widom 601 на одном конце или внутри (рис. 3A,B). Получен ландшафт связывания димеров H3-H4 на каждой конструкции ДНК (рис. 3C,D). Место связывания Cy5-H3-H4 оценивали по центральному положению 2D гауссова аппроксимации для каждого флуоресцентного пунктума17,41. Если нагрузочная активность H3-H4 Abo1 зависит от последовательности ДНК, то распределение связывания будет смещено в сторону последовательности Widom 601. На рисунке 3C,D представлены гистограммы распределения связывания димеров H3-H4 по Abo1 на лямбда-ДНК, содержащей 601 повтор Widom в конце (десять повторов) и внутри (пять повторов) соответственно. Не было выявлено предпочтительного связывания с множественными повторами Widom 601, а распределение связывания было случайным, что позволяет предположить, что Abo1 не имеет никаких предпочтений к последовательности Widom 601, а вместо этого загружает H3-H4 в ДНК независимым от последовательности образом (рис. 3C, D).
Рисунок 1: Подготовка проточной ячейки. (А) Схемы сборки проточных ячеек и системы ДНК-занавесов. Микрофлюидная камера может быть образована между предметным стеклом из плавленого кремнезема и стеклянным покровным стеклом, склеенным двусторонним скотчем. Под действием гидродинамического потока в камере большое количество молекул лямбда-ДНК выстраивается на диффузионном барьере (в данном случае в нанотранше) из-за текучести липидного бислоя и растягивается, как занавес. На увеличенном изображении диффузионного барьера нанотраншея имеет пилообразные узоры с шагом 1,5 мкм, шириной 350 нм и глубиной 1,4 мкм. (B) Фотография микрофлюидной системы, состоящей из шприцевого насоса, запорного клапана и 6-ходового клапана впрыска пробы с петлей для отбора проб. (C) Изображения компонентов держателя предметных стекол (слева), сборки держателей и проточной ячейки (в центре), а также полностью собранной проточной ячейки, установленной на изготовленном по индивидуальному заказу микроскопе TIRF (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация нагрузки гистонов Abo1 с использованием одномолекулярной ДНК-завесы. (A) Изображение занавеса ДНК, где молекулы ДНК, окрашенные YOYO-1 (зеленый), хорошо выровнены на диффузионном барьере. (B) Изображения Cy5-H3-H4 (красные) без Abo1. (C) Изображения Cy5-H3-H4 (красные), загруженные Abo1 в присутствии (вверху) и отсутствии (внизу) буферного потока. (D) Кимограф, извлеченный из одной молекулы ДНК из (C). Когда поток временно отключается, сигналы флуоресценции Cy5 исчезают, указывая на то, что Cy5-H3-H4 связывается с ДНК, но не с поверхностью предметного стекла. (E) Изображение Cy5-H3-H4, загруженного Abo1 без нуклеотида (Apo) (вверху). Изображение Cy5-H3-H4, загруженного Abo1 в присутствии ADP (внизу). (F) Количественное определение Cy5-H3-H4, загруженного Abo1, по нуклеотидам. Столбцы погрешности отображают стандартное отклонение в трех экземплярах. Каждый эксперимент включал в себя анализ 100-200 молекул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Последовательно-независимая нагрузка H3-H4 на Abo1. (А) Один конец лямбда-ДНК прикреплен к биотинилированному липиду с помощью стрептавидина, а другой конец содержит десять повторов последовательности Widom 601 (вверху). Другая лямбда-ДНК содержит пять повторов последовательности Widom 601 внутри лямбда-ДНК (внизу). (Б) Схема анализа ДНК-шторы с лямбда-ДНК, содержащей 601 повторы Видома. (С,Д) Гистограммы распределения связывания Cy5-H3-H4 на лямбда-ДНК, содержащей повторы Widom 601 в конце (C) и внутри (D). Специфичность последовательности ДНК отсутствует, когда H3-H4 собирается Abo1. Полосы ошибок получаются путем начальной загрузки42 с доверительным интервалом 70%. Общее количество событий составляет 312 и 252 для (C) и (D) соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В качестве метода визуализации одной молекулы ДНК-занавес широко используется для исследования метаболических реакций ДНК43. Занавес ДНК представляет собой гибридную систему, объединяющую липидную текучесть, микрофлюидику и TIRFM. В отличие от других одномолекулярных методов, ДНК-занавес обеспечивает высокопроизводительную визуализацию взаимодействий белка и ДНК в режиме реального времени. Таким образом, метод ДНК-занавеса подходит для исследования механизма, лежащего в основе молекулярных взаимодействий, включая последовательно-специфическую ассоциацию, движение белка вместе с ДНК и белок-белковое столкновение на ДНК 17,20,26. Кроме того, высокая пропускная способность ДНК-занавеса позволяет собирать достаточное количество данных для обеспечения статистической надежности. ДНК-занавес облегчает исследование биофизико-химических свойств белков, включая кинетические параметры, коэффициент диффузии, скорость и процессивность 17,26,27,30. Важно отметить, что ДНК-занавес может быть использован для определения связывающего ландшафта осаждения нуклеосом, что указывает на предпочтение нуклеосом30 собственной последовательности.
Для получения высококачественных данных анализа ДНК-шторы необходимо учитывать несколько моментов. Во-первых, липидный бислой должен быть соответствующим образом сформирован на поверхности предметного стекла. Текучесть липидного бислоя позволяет молекулам ДНК перемещаться по предметному стеклу и выравниваться на диффузионном барьере в присутствии гидродинамического потока. Липидный бислой также пассивирует поверхность микрофлюидной камеры, предотвращая неспецифическую адсорбцию белков на поверхности. Поскольку пассивация липидным бислоем не является полной, флуоресцентно меченные белки неспецифично адсорбируются на поверхности, что приводит к неправильной интерпретации результатов. Тем не менее, поверхностно застрявшие белки можно отличить от белков, связанных с ДНК, включив и выключив переходный поток, потому что белки, связанные с ДНК, исчезают, когда поток прекращается. Во-вторых, фотообесцвечивание флуорофоров должно быть подавлено. Во многих методах одномолекулярной флуоресцентной визуализации используется система очистки кислорода для уменьшения фотообесцвечивания. Было разработано несколько систем очистки кислорода, наиболее популярной из которых является глокси. Глокси, состоящий из глюкозооксидазы и каталазы, ферментативно восстанавливает молекулярный кислород в растворе, но снижает рН 44,45,46. Низкий уровень рН несовместим с физиологическими условиями и снижает липидную текучесть. Чтобы отсрочить снижение рН, (1) буфер для визуализации должен быть подготовлен дегазированной деионизированной водой, (2) буфер должен быть немедленно использован, и (3) буфер должен быть запечатан и храниться на льду до использования.
Была разработана уникальная платформа для совершенствования системы ДНК-занавеса, в которой в качестве диффузионных барьеров вместо хромовых наноузоров служат вырезанные нанотраншеи25. Поскольку эти нанотраншеи более надежны в суровых условиях очистки с сильными растворителями, они обеспечивают воспроизводимое и более четкое изображение. Однако метод ДНК-занавеса имеет ряд ограничений. При непрерывном лазерном освещении флуорофоры, которые маркируют белки, обесцвечиваются, что затрудняет длительные измерения. Занавес ДНК не работает при низком рН (ниже ~6), потому что липидный бислой не является жидким. Кроме того, флуоресцентный фон и неспецифическое связывание белков с поверхностью предметного стекла нарушают одномолекулярную визуализацию при высокой концентрации белка. Еще один недостаток ДНК-завесы заключается в том, что пространственное разрешение ДНК-завесы составляет ~1 кбит/пиксель, поэтому движение белков на скорости менее 1 кбит/не может наблюдаться. Кроме того, занавес ДНК непрерывно прикладывает гидродинамическую силу к белкам на ДНК. Но сила, действующая потоком, слаба (менее 1 пН), и, следовательно, гистоны или нуклеосомы не могут перемещаться вдоль ДНК в занавесе. Сообщалось также, что нуклеосомы редко скользят по ДНК без хроматиновых ремоделеров47. Если гистоны или нуклеосомы скользят по ДНК, большинство из них останется в концевой области ДНК в занавесе. Однако смещенного распределения мы не увидели. С другой стороны, если гистоны или нуклеосомы стекают с конца ДНК, они будут истощены на конце ДНК. Мы этого тоже не наблюдали.
Эта работа демонстрирует, что анализ ДНК-занавеса является платформой визуализации одной молекулы, идеально подходящей для исследования динамики хроматина. Занавес ДНК может быть применен для изучения процесса, с помощью которого шапероны гистонов, такие как бромдоменсодержащие ААА+ АТФазы, собирают хроматин. Биологическая функция бромдоменсодержащих ААА+ АТФаз является спорной. Недостаток у человека ATAD2 или S. cerevisiae Yta7 подавляет экспрессию генов посредством конденсации хроматина18. Напротив, S. pombe Abo1 увеличивает плотность нуклеосом16. Исследования на одной молекуле показывают, что Abo1 катализирует нагрузку гистонов H3-H4 на ДНК. Показано, что активность загрузки гистонов Abo1 зависит от гидролиза АТФ (рис. 2C,E,F). Более того, связывающее распределение димеров H3-H4 показывает, что димеры H3-H4 загружаются в ДНК Abo1 независимым от последовательности образом (рис. 3). В заключение, занавес ДНК может быть использован для раскрытия биологической роли Abo1 в качестве гистонного шаперона в сборке гистонов. С помощью метода ДНК-занавеса в будущем будет изучено образование нуклеосом Abo1 и другими шаперонами гистонов, такими как CAF-1 и FACT.
Основываясь на этом протоколе, анализ ДНК-занавеса может быть использован для наблюдения за реорганизацией хроматина путем ремоделирования комплексов, которые транслоцируют и перестраивают нуклеосомы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы высоко оценивают любезную поддержку Abo1 и Cy5-H3-H4 со стороны профессора Джи-Джун Сонга, доктора философии Кэрол Чо и доктора философии Джувона Чана из KAIST, Южная Корея. Работа выполнена при поддержке гранта Национального исследовательского фонда (NRF-2020R1A2B5B01001792), фонда очных исследований (1.210115.01) Ульсанского национального института науки и технологий и Института фундаментальных наук (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P.
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G.
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
