Summary
DNA curtain, una tecnica di imaging ad alto rendimento di una singola molecola, fornisce una piattaforma per la visualizzazione in tempo reale di diverse interazioni proteina-DNA. Il presente protocollo utilizza la tecnica della cortina del DNA per studiare il ruolo biologico e il meccanismo molecolare di Abo1, una ATPasi AAA+ contenente bromodominio pombe di Schizosaccharomyces .
Abstract
La cromatina è una struttura di ordine superiore che impacchetta il DNA eucariotico. La cromatina subisce alterazioni dinamiche in funzione della fase del ciclo cellulare e in risposta a stimoli ambientali. Questi cambiamenti sono essenziali per l'integrità genomica, la regolazione epigenetica e le reazioni metaboliche del DNA come la replicazione, la trascrizione e la riparazione. L'assemblaggio della cromatina è cruciale per la dinamica della cromatina ed è catalizzato dagli chaperoni istonici. Nonostante studi approfonditi, i meccanismi con cui gli chaperoni istonici consentono l'assemblaggio della cromatina rimangono sfuggenti. Inoltre, le caratteristiche globali dei nucleosomi organizzati da chaperoni istonici sono poco comprese. Per affrontare questi problemi, questo lavoro descrive una tecnica unica di imaging a singola molecola chiamata DNA curtain, che facilita lo studio dei dettagli molecolari dell'assemblaggio del nucleosoma da parte degli chaperoni istonici. La tenda del DNA è una tecnica ibrida che combina la fluidità lipidica, la microfluidica e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) per fornire una piattaforma universale per l'imaging in tempo reale di diverse interazioni proteina-DNA. Utilizzando la cortina del DNA, viene studiata la funzione chaperone dell'istone di Abo1, l'ATPasi AAA+ contenente bromodominio di Schizosaccharomyces pombe , e viene rivelato il meccanismo molecolare alla base dell'assemblaggio istonico di Abo1. La tenda del DNA fornisce un approccio unico per lo studio della dinamica della cromatina.
Introduction
Il DNA eucariotico è impacchettato in una struttura di ordine superiore nota come cromatina 1,2. Il nucleosoma è l'unità fondamentale della cromatina, che consiste di circa 147 bp di DNA avvolto attorno agli istoni del nucleo ottamerico 3,4. La cromatina svolge un ruolo fondamentale nelle cellule eucariotiche; ad esempio, la struttura compatta protegge il DNA da fattori endogeni e minacce esogene5. La struttura della cromatina cambia dinamicamente in base alla fase del ciclo cellulare e agli stimoli ambientali, e questi cambiamenti controllano l'accesso alle proteine durante le transazioni del DNA come la replicazione, la trascrizione e la riparazione6. La dinamica della cromatina è importante anche per la stabilità genomica e l'informazione epigenetica.
La cromatina è regolata dinamicamente da vari fattori, tra cui le modificazioni della coda degli istoni e gli organizzatori della cromatina come i rimodellatori della cromatina, le proteine del gruppo polycomb e gli chaperoni istonici7. Gli chaperoni istonici coordinano l'assemblaggio e il disassemblaggio dei nucleosomi tramite deposizione o distacco degli istoni del nucleo 8,9. I difetti negli chaperoni istonici inducono instabilità del genoma e causano disturbi dello sviluppo e cancro 9,10. Vari chaperoni istonici non necessitano di un consumo di energia chimica come l'idrolisi dell'ATP per assemblare o disassemblare i nucleosomi 9,11,12,13. Recentemente, i ricercatori hanno riferito che le ATPasi AAA+ (ATPasi associate a diverse attività cellulari) contenenti bromodominio svolgono un ruolo nella dinamica della cromatina come chaperoniistonici 14,15,16,17. L'ATAD2 umano (proteina 2 contenente il dominio AAA della famiglia ATPasi) promuove l'accessibilità della cromatina per migliorare l'espressione genica18. Come co-regolatore trascrizionale, ATAD2 regola la cromatina dei fattori trascrizionali oncogenici14 e la sovraespressione di ATAD2 è correlata a una prognosi sfavorevole in molti tipi di cancro19. Yta7, l'omologo di Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) di ATAD2, diminuisce la densità nucleosomica nella cromatina15. Al contrario, Abo1, l'omologo di Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) di ATAD2, aumenta la densità del nucleosoma16. Utilizzando una tecnica di imaging unica a singola molecola, la cortina di DNA, se Abo1 contribuisce all'assemblaggio o al disassemblaggio del nucleosoma viene affrontata17,20.
Tradizionalmente, le proprietà biochimiche delle biomolecole sono state esaminate mediante esperimenti di massa come il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) o la co-immunoprecipitazione (co-IP), in cui viene sondato un gran numero di molecole e le loro proprietà medie sono caratterizzate21,22. Negli esperimenti di massa, i sottostati molecolari sono velati dall'effetto della media d'insieme e l'indagine sulle interazioni biomolecolari è limitata. Al contrario, le tecniche a singola molecola aggirano i limiti degli esperimenti di massa e consentono la caratterizzazione dettagliata delle interazioni biomolecolari. In particolare, le tecniche di imaging a singola molecola sono state ampiamente utilizzate per studiare le interazioni DNA-proteina e proteina-proteina23. Una di queste tecniche è la tenda del DNA, una tecnica di imaging unica a singola molecola basata sulla microfluidica e sulla microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM)24,25. In una cortina di DNA, centinaia di singole molecole di DNA sono ancorate al doppio strato lipidico, che consente il movimento bidimensionale delle molecole di DNA grazie alla fluidità lipidica. Quando viene applicato il flusso idrodinamico, le molecole di DNA si muovono lungo il flusso sul doppio strato e rimangono bloccate in corrispondenza di una barriera di diffusione, dove vengono allineate e allungate. Mentre il DNA viene colorato con agenti intercalanti, vengono iniettate proteine marcate in modo fluorescente e TIRFM viene utilizzato per visualizzare le interazioni proteina-DNA in tempo reale a livello di singola molecola23. La piattaforma a cortina di DNA facilita l'osservazione dei movimenti delle proteine come la diffusione, la traslocazione e la collisione 26,27,28. Inoltre, la cortina del DNA può essere utilizzata per la mappatura di proteine su DNA con posizioni, orientamenti e topologie definite o applicata allo studio della separazione di fase di proteine e acidi nucleici 29,30,31.
In questo lavoro, la tecnica del DNA curtain viene utilizzata per fornire prove della funzione degli chaperoni attraverso la visualizzazione diretta di proteine specifiche. Inoltre, poiché DNA curtain è una piattaforma ad alto rendimento, facilita una quantità di raccolta dati sufficiente per l'affidabilità statistica. Qui, viene descritto in dettaglio come condurre il test della tenda del DNA per studiare il ruolo molecolare di S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1.
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Protocol
1. Preparazione della cella di flusso
- Preparare un vetrino di silice fusa pulito contenente modelli di nano-trincee seguendo il rapporto25 pubblicato in precedenza.
- Praticare due fori di 1 mm di diametro in un vetrino di silice fusa pulito (Figura 1A) utilizzando una punta diamantata (vedere la tabella dei materiali).
- Depositare 250 nm di alluminio (Al) di spessore sul vetrino utilizzando DC sputter32 (vedi Tabella dei materiali) con 10 mTorr di gas argon.
- Centrifugare uno strato di 310 nm di poli(metacrilato di metile) (PMMA) al 4% 950K (vedi tabella dei materiali) a 4.000 giri/min per 1 minuto e cuocere su una piastra calda a 180 °C per 3 minuti.
- Disegnare i modelli di nano-trincee sullo strato di PMMA tra i due fori utilizzando la litografia a fascio di elettroni (ebeam)33 con corrente di 0,724 nA a 80 kV.
NOTA: L'architettura e le dimensioni dei modelli di nano-trincee sono mostrate nella Figura 1A. - Rimuovere il PMMA esposto a ebeam immergendo i vetrini nella soluzione di sviluppo (rapporto 1:3 di metilisobutilchetone e isopropanolo, vedere la tabella dei materiali) per 2 minuti.
- Incisione di strati di alluminio con incisione ionica reattiva al plasma accoppiata induttivamente (ICP-RIE) utilizzando gas di cloro (Cl2) e tricloruro di boro (BCl3).
NOTA: Questi due gas possono rimuovere l'Al dalle aree esposte all'ebeam. - Scavare nano-trincee sui vetrini utilizzando gas di tetrafluoruro di zolfo (SF4), tetrafluorometano (CF4) e ossigeno (O2 ) (vedi Tabella dei materiali).
- Rimuovere lo strato di alluminio rimanente immergendo i vetrini in mordenzante di alluminio (sviluppatore AZ 300 MIF, vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti.
- Dopo la fabbricazione, sciacquare i vetrini con acqua deionizzata e sonicare in acetone per 30 minuti utilizzando un sonicatore a bagno.
- Pulire i vetrini in soluzione Hellmanex III al 2% (vedere Tabella dei materiali) per almeno 1 giorno con agitazione magnetica.
- Sonicare i vetrini in acetone per 30 minuti e NaOH 1 M per 30 minuti in successione.
- Sciacquare i vetrini con acqua deionizzata e asciugarli con un gas azoto (N2).
- Metti un foglio di carta pulito (5 mm x 35 mm) al centro del nastro biadesivo. Attacca il nastro adesivo sopra la diapositiva per coprire i due fori e i nano-pattern con la carta.
- Eseguire l'asportazione della carta utilizzando una lama pulita (Figura 1A).
- Mettere un vetrino coprioggetti sopra il nastro biadesivo e strofinare il vetrino coprioggetto utilizzando la punta di una pipetta per formare una camera microfluidica (Figura 1A).
- Posizionare la cella di flusso assemblata tra due vetrini da microscopio e agganciarli.
- Cuocere la cella di flusso in forno sottovuoto a 120 °C per 45 min.
- Collegare il connettore del fluido (Nanoport) per le analisi basate su chip (vedere la tabella dei materiali) a ciascun foro aperto utilizzando una pistola per colla a caldo e collegare le due linee di tubi Luer lock.
- Collegare una siringa Luer lock contenente 3 mL di acqua deionizzata e lavare la camera.
- Lavare la camera con 3 mL di tampone lipidico (20 mM di Tris-HCl, pH 8,0 e 100 mM di NaCl) tramite la connessione goccia a goccia.
NOTA: La connessione drop-by-drop collega tutte le siringhe alla cella di flusso per evitare l'iniezione di bolle d'aria nella camera. - Iniettare 1 mL di lipide biotinilato 0,04x in tampone lipidico nella camera in due colpi con 5 minuti di incubazione per iniezione.
NOTA: La preparazione di 1x stock lipidico biotinilato è descritta in un rapporto precedentemente pubblicato34. - Lavare la camera con 3 mL di tampone lipidico e incubare per 20 minuti affinché il doppio strato lipidico venga fatto maturare sulla superficie del vetrino.
- Aggiungere 1 mL di tampone BSA (40 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM di NaCl, 2 mM di MgCl2 e 0,2 mg/mL di BSA) e incubare per 5 minuti per passivare la superficie del vetrino.
NOTA: Questo passaggio può ridurre il legame aspecifico delle proteine alla superficie del vetrino. - Iniettare 0,025 mg/mL di streptavidina in 1 mL di tampone BSA con due colpi e 10 minuti di incubazione per iniezione.
- Lavare via la streptavidina residua con 3 mL di tampone BSA.
- Iniettare ~300 pM (30 μL) di DNA fagico lambda biotinilato in 1 mL di tampone BSA nella camera con due colpi e 10 minuti di incubazione per iniezione.
NOTA: La preparazione del DNA lambda biotinilato è descritta in un rapporto pubblicato in precedenza34.
2. Collegare la cella di flusso al sistema microfluidico e caricarla sul microscopio
- Preparare il tampone di imaging Abo1 (50 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM di NaCl, 1 mM di DTT, 1 mM di ATP, 2 mM di MgCl2, 1,6% di glucosio e 0,1x di gloxy, vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Gloxy è un sistema di eliminazione dell'ossigeno che riduce il fotosbiancamento dei coloranti fluorescenti. La preparazione di brodo gloxy 100x con glucosio ossidasi e catalasi è descritta nella referenza35. - Collegare una siringa contenente 10 mL di tampone di imaging a una pompa a siringa e rimuovere le bolle in tutte le linee di tubi del sistema microfluidico.
- Accoppiare la cella di flusso preparata con il sistema microfluidico tramite connessione drop-to-drop per evitare l'iniezione di bolle nella cella di flusso (Figura 1B).
- Assemblare la cella a flusso e i supporti della cella a flusso e montare il gruppo su un microscopio TIRF personalizzato (Figura 1C).
ATTENZIONE: Quando la cella di flusso viene posta sotto il microscopio, impostare con cura l'altezza della lente dell'obiettivo. La cella di flusso non deve toccare la lente dell'obiettivo. Ciò può danneggiare l'obiettivo. - Indice di caduta corrispondente all'olio al centro della cella di flusso e posizionare un prisma a colomba su misura (vedere la tabella dei materiali) sulla goccia d'olio.
3. Assemblaggio degli istoni da parte di Abo1 utilizzando la cortina del DNA
- Miscelare 5 nM di Abo1 e 12,5 nM di dimero istonico H3-H4 marcato con Cy5 (Cy5-H3-H4) (vedere la tabella dei materiali) in 150 μL di tampone di imaging. Tutte le proteine sono state preparate seguendo il rapporto17 precedentemente pubblicato.
- Incubare la miscela con ghiaccio per 15 min.
NOTA: Per evitare il fotosbiancamento di Cy5, l'incubazione deve essere effettuata al buio. - Iniettare ~20 pM (2 μL) di colorante YOYO-1 nel tampone di imaging attraverso un loop di campionamento da 100 μL per colorare le molecole di DNA lambda.
- Eseguire il software di imaging (vedere la tabella dei materiali) e accendere il laser a 488 nm per verificare se le cortine di DNA sono ben formate.
NOTA: Se le cortine di DNA sono ben formate, le molecole di DNA, che sono colorate con YOYO-1, sono mostrate come linee allineate a una barriera in presenza di flusso. Le linee tese indietreggiano e si diffondono lontano dalla barriera quando il flusso viene disattivato. - Iniettare 2 mL di tampone ad alto contenuto salino (200 mM di NaCl e 40 mM di MgCl2) per eliminare il colorante YOYO-1 dal DNA.
- Dopo aver rimosso il colorante YOYO-1, iniettare il campione proteico pre-incubato.
- Quando le proteine raggiungono la cortina di DNA, spegnere la pompa della siringa, chiudere la valvola di intercettazione e incubare per 15 minuti per il caricamento degli istoni da parte di Abo1.
- Lavare via l'Abo1 non legato e le proteine istoniche per 5 minuti.
- Aprire la valvola di intercettazione e riprendere l'iniezione del flusso.
- Accendere il laser a 637 nm e visualizzare l'immagine delle proteine fluorescenti mentre il flusso tampone è attivo.
- Disattivare temporaneamente il flusso tampone per verificare se le proteine istoniche sono caricate sul DNA (Figura 2C).
- Raccogliere le immagini della cortina di DNA con un programma di acquisizione di immagini (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Quando il flusso tampone si interrompe transitoriamente, il DNA si ritira dal campo evanescente di riflessione interna totale e le proteine marcate in modo fluorescente legate al DNA scompaiono.
4. Analisi dei dati
- Trasforma le immagini scattate dal programma di acquisizione immagini in formato TIFF come sequenze di immagini.
NOTA: Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando l'immagine J (NIH) come descritto nel riferimento20. - Scegli una singola molecola di DNA dalle sequenze di immagini e disegna un chimografo.
NOTA: Il kymografo può mostrare la variazione dell'intensità di fluorescenza di ciascuna proteina istonica legata a una singola molecola di DNA in funzione del tempo. - Creare il profilo di intensità della fluorescenza dal kymografo e adattarlo a più funzioni gaussiane.
- Raccogliere le coordinate centrali dei picchi dal profilo di intensità della fluorescenza. In questa fase è possibile ottenere l'intensità minima della fluorescenza istonica.
- Dividere tutte le intensità di picco raccolte dai profili per l'intensità minima. Il numero di dimeri H3-H4 legati al DNA è stimato in questa fase.
- Eseguire i passaggi 4.2-4.5 per altre molecole di DNA.
- Creare un istogramma per la distribuzione di associazione dei dimeri H3-H4 con dimensioni del contenitore di 1 kbp. Il numero di molecole analizzate è di almeno 300.
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Representative Results
Questo lavoro descrive la procedura per la preparazione delle cellule a flusso per il test a cortina di DNA (Figura 1A). Il test della tenda del DNA ha facilitato lo studio dell'assemblaggio del dimero dell'istone H3-H4 sul DNA da parte di Abo1. In primo luogo, la formazione della cortina di DNA è stata controllata colorando le molecole di DNA con YOYO-1, un colorante intercalante. Le linee verdi sono state mostrate in array paralleli, indicando che YOYO-1 si è intercalato in molecole di DNA, che erano ben allineate e allungate a una barriera di diffusione sotto flusso idrodinamico (Figura 2A). Per escludere la possibilità che YOYO-1 ostacolasse l'interazione tra DNA e proteine istoniche, YOYO-1 è stato rimosso dal DNA con un tampone ad alto contenuto di sale prima di aggiungere proteine istoniche. Quando i dimeri Cy5-H3-H4 sono stati iniettati nella cortina di DNA in assenza di Abo1, Cy5-H3-H4 non si è legato al DNA, indicando una mancanza di legame spontaneo dei dimeri H3-H4 al DNA (Figura 2B). Quando Cy5-H3-H4 è stato iniettato con Abo1, sono stati osservati punti fluorescenti rossi sulle molecole di DNA, suggerendo che Abo1 carica dimeri H3-H4 sul DNA (Figura 2C). Il flusso tampone è stato temporaneamente disattivato per garantire che i dimeri Cy5-H3-H4 non si legassero alla superficie del vetrino mentre si legavano al DNA. Quando il flusso è stato interrotto, le proteine marcate in fluorescenza legate al DNA sono scomparse perché le molecole di DNA sono uscite dal campo evanescente. Al contrario, le proteine adsorbite sulla superficie sono rimaste le stesse. I segnali fluorescenti sono scomparsi in assenza di flusso e sono riapparsi quando il flusso è stato ripreso, suggerendo che i dimeri H3-H4 si legano al DNA (Figura 2C). Il legame dei dimeri H3-H4 al DNA è stato confermato anche dal kymografo, in cui i segnali di fluorescenza scomparivano ogni volta che il flusso veniva interrotto (Figura 2D). Poiché Abo1 è una ATPasi AAA+, è stato esaminato l'effetto dell'idrolisi dell'ATP sull'attività di carico istonico di Abo116. Pochi punti fluorescenti sono apparsi nella cortina del DNA in assenza di nucleotide (Apo) o in presenza di ADP (Figura 2E), indicando che i dimeri H3-H4 raramente si legano al DNA sia nello stato Apo che in presenza di ADP. La Figura 2F mostra le analisi quantitative delle Figure 2B, C e 2E, mostrando che il numero di dimeri H3-H4 legati al DNA aumenta in presenza di ATP. I risultati suggeriscono che l'idrolisi dell'ATP è essenziale per il caricamento di H3-H4 sul DNA da parte di Abo1 (Figura 2E,F).
Successivamente, è stato testato se Abo1 carica preferenzialmente gli istoni nella sequenza Widom 601, che ha un'affinità di legame dieci volte maggiore con gli istoni rispetto alle sequenze casuali in vitro, anche se i nucleosomi non hanno specificità per la sequenza Widom 601 in vivo 36,37,38,39,40. La cortina di DNA è stata formata con DNA lambda che contiene ripetizioni Widom 601 a un'estremità o internamente (Figura 3A,B). È stato ottenuto il paesaggio di legame dei dimeri H3-H4 su ciascun costrutto di DNA (Figura 3C,D). La posizione di legame di Cy5-H3-H4 è stata stimata dalla posizione centrale del fitting gaussiano 2D per ogni punctum fluorescente17,41. Se l'attività di carico H3-H4 di Abo1 dipende dalla sequenza di DNA, allora la distribuzione di legame sarebbe sbilanciata verso la sequenza Widom 601. La Figura 3C,D mostra gli istogrammi di distribuzione di legame dei dimeri H3-H4 di Abo1 su DNA lambda contenente ripetizioni Widom 601 rispettivamente alla fine (dieci ripetizioni) e internamente (cinque ripetizioni). Non c'è stato alcun legame preferenziale alle ripetizioni multiple di Widom 601 e la distribuzione del legame è stata casuale, suggerendo che Abo1 non ha alcuna preferenza per la sequenza di Widom 601 ma carica invece H3-H4 sul DNA in modo indipendente dalla sequenza (Figura 3C,D).
Figura 1: Preparazione della cella di flusso. (A) Schemi di assemblaggio delle celle a flusso e del sistema a cortina di DNA. La camera microfluidica può essere formata tra un vetrino in silice fusa e un vetrino coprioggetti incollato insieme con nastro biadesivo. Sotto il flusso idrodinamico nella camera, una grande quantità di molecole di DNA lambda sono allineate a una barriera di diffusione (una nano-trincea qui) a causa della fluidità del doppio strato lipidico e tese come una tenda. Nella vista ingrandita della barriera di diffusione, la nano-trincea ha modelli a dente di sega con passo di 1,5 μm, larghezza di 350 nm e profondità di 1,4 μm. (B) Fotografia del sistema microfluidico costituito da una pompa a siringa, una valvola di intercettazione e una valvola di iniezione del campione a 6 vie con un anello del campione. (C) Immagini dei componenti del supporto del vetrino (a sinistra), dell'assemblaggio dei supporti e della cella di flusso (al centro) e della cella di flusso completamente assemblata montata su un microscopio TIRF su misura (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Visualizzazione del carico istonico da parte di Abo1 utilizzando una cortina di DNA a singola molecola. (A) Immagine della cortina di DNA, in cui le molecole di DNA colorate con YOYO-1 (verde) sono ben allineate a una barriera di diffusione. (B) Immagini di Cy5-H3-H4 (rosso) senza Abo1. (C) Immagini di Cy5-H3-H4 (rosso) caricato da Abo1 in presenza (in alto) e in assenza (in basso) di flusso tampone. (D) Kymograph estratto da una singola molecola di DNA da (C). Quando il flusso viene temporaneamente disattivato, i segnali di fluorescenza Cy5 scompaiono, indicando che Cy5-H3-H4 si lega al DNA ma non alla superficie del vetrino. (E) Immagine di Cy5-H3-H4 caricata da Abo1 senza nucleotide (Apo) (in alto). Immagine di Cy5-H3-H4 caricata da Abo1 in presenza di ADP (in basso). (F) Quantificazione di Cy5-H3-H4 caricato da Abo1 in funzione dei nucleotidi. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard in triplice copia. Ogni esperimento prevedeva l'analisi di 100-200 molecole. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caricamento indipendente dalla sequenza di H3-H4 da parte di Abo1. (A) Un'estremità del DNA lambda è ancorata al lipide biotinilato tramite streptavidina e l'altra estremità contiene dieci ripetizioni della sequenza Widom 601 (in alto). L'altro DNA lambda contiene cinque ripetizioni della sequenza Widom 601 all'interno del DNA lambda (in basso). (B) Schema del test a cortina di DNA con DNA lambda contenente ripetizioni Widom 601. (C,D) Istogrammi di distribuzione di legame di Cy5-H3-H4 su DNA lambda contenente ripetizioni Widom 601 alla fine (C) e internamente (D). Non c'è specificità di sequenza per il DNA quando H3-H4 è assemblato da Abo1. Le barre di errore si ottengono eseguendo il bootstrap42 con un intervallo di confidenza del 70%. Gli eventi totali sono 312 e 252 rispettivamente per (C) e (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Come tecnica di imaging a singola molecola, la cortina di DNA è stata ampiamente utilizzata per sondare le reazioni metaboliche del DNA43. La cortina del DNA è un sistema ibrido che concatena fluidità lipidica, microfluidica e TIRFM. A differenza di altre tecniche a singola molecola, la tenda del DNA consente la visualizzazione in tempo reale ad alto rendimento delle interazioni proteina-DNA. Pertanto, la tecnica della cortina del DNA è adatta per sondare il meccanismo alla base delle interazioni molecolari, tra cui l'associazione sequenza-specifica, il movimento delle proteine insieme al DNA e la collisione proteina-proteina sul DNA 17,20,26. Inoltre, la natura ad alto rendimento della cortina di DNA consente la raccolta di dati sufficienti per garantire l'affidabilità statistica. La cortina del DNA facilita lo studio delle proprietà bio-fisico-chimiche delle proteine, compresi i parametri cinetici, il coefficiente di diffusione, la velocità e la processività 17,26,27,30. È importante sottolineare che la cortina del DNA può essere utilizzata per determinare il paesaggio di legame della deposizione dei nucleosomi, che indica la preferenza di sequenza intrinseca dei nucleosomi30.
Diversi punti devono essere considerati per ottenere dati di alta qualità dal test della tenda del DNA. Innanzitutto, il doppio strato lipidico deve essere opportunamente formato sulla superficie del vetrino. La fluidità del doppio strato lipidico permette alle molecole di DNA di muoversi sul vetrino ed essere allineate ad una barriera di diffusione in presenza di flusso idrodinamico. Il doppio strato lipidico passiva anche la superficie della camera microfluidica per prevenire l'adsorbimento aspecifico delle proteine sulla superficie. Poiché la passivazione da parte del doppio strato lipidico non è completa, le proteine marcate con fluorescenza vengono adsorbite in modo non specifico sulla superficie, portando a un'interpretazione errata dei risultati. Tuttavia, le proteine bloccate in superficie possono essere distinte da quelle legate al DNA attivando e disattivando il flusso transitorio perché le proteine legate al DNA scompaiono quando il flusso si interrompe. In secondo luogo, il fotosbiancamento dei fluorofori deve essere soppresso. Molti metodi di imaging a fluorescenza a singola molecola adottano un sistema di eliminazione dell'ossigeno per ridurre il fotosbiancamento. Sono stati sviluppati diversi sistemi di evacuazione dell'ossigeno, il più popolare dei quali è il gloxy. La glossi, costituita da glucosio ossidasi e catalasi, riduce enzimaticamente gli ossigeni molecolari in soluzione ma abbassa il pH 44,45,46. Un pH basso non è compatibile con le condizioni fisiologiche e riduce la fluidità lipidica. Per ritardare la diminuzione del pH, (1) il tampone di imaging deve essere preparato con acqua deionizzata degassata, (2) il tampone deve essere utilizzato immediatamente e (3) il tampone deve essere sigillato e conservato su ghiaccio fino all'uso.
È stata sviluppata una piattaforma unica per migliorare il sistema di cortina di DNA in cui le nano-trincee intagliate fungono da barriere di diffusione al posto dei nano-modelli di cromo25. Poiché queste nano-trincee sono più robuste in condizioni di pulizia difficili con solventi forti, consentono immagini ripetibili e più chiare. Tuttavia, la tecnica della cortina di DNA ha diverse limitazioni. Sotto l'illuminazione laser continua, i fluorofori che marcano le proteine vengono fotosbiancati, rendendo difficili le misurazioni a lungo termine. La cortina di DNA non funziona a pH basso (inferiore a ~6) perché il doppio strato lipidico non è fluidico. Inoltre, il fondo di fluorescenza e il legame non specifico delle proteine alla superficie del vetrino disturbano l'imaging di una singola molecola quando la concentrazione proteica è elevata. Un altro svantaggio della cortina di DNA è che la risoluzione spaziale della cortina di DNA è di ~1 kbp/pixel, quindi il movimento delle proteine a meno di 1 kbp non può essere osservato. Inoltre, la cortina del DNA applica continuamente una forza idrodinamica alle proteine sul DNA. Ma la forza del flusso è debole (meno di 1 pN), e quindi è difficile che gli istoni o i nucleosomi si muovano lungo il DNA nella tenda. È stato anche riportato che i nucleosomi raramente scivolano lungo il DNA senza rimodellatori della cromatina47. Se gli istoni o i nucleosomi scivolano lungo il DNA, la maggior parte di essi rimarrà nella regione finale del DNA nella cortina. Tuttavia, non abbiamo visto la distribuzione distorta. D'altra parte, se gli istoni o i nucleosomi defluiscono dall'estremità del DNA, si esaurirebbero alla fine del DNA. Non abbiamo osservato nemmeno questo.
Questo lavoro dimostra che il test a cortina del DNA è una piattaforma di imaging a singola molecola ideale per studiare la dinamica della cromatina. La cortina del DNA può essere applicata per studiare il processo mediante il quale gli chaperoni istonici come le ATPasi AAA+ contenenti bromodominio assemblano la cromatina. La funzione biologica delle ATPasi AAA+ contenenti bromodominio è controversa. La mancanza di ATAD2 umano o S. cerevisiae Yta7 sottoregola l'espressione genica attraverso la condensazione della cromatina18. Al contrario, S. pombe Abo1 aumenta la densità del nucleosoma16. Gli studi su una singola molecola mostrano che Abo1 catalizza il carico di istoni H3-H4 sul DNA. È dimostrato che l'attività di carico istonico di Abo1 dipende dall'idrolisi dell'ATP (Figura 2C,E,F). Inoltre, la distribuzione di legame dei dimeri H3-H4 mostra che i dimeri H3-H4 sono caricati sul DNA da Abo1 in modo indipendente dalla sequenza (Figura 3). In conclusione, la cortina del DNA può essere utilizzata per svelare il ruolo biologico di Abo1 come chaperone istonico nell'assemblaggio degli istoni. Utilizzando la tecnica della cortina del DNA, in futuro verrà studiata la formazione di nucleosomi da parte di Abo1 e di altri chaperoni istonici come CAF-1 e FACT.
Sulla base di questo protocollo, il test a cortina di DNA può essere utilizzato per osservare la riorganizzazione della cromatina rimodellando i complessi che traslocano e riorganizzano i nucleosomi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori apprezzano il gentile supporto per Abo1 e Cy5-H3-H4 da parte del professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., e Juwon Jang, Ph.D., a KAIST, Corea del Sud. Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione della National Research Foundation (NRF-2020R1A2B5B01001792), dal fondo di ricerca intramurale (1.210115.01) dell'Istituto nazionale di scienza e tecnologia di Ulsan e dall'Istituto per la scienza di base (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
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