Summary
DNAカーテンは、ハイスループットな1分子イメージング技術であり、多様なタンパク質-DNA相互作用をリアルタイムで可視化するためのプラットフォームを提供します。現在のプロトコルはAbo1の Schizosaccharomycesのpombe のbromodomain含んでいるAAA+ ATPaseの生物的役割そして分子メカニズムを調査するのにDNAのカーテンの技術を利用する。
Abstract
クロマチンは、真核生物のDNAをパッケージ化する高次構造です。クロマチンは、細胞周期の段階に応じて、また環境刺激に応答して動的に変化します。これらの変化は、ゲノムの完全性、エピジェネティックな調節、および複製、転写、修復などのDNA代謝反応に不可欠です。クロマチンの集合体はクロマチンの動態に不可欠であり、ヒストンシャペロンによって触媒されます。広範な研究にもかかわらず、ヒストンシャペロンがクロマチンの組み立てを可能にするメカニズムは、とらえどころのないままです。さらに、ヒストンシャペロンによって組織化されたヌクレオソームの全体的な特徴はよくわかっていません。これらの問題に対処するために、本研究では、ヒストンシャペロンによるヌクレオソームアセンブリの分子詳細の調査を容易にするDNAカーテンと呼ばれる独自の単一分子イメージング技術について説明します。DNAカーテンは、脂質流動性、マイクロ流体工学、全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を組み合わせたハイブリッド技術であり、多様なタンパク質-DNA相互作用のリアルタイムイメージングのためのユニバーサルプラットフォームを提供します。DNAカーテンを用いて、Abo1のヒストンシャペロン機能( Schizosaccharomyces pombe bromodomain 含有AAA+ ATPase)を調べ、Abo1のヒストン集合の分子機構を明らかにしました。DNAカーテンは、クロマチン動態を研究するためのユニークなアプローチを提供します。
Introduction
真核生物のDNAは、クロマチン1,2として知られる高次構造にパッケージ化されています。ヌクレオソームはクロマチンの基本単位であり、オクタメリックコアヒストンに巻き付いた約147 bpのDNAから構成されています3,4。クロマチンは真核細胞において重要な役割を果たします。例えば、コンパクトな構造は、内因性因子や外因性の脅威からDNAを保護します5。クロマチンの構造は、細胞周期の段階や環境刺激に応じてダイナミックに変化し、複製、転写、修復などのDNAトランザクションにおけるタンパク質のアクセスを制御しています6。クロマチン動態は、ゲノムの安定性やエピジェネティックな情報にとっても重要です。
クロマチンは、ヒストン尾部修飾やクロマチンリモデラー、ポリコーム群タンパク質、ヒストンシャペロンなどのクロマチンオーガナイザーなど、さまざまな要因によって動的に制御されています7。ヒストンシャペロンは、コアヒストンの堆積または剥離を介してヌクレオソームの組み立てと分解を調整します8,9。ヒストンシャペロンの欠損はゲノムの不安定性を誘発し、発達障害や癌を引き起こします9,10。様々なヒストンシャペロンは、ヌクレオソームを組み立てたり分解したりするためにATP加水分解のような化学的エネルギー消費を必要としません9,11,12,13。最近、研究者らは、ブロモドメインを含むAAA+(多様な細胞活性に関連するATPアーゼ)ATPアーゼが、ヒストンシャペロンとしてクロマチン動態に関与していることを報告しました14,15,16,17。ヒトATAD2(ATPaseファミリーAAAドメイン含有タンパク質2)は、クロマチンのアクセシビリティを促進し、遺伝子発現を増強する18。転写共調節因子として、ATAD2は発がん性転写因子のクロマチンを調節しており14、ATAD2の過剰発現は多くの種類の癌における予後不良と関連している19。ATAD2の出芽酵母(S. cerevisiae)ホモログであるYta7は、クロマチン15のヌクレオソーム密度を低下させる。対照的に、ATAD2の分裂分裂菌(S. pombe)ホモログであるAbo1は、ヌクレオソーム密度を増加させる16。独自の単一分子イメージング技術であるDNAカーテンを用いて、Abo1がヌクレオソームの組み立てまたは分解に寄与するかどうかが取り上げられる17,20。
従来、生体分子の生化学的特性は、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)や共免疫沈降(co-IP)などのバルク実験によって調べられており、多数の分子が調べられ、それらの平均特性が特徴付けられています21,22。バルク実験では、分子のサブステートはアンサンブル平均効果によってベールに包まれ、生体分子相互作用の探索は制限されます。対照的に、単一分子技術はバルク実験の限界を回避し、生体分子相互作用の詳細な特性評価を可能にします。特に、単一分子イメージング技術は、DNA-タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互作用の研究に広く使用されている23。そのような技術の1つが、マイクロ流体工学と全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)に基づく独自の単一分子イメージング技術であるDNAカーテンです24,25。DNAカーテンでは、何百もの個々のDNA分子が脂質二重層に固定されており、脂質の流動性によりDNA分子の2次元運動が可能になります。流体力学的流れが適用されると、DNA分子は二重層上の流れに沿って移動し、拡散障壁に引っかかり、そこで整列して引き伸ばされます。DNAをインターカレート剤で染色しながら、蛍光標識タンパク質を注入し、TIRFMを使用してタンパク質-DNA相互作用を1分子レベルでリアルタイムに可視化します23。DNAカーテンプラットフォームは、拡散、転座、衝突などのタンパク質の動きの観察を容易にします26,27,28。さらに、DNAカーテンは、定義された位置、配向、およびトポロジーを持つDNAのタンパク質マッピングに使用したり、タンパク質と核酸の相分離の研究に適用したりできます29,30,31。
この研究では、DNAカーテン技術を使用して、特定のタンパク質を直接可視化することにより、シャペロンの機能の証拠を提供します。さらに、DNAカーテンはハイスループットプラットフォームであるため、統計的信頼性に十分なデータ収集が容易になります。ここでは、 S. pombe bromodomain含有AAA+ ATPase Abo1の分子的役割を調べるためのDNAカーテンアッセイの実施方法について詳細に説明する。
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Protocol
1. フローセルの作製
- 以前に公開されたレポート25に従って、ナノトレンチパターンを含む洗浄済みの石英ガラススライドを準備します。
- ダイヤモンドコーティングされたドリルビットを使用して、洗浄済みの石英ガラススライド(図1A)に直径1 mmの穴を2つ開けます( 材料表を参照)。
- DCスパッタ32 ( 材料表参照)と10mTorrのアルゴンガスを使用して、250nmの厚いアルミニウム(Al)をスライド上に堆積させます。
- 厚さ310 nmの4%950Kポリメタクリル酸メチル(PMMA)( 材料表参照)を4,000rpmで1分間スピンコートし、180°Cのホットプレートで3分間焼きます。
- 80kVで0.724nAの電流で電子ビーム(ebeam)リソグラフィー33 を使用して、2つの穴の間のPMMA層にナノトレンチパターンを描画します。
注:ナノトレンチパターンのアーキテクチャと寸法を 図1Aに示します。 - スライドを現像液(メチルイソブチルケトンとイソプロパノールの比率が1:3、 材料表を参照)に2分間浸漬して、電子ビーム露光されたPMMAを除去します。
- 塩素(Cl2)および三塩化ホウ素(BCl3)ガスを用いた誘導結合プラズマ反応性イオンエッチング(ICP-RIE)によるエッチングAl層。
注:これら2つのガスは、ビームが露出した領域からAlを除去することができます。 - 四フッ化硫黄(SF4)、テトラフルオロメタン(CF4)、および酸素(O2)ガスを使用して、スライドにナノトレンチを刻みます( 材料表を参照)。
- スライドをAlエッチング液(AZ 300 MIF現像液、 材料表を参照)に10分間浸漬して、残りのAl層を除去します。
- 製造後、スライドを脱イオン水ですすぎ、浴式超音波処理装置を使用してアセトンで30分間超音波処理します。
- スライドを2%Hellmanex III溶液( 材料表参照)で磁気撹拌で少なくとも1日間洗浄します。
- スライドをアセトンで 30 分間、1 M NaOH で 30 分間連続して超音波処理します。
- スライドを脱イオン水ですすぎ、窒素(N2)ガスで乾燥させます。
- 両面テープの中央にきれいな紙(5mm×35mm)を貼ります。スライドの上にテープを貼り、2つの穴とナノパターンを紙で覆います。
- 清潔なブレードを使用して用紙を切除します(図1A)。
- 両面テープの上にガラス製のカバーガラスを置き、ピペットチップでカバーガラスをこすり、マイクロ流体チャンバーを形成します(図1A)。
- 組み立てたフローセルを2枚の顕微鏡スライドの間に置き、クリップで留めます。
- フローセルを120°Cの真空オーブンで45分間焼きます。
- ホットグルーガンを使用して、チップベースの分析用の流体コネクタ(ナノポート)を各開いた穴に取り付け( 材料表を参照)、ルアーロックチューブの2本のラインを接続します。
- 3 mLの脱イオン水を含むルアーロックシリンジを接続し、チャンバーを洗浄します。
- 3 mLの脂質緩衝液(20 mMのTris-HCl、pH 8.0、および100 mMのNaCl)でチャンバーをドロップバイドロップ接続 で 洗浄します。
注意: ドロップバイドロップ接続は、チャンバーに気泡が注入されないように、すべてのシリンジをフローセルにリンクします。 - 脂質バッファー中の 0.04x ビオチン化脂質 1 mL をチャンバーに注入し、1 ショットあたり 5 分間のインキュベーションで 2 ショットで行います。
注:1xビオチン化脂質ストックの調製は、以前に発表されたレポート34に記載されています。 - チャンバーを3 mLの脂質緩衝液で洗浄し、20分間インキュベートして、脂質二重層をスライド表面上で成熟させます。
- 1 mL の BSA バッファー(40 mM の Tris-HCl、pH 8.0、50 mM の NaCl、2 mM の MgCl2、0.2 mg/mL の BSA)を加え、5 分間インキュベートしてスライド表面を不動態化します。
注:このステップにより、スライド表面へのタンパク質の非特異的結合を減らすことができます。 - 0.025 mg/mL のストレプトアビジンを 1 mL の BSA バッファーに 2 回のショットで注入し、1 ショットあたり 10 分間のインキュベーションを行います。
- 残留ストレプトアビジンを3 mLのBSA緩衝液で洗い流します。
- ~300 pM(30 μL)のビオチン化ラムダファージDNAを1 mLのBSAバッファーに2ショット、1ショットあたり10分間のインキュベーションでチャンバーに注入します。
注:ビオチン化ラムダDNAの調製は、以前に発表されたレポート34に記載されています。
2. フローセルをマイクロ流体システムに接続し、顕微鏡にロードする
- Abo1イメージングバッファー(50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM ATP、2 mM MgCl2、1.6%グルコース、0.1xグロキシー、材料 表を参照)を調製します。
注:グロキシーは、蛍光染料の光退色を低減する酸素掃気システムです。グルコースオキシダーゼとカタラーゼによる100倍グロキシストックの調製については、参考文献35に記載されています。 - 10 mLのイメージングバッファーを含むシリンジをシリンジポンプに接続し、マイクロ流体システムのすべてのチューブラインで気泡を除去します。
- 準備したフローセルをドロップtoドロップ接続 で マイクロ流体システムと結合し、フローセルへの気泡注入を回避します(図1B)。
- フローセルとフローセルホルダーを組み立て、カスタムメイドのTIRF顕微鏡に取り付けます(図1C)。
注意: フローセルを顕微鏡下に置くときは、対物レンズの高さを慎重に設定してください。フローセルは対物レンズに触れてはなりません。レンズが破損する恐れがあります。 - フローセルの中央にオイルに一致するインデックスを滴下し、オイルドロップにカスタムメイドのダブプリズム( 材料表を参照)を置きます。
3. DNAカーテンを用いたAbo1によるヒストン集合
- 5 nM の Abo1 と 12.5 nM の Cy5 標識 H3-H4 ヒストン二量体(Cy5-H3-H4)( 資料表参照)を 150 μL のイメージングバッファー中で混合します。すべてのタンパク質は、以前に発表されたレポート17に従って調製されました。
- 混合物を氷上で15分間インキュベートします。
注:Cy5の光退色を避けるために、インキュベーションは暗所で行う必要があります。 - ~20 pM(2 μL)のYOYO-1色素をイメージングバッファーに注入し、100 μLのサンプルループを通してラムダDNA分子を染色します。
- イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を実行し、488 nmレーザーをオンにして、DNAカーテンが整形されているかどうかを確認します。
注:DNAカーテンが整形されている場合、YOYO-1で染色されたDNA分子は、流れの存在下でバリアに整列した線として表示されます。引き伸ばされたラインは、流れがオフになると反動してバリアから拡散します。 - 2 mLの高塩バッファー(200 mMのNaClと40 mMのMgCl2)を注入して、DNAからYOYO-1色素を除去します。
- YOYO-1色素を除去した後、インキュベートしたタンパク質サンプルを注入します。
- タンパク質がDNAカーテンに到達したら、シリンジポンプをオフにし、シャットオフバルブをオフにし、15分間インキュベートしてAbo1によるヒストンローディングを行います。
- 結合していないAbo1タンパク質とヒストンタンパク質を5分間洗い流します。
- シャットオフバルブをオンにして、フローインジェクションを再開します。
- 637 nmレーザーをオンにし、バッファーフローがオンの状態で蛍光タンパク質をイメージングします。
- バッファーフローを一過性にオフにして、ヒストンタンパク質がDNAにロードされているかどうかを確認します(図2C)。
- 画像取得プログラムでDNAカーテン画像を収集します( 材料表を参照)。
注:バッファーフローが一過性に停止すると、DNAは全反射のエバネッセントフィールドから反跳し、DNAに結合した蛍光標識タンパク質は消失します。
4. データ分析
- 画像取得プログラムで撮影した画像を画像シーケンスとしてTIFF形式に変換します。
注:すべてのデータは、参考文献20に記載されているように、Image J(NIH)を使用して分析されました。 - 画像シーケンスから単一のDNA分子を選択し、キモグラフを描きます。
注:キモグラフは、単一のDNA分子に結合した各ヒストンタンパク質の蛍光強度の変化を時間の関数として表示することができます。 - キモグラフから蛍光強度プロファイルを作成し、複数のガウス関数で当てはめます。
- 蛍光強度プロファイルからピークの中心座標を収集します。この工程では、ヒストン蛍光の最小強度を得ることができる。
- プロファイルから収集したすべてのピーク強度を最小強度で割ります。DNAに結合したH3-H4二量体の数は、このステップで推定されます。
- 他のDNA分子について、ステップ4.2〜4.5を実行します。
- ビンサイズが 1 kbp の H3-H4 二量体の結合分布のヒストグラムを作成します。分析された分子の数は少なくとも300です。
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Representative Results
この研究では、DNAカーテンアッセイ用のフローセル調製手順について説明します(図1A)。DNAカーテンアッセイは、Abo1によるDNA上のヒストンH3-H4二量体集合の研究を容易にしました。まず、インターカレート色素であるYOYO-1でDNA分子を染色することにより、DNAカーテンの形成を確認しました。緑色の線が平行に配列され、YOYO-1がDNA分子に挿入され、流体力学的流れ下で拡散障壁でよく整列し、引き伸ばされたことを示しています(図2A)。YOYO-1がDNAとヒストンタンパク質の相互作用を阻害する可能性を排除するために、ヒストンタンパク質を添加する前に、高塩バッファーでDNAからYOYO-1を除去しました。Abo1の非存在下でCy5-H3-H4二量体をDNAカーテンに注入すると、Cy5-H3-H4はDNAに結合せず、H3-H4二量体がDNAに自発的に結合していないことが示されました(図2B)。Cy5-H3-H4にAbo1を注入すると、DNA分子に赤色蛍光の点状が見られ、Abo1がH3-H4二量体をDNAにロードしていることが示唆されました(図2C)。バッファーフローを一過性にオフにして、Cy5-H3-H4二量体がDNAに結合する際にスライド表面に結合しないようにしました。フローを止めると、DNA分子がエバネッセントフィールドから反跳するため、DNAに結合した蛍光標識タンパク質は消失しました。対照的に、表面に吸着されたタンパク質は同じままでした。蛍光シグナルはフローの非存在下では消失し、フローが再開されると再び出現し、H3-H4二量体がDNAに結合することを示唆しています(図2C)。H3-H4二量体のDNAへの結合は、フローをオフにすると蛍光シグナルが消失するキモグラフによっても確認されました(図2D)。Abo1はAAA+ ATPアーゼであるため、ATP加水分解がAbo1のヒストンローディング活性に及ぼす影響を調べた16。ヌクレオチド(Apo)の非存在下またはADPの存在下では、DNAカーテンに蛍光点がほとんど現れず(図2E)、H3-H4二量体はApo状態でもADPの存在下でもDNAに結合することはめったにないことを示しています。図2Fは、図2B、C、および図2Eの定量分析を示しており、ATPの存在下でDNAに結合したH3-H4二量体の数が増加することを示しています。この結果は、ATPの加水分解が、Abo1によるH3-H4のDNAへのロードに必須であることを示唆しています(図2E、F)。
次に、ヌクレオソームはin vivoでWidom 601配列に特異性がないにもかかわらず、in vitroでランダム配列よりも10倍高いヒストン結合親和性を持つWidom 601配列にAbo1がヒストンを優先的にロードするかどうかを調べました36,37,38,39,40。DNAカーテンは、一端または内部にWidom 601リピートを含むラムダDNAで形成されました(図3A、B)。各DNAコンストラクト上のH3-H4二量体の結合ランドスケープが得られました(図3C、D)。Cy5-H3-H4の結合位置は、各蛍光点状17,41に対する2次元ガウシアンフィッティングの中心位置から推定した。Abo1のH3-H4ローディング活性がDNA配列に依存する場合、結合分布はWidom 601配列に偏ります。図3C、Dは、末端(10リピート)と内部(5リピート)にそれぞれWidom 601リピートを含むラムダDNA上のAbo1によるH3-H4二量体の結合分布ヒストグラムを示しています。複数のWidom 601リピート配列に優先的結合はなく、結合分布はランダムであったことから、Abo1はWidom 601配列を選好せず、代わりに配列に依存しない方法でH3-H4をDNAにロードしていることが示唆されました(図3C、D)。
図1:フローセルの作製。 (A)フローセルアセンブリとDNAカーテンシステムの概略図。マイクロ流体チャンバーは、石英ガラス製スライドとガラスカバーガラスの間に両面テープで貼り付けることができます。チャンバー内の流体力学的流れ下では、脂質二重層の流動性により、大量のラムダDNA分子が拡散バリア(ここではナノトレンチ)に整列し、カーテンのように引き伸ばされます。拡散バリアの拡大図では、ナノトレンチには1.5μmピッチ、幅350nm、深さ1.4μmの鋸歯状パターンがあります。(B)シリンジポンプ、シャットオフバルブ、サンプルループ付き6方向サンプル注入バルブからなるマイクロ流体システムの写真。(C)スライドホルダーの部品(左)、ホルダーとフローセルの組み立て(中央)、カスタムメイドのTIRF顕微鏡に取り付けられた完全に組み立てられたフローセル(右)の写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:1分子DNAカーテンを用いたAbo1によるヒストンローディングの可視化。 (A)YOYO-1(緑色)で染色したDNA分子が拡散バリアで整列したDNAカーテンの画像。(B) Abo1を含まないCy5-H3-H4(赤)の画像。(C)Abo1が負荷したCy5-H3-H4(赤)の画像(上)とバッファフローの有無(下)。(D)(C)から単一のDNA分子から抽出したキモグラフ。フローが一過性にオフになると、Cy5の蛍光シグナルは消失し、Cy5-H3-H4はDNAには結合するがスライド表面には結合しないことを示しています。(E)ヌクレオチド(Apo)を含まないAbo1がロードしたCy5-H3-H4の画像(上)。ADP存在下でAbo1が負荷したCy5-H3-H4の画像(下)。(F)Abo1が担持したCy5-H3-H4のヌクレオチドによる定量。エラーバーは、標準偏差を 3 つで表します。各実験には、100〜200個の分子の分析が含まれていました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:Abo1によるH3-H4の配列非依存負荷。 (A)ラムダDNAの一方の末端はストレプトアビジン を介して ビオチン化脂質に固定されており、もう一方の末端にはWidom 601配列の10リピートが含まれています(上)。もう1つのラムダDNAには、ラムダDNA内にWidom 601配列のリピート配列が5つ含まれています(下)。(B)Widom 601リピートを含むラムダDNAを用いたDNAカーテンアッセイの概略図。(C、D)Widom 601を含むラムダDNA上のCy5-H3-H4の結合分布ヒストグラムは、末端(C)と内部(D)で繰り返されます。H3-H4がAbo1によって組み立てられた場合、DNAの配列特異性はありません。エラーバーは、70%信頼区間で42 をブートストラップすることによって得られます。合計イベント数は、(C)と(D)でそれぞれ312と252です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
単一分子イメージング技術として、DNAカーテンはDNA代謝反応を調べるために広く使用されている43。DNAカーテンは、脂質流動性、マイクロ流体工学、TIRFMを連結したハイブリッドシステムです。他の単一分子技術とは異なり、DNAカーテンはタンパク質-DNA相互作用のハイスループットなリアルタイム可視化を可能にします。したがって、DNAカーテン法は、配列特異的な会合、DNAに沿ったタンパク質の移動、DNA上でのタンパク質間衝突など、分子相互作用の背後にあるメカニズムを調べるのに適しています17,20,26。さらに、DNAカーテンのハイスループットな性質により、統計的信頼性を確保するのに十分なデータを収集できます。DNAカーテンは、速度論的パラメータ、拡散係数、速度、処理能力など、タンパク質の生物物理化学的特性の調査を容易にします17,26,27,30。重要なことに、DNAカーテンは、ヌクレオソームの本質的な配列選好性を示すヌクレオソーム沈着の結合ランドスケープを決定するために使用され得る30。
DNAカーテンアッセイから高品質のデータを得るには、いくつかの点を考慮する必要があります。まず、脂質二重層をスライド面に適切に形成する必要がある。脂質二重層の流動性により、DNA分子はスライド上を移動し、流体力学的流れの存在下で拡散バリアに整列します。また、脂質二重層はマイクロ流体チャンバーの表面を不動態化し、表面へのタンパク質の非特異的吸着を防ぎます。脂質二重層による不動態化は完全ではないため、蛍光標識されたタンパク質は表面に非特異的に吸着され、結果の誤った解釈につながります。しかし、表面に詰まったタンパク質は、流れが止まるとDNAに結合したタンパク質が消えるため、一過性の流れをオン/オフすることでDNAに結合したタンパク質と区別することができます。第二に、蛍光色素の光退色を抑制する必要があります。多くの1分子蛍光イメージング法は、光退色を低減するために酸素掃気システムを採用しています。いくつかの酸素消去システムが開発されていますが、その中でも最も人気があるのはグロキシーです。グルコースオキシダーゼとカタラーゼからなるグロキシは、溶液中の分子状酸素を酵素的に還元しますが、pH 44,45,46を低下させます。低pHは生理学的条件と相容れず、脂質の流動性を低下させます。pHの低下を遅らせるには、(1)イメージングバッファーを脱気した脱イオン水で調製し、(2)バッファーをすぐに使用し、(3)バッファーを密封して使用するまで氷上に保管する必要があります。
DNAカーテンシステムを改善するために、クロムナノパターンの代わりに彫刻されたナノトレンチが拡散バリアとして機能する独自のプラットフォームが開発された25。これらのナノトレンチは、強力な溶媒による過酷な洗浄条件下でより堅牢であるため、再現性のある、より鮮明なイメージングを可能にします。しかし、DNAカーテン法にはいくつかの限界があります。連続レーザー照射下では、タンパク質を標識する蛍光色素が光退色するため、長時間の測定が困難になります。DNAカーテンは、脂質二重層が流動性ではないため、低pH(~6未満)では機能しません。さらに、蛍光バックグラウンドとスライド表面へのタンパク質の非特異的結合は、タンパク質濃度が高い場合、1分子イメージングを妨げます。DNAカーテンのもう一つの欠点は、DNAカーテンの空間分解能が~1 kbp/ピクセルであるため、1 kbp未満のタンパク質の動きを観察できないことです。さらに、DNAカーテンは、DNA上のタンパク質に流体力学的な力を連続的に加えます。しかし、流れによる力は弱い(1 pN未満)ため、ヒストンやヌクレオソームがカーテン内のDNAに沿って移動することは困難です。また、ヌクレオソームがクロマチンリモデラーなしでDNA上をスライドすることはめったにないことも報告されている47。ヒストンやヌクレオソームがDNAに沿ってスライドすると、そのほとんどがカーテンの中のDNAの末端領域にとどまります。しかし、偏った分布は見られませんでした。一方、ヒストンやヌクレオソームがDNA末端から流出すると、DNA末端で枯渇してしまいます。これも観察されませんでした。
この研究は、DNAカーテンアッセイがクロマチン動態の調査に理想的な1分子イメージングプラットフォームであることを実証しています。DNAカーテンは、ブロモドメイン含有AAA+ ATPaseなどのヒストンシャペロンがクロマチンを組み立てるプロセスを研究するために適用できます。ブロモドメイン含有AAA+ ATPaseの生物学的機能については議論の余地があります。ヒトATAD2または 出芽酵母 Yta7の欠乏は、クロマチン凝縮 を介して 遺伝子発現をダウンレギュレートする18。対照的に、 S. pombe Abo1はヌクレオソーム密度を増加させる16。単一分子の研究は、Abo1がDNAへのヒストンH3-H4ロードを触媒することを示しています。Abo1のヒストンローディング活性はATP加水分解に依存することが示されています(図2C、E、F)。さらに、H3-H4二量体の結合分布は、H3-H4二量体が配列非依存的にAbo1によってDNAにロードされていることを示しています(図3)。結論として、DNAカーテンは、ヒストン集合におけるヒストンシャペロンとしてのAbo1の生物学的役割を解明するために使用できます。今後は、DNAカーテン法を用いて、Abo1やCAF-1、FACTなどのヒストンシャペロンによるヌクレオソーム形成の研究が進められています。
このプロトコルに基づいて、DNAカーテンアッセイを使用して、ヌクレオソームを転位および再配置する複合体をリモデリングすることにより、クロマチンの再構成を観察できます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
著者らは、韓国のKAISTのJi-Joon Song教授、Carol Cho博士、Juwon Jang博士によるAbo1およびCy5-H3-H4への親切な支援に感謝します。この研究は、国立研究財団助成金(NRF-2020R1A2B5B01001792)、蔚山科学技術研究所の学内研究費(1.210115.01)、基礎科学研究所(IBS-R022-D1)の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
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