Summary
DNA-Vorhang, ein Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, bietet eine Plattform für die Echtzeit-Visualisierung verschiedener Protein-DNA-Interaktionen. Das vorliegende Protokoll verwendet die DNA-Vorhangtechnik, um die biologische Rolle und den molekularen Mechanismus von Abo1 zu untersuchen, einer Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase.
Abstract
Chromatin ist eine Struktur höherer Ordnung, die eukaryotische DNA verpackt. Das Chromatin unterliegt dynamischen Veränderungen in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase und als Reaktion auf Umweltreize. Diese Veränderungen sind essentiell für die genomische Integrität, die epigenetische Regulation und DNA-Stoffwechselreaktionen wie Replikation, Transkription und Reparatur. Die Chromatin-Assemblierung ist entscheidend für die Chromatindynamik und wird durch Histon-Chaperone katalysiert. Trotz umfangreicher Studien sind die Mechanismen, mit denen Histon-Chaperone die Chromatin-Assemblierung ermöglichen, nach wie vor schwer fassbar. Darüber hinaus sind die globalen Eigenschaften von Nukleosomen, die durch Histon-Chaperone organisiert werden, nur unzureichend verstanden. Um diese Probleme anzugehen, beschreibt diese Arbeit eine einzigartige Einzelmolekül-Bildgebungstechnik namens DNA-Vorhang, die die Untersuchung der molekularen Details der Nukleosomenassemblierung durch Histon-Chaperone erleichtert. Der DNA-Vorhang ist eine Hybridtechnik, die Lipidfluidität, Mikrofluidik und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) kombiniert, um eine universelle Plattform für die Echtzeit-Bildgebung verschiedener Protein-DNA-Wechselwirkungen bereitzustellen. Mit Hilfe des DNA-Vorhangs wird die Histon-Chaperon-Funktion von Abo1, der Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase, untersucht und der molekulare Mechanismus, der der Histonassemblierung von Abo1 zugrunde liegt, aufgedeckt. Der DNA-Vorhang bietet einen einzigartigen Ansatz zur Untersuchung der Chromatindynamik.
Introduction
Eukaryotische DNA ist in eine Struktur höherer Ordnung verpackt, die als Chromatin 1,2 bekannt ist. Das Nukleosom ist die grundlegende Einheit des Chromatins, das aus etwa 147 bp DNA besteht, die um die oktameren Kernhistone 3,4 gewickelt ist. Chromatin spielt eine entscheidende Rolle in eukaryotischen Zellen; So schützt die kompakte Struktur die DNA vor endogenen Faktoren und exogenen Bedrohungen5. Die Chromatinstruktur ändert sich dynamisch in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase und Umweltreizen, und diese Veränderungen steuern den Proteinzugang während DNA-Transaktionen wie Replikation, Transkription und Reparatur6. Die Chromatindynamik ist auch wichtig für die genomische Stabilität und die epigenetische Information.
Chromatin wird dynamisch durch verschiedene Faktoren reguliert, darunter Histonschwanzmodifikationen und Chromatinorganisatoren wie Chromatin-Remodeler, Polycomb-Gruppenproteine und Histon-Chaperone7. Histon-Chaperone koordinieren den Auf- und Abbau von Nukleosomen durch Abscheidung oder Ablösung von Kernhistonen 8,9. Defekte in Histon-Chaperonen induzieren Genominstabilität und verursachen Entwicklungsstörungen und Krebs 9,10. Verschiedene Histon-Chaperone benötigen keinen chemischen Energieverbrauch wie ATP-Hydrolyse, um Nukleosomen 9,11,12,13 zu montieren oder zu zerlegen. Kürzlich berichteten Forscher, dass Bromodomänen-haltige AAA+-ATPasen (ATPase, die mit verschiedenen zellulären Aktivitäten assoziiert sind) eine Rolle bei der Chromatindynamik als Histon-Chaperone spielen 14,15,16,17. Humanes ATAD2 (ATPase-Familie AAA-Domänen-enthaltendes Protein 2) fördert die Zugänglichkeit von Chromatinen, um die Genexpression zu verbessern18. Als transkriptioneller Co-Regulator reguliert ATAD2 das Chromatin onkogener Transkriptionsfaktoren14, und die Überexpression von ATAD2 ist bei vielen Krebsarten mit einer schlechten Prognose verbunden19. Yta7, das Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)-Homolog von ATAD2, verringert die Nukleosomendichte in Chromatin15. Im Gegensatz dazu erhöht Abo1, das Homolog von ATAD2 von Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), die Nukleosomendichte16. Mit Hilfe einer einzigartigen Einzelmolekül-Bildgebungstechnik, dem DNA-Vorhang, wird untersucht, ob Abo1 zum Auf- oder Abbau von Nukleosomen beiträgt17,20.
Traditionell wurden die biochemischen Eigenschaften von Biomolekülen durch Massenexperimente wie den elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) oder die Co-Immunpräzipitation (co-IP) untersucht, bei denen eine große Anzahl von Molekülen untersucht und ihre durchschnittlichen Eigenschaften charakterisiert werden21,22. In Massenexperimenten werden molekulare Unterzustände durch den Ensemble-Mittelwert-Effekt verschleiert, und die Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen ist eingeschränkt. Im Gegensatz dazu umgehen Einzelmolekültechniken die Einschränkungen von Massenexperimenten und ermöglichen die detaillierte Charakterisierung biomolekularer Wechselwirkungen. Insbesondere Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren werden häufig zur Untersuchung von DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt23. Eine dieser Techniken ist der DNA-Vorhang, ein einzigartiges Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, das auf Mikrofluidik und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) basiert24,25. In einem DNA-Vorhang sind Hunderte von einzelnen DNA-Molekülen an der Lipiddoppelschicht verankert, die aufgrund der Lipidfluidität die zweidimensionale Bewegung von DNA-Molekülen ermöglicht. Wenn eine hydrodynamische Strömung angewendet wird, bewegen sich DNA-Moleküle entlang der Strömung auf der Doppelschicht und bleiben an einer Diffusionsbarriere hängen, wo sie ausgerichtet und gestreckt werden. Während die DNA mit Interkalationsmitteln gefärbt wird, werden fluoreszenzmarkierte Proteine injiziert, und TIRFM wird verwendet, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in Echtzeit auf Einzelmolekülebene zu visualisieren23. Die DNA-Vorhangplattform erleichtert die Beobachtung von Proteinbewegungen wie Diffusion, Translokation und Kollision 26,27,28. Darüber hinaus kann der DNA-Vorhang für die Proteinkartierung auf DNA mit definierten Positionen, Orientierungen und Topologien oder für die Untersuchung der Phasentrennung von Proteinen und Nukleinsäuren verwendet werden 29,30,31.
In dieser Arbeit wird die DNA-Vorhang-Technik verwendet, um den Nachweis für die Funktion von Chaperonen durch direkte Visualisierung spezifischer Proteine zu erbringen. Da es sich bei DNA-Vorhang um eine Hochdurchsatzplattform handelt, ermöglicht es außerdem einen Umfang der Datenerfassung, der für die statistische Zuverlässigkeit ausreicht. Hier wird beschrieben, wie der DNA-Vorhang-Assay im Detail durchgeführt wird, um die molekulare Rolle der S. pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase Abo1 zu untersuchen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Durchflusszelle
- Bereiten Sie einen gereinigten Objektträger mit Quarzglas vor, der Nano-Trench-Muster gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht25 enthält.
- Bohren Sie zwei Löcher mit 1 mm Durchmesser in einen gereinigten Quarzglas-Objektträger (Abbildung 1A) mit einem diamantbeschichteten Bohrer (siehe Materialtabelle).
- 250 nm dickes Aluminium (Al) mit DC-Sputter32 (siehe Materialtabelle) mit 10 mTorr Argongas auf den Objektträger auftragen.
- Eine 310 nm dicke Schicht aus 4% 950K Poly(methylmethacrylat) (PMMA) (siehe Materialtabelle) bei 4.000 U/min 1 min schleudern und auf einer heißen Platte bei 180 °C 3 min backen.
- Zeichnen Sie die Nano-Trench-Muster auf der PMMA-Schicht zwischen den beiden Löchern mit Hilfe der Elektronenstrahllithographie (ebeam)33 mit 0,724 nA Strom bei 80 kV.
HINWEIS: Die Architektur und die Abmessungen der Nano-Trench-Muster sind in Abbildung 1A dargestellt. - Entfernen Sie das ebeam-exponierte PMMA, indem Sie die Objektträger 2 Minuten lang in der Entwicklungslösung (1:3-Verhältnis von Methylisobutylketon und Isopropanol, siehe Materialtabelle) einweichen.
- Ätzen von Al-Schichten mit induktiv gekoppeltem plasmareaktivem Ionenätzen (ICP-RIE) unter Verwendung von Chlor (Cl2) und Bortrichlorid (BCl 3) Gasen.
HINWEIS: Diese beiden Gase können das Al aus ebeam-exponierten Bereichen entfernen. - Schnitzen Sie Nanogräben in die Objektträger mit Schwefeltetrafluorid (SF4), Tetrafluormethan (CF4) und Sauerstoff (O2) Gasen (siehe Materialtabelle).
- Entfernen Sie die restliche Al-Schicht, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in Ätzmittel (AZ 300 MIF-Entwickler, siehe Materialtabelle) einweichen.
- Spülen Sie die Objektträger nach der Herstellung mit deionisiertem Wasser ab und beschallen Sie sie 30 Minuten lang mit einem badartigen Ultraschallgerät.
- Reinigen Sie die Objektträger mindestens 1 Tag lang unter magnetischem Rühren in 2%iger Hellmanex III-Lösung (siehe Materialtabelle).
- Beschallen Sie die Objektträger nacheinander 30 min in Aceton und 30 min 1 M NaOH.
- Spülen Sie die Objektträger mit deionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie mit einem Stickstoffgas (N2).
- Lege ein sauberes Papier (5 mm x 35 mm) auf die Mitte des doppelseitigen Klebebandes. Befestigen Sie das Klebeband über dem Objektträger, um die beiden Löcher und die Nanomuster mit dem Papier zu bedecken.
- Schneiden Sie das Papier mit einer sauberen Klinge aus (Abbildung 1A).
- Legen Sie ein Deckglas auf das doppelseitige Klebeband und reiben Sie das Deckglas mit einer Pipettenspitze ab, um eine mikrofluidische Kammer zu bilden (Abbildung 1A).
- Platzieren Sie die zusammengebaute Durchflusszelle zwischen zwei Objektträgern und clipsen Sie sie.
- Die Durchflusszelle in einem 120 °C Vakuumofen 45 min backen.
- Befestigen Sie den Flüssigkeitsanschluss (Nanoport) für die chipbasierten Analysen (siehe Materialtabelle) mit einer Heißklebepistole an jedem offenen Loch und verbinden Sie die beiden Leinen des Luer-Lock-Schlauchs.
- Schließen Sie eine Luer-Lock-Spritze mit 3 ml deionisiertem Wasser an und waschen Sie die Kammer.
- Waschen Sie die Kammer mit 3 ml Lipidpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 100 mM NaCl) über die Tropfen-für-Tropfen-Verbindung.
HINWEIS: Die Tropfen-für-Tropfen-Verbindung verbindet alle Spritzen mit der Durchflusszelle, um zu vermeiden, dass Luftblasen in die Kammer injiziert werden. - Injizieren Sie 1 ml 0,04x biotinyliertes Lipid in Lipidpuffer in zwei Schüssen mit 5 Minuten Inkubation pro Schuss in die Kammer.
ANMERKUNG: Die Herstellung von 1x biotinyliertem Lipidstock wird in einem zuvor veröffentlichten Bericht34 beschrieben. - Waschen Sie die Kammer mit 3 ml Lipidpuffer und inkubieren Sie 20 Minuten lang, damit die Lipiddoppelschicht auf der Objektträgeroberfläche reifen kann.
- Fügen Sie 1 ml BSA-Puffer hinzu (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2 und 0,2 mg/ml BSA) und inkubieren Sie 5 Minutenlang, um die Objektträgeroberfläche zu passivieren.
HINWEIS: Dieser Schritt kann die unspezifische Bindung von Proteinen an die Objektträgeroberfläche reduzieren. - Injizieren Sie 0,025 mg/ml Streptavidin in 1 ml BSA-Puffer mit zwei Schüssen und 10 Minuten Inkubation pro Schuss.
- Waschen Sie das restliche Streptavidin mit 3 ml BSA-Puffer aus.
- Injizieren Sie ~300 pM (30 μl) biotinylierte Lambda-Phagen-DNA in 1 ml BSA-Puffer mit zwei Schüssen und 10 Minuten Inkubation pro Schuss in die Kammer.
ANMERKUNG: Die Herstellung von biotinylierter Lambda-DNA wird in einem zuvor veröffentlichten Bericht34 beschrieben.
2. Durchflusszelle an das mikrofluidische System anschließen und auf das Mikroskop laden
- Bereiten Sie den Abo1-Bildgebungspuffer vor (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1,6 % Glukose und 0,1x Gloxy, siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Gloxy ist ein Sauerstofffängersystem, das das Photobleichen von Fluoreszenzfarbstoffen reduziert. Die Herstellung von 100x Gloxy-Stamm mit Glucoseoxidase und Katalase ist in Referenz35 beschrieben. - Schließen Sie eine Spritze mit 10 ml Bildgebungspuffer an eine Spritzenpumpe an und entfernen Sie Blasen in allen Schlauchleitungen im mikrofluidischen System.
- Koppeln Sie die vorbereitete Durchflusszelle über eine Tropfen-zu-Tropfen-Verbindung mit dem Mikrofluidiksystem, um eine Blaseninjektion in die Durchflusszelle zu vermeiden (Abbildung 1B).
- Montieren Sie die Durchflusszelle und die Durchflusszellenhalter und montieren Sie die Baugruppe auf einem speziell angefertigten TIRF-Mikroskop (Abbildung 1C).
VORSICHT: Wenn die Durchflusszelle unter das Mikroskop gehalten wird, stellen Sie die Höhe der Objektivlinse sorgfältig ein. Die Durchflusszelle darf die Objektivlinse nicht berühren. Dadurch kann das Objektiv beschädigt werden. - Tropfen Sie das zum Index passende Öl auf die Mitte der Durchflusszelle und setzen Sie ein speziell angefertigtes Taubenprisma (siehe Materialtabelle) auf den Öltropfen.
3. Histon-Assemblierung durch Abo1 unter Verwendung des DNA-Vorhangs
- Mischen Sie 5 nM Abo1 und 12,5 nM Cy5-markiertes H3-H4-Histon-Dimer (Cy5-H3-H4) (siehe Materialtabelle) in 150 μl Bildgebungspuffer. Alle Proteine wurden in Anlehnung an den zuvor veröffentlichten Bericht17 hergestellt.
- Die Mischung 15 Minuten auf Eis inkubieren.
HINWEIS: Um ein Photobleichen von Cy5 zu vermeiden, muss die Inkubation im Dunkeln erfolgen. - Injizieren Sie ~20 pM (2 μl) des YOYO-1-Farbstoffs in einen Bildgebungspuffer durch eine 100-μl-Probenschleife, um Lambda-DNA-Moleküle zu färben.
- Führen Sie eine Bildgebungssoftware aus (siehe Materialtabelle) und schalten Sie den 488-nm-Laser ein, um zu überprüfen, ob die DNA-Vorhänge gut geformt sind.
HINWEIS: Wenn DNA-Vorhänge gut ausgebildet sind, werden die DNA-Moleküle, die mit YOYO-1 gefärbt sind, als ausgerichtete Linien an einer Barriere in Gegenwart von Fluss dargestellt. Die gedehnten Linien ziehen sich zurück und diffundieren von der Barriere weg, wenn der Durchfluss abgeschaltet wird. - Injizieren Sie 2 ml Puffer mit hohem Salzgehalt (200 mM NaCl und 40 mM MgCl2), um den YOYO-1-Farbstoff aus der DNA zu entfernen.
- Nachdem der YOYO-1-Farbstoff entfernt wurde, injizieren Sie die vorinkubierte Proteinprobe.
- Wenn die Proteine den DNA-Vorhang erreichen, schalten Sie die Spritzenpumpe aus, schalten Sie das Absperrventil aus und inkubieren Sie 15 Minuten für die Histonbeladung mit Abo1.
- Waschen Sie die ungebundenen Abo1- und Histonproteine 5 Minuten lang aus.
- Schalten Sie das Absperrventil ein und setzen Sie die Durchflusseinspritzung fort.
- Schalten Sie den 637-nm-Laser ein und bilden Sie die fluoreszierenden Proteine ab, während der Pufferfluss eingeschaltet ist.
- Schalten Sie den Pufferfluss vorübergehend aus, um zu überprüfen, ob Histonproteine auf die DNA geladen sind (Abbildung 2C).
- Sammeln Sie DNA-Vorhangbilder mit einem Bildaufnahmeprogramm (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Wenn der Pufferfluss vorübergehend stoppt, wird die DNA aus dem flüchtigen Feld der Totalreflexion zurückgeworfen, und fluoreszenzmarkierte Proteine, die an die DNA gebunden sind, verschwinden.
4. Datenanalyse
- Wandeln Sie die vom Bildaufnahmeprogramm aufgenommenen Bilder in das TIFF-Format als Bildsequenzen um.
HINWEIS: Alle Daten wurden unter Verwendung von Bild J (NIH) analysiert, wie in der Referenz20 beschrieben. - Wählen Sie ein einzelnes DNA-Molekül aus den Bildsequenzen aus und zeichnen Sie einen Kymographen.
HINWEIS: Der Kymograph kann die Änderung der Fluoreszenzintensität jedes Histonproteins, das an ein einzelnes DNA-Molekül gebunden ist, in Abhängigkeit von der Zeit anzeigen. - Erstellen Sie das Fluoreszenzintensitätsprofil aus dem Kymographen und passen Sie es mit mehreren Gaußschen Funktionen an.
- Erfassen Sie die Mittelkoordinaten der Peaks aus dem Fluoreszenzintensitätsprofil. In diesem Schritt kann die minimale Intensität der Histonfluoreszenz erhalten werden.
- Teilen Sie alle Spitzenintensitäten, die aus den Profilen gesammelt wurden, durch die minimale Intensität. In diesem Schritt wird die Anzahl der an DNA gebundenen H3-H4-Dimere geschätzt.
- Führen Sie die Schritte 4.2-4.5 für andere DNA-Moleküle durch.
- Erstellen Sie ein Histogramm für die Bindungsverteilung von H3-H4-Dimeren mit einer Bin-Größe von 1 kbp. Die Anzahl der analysierten Moleküle beträgt mindestens 300.
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Representative Results
In dieser Arbeit wird das Verfahren zur Flusszellpräparation für den DNA-Vorhang-Assay beschrieben (Abbildung 1A). Der DNA-Vorhang-Assay erleichterte die Untersuchung der Histon-H3-H4-Dimerassemblierung auf DNA durch Abo1. Zunächst wurde die Bildung von DNA-Vorhängen durch Färbung von DNA-Molekülen mit YOYO-1, einem interkalierenden Farbstoff, überprüft. Grüne Linien wurden in parallelen Arrays gezeigt, was darauf hindeutet, dass YOYO-1 in DNA-Moleküle eingelagert war, die gut ausgerichtet und an einer Diffusionsbarriere unter hydrodynamischer Strömung gestreckt waren (Abbildung 2A). Um auszuschließen, dass YOYO-1 die Interaktion von DNA und Histonproteinen behindert, wurde YOYO-1 vor der Zugabe von Histonproteinen mit einem hohen Salzpuffer aus der DNA entfernt. Wenn Cy5-H3-H4-Dimere in Abwesenheit von Abo1 in den DNA-Vorhang injiziert wurden, bindete Cy5-H3-H4 nicht an DNA, was auf eine fehlende spontane Bindung von H3-H4-Dimeren an DNA hindeutet (Abbildung 2B). Als Cy5-H3-H4 mit Abo1 injiziert wurde, wurden rot fluoreszierende Punkte auf DNA-Molekülen gesehen, was darauf hindeutet, dass Abo1 H3-H4-Dimere auf die DNA lädt (Abbildung 2C). Der Pufferfluss wurde vorübergehend abgeschaltet, um sicherzustellen, dass Cy5-H3-H4-Dimere nicht an die Objektträgeroberfläche binden, während sie an DNA binden. Wenn der Fluss abgeschaltet wurde, verschwanden fluoreszenzmarkierte Proteine, die an DNA gebunden waren, weil DNA-Moleküle aus dem evaneszenten Feld zurückstießen. Im Gegensatz dazu blieben die an der Oberfläche adsorbierten Proteine gleich. Die Fluoreszenzsignale verschwanden in Abwesenheit des Flusses und tauchten wieder auf, wenn der Fluss wieder aufgenommen wurde, was darauf hindeutet, dass H3-H4-Dimere an DNA binden (Abbildung 2C). Die Bindung von H3-H4-Dimeren an DNA wurde auch durch den Kymographen bestätigt, bei dem die Fluoreszenzsignale verschwanden, wenn der Fluss ausgeschaltet wurde (Abbildung 2D). Da es sich bei Abo1 um eine AAA+-ATPase handelt, wurde die Wirkung der ATP-Hydrolyse auf die Histonbeladungsaktivität von Abo1 untersucht16. Nur wenige fluoreszierende Punkte traten im DNA-Vorhang auf, entweder in Abwesenheit von Nukleotid (Apo) oder in Gegenwart von ADP (Abbildung 2E), was darauf hindeutet, dass H3-H4-Dimere selten an DNA binden, weder im Apo-Zustand noch in Gegenwart von ADP. Abbildung 2F zeigt quantitative Analysen von Abbildung 2B, C und Abbildung 2E, die zeigen, dass die Anzahl der an DNA gebundenen H3-H4-Dimere in Gegenwart von ATP zunimmt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ATP-Hydrolyse für die H3-H4-Beladung der DNA durch Abo1 essentiell ist (Abbildung 2E,F).
Als nächstes wurde getestet, ob Abo1 bevorzugt Histone in die Widom 601-Sequenz lädt, die eine zehnmal höhere Bindungsaffinität zu Histone aufweist als zufällige Sequenzen in vitro, obwohl Nukleosomen in vivo 36,37,38,39,40 keine Spezifität für die Widom 601-Sequenz aufweisen. Der DNA-Vorhang wurde mit Lambda-DNA gebildet, die Widom 601-Wiederholungen an einem Ende oder intern enthält (Abbildung 3A,B). Die Bindungslandschaft von H3-H4-Dimeren auf jedem DNA-Konstrukt wurde erhalten (Abbildung 3C,D). Die Bindungsstelle von Cy5-H3-H4 wurde aus der Mittelposition der 2D-Gauß-Anpassung für jedes fluoreszierende Punctumgeschätzt 17,41. Wenn die H3-H4-Ladeaktivität von Abo1 von der DNA-Sequenz abhängt, dann wäre die Bindungsverteilung in Richtung der Widom 601-Sequenz verzerrt. Abbildung 3C,D zeigt die Histogramme der Bindungsverteilung von H3-H4-Dimeren durch Abo1 auf Lambda-DNA, die Widom 601-Wiederholungen am Ende (zehn Wiederholungen) bzw. intern (fünf Wiederholungen) enthält. Es gab keine bevorzugte Bindung an die multiplen Widom 601-Wiederholungen, und die Bindungsverteilung war zufällig, was darauf hindeutet, dass Abo1 keine Präferenz für die Widom 601-Sequenz hat, sondern stattdessen H3-H4 sequenzunabhängig auf die DNA lädt (Abbildung 3C, D).
Abbildung 1: Vorbereitung der Durchflusszelle. (A) Schematische Darstellung der Flusszellenassemblierung und des DNA-Vorhangsystems. Die Mikrofluidikkammer kann zwischen einem Objektträger aus Quarzglas und einem Glasdeckglas gebildet werden, das mit doppelseitigem Klebeband zusammengeklebt ist. Unter der hydrodynamischen Strömung in der Kammer ist eine große Menge an Lambda-DNA-Molekülen aufgrund der Fließfähigkeit der Lipiddoppelschicht an einer Diffusionsbarriere (hier ein Nanograben) ausgerichtet und wie ein Vorhang gespannt. In der vergrößerten Ansicht der Diffusionsbarriere weist der Nanograben Sägezahnmuster mit 1,5 μm Teilung, 350 nm Breite und 1,4 μm Tiefe auf. (B) Foto des mikrofluidischen Systems, bestehend aus einer Spritzenpumpe, einem Absperrventil und einem 6-Wege-Probeninjektionsventil mit einer Probenschleife. (C) Bilder von Objektträgerkomponenten (links), der Montage von Haltern und Durchflusszelle (Mitte) und der vollständig montierten Durchflusszelle, die auf einem speziell angefertigten TIRF-Mikroskop montiert ist (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Visualisierung der Histonbeladung durch Abo1 unter Verwendung eines Einzelmolekül-DNA-Vorhangs. (A) Bild eines DNA-Vorhangs, in dem DNA-Moleküle, die mit YOYO-1 (grün) gefärbt wurden, an einer Diffusionsbarriere gut ausgerichtet sind. (B) Bilder von Cy5-H3-H4 (rot) ohne Abo1. (C) Bilder von Cy5-H3-H4 (rot), geladen von Abo1 in Gegenwart (oben) und Abwesenheit (unten) von Pufferfluss. (D) Kymograph, extrahiert aus einem einzelnen DNA-Molekül aus (C). Wenn der Fluss vorübergehend ausgeschaltet wird, verschwinden die Cy5-Fluoreszenzsignale, was darauf hindeutet, dass Cy5-H3-H4 an DNA, aber nicht an die Objektträgeroberfläche bindet. (E) Bild von Cy5-H3-H4, das mit Abo1 ohne Nukleotid (Apo) beladen ist (oben). Bild von Cy5-H3-H4, geladen von Abo1 in Gegenwart von ADP (unten). (F) Quantifizierung von Cy5-H3-H4, das mit Abo1 beladen ist, anhand von Nukleotiden. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung in dreifacher Form dar. Jedes Experiment beinhaltete die Analyse von 100-200 Molekülen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Sequenzunabhängige Belastung von H3-H4 durch Abo1. (A) Ein Ende der Lambda-DNA ist über Streptavidin an biotinyliertes Lipid verankert, und das andere Ende enthält zehn Wiederholungen der Widom 601-Sequenz (oben). Die andere Lambda-DNA enthält fünf Wiederholungen der Widom 601-Sequenz in der Lambda-DNA (unten). (B) Schematische Darstellung eines DNA-Curtain-Assays mit Lambda-DNA, die Widom 601-Wiederholungen enthält. (C,D) Histogramme der Bindungsverteilung von Cy5-H3-H4 auf Lambda-DNA, die Widom 601 enthält, wiederholen sich am Ende (C) und intern (D). Es gibt keine Sequenzspezifität für DNA, wenn H3-H4 durch Abo1 assembliert wird. Fehlerbalken werden durch Bootstrapping42 mit einem Konfidenzintervall von 70 % ermittelt. Die Gesamtzahl der Ereignisse beträgt 312 bzw. 252 für (C) bzw. (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Als Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren wurde der DNA-Vorhang in großem Umfang zur Untersuchung von DNA-Stoffwechselreaktionen eingesetzt43. Der DNA-Vorhang ist ein hybrides System, das Lipidfluidität, Mikrofluidik und TIRFM miteinander verbindet. Im Gegensatz zu anderen Einzelmolekültechniken ermöglicht der DNA-Vorhang eine Hochdurchsatz-Echtzeitvisualisierung von Protein-DNA-Interaktionen. Daher eignet sich die DNA-Vorhang-Technik, um den Mechanismus hinter molekularen Wechselwirkungen zu untersuchen, einschließlich sequenzspezifischer Assoziation, Proteinbewegung zusammen mit DNA und Protein-Protein-Kollision auf DNA 17,20,26. Darüber hinaus ermöglicht der hohe Durchsatz des DNA-Vorhangs die Erfassung ausreichender Daten, um die statistische Zuverlässigkeit zu gewährleisten. Der DNA-Vorhang erleichtert die Untersuchung der biophysikalisch-chemischen Eigenschaften von Proteinen, einschließlich kinetischer Parameter, Diffusionskoeffizient, Geschwindigkeit und Prozessivität 17,26,27,30. Wichtig ist, dass der DNA-Vorhang verwendet werden kann, um die Bindungslandschaft der Nukleosomenablagerung zu bestimmen, was auf die intrinsische Sequenzpräferenz von Nukleosomen hinweist30.
Um qualitativ hochwertige Daten aus dem DNA-Curtain-Assay zu erhalten, müssen mehrere Punkte berücksichtigt werden. Zunächst muss die Lipiddoppelschicht auf der Objektträgeroberfläche entsprechend ausgebildet werden. Die Fließfähigkeit der Lipiddoppelschicht ermöglicht es DNA-Molekülen, sich auf dem Objektträger zu bewegen und in Gegenwart einer hydrodynamischen Strömung an einer Diffusionsbarriere ausgerichtet zu werden. Die Lipiddoppelschicht passiviert auch die Oberfläche der mikrofluidischen Kammer, um eine unspezifische Adsorption von Proteinen an die Oberfläche zu verhindern. Da die Passivierung durch die Lipiddoppelschicht nicht vollständig ist, werden fluoreszenzmarkierte Proteine unspezifisch an der Oberfläche adsorbiert, was zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse führt. Die an der Oberfläche haften gebliebenen Proteine können jedoch von DNA-gebundenen Proteinen unterschieden werden, indem der transiente Fluss ein- und ausgeschaltet wird, da DNA-gebundene Proteine verschwinden, wenn der Fluss stoppt. Zweitens muss das Photobleichen von Fluorophoren unterdrückt werden. Viele Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren verwenden ein Sauerstofffängersystem, um das Ausbleichen von Photobleichen zu reduzieren. Es wurden mehrere Sauerstofffängersysteme entwickelt, von denen gloxy das beliebteste ist. Gloxy, bestehend aus Glucoseoxidase und Katalase, reduziert enzymatisch den molekularen Sauerstoff in Lösung, senkt aber den pH-Wert 44,45,46. Ein niedriger pH-Wert ist nicht mit den physiologischen Bedingungen vereinbar und verringert die Fließfähigkeit der Lipide. Um den Abfall des pH-Werts zu verzögern, muss (1) der Bildgebungspuffer mit entgastem deionisiertem Wasser vorbereitet werden, (2) der Puffer muss sofort verwendet werden und (3) der Puffer muss versiegelt und bis zur Verwendung auf Eis gelagert werden.
Es wurde eine einzigartige Plattform entwickelt, um das DNA-Vorhangsystem zu verbessern, bei dem geschnitzte Nanogräben anstelle von Chrom-Nanomustern als Diffusionsbarrieren dienen25. Da diese Nano-Gräben unter rauen Reinigungsbedingungen mit starken Lösungsmitteln robuster sind, ermöglichen sie eine wiederholbare, klarere Bildgebung. Die DNA-Vorhang-Technik hat jedoch mehrere Einschränkungen. Unter kontinuierlicher Laserbeleuchtung werden die Fluorophore, die Proteine markieren, photogebleicht, was Langzeitmessungen schwierig macht. Der DNA-Vorhang funktioniert bei niedrigem pH-Wert (niedriger als ~6) nicht, da die Lipiddoppelschicht nicht fluidisch ist. Darüber hinaus stören der Fluoreszenzhintergrund und die unspezifische Bindung von Proteinen an die Objektträgeroberfläche die Einzelmolekül-Bildgebung, wenn die Proteinkonzentration hoch ist. Ein weiterer Nachteil des DNA-Vorhangs ist, dass die räumliche Auflösung des DNA-Vorhangs ~1 kbp/Pixel beträgt, so dass die Bewegung von Proteinen bei weniger als 1 kbp nicht beobachtet werden kann. Darüber hinaus übt der DNA-Vorhang kontinuierlich hydrodynamische Kraft auf Proteine auf der DNA aus. Aber die Kraft durch Strömung ist schwach (weniger als 1 pN), und daher ist es eine Herausforderung, dass sich Histone oder Nukleosomen entlang der DNA im Vorhang bewegen. Es wurde auch berichtet, dass Nukleosomen selten ohne Chromatin-Remodeler entlang der DNA gleiten47. Wenn Histone oder Nukleosomen entlang der DNA gleiten, bleiben die meisten von ihnen im Endbereich der DNA im Vorhang. Wir sahen jedoch keine verzerrte Verteilung. Auf der anderen Seite, wenn Histone oder Nukleosomen vom DNA-Ende abfließen, würden sie am Ende der DNA erschöpft sein. Auch das haben wir nicht beobachtet.
Diese Arbeit zeigt, dass der DNA-Vorhang-Assay eine Einzelmolekül-Bildgebungsplattform ist, die sich ideal für die Untersuchung der Chromatindynamik eignet. DNA-Vorhänge können angewendet werden, um den Prozess zu untersuchen, durch den Histon-Chaperone wie Bromodomänen-haltige AAA+-ATPasen das Chromatin zusammensetzen. Die biologische Funktion von Bromodomänen-haltigen AAA+-ATPasen ist umstritten. Ein Mangel an humanem ATAD2 oder S. cerevisiae Yta7 reguliert die Genexpression über die Chromatinkondensation herunter18. Im Gegensatz dazu erhöht S. pombe Abo1 die Nukleosomendichte16. Die Einzelmolekülstudien zeigen, dass Abo1 die Beladung der DNA mit Histon H3-H4 katalysiert. Es wird gezeigt, dass die Histonbeladungsaktivität von Abo1 von der ATP-Hydrolyse abhängt (Abbildung 2C,E,F). Darüber hinaus zeigt die Bindungsverteilung von H3-H4-Dimeren, dass H3-H4-Dimere sequenzunabhängig von Abo1 auf DNA geladen werden (Abbildung 3). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der DNA-Vorhang verwendet werden kann, um die biologische Rolle von Abo1 als Histon-Chaperon in der Histon-Assemblierung zu entschlüsseln. Mit Hilfe der DNA-Vorhang-Technik soll in Zukunft die Nukleosomenbildung durch Abo1 und andere Histon-Chaperone wie CAF-1 und FACT untersucht werden.
Basierend auf diesem Protokoll kann der DNA-Curtain-Assay verwendet werden, um die Reorganisation des Chromatins durch den Umbau von Komplexen zu beobachten, die Nukleosomen translozieren und neu anordnen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich für die freundliche Unterstützung von Abo1 und Cy5-H3-H4 durch Professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., und Juwon Jang, Ph.D., in KAIST, Südkorea. Diese Arbeit wird durch den National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), den intramuralen Forschungsfonds (1.210115.01) des Ulsan National Institute of Science and Technology und das Institute for Basic Science (IBS-R022-D1) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
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